（生物医学工程专业论文）几种化合物及脂质体包裹对量子点光学性质的影响.pdf

吣y 1 帆9 叭0 矾7 帆帆5 帆1 l 8 帆i t h ei n f l u e n c eo fs e v e r a lc o m p o u n d sa n dl i p o s o m ee n c a p s u l a t i o no n t h eo p t i c a lp r o p e r t i e so fq u a n t u md o t s b y s u nl i c h u n b s ( s h a n x in o r m a lu n i v e r s i t y ) 2 0 0 8 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e l n b i o m e d i c a le n g i n e e r i n g i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rg a ih o n g w e i m a y , 2 0 1 1 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名：忍泌右日期：劲i 【年6 月多日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 1 保密口，在年解密后适用本授权书。 2 不保密哦 ( 请在以上相应方框内打”) 作者签名：京帱香日期：加1 1 年月多日 导师签名多齐 期o z o lf 年6 月3 日 硕士学位论文 摘要 与常规的有机荧光染料相比，量子点具有激发光谱宽，发射光谱窄，量子 产率高，光学稳定性好等优点，它已广泛应用于分子生物学，细胞生物学，生 物化学，蛋白质组学、基因组学、药物筛选，医学诊断等领域。本文主要研究 了几种化合物及脂质体包裹对量子点光学性质的影响，具体内容如下： 1 、几种化合物对量子点光学性质的影响。实验研究了巯基乙酸、半胱氨酸、 二硫代苏糖醇、没食子酸乙酯、硫脲、谷胱甘肽，表面活性剂以及亚硫酸钠除 氧对溶液中单个量子点闪烁、漂白、蓝移的影响。结果表明，巯基化合物巯基 乙酸、半胱氨酸、二硫代苏糖醇、硫脲、谷胱甘肽，以及抗氧化剂没食子酸乙 酯通过钝化量子点的表面缺陷态而抑制了量子点的闪烁；并且加入这几种化合 物后，量子点的幂律分布指数伐o n 减小，量子点“o n ”时间变长。一定浓度的三重 态淬灭剂二硫代苏糖醇、谷胱甘肽，抗氧化剂没食子酸乙酯以及亚硫酸钠对量 子点溶液除氧后，有效地抑制了量子点的漂白；临界胶束浓度以上的阳离子表 面活性剂c t a b 、c t a c 可以保护量子点的受激三线态免遭淬灭，而加快了量子 点的漂白。由此我们推测量子点的光氧化和三重态的积聚共同导致了量子点的 光漂白。添加一定浓度的强还原剂二硫代苏糖醇和没食子酸乙酯，以及对溶液 进行除氧后阻止了量子点核的氧化，从而抑制了量子点的蓝移。实验发现了几 种有效抑制量子点闪烁、漂白与光谱蓝移的化合物，改善了量子点的光学性质， 并初步阐释了量子点这些光学现象所隐藏的机理，从而有望进一步拓展量子点 的应用范围。 2 、脂质体包裹对量子点光学性质的影响。实验采用逆相蒸发法将水溶性的 羧基量子点包裹进脂质体，用荧光成像和散射成像相结合的方式，对其进行表 征，并考察了脂质体包裹后对量子点光学性质的影响。结果表明，大部分量子 点被包裹入脂质体；量子点被脂质体包裹后，其耐漂白能力降低。该方法提高 了量子点的生物兼容性，但同时降低了量子点的光化学稳定性。 关键词：量子点光谱蓝移；量子点光漂白；量子点闪烁；三线态淬灭；脂质体 包裹量子点 几种化合物及脂质体包裹对量子点光学性质的影响 a b s t r a c t c o m p a r e dw i t hc o n v e n t i o n a lf l u o r e s c e n c ed y e s ，q u a n t u md o t s ( q d s ) h a v em a n y e x c e l l e n to p t i c a lp r o p e r t i e s ，s u c ha sb r o a de x c i t a t i o ns p e c t r u m ，n a r r o we m i s s i o n s p e c t r a ，h i g hq u a n t u my i e l d s ，g o o dp h o t o s t a b i l i t ya n d s oo n t h e yh a v eg o t t e n e x t e n s i v eu s ei nm o l e c u l a r b i o l o g y ， c e l l b i o l o g y ，b i o c h e m i s t r y ， p r o t e o m i c s ，g e n o m i c s ，d r u gs c r e e n i n g ，m e d i c a ld i a g n o s i s ，a n ds oo n t h i st h e s i s s t u d i e dt h ei n f l u e n c e so fs e v e r a lc o m p o u n d sa n dl i p o s o m ee n c a p s u l a t i o no nt h e o p t i c a lp r o p e r t yo fq u a n t u md o t s t h em a i nc o n t e n t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h ei n f l u e n c eo fs e v e r a lc o m p o u n d so nt h eo p t i c a lp r o p e r t i e so fq u a n t u m d o t s t h ee f f e c to fs e v e r a lc o m p o u n d ss u c ha sm e r c a p t o a c e t i ca c i d ，c y s t e i n e ， d i t h i o t h r e i t o l ，e t h y lg a l l a t e ，t h i o u r e a ，g l u t a t h i o n e ，s u r f a c t a n t sa n ds o d i u ms u l f i t e s d e p l e t i n go x y g e ni ns o l u t i o nt of l u o r e s c e n c eb l i n k i n g ，p h o t o b l e a c h i n g ，b l u es h i f to f s i n g l eq u a n t u md o t si ns o l u t i o nw a si n v e s t i g a t e di nd e t a i l t h er e s u l t so fe x p e r i m e n t p r o v e d t h a t s u l f h y d r y lc o m p o u n d s s u c ha s m e r c a p t o a c e t i ca c i d ，c y s t e i n e ， d i t h i o t h r e i t o l ，t h i o u r e a ，g l u t a t h i o n e ，a n da n t i o x i d a n te t h y lg a l l a t ec o u l ds u p p r e s s b l i n k i n gi nq u a n t u md o t sb yp a s s i v a t i n gs u r f a c et r a ps t a t e so fq u a n t u md o t s a n dt h e p o w e r 1 a wd i s t r i b u t i o ne x p o n e n t i a la o nd e c r e a s e dw h i c hm e a n tl o n g “o n t i m ea f t e r a d d i t i o no ft h o s ec o m p o u n d s t h ea d d i t i o no fa na p p r o p r i a t ed o s eo ft r i p l e tq u e n c h e r s u c ha sd i t h i o t h r e i t o l ，g l u t a t h i o n e ，a n da n t i o x i d a n te t h y lg a l l a t ei n t ot h es a m p l ea n d d e p l e t i n g t h e o x y g e n f r o ms o l u t i o n b y u s eo fs o d i u ms u l f i t ec o u l di n h i b i t p h o t o b l e a c h i n go fq u a n t u md o t s w ea l s of o u n dq d s p h o t o b l e a c h i n gw a ss p e e d e