（发酵工程专业论文）酵母发酵生产维生素Dlt2gt的研究.pdf

摘要 维生素d 2 是麦角固醇经紫外线照射转变来的，麦角固醇存在于真菌的细 胞膜中，本文对酵母发酵产麦角固醇作了详细研究，探讨了麦角固醇光化学合 成维生素d 2 的两种转化工艺。 本文首先对定量分析麦角固醇的方法进行了研究，比较分析了紫外分光光 度法、乙酸酐显色法、高效液相色谱法在选育麦角固醇高产菌株方面的优劣， 确定h p l c 检测麦角固醇含量的各项参数：色谱柱s h i m p a c kc l c s i l ，流动相 ( 、，v ) ，甲醇：水= 9 7 ：3 ，流速1 5 m l m i n ，进样量1 0ul ，紫外检测波长2 8 2 m n 。 虽然高效液相色谱法结果准确，但是结合实验室条件确定紫外分光光度法为麦 角固醇的测定方法。 在“皂化一萃取一紫外检测”法中，对于1 0 m l 发酵液( 约含生物量0 1 9 左右) 最佳的皂化及测定条件是k o h 3 0 ( w v ) ，无水乙醇4 0 ( v v ) ，5 0 m l 乙醚作萃取溶剂，最佳萃取时间为1 0 r a i n ，在2 8 2 n m 处测紫外吸收值。 从l o 个不同种属的酵母菌中。筛选得到一株麦角固醇含量和生物量都较 高的菌株酿酒酵母q y w - 2 ( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e q y w - 2 ) ，该菌株培养 1 4 h 左右即结束菌体生长的指数期，碳源利用较广，如蔗糖、葡萄糖等都可作 为适宜的碳源；在氮源方面，以有机氮源为最佳，其中蛋白胨作氮源时麦角固 醇产量最高。 运用单因素实验和正交实验法优化出适合工业生产的发酵培养基组成，酿 酒酵母q y w - 2 发酵产麦角固醇的最佳培养基为( l ) ：糖蜜1 8 0 m l ，玉米浆 1 0 0 m l ，( n h 4 ) 2 s 0 45 9 ，m g s 0 4o 1 9 ，k 2 h p 0 4o 8 9 ，m g s 0 4 对菌种产麦角固醇 及菌体生长有显著的促进作用；少量添加的z n s 0 4 7 h 2 0 有利于菌体生长， 但对产麦角固醇有一定的抑制作用，f e s 0 4 7 t - 1 2 0 、c u s 0 4 5 h 2 0 不利于酿 酒酵母q y w - 2 产麦角固醇。 酿酒酵母q y w - 2 在最佳种子培养基中培养1 4 h ，按l o ( v v ) 接种量接种 于最佳发酵培养基中，最适发酵温度3 0 。c ，摇床转速2 0 0 r m i n 。发酵最适起 始p h 5 5 ，最佳发酵周期3 6 h ，在较佳培养基及培养条件下，酿酒酵母q y w - 2 麦角固醇含量达到3 1 9 ，生物量达到1 4 4 l ，发酵液麦角固醇产量可达 4 6 0 m g l 。 麦角固醇溶液转化成维生素d 2 的最佳光照时间为2 5 r a i n ，高效液相色谱 测定维生素d 2 的条件为色谱柱v p o d s ，流动 h ( v v ) ，甲醇：乙腈= 1 ：l ，流 速1 0 m l m i n ，进样量2 0ul ，紫外检测波长2 6 5 n m 。 发酵培养后的酵母菌体直接在紫外灯下照射，麦角固醇可转变成维生素 d 2 ，此种酵母作为提供维生素d 2 来源的饲料添加剂，比先提取麦角固醇再照 射转变成维生素d 2 的方法省时、省力、更方便。 关键词：麦角固醇酵母发酵高效液相色谱皂化维生素d 2 光化学合成 a b s t r a c t v i t a m i nd 2i st r a n s f o r m e db ye r g o s t e r o lt h r o u 曲u l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ，, a n d e r g o s t e r o l i sam a j o rm e m b r a n ec o m p o n e n to ff u n g i t h e r e f o r e ，t h ep r o c e s so f e r g o s t e r o lf e r m e n t a t i o na n dt r a n s f o r m a t i o nt e c h n i c st h a te r g o s t e r o lt r a n s f e r e dt o v i t a m i nd 2i sd e e p l yd i s c u s s e di nt h i sp a p e r f i r s t l y , t h e m e t h o do fq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so ne r g o s t e r o lw a ss t u d i e d i n c i d e n t a l l yt h ep a r a m e t e r so fh p l cm e t h o dt od e t e r m i n ee r g o s t e r o lc o n t