d u pb yc a t i o n i cs u r f a c t a n t s ( h e x a d e c y lt r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ，c t a b ， h e x a d e c y l t r i m e t h y l a m m o n i u mc h l o r i d e ，c t a c ) b e c a u s et h e yc o u l dp r o t e c tq d s t r i p l e te x c i t e ds t a t ef r o mq u e n c h i n ga tac o n c e n t r a t i o na b o v et h ec r i t i c a lm i c e l l a r c o n c e n t r a t i o n ( c m c ) o ft h e m t h u sw es p e c u l a t e t h a t p h o t o o x i d a t i o n a n d a c c u m u l a t i o no ft h et r i p l e te x c i t e ds t a t et o g e t h e ri n d u c ep h o t o b l e a c h i n go fq u a n t u m d o t s t h eo x i d a t i o no fq u a n t u md o t sc o r e sw a sb l o c k e db ya d d i t i o no fa na p p r o p r i a t e d o s eo fs t r o n gr e d u c i n ga g e n t s ( d i t h i o t h r e i t o l ，e t h y lg a l l a t e ) a n db ye f f i c i e n to x y g e n r e m o v a lu s i n gs o d i u ms u l f l t e ，a n da sar e s u l t ，b l u es h i f to fq u a n t u md o t sw a s s u p p r e s s e d i n aw o r d ，t h eo p t i c a lp r o p e r t i e so fq u a n t u md o t sw e r ei m p r o v e db y s e v e r a lc o m p o u n d sw h i c hc o u l de f f e c t i v e l ys u p p r e s st h ep h o t o b l e a c h i n g ，b l u es h i f t a n db l i n k i n gi nq u a n t u md o t sa n dt h ep o s s i b l em e c h a n i s mb e h i n dt h e s eo p t i c a l p h e n o m e n aw a se l u c i d a t e d c o n s e q u e n t l y , t h ea p p l i c a t i o ns c o p eo fq u a n t u md o t s i l l w o u l de x p a n df u r t h e r 2 t h ei n f l u e n c eo f l i p o s o m ee n c a p s u l a t i o no nt h eo p t i c a lp r o p e r t i e so f q u a n t u m d o t s t h ew a t e r - s o u b l ec a r b o x y lq u a n t u md o t sw e r ee n c a p s u l a t e di n l i p o s o m e sb v t h e m e t h o do f r e v e r s e p h a s ee v a p o r a t i o n i tw a sc h a r a c t e r i z e db yt h ec o m b i n a t i o n o ff l u o r e s c e n ti m a g i n ga n ds c a t t e r i n gi m a g i n ga n dw e a l s oi n v e s t i g a t e dt h ei m p a c to f 1 1 