e n tw e r e s t u d i e d t h eo p e r a t i n gc o n d i t i o n s i n c l u d e d c h r o m a t o g r a p h i cc o l u m ns h i m p a c k c l c - s i l ，m e t h a n o l ：w a t e r ( 9 7 ：3 ，v a sm o b i l ep h a s ew i t haf l o wr a t eo f1 5 m l m i n a n du vd e t e c t i o na t2 8 2 n r n t h ea c c u r a c ya n dp r e c i s i o no ft h em e t h o dw e r ei d e a l b u ti nc o m p a r i s o n 谢t hh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a mm e t h o da n dt i n c t r e a c t i o nw i t ha c e t i c a n h y d r i d e ，m e n s u r a t i o nb y u vs p e c t r o p h o t o m e t e rw a s o p t i m u mf o rt h et e s t t h eb e s tc o n d i t i o n si nt h ep r o c e s so f s a p o n i f i c a t i o n - - e x t r a c t i o n - - u v d e t e c t i o n w e r e3 0 k o h ( w v ) , 4 0 e t h a n o l ( v v ) , 5 0 m la e t h e r ，10 m i no ft h e b e s tt i m eo ne x t r a c t i o na n dt h eo p t i m a lw a v e l e t t g t hw a s2 8 2 u m a s t r a i n ，d e s i g n a t e da ss a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eq y w - 2 ，p r o d u c i n ge r g o s t e r o l a n db i o m a s sw i t hh i 曲y i e l dw a ss u c c e s s f u l l ys e l e c t e df r o m8k i n d so fy e a s ta s p a r e n ts t r a i n t h es t r a i nc o u l du t i l i z ef a r - r a n g i n gc a r b o ns o u r c e s ，f o re x a m p l e s u c r o s e ，g l u c o s ea n dt h es u i t a b l en i t r o g e ns o u r c e sa r eo r g a n i cs u b s t a n c es u c ha s p e p t o n ee t c a tt h es a l n e t i m e ，t h eo p t i m u mm e d i u ma n df e r m e n t a t i o np r o c e s sf o r i n d u s t r i a l i s a t i o no fe r g o s t e r o lb ys a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eq y w - 2w e r es t u d i e di n c o n s i d e r a b l ed e t a i l t h ef o l l o w i n gp a p e rd i s s e r t a t et h e o p t i m a lc o n d i t i o n so fc u l t u r em e d i u m p r e s c r i p t i o n ，a n dt e c h n i c a lp a r a m e t e r so ny e a s tf e r m e n t a t i o nw e r es t u d i e di nt h e 5 0 0 m ls h a k e f l a s k t h eo p t i m a ls e e dw a sc u l t i v a t e di nw o r tm e d i u mf o r1 4 h ，1 0 i n o c u l a t i o n i tw a sa l s of o u n dt h a tt h ea d d i t i o no fm g s 0 4a