p o s o m ee n c a p s u l a t i o no nt h e o p t i c a lp r o p e r t i e so fq u a n t u md o t s t h er e s u l t i n d i c a t e dt h a tm o s to ft h eq u a n t u md o t sw e r ee n c a p s u l a t e di n l i p o s o m e sa n dt h e q u a n t u md o t sh a dl o w e rp h o t o b l e a c h i n gr e s i s t a n c ea f t e r l i p o s o m ee n c a p s u l a t i o n t h i sm e t h o dr a i s e dt h eb i o l o g i c a lc o m p a t i b i l i t yo f q u a n t u md o t s ，b u tm e a n w h i l e t h e q d s p h o t o s t a b i l i t yw a sl o w e r e d k e yw o r d s ：b l u es h i f to fq u a n t u md o t s ；p h o t o b l e a c h i n go fq u a n t u m d o t s ；b l i n k i n g i nq u a n t u md o t s ；t r i p l e ts t a t eq u e n c h i n g ；l i p o s o m ee n c a p s u l a t i o no f q u a n t u md o t s i v 。一 几种化合物及脂质体包裹对量子点光学性质的影响 目录 学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t ：i i i 本文所用英文缩写词表。v i i 第1 章绪论1 1 1 量子点概述l 1 2 量子点的发光原理2 1 3 单个量子点的光学性质3 1 4 单个量子点的成像方法4 1 4 1 宽场落射式荧光显微镜。4 1 4 2 全内反射荧光显微镜5 1 5 单个量子点的确认原则7 1 6 量子点在生物医学中的应用8 1 6 1 在分子水平检测中的应用8 1 6 2 在细胞水平检测中的应用9 1 6 3 在活体水平检测中的应用1 0 1 7 本论文的主要研究内容1 1 第2 章几种化合物对量子点光学性质的影响1 2 2 1 引言1 2 2 2 实验部分。1 3 2 2 1 试剂与仪器1 3 2 2 2 实验方法1 4 2 3 实验结果1 4 2 3 1 量子点的闪烁抑制1 4 2 3 2 量子点的光漂白抑制18 2 3 3 量子点的光谱蓝移抑制2 1 2 3 4 表面活性剂对量子点光学性质的影响2 6 2 4 讨论2 8 2 5 小结3 0 第3 章脂质体包裹对量子点光学性质的影响3 2 3 1 引言3 2 v _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。 3 2 实验部分 3 2 1 试剂与仪 3 2 2 实验方法 3 3 结果与讨论 3 3 1 包裹量子 3 3 2 脂质体包 3 3 3 脂质体包裹量子点的光谱蓝移3 6 3 4 小结3 7 结论3 8 参考文献4 0 附录a 攻读学位期间所发表的学术论文目录5 0 附录b 几种化合物的结构式5 1 致 射5 2 v i _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ 。_ _ 。一 半胱氨酸 巯基乙酸 二硫代苏糖醇 还原型谷胱甘肽 没食子酸乙酯 硫脲 十六烷基三甲基溴 化铵 十六烷基三甲基氯 化铵 十二烷基硫酸钠 十二烷基磺酸钠 曲拉通x - 1 0 0 二肉豆蔻酰磷脂酰 胆碱 c y s t e i n e m e r c a p t o a c e t i ca c i d 1 ，4 d i t h i o t h r e i t o l g l u t a t h i o n er e d u c e d e t h y lg a l l a t e t h i o u r e a c y s m a a d t t g s h e g h e x a d e c y lt r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d ec t a b h e x a d e c y lt r i m e t h y la m m o n i u mc h l o r i d ec t a c s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s o d i u ml a u r y ls u l f o n a t e t r i t o nx 10 0 t r i t o nx 1 0 0 1 , 2 - d i m y r i s t o y l - s n - g l y c e r o 3 p h o s p h o c h o l i n ed m p c i 。一 硕士学位论文 第1 章绪论 单分子层次的某些现象与宏观现象、系综平均现象有着明显的差异。单分子 检测( s i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n ，s m d ) 使人们能直接研究和操纵单个分子。与 整体分析法相比，s m d 方法可以研究复杂体系中的个体，特别是能用来检测中 间产物，跟踪化学反应途径。而且，它还可被用来研究生物大分子，提供不可能 用传统的统计方法得到的有关分子结构和功能的信息。s m d 快速、卓越的进展， 为化学、生物学、医学和纳米材料等领域提供了新的检测手段【l 】。 荧光单分子检测技术是用荧光标记来显示和追踪单个分子的方法【2 j 。1 9 7 6 年，h i r s e h f e l d l 3 检测到标有8 0 1 0 0 个染料的单个抗体分子，开创了单分子检测 的先河。1 9 9 0 年，s h e r a 等【4 】首次实现了室温流体中单个罗丹明6 g 分子的荧光 检测。由于荧光信号测量灵敏度高且光子对分子的干扰最轻微，所以被广泛应用 于单分子的研究1 2 。用作荧光标记的探针有两种：即有机染料分子和纳米粒子。 后者包括具有光学活性的金属纳米粒子、荧光微球和量子点( q u a n t u md o t s ， q d ) 。由于有机荧光团有信号强度低、化学稳定性差、易光降解等缺陷，因此限 制了它的进一步应用。最近发展起来的量子点有许多独特的优点，有望代替传统 的有机染料。作为一种新型荧光探针，它已引起了科学工作者广泛的研究兴趣， 并被应用到单分子、细胞、活体等多种体系。 1 1 量子点概述 量子点，又可称为纳米晶，是一种由i i b 和a 族( 如z n o 、z n s 、c d s e 、 c d t e 、c d s 、z n s e 等) 或a 和v a 族( 如i n p 、i n a s 等) 元素组成1 5 - 9 的半导 体纳米颗粒。量子点的粒径一般介于1 - 1 0n m 1 0 。1 3 】之间，小于或接近激子波尔 半径，量子点内的载流子( 电子和空穴) 的运动处于强受限状态，连续的能带结 构变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。其半径越小，能隙 越大，光吸收和发射能量越高。这种量子尺寸限域将导致量子点产生非线性光学 效应，引起尺寸效应、表面效应、量子限域效应、宏观量子隧道效应等，从而使 它具有不同于宏观体系的低维度物性，表现出自身独特的物理化学性质。量子点 通常为核壳( c o r e s h e l l ) 结构，核心为具有高发光效率的半导体物质( 如c d s e ， c d t e 等) ，外包一层高带隙材料( 如z n s ，c d s ，z n s e 等) 以进一步提高发光量 子效率。同时，外壳的存在极大地提高了量子点的光化学稳定性。核壳结构之外 再通过化学方法引入活性基团如羧基、氨基等，活性基团的引入使量子点具有水 溶性和可标记基团，因而可使量子点与生物分子进行化学偶联。 与传统的有机荧光染料相比，量子点作为荧光标志物有如下优势【6 ，8 ，1 4 】： 几种化合物及脂质体包裹对量子点光学性质的影响 ( 1 ) 吸收光谱宽，激发波长小于其发射波长的光均可激发量子点，因而可用同 同一波长的光激发多种量子点；( 2 ) 发射光谱窄而对称，通过改变量子点粒径大 小，可使它发出不同波长的荧光，光谱重叠明显减小；( 3 ) 斯托克( s t o k e s ) 位 移大，吸收光谱与发射光谱容易分开【9 1 5 】：( 4 ) 荧光量子产率高【1 6 】；( 5 ) 荧光强 度高，光稳定性好，抗漂白能力刮6 ，1 7 1 ，可长时间追踪监测【1 7 ，1 羽，c h a r t 和n i e 通过实验证明c d s e z n s 量子点的荧光强度是罗丹明6 g 分子的2 0 倍，其抗漂白 能力是罗丹明6 g 的1 0 0 倍【1 9 j ；( 6 ) 对细胞的毒性小，可用于活细胞及体内研究。 1 2 量子点的发光原理 当半导体量子点的颗粒尺寸与其激子的玻尔半径相近时，随着颗粒尺寸的减 小，其载流子( 电子、空穴) 的运动处于受限状态，导致动能增加，原来连续的 能带结构( 导带和价带) 变成准分立的类分子能级( 如图1 1 所示) ，并且由于 动能的增加使得半导体颗粒的有效带隙增加，其相应的吸收光谱和荧光光谱会发 生蓝移，而且量子点尺寸越小，蓝移越显著，这就是所谓的量子尺寸效应。