n dk 2 h p 0 4c o u l d s t i m u l a t et h eg r o w t ho fm y c e l i aa n d e r g o s t e r o lp r o d u c t i o n 1 e nm o l a s s e si s s u b j o i n e dt om e d i u ma c t e da sc a r b o ns o u r c e s ，c o r ns t e e pf i q u o ra sn i t r o g e ns o u r c e a n d 似h 4 - ) 2 s 0 4a sa u x i f i a r yn i t r o g e ns o u r c e z n s 0 4 7 h 2 0c o u l dp r o m o t eg r o w t ho f s t r a i n so f s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a eq y w - 2b u tr e s t r a i n e d e r g o s t e r o l p r o d u c t i o n z n s 0 4 7 h 2 0a n dc u s 0 4 5 h 2 0c o u l dn o to n l yp r o m o t eg r o w t ho f s t r a i n sb u ta l s oe r g o s t e r o lp r o d u c t i o n t h ee f f e c to fo t h e rc o n d i t i o n ss u c ha ss t a r t p hv a l u ea n dc u l t u r et e m p e r a t u r eo ne r g o s t e r o lf e r m e n t a t i o nh a da l s ob e e ns t u d i e d t h e o p t i m a l i n i t i a l p hv a l u e w a s5 5a n dc u l t u r e t e m p e r a t u r ew a s 3 0 r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a lm e d i u ma n dc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e da d o p t i n gt h e o r t h o g o n a ld e s i g nt e s ta s s i s t e db yt h ec o m p u t e rs o f t w a r e ，t h eo p t i m u mc o n s t i t u t e s o fm e d i u mw e r ea s f o l l o w s ( l ) ：m o l a s s e s l 8 0 m l ，c o r ns t e e pl i q u o r1 0 0 m l ， ( n h 4 ) 2 s 0 4 5 9 ，m g s 0 4 0 1 9 ，k 2 h p 0 4 0 8 9 u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，a5 0 0 m l f l a s kc o n t a i n i n gt o o m lm e d i u mw a sc u l t i v a t e da t3 0 。cf o r3 6 hi np h 5 5a n dt h e r o t a t i n gs p e e dw a s2 0 0 r m i n a n dt h ee r g o s t e r o lc o n t e n tr e a c h e d3 1 b a s e do nc e l l d r ys o l i d s i nt h et e s t ，t h eb i o m a s sr e a c h e d1 4 4 9 la n da c c u m u l a t e4 6 0m g l e r g o s t e r 0 1 t h er e s i d u a ls u g a ri nc u l t u r em e d i u ma tt h ee n do ff e r m e n t a t i o nw a s 2 7 9 l i ns h o r t ，i tc o u l dm u l t i p l ya b u n d a n ty e a s tc e l l st oi n c r e a s et h eb i o m a s si nt h e p r o p h a s ea n du r g et o a c c u m u l a t ee r g o s t e r o li n y e a s t si nt h em e t a p h a s ea n d a n a