由于 受量子尺寸效应的影响，半导体量子点的发光原理如图1 1 所示【2 0 】，当一束光照 射到半导体量子点上，半导体材料吸收光子后，其价带上的电子跃迁到导带，产 生电子空穴对( 即激子) ，导带上的电子还可以再跃迁回价带同时发射光子，即电子 空穴辐射复合，也可以落入半导体材料的电子陷阱中。当电子落入较深的电子陷 阱中的时候，绝大部分电子以非辐射的形式而猝灭了，只有极少数的电子以发射 光子的形式跃迁回价带或是吸收一定能量后又跃迁到导带。因此，当量子点的电 子陷阱较深时，它的发光效率会显著降低。半导体量子点受光激发后产生了空穴 电子对( 即激子) ，电子和空穴复合的途径主要有【2 l 】：( 1 ) 电子和空穴直接复 合，产生激子态发光。由于受量子尺寸效应的影响，所产生的发射光的波长随着 量子点颗粒尺寸的减小而蓝移。( 2 ) 通过表面缺陷态间接复合发光。在纳米颗 粒的表面存在着许多悬键，因而形成了许多表面缺陷态。当半导体量子点受光激 发后，产生的载流子以极快的速度受限于表面缺陷态而产生表面态发光。量子点 的表面越完整，表面对载流子的捕获能力就越弱，从而使得表面缺陷态的发光就 越弱。( 3 ) 通过杂质能级复合发光。以上3 种情况的发光是相互竞争的。如果 量子点的表面存在着许多缺陷，对电子和空穴的捕获能力就会很强，使得电子和 空穴直接复合的几率很小，从而使得激子态的发光很弱，甚至观察不到，而只有 表面缺陷态的发光。由于电子和空穴直接复合对量子点的发光最有利，所以为了 得到激子态的发光，需设法制备表面完整的量子点或者通过对量子点的表面进行 修饰来减少其表面缺陷。 硕士学位论文 占t 图1 1 半导体量子点的光致发光原理斟2 0 1 图中实线代表辐射跃迁，虚线代表非辐射跃迂。 1 3 单个量子点的光学性质 单个的量子点呈现一些现象，如荧光间断( f l u o r e s c e n c ei n t e r m i t t e n c y ) 或称 闪烁( b l i n k i n g ) 、光漂白( p h o t o b l e a c h i n g ) 和光谱蓝移( s p e c t r a lb l u i n g ) 。荧光 闪烁是指单个量子点在受到激发时，连续的荧光发射被一些不发射光的暗态( 诱 捕态) 所中断。通常认为量子点的暗态是由于量子点上核的载流子( 电子或空穴) 被表面的缺陷态所诱捕，因而使量子点核带正电。由于电荷诱导的随后的电子空 穴对的非辐射复合发生，此时量子点处于非发射态( o 行态) ；当电离的电荷去诱 捕而返回核，使核重新变回中性时，量子点又重新获得发射态( o n 态) 。n i r m a l 等人【2 2 】首先观察到了单个c d s e 量子点的闪烁现象。随后量子点的闪烁现象( o n 与o f f ) 得到了广泛的研究 2 3 丑6 1 。荧光漂白是指在连续激发光照射下，量子点逐 渐失去荧光的现象。2 0 0 7 年，l e e 等人1 2 7 观察到了亲和素包裹的量子点的光漂白 现象。量子点的光谱蓝移是指在连续光照射下，量子点的荧光发射波长逐渐向短 波长方向移动的现象。n i r m a l 等人瞄】在观察单个c d s e 量子点的闪烁时首先发现 了量子点的蓝移现象。c o r d e r o 等人【2 8 】发现在低能量的氙弧光灯( 3 wc m 2 ) 的连 续光照射几个小时后，q d 单层蓝移了1 6 r i m 。然而在更高的激光强度( 8 0 k w c m 之) ，n a z z a l 等人【2 9 】也观察到了埋入p m m a 膜里c d s e 量子点相同程度的蓝移。 这两个小组同时发现量子点的蓝移幅度在氮气中要比在氧气中小以及有z n s 包 裹的量子点蓝移程度也小。量子点的这些光学属性对环境，如光强、溶剂、气体、 温度、p h 值等比较敏感【2 邺引。 量子点的闪烁、荧光漂白和荧光光谱蓝移通常不利于定量分析，所以科学家 几种化合物及脂质体包裹对量子点光学性质的影响 们一直致力于克服这些缺点的研究。通常有两种方法来抑制量子点的这些现象。 第一种是通过改变合成方法来提高量子点的光学性能。如合成特大的量子点 ( g i a n tq u a n t u md o t s ，g q d s ) ，这种量子点核被很厚的壳包裹，表现出抗闪烁和 漂白的现象【3 4 l 。另一个研究小组m a h l e r 等人【3 5 】合成厚壳包裹的c d s e c d s 核壳 量子点。由于结晶度增加和核壳界面晶格应变的减少，不闪烁的量子点达到6 8 。 