p h a s eo f f e r m e n t a t i o n p h o t o c h e m i s t r yc o n d i t i o n sw e r ea l s od i s c u s s e da n dt h eo p t i m a li l l u m i n a t i o n t i m ew a s2 5m i n t h em e t h o dt h a t d i r e c t l yi r r a d i a t e dy e a s tm y c e l i aw a sm o r e c o n v e n i e n ta n dt i m e - s a v i n ga p p l i e dt of e e da d d i t i v ep r o d u c t i o nc o m p a r e dw i t ht h a t o fv i t a m i nd 2t r a n s f o r m e db ye r g o s t e r o lw h i c hw a se x t r a c t e db ys a p o n i f i c a t i o n t h e p a r a m e t e r s o fh p l cm e t h o dt od e t e r m i n ev i t a m i n d 2c o n t e n tw e r e s t u d i e d t h e o p e r a t i n g c o n d i t i o n si n c l u d e d c h r o m a t o g r a p h i c v p o d s ，m e t h a n o l ：a c e t o n i t r i l e ( 1 ：1 ，v ) a sm o b i l ep h a s ew i maf l o w 1 0 m l m i na n du vd e t e c t i o na t2 6 5 n m c o l u m n r a t eo f k e yw o r d s ：e r g o s t e r o l y e a s t f e r m e n t a t i o nh p l c s a p o n i f i c a t i o n v i t a m i nd 2 p h o t o c h e m i s t r ys y n t h e s i s 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成 果。文中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含 法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学 位申请的论文或成果，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东 轻工业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅 以及申请专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复 印件和电子版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术 论文或成果时，署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 导师签名 塞叁重 日期：2 0 。年石月2 2 - m 曰期：竺! 年乒 一2 2 - m 山东轻工业学院硕士学位论文 第一章绪论 维生素是维持机体正常代谢机能的一类小分子有机化合物，通常根据它 们的溶解性质分为脂溶性和水溶性两大类【l 】，它们在体内不能合成，大多需 从外界摄取。 因为维生素的化学结构各不相同，所以它们的生产方法也很多样，维生 素的生产方法有化学合成法、生物提取法以及近年来发展起来的微生物发酵 法。在工业上维生素d 开始是通过化学合成法获得的，但化学法工艺繁琐、 成本较高，微生物发酵法是目前和今后维生素d 生产的主要方法。发酵法是 用人工培养微生物的方法生产维生素，包括菌种培养、发酵、提取、纯化等。 发酵生产维生素d 2 一般是发酵培养真菌，然后提取真菌细胞膜内的麦角固 醇，麦角固醇再经紫外线照射转化成维生素d 2 。 维生素d 主要以维生素d 2 ( 麦角钙化醇) 与维生素d 3 ( 胆钙化醇) 两种活化 形式存在，两者结构相似，作用相同【2 】。前者由存在于植物、真菌体内的维 生素d ：的前体一麦角固醇( e r g o s t e r 0 1 ) 经紫外线照射转变而来，后者是由存在动 物体内的维生素d 3 的前体一7 一脱氢胆固醇( 7 一d e h y d r o c h o i e s t e r 0 1 ) 经紫外线照 射后得到的产物【3 】。人体内维生素d 的摄取及代谢见图1 1 ，食品中的维生素 d 含量见表1 1 。 