e a r l y 和h a m m e r 等人【3 6 j 发现c d s e 量子点与有机配体l i g o ( p h e n y l e n ev i n y l e n e ) 连 接形成c d s e o p v 纳米结构可以抑制量子点的闪烁，并且o p v 配体的数目影响 量子点的闪烁程度，当达到约2 5 个配体时，可以完全抑制c d s e 量子点的闪烁。 w a n g t 3 7 j 等用核壳界面混合的方法合成了完全不闪烁的c d z n s e z n s e 半导体量子 点。这是纳米材料领域的一个重要发现，但是它的缺点是有多个发射峰，影响了 其在成像中的应用。 第二种是通过改变量子点周围的环境而达到抑制量子点的这些现象发生。比 如向量子点溶液中加入添加剂。h o h n g 和h a 两人【3 8 】向亲和素包被的量子点溶液 中加入b 巯基乙醇( b m e ) ，可以观察到量子点闪烁现象的有效抑制。f o m e n k o 小组【3 9 j 和b i e b r i c h e r l 4 0 1 小组分别发现没食子酸丙酯和巯基乙胺也可抑制量子点的 闪烁。h e 等人【4 l 】在巯基丙酸溶液中合成不闪烁的c d t e 量子点。h a m a d a 4 2 】等发 现单个c d s e z n s 量子点的闪烁可被添加的t i 0 2 纳米颗粒溶液所抑制。本人所在 实验型4 3 j 发现巯基乙胺可以抑制量子点的漂白和蓝移，而b 巯基乙醇只可以抑制 量子点的蓝移，却没有抑制其漂白。目前，量子点的闪烁、漂白和蓝移之间的相 互关系，以及这些现象背后所蕴藏的机理还不是很清楚。 1 4 单个量子点的成像方法 单个量子点的荧光检测方法主要有点检测法和成像检测法。点检测法是以雪 崩二极管或光电倍增管为检测器进行光子计数。该方法具有较高的信噪比和时间 分辨率，但是不能同时进行多点检测，也不能对特定分子的轨迹进行记录。成像 检测法能弥补点检测法的缺陷，可以实现高通量的检测，并且对指定分子进行轨 迹示踪。荧光成像检测法包括宽场成像和扫描成像两种。宽场成像方法包括落射 式荧光显微镜和全内发射式荧光显微镜。扫描成像使用最多的是共聚焦显微镜和 近场扫描光学显微镜。下面将重点介绍一下宽场成像方法。 1 4 1 宽场落射式荧光显微镜 荧光显微镜按高压光源的激发光路不同分为透射式荧光显微镜 ( t r a n s m i s s i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ) 和落射式荧光显微镜( e p i f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e ) 。透射式荧光显微镜是比较旧式的荧光显微镜。因为其光路需穿过 样品，这对样品的要求高，且背景大，因而限制了其在生物医学方面的应用。 硕士学位论文 落射式荧光显微镜是单分子成像最直接的方法。其光路原理如图1 2 所示d 4 ， 来自于汞灯的光经激发滤光片照射到双色反射镜( 二向色镜) 后，由于滤镜上镀 膜的性质而反射，当滤镜对光源呈4 5 0 倾斜时，光便垂直射向物镜，经物镜射向 标本，使标本中的荧光物质受到激发，这时物镜直接起聚光器作用。样品所产生 的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，返回到二 向色镜，二向色镜可以使长波长的发射光透过，从而使激发光和荧光分开，残余 激发光再被截止滤片吸收。如换用不同的激发滤片二向色镜截止滤片的组合 插块，可满足不同荧光分子的需要。这种显微镜在配置了e m c c d ( e l e c t r o n m u l t i p l y i n gc h a r g ec o u p l e dd e v i c e ) 或i c c d ( i n t e n s i f i e dc h a r g ec o u p l e dd e v i c e ) 以及恰当的滤光片组，就可以实现单分子水平的成像。由于光源来自被检物体的 上方，故对透明与非透明的被检物体都适用。由于物镜起到了聚光镜的作用，不 仅便于操作，而且从低倍到高倍，可以实现整个视场的均匀照明。然而，当观察 的样品较厚或者样品中有运动幅度较大的分子时，宽场落射式荧光显微镜除了能 很清楚地检测到焦平面上的样品外，焦平面以外层面的样品也能被观察到，但并 不清晰，影响了焦平面样品的检测。所以，宽场落射式荧光显微镜适于观察吸附 在焦平面上的分子或者只在其附近做小幅度运动的分子。 荧先( 蹙】 i 蠹发光线 图1 2 落射式荧光显微镜成像光路图脚l 1 4 2 全内反射荧光显微镜 全内反射荧光显微镜( t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e ， t i i 强m ) 是利用全内反射产生的隐失波激发样品，使激发区域限定在样品表面几 百纳米以下的薄层范围内，有效控制了激发体积，因而它具有其它光学成像技术 几种化合物及脂质体包裹对量子点光学性质的影响 无法比拟的高对比度和信噪比。而且它对生物样本的损伤小，可以进行活体物质 的研究和单分子的动态研究。 当一束光从玻璃( 折射率n 1 ) 传播进入水溶液( 折射率h e ) 时，入射光在 界面上会同时发生折射和反射，入射角0 l 和折射角0 2 之间的关系服从s n e l l 定律： n l s i n o r - - n 2 s i n 0 2 ( 1 1 ) 当入射角大于临界角e 。( 0 。= a r c s i n ( n l n 2 ) ) 时，光线会在玻璃界面上完全反射而 不进入水溶液，即发生全内反射，如图1 3 所示。然而，此时仍有少部分光能量 会穿过界面渗透到水溶液沿着界面传播，这部分电磁场称为“隐失场 ( 或称“隐 失波 ) 。隐失波能激发界面附近的荧光分子，而产生全内反射荧光。隐失波频 率与入射光的频率相同，其强度i ( z ) ( 单位时间和单位面积的能量) 随离开界面的 垂直距离z 呈指数衰减。其公式为 i ( z ) = i ( o ) e x p ( 一z d ) ( 1 2 ) 式中，z 为距界面处距离，i ( o ) 为界面处入射光强度，d 为入射光减弱为原来的 1 e 时所通过的距离。激发深度d 的表达式为 d = l 。再耳面而司 ( 1 3 ) 式中，n l 和1 1 2 分别为光疏介质与光密介质的折射率，为入射光波长。 ：折射 l 吵n ： 一一图1 3 全内发射示意图 全内反射荧光显微镜主要有两种类型：棱镜型和物镜型( 或无棱镜型) 。棱镜 型全内反射荧光显微镜隐失场的激发深度约为1 0 0 - 2 0 0n l n 。如图1 4 ( a ) 所示【4 5 1 ， 棱镜型全内反射荧光显微镜体系中，入射光通过棱镜进入玻璃水溶液界面，而 在另一侧的显微镜物镜用来收集荧光基团发射的荧光。该系统在实现上比较容易， 它只需要显微镜、棱镜和激光光源，就能够得到高质量成像，背景噪音极低，。 但是，该体系的样品放置空间受到棱镜的限制，不利于对活细胞、组织等较厚的 样品进行研究。如图1 4 ( b ) 所示【4 5 l ，物镜型全内反射荧光显微镜用高数值孔径 的物镜作为荧光信号的接受器，同时又可作为发生全内反射的光学器件，其样品 的放置十分方便，并且由于样品远离物镜而可与多种技术联用，例如光镊技术、 纳米操纵、原子力显微镜、扫描探针显微术等，因而它相对于棱镜型全内反射荧 硕士学位论文 光显微镜展现出了更加广阔的应用前景。 b 图1 4 棱镜型a ) 和物镜型b ) 全内反射荧光显微镜成像示意图 4 5 1 全内反射荧光显微术是研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学 最有前途的光学成像技术。如s t e y e r 和a l m e r s 4 5 】利用全内反射荧光显微镜实时 观察了细胞膜1 0 0n l t l 范围内的生命活动。s a k o 4 6 1 等人用全内反射荧光显微镜在 活的a 4 3 1 癌细胞表面观察到了单个c y 3 标记的表皮生长因子( e g f ) 与其受体 ( e g f r ) 的结合。y a o 等【4 7 】利用全内反射荧光显微镜在单分子水平上监测了液 固界面上发夹型分子信标探针d n a 的杂交过程。发夹型d n a 的两个末端分 别标以荧光团和淬灭剂，当遇到互补d n a 时，发夹d n a 变构，颈环打开而与 c d n a 杂交，从而引起荧光信号的变化。他们发现这是一个多步杂交过程。c h a r s 等【4 8 j 将全内反射荧光显微术用于液一固界面的d n a 寡聚核苷酸的吸附和表面扩 散研究。f u n a t s u l 4 9 】等用全内反射荧光显微术观察荧光团标记的单个肌球蛋白分 子，并检测到了单个a t p 的转化反应。x u 和y e u n g 5 0 1 利用隐失场，在亚毫秒级 范围内检测了单分子在自由溶液中的扩散运动。c h a r t 等【5 l 】用全内反射荧光显微 镜单分子计数方法对癌细胞和正常细胞中的m i r n a 进行定量检测。此外它还可 用于研究单个量子点，单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移，聚合物单分子 的构象动力学，胞吞和胞吐过程，以及肌丝的聚合动力学及微丝形态。 1 5 单个量子点的确认原则 要实现单个量子点的成像实验，首先样品的浓度要适中，浓度切不可太大， 量子点之间的距离要在光学成像的分辨率范围内。其次，通过清洗玻片等方法， 确保单个量子点的荧光信号大于背景信号。如何判定视场内观察到的荧光斑是否 是量子点以及是否是单个的量子点，有以下几种方法：( 1 ) 看强度，通常量子点 的荧光强度很高，其亮度明显高于背景信号甚至荧光染料。有研究发现单个量子 点的荧光强度是罗丹明6 g 的至少2 0 倍【1 9 1 。( 2 ) 更换滤光块