图1 1 维生素d 的摄取及代谢f 4 】 f i g u r e l 1i n g e s t i o na n d m e t a b o l i s mo f v i t a m i nd 第章绪论 1 1 维生素d 的由来、化学结构及性质 1 6 4 5 年惠斯勒( w h i s t l e r ) 首先记述了软骨病。1 8 9 0 年帕尔姆( p a l m l 提出了 软骨病与缺乏阳光照射有关，并在1 9 1 9 年首先讨论了用紫外线治疗软骨病。 1 9 2 2 年麦克勒姆( m e c o l l u m ) 等从脂溶性维生素中分离出维生素d 。1 9 2 4 年， s t e e n b o c k 教授提出紫外线具有促进维生素d 合成的作用。1 9 2 6 年温道斯 ( w i n d a u s ) 用紫外线照射麦角固醇，取得了与维生素d 有同等效果的物质，命 名为维生素d 3 。1 9 3 2 年温道斯首先得到纯维生素d 2 的结晶与光固醇的分子 化合物，把纯维生素的结晶命名为维生素d 2 5 1 。1 9 6 9 年发现维生素d 经代谢 转变为一种控制钙的激素f 6 j 。 维生素d 2 又称抗佝偻病维生素、麦角钙化固醇，是一类由固醇衍生而来 的脂溶性维生素。它的化学名称为9 、1 0 一开环麦角甾5 、7 、1 0 ( 1 9 ) ，2 2 一四烯 3 b 醇，分子式c 2 8 h 4 4 0 ，分子量3 9 6 6 6 。其分子结构式为： 图1 2 维生素d 2 分子结构式 f i g u r e1 2t h es t r u c t u r eo f v i t a m i nd 2 维生素d 2 为无色针状结晶或白色结晶性粉末，无臭、无味，不溶于水， 溶于油脂及脂溶性溶剂，熔点1 1 5 1 1 8 。c ( 分解) 。维生素d 2 的化学性质较稳定， 不易受酸、碱和氧的影响 7 】如在1 3 0 。c 自n 热9 0 分钟，仍能保持活性。但在 酸性溶液中会逐渐分解，所以一般在热加工中不会引起维生素d 2 的损失。但 油脂氧化酸败则可引起维生素d 2 破坏【8 1 。维生素d 2 对紫外线的作用不稳定， 山东轻工业学院硕士学位论文 能够发生不可逆的光化学过程【5 】，在高度真空下能升华而不分解i 9 1 。 维生素d 2 在波长为2 6 5 n m 时，吸光值最大，在波长2 2 8 n m 时吸光值最 小。 1 2 维生素d 2 的应用 1 2 1 维生素d 2 的医学作用 维生素d 2 是一种具有广泛效应的激素载体i lo j ，与人体钙、磷的吸收有关 1 1 , 1 2 ，对细胞的增长、分化和免疫功能具有重要作用，并影响神经、肌肉、 造血、免疫等组织器官功能【l ”。它能作用于小肠黏膜细胞的细胞核，促进运 钙蛋白的生物合成。还可增强小肠黏膜刷状缘c a 2 + a t p 酶的活性，因而能够 加速c a 2 + 的吸收。通过促进小肠对钙、磷的吸收，保持血液和组织液中钙、 磷浓度的恒定 5 , 1 4 , 1 5 。维生素d 2 能促进磷的代谢：一方面能够激发肠道对磷的 运转过程，促进肠壁对磷的主动吸收，维生素d 2 在肠道的转运载体为特异性 磷酸转移蛋白，以磷酸盐的形式结合而转运：另一方面，维生素d 2 还能促进 磷酸盐在肾小管中的重吸收。 此外，维生素d 2 还可刺激存储于骨骼中的钙和磷的再吸收，把已经沉积 在骨骼中的钙和磷动员出来，破坏钙化的骨骼。 维生素d 2 还可维持神经系统稳定，正常的心脏活动和血液凝固，可使组 织柠檬酸的水平增高，增加柠檬酸的排泄量 5 , 1 6 l 。 有文献报道，维生素d 2 缺乏会造成近视。营养专家指出，维生素d 2 可 能对许多疾病有治疗效果，如：膀胱炎、胆固醇高、糖尿病、骨折、软骨病、 佝偻病、癫痫、脑膜炎、白内障、眼疲劳、青光眼、胆结石、发烧、关节炎、 便秘、坐骨神经痛、肝硬化、黄疸、支气管炎、感冒、肺结核、阴道炎、烧 伤、湿疹、衰老、癌症等等 5 , t 2 o 维生素d 2 能刺激种改善情绪的物质一5 h t 的合成【i “。 大剂量维生素d 2 可治疗皮肤结核，皮肤及粘膜各型红斑狼疮，能抑制表 皮过度增生和表皮细胞过度分化，在细胞免疫调节和抗炎症上，也有一定作 用i l g ，删，可用于寻常型银屑病的治疗【1 8 l 。 现已发现，乳腺、肺、卵巢、骨、皮肤、淋巴和造血系统组织的恶性肿 瘤细胞上有维生素d 2 受体，其活性形式1 ，2 5 ( o h h d 3 不仅能抑制这些肿瘤细 胞的增殖，还能诱导它们向正常细胞分化【l ”。研究表明，有规律的适度照晒 阳光，皮肤里被激活的维生素d 2 对预防乳腺癌、结肠癌具有较强的保护作用； 有预防前列腺癌的作用，对黑色素瘤、白血病及淋巴瘤也有保护作用，可使 总体癌症死亡率降低【1 9 , 1 4 , 2 0 ，具有明显的抗癌功效【2 l 】。 第一章绪论 有资料表明，维生素d 2 对于一些血液病的治疗也有较好疗效，可以解除 白血病化疗后的骨髓受抑，缓解白血病性骨疼，治疗急性白血病、骨质增生 异常综合症、骨髓纤维化及4 , j l 骨髓坏死【2 l 等疾病。 维生素d 2 与牙齿的发育和形成也有关，参与了釉质、牙本质的形成和生 物矿化【l ”。牙齿的生长和发育也离不开维生素d 2 ，牙齿的珐琅质和牙质几乎 都是由钙和磷构成的。缺乏维生素d 2 ，导致钙、磷代谢失调，珐琅质和牙质 不能正常发育，不能形成均匀细密的牙齿珐琅保护层，儿童牙齿发育迟滞、 稀疏、珐琅质钙化不良，且有凹陷的裂纹，很容易发生龋齿。因此，对正处 于发育阶段的儿童，保证足量的维生素d 2 的供应是非常重要的。 1 2 2 作为食品添加剂 作为食品添加剂，维生素d 2 广泛用于补钙保健品和饼干、饮料、奶制品 等食品中，以预防维生素d 2 缺乏症。 1 2 3 饲料添加剂 维生素d 2 在饲料添加剂中的使用，美国占其产量的9 0 ，日本占其产量 的6 5 ，而我国仅占1 0 左右1 2 2 j 。作为饲料添加剂，维生索d 2 可明显提高家 禽的产蛋率、孵化率和猪的瘦肉率，增加肉、蛋、奶的营养价值1 23 1 。陈四清 等研究了维生素d 2 对中国对虾生长的影响，各项生物学指标显示，维生素 d 2 是中国对虾生长不可缺少的营养物质，有促进蛋白质消化吸收的作用，投 喂适量的维生素d 2 时，有助于对虾增长体长、增加体重，促进钙、磷在虾体 中的吸收、虾壳中的沉积、虾壳的硬化1 2 4 】。 1 2 4 对于植物的作用 维生素d 2 可刺激某些植物根系的生成，这可能与过氧化物酶活性的变化 有关。将维生素d 2 与植物生长素混合后用于洋蓟离体培养，能导致很高的生 根率( 25 1 。 1 3 维生素d 2 国内外生产概况 目前世界上主要的维生素d 2 生产厂家是巴斯夫制药公司、罗氏制药公 司、曰清化学公司、d a n s c h e m a s 和d u p h a rb v 公司，年总生产能力1 0 0 0 吨左右。发达国家在2 0 世纪7 0 年代就推出了许多维生素d 的强化食品【2 6 1 。 中国从2 0 世纪8 0 年代开始研究酵母发酵生产麦角固醇并建立了维生素d 2 的 生产厂家。但是大部分企业因得率较低、成本高而纷纷转产，目前生产维生 素d 2 的厂家主要有广州第三制药厂、江西赣南制药厂、内江茂市糖厂、山东 东辰集团、上海第六制药厂和东北制药总厂，总生产能力为1 5 0 0 公斤年， 山东轻工业学院硕j j 学位论文 实际产量在5 0 0 公斤年左右，国内使用的维生素d 2 多为进1 ：3 产品。 目前，我国的维生素d 2 生产水平低，得率只有2 0 一2 2 ，与发达国家生 产水平( 得率3 0 - 3 3 ) 相差很大，因此提高麦角固醇的发酵水平，已成为中 国维生素d 2 发展的迫切要求。 1 4 微生物发酵产维生素d 2 的研究进展 麦角固醇在紫外线照射下可转化为维生素d 2 前体，加热异构失去两个氢 原子得到维生素d 2 1 2 7 , 2 8 。麦角固醇主要存在于植物和一些真菌的质膜上 2 9 , 3 0 , 3 1 , 3 2 ，其中以酵母菌的含量最高，一般为细胞干重的0 0 3 4 6 ，但在 少数菌种如酿酒酵母、卡尔斯酵母、卵形酵母中其含量可高达7 1 0 3 3 1 。 所以一般都以酵母作为麦角固醇的生产菌株1 3 。选育高产麦角固醇酵母菌种 是维生素d 2 生产的第一步也是最重要的一步。 国内从二十世纪五六十年代开始研究从酵母中提取麦角固醇，并且最早 工业生产麦角固醇均从药用干酵母粉中提取，但麦角固醇含量仅有 o 4 0 6 ，不能形成工业化生产。国内许多科研学者对选育麦角固醇酵母菌 种进行了大量研究，并同时对优化菌种的发酵条件进行了研究。 1 4 1 自然选育 目前大多数研究者采用常规育种的方法。如先经自然筛选出麦角固醇含量 较高的菌株再通过诱变育种或发酵条件优化来提高其产量。国内外有代表性的 一些高产菌均由这些方法获得。e u g e n e 选育生产麦角固醇的酵母菌，麦角固醇 产量可达细胞干重的2 3 3 5 1 。p r u e s s 等对五个酵母属的1 3 种菌测定麦角固醇含 量，发现除酿酒酵母外，其他四个属的含量均在0 2 一0 3 1 3 5 1 。莫湘筠等测定了 3 3 株酵母菌的麦角固醇含量，其中2 株酿酒酵母的麦角固醇含量高达4 3 3 和 3 3 1 3 6 】。张博润等分析了2 3 1 株不同种、属酵母菌的麦角固醇含量，发现不同种、 属间差异很大，最高可达细胞干重的3 ，最低的只有0 7 【2 8 】。 自然选育是一种简单易行的选育方法，但是它的缺点是效率低、进展慢。 因此，把自然选育和诱变育种等其他育种方法结合使用，可以收到较好效果。 1 4 2 诱变育种法 诱变育种曾在多种生产菌的选育工作中起过重要作用，至今也是一种常 规使用的育种方法。但由于诱变随机性大，麦角固醇高产菌的筛选又无快速、 简便的初筛手段，且麦角固醇含量测定非常耗时。所以诱变育种的菌种选育 工作量非常大。 张沧剥”1 等对啤酒酵母进行了h e n e 激光和紫外线诱变，筛选出一株产 第一章绪论 麦角固醇较高的突变株，其产量为2 3 9 ，比出发菌株提高了3 9 8 。孙启玲 等【3 8 】对y e p - 8 进行紫外诱变，筛选到含麦角固醇3 1 的菌株。 1 4 3 杂交育种法 杂交法局限大，杂交率低，因此利用此法选育麦角固醇高产菌株的报道 很少。莫斯科大学的研究者采用杂交法选育到麦角固醇含量达2 7 的酵母菌 3 5 1 。孙启玲等3 8 1 把含麦角固醇约为2 的单倍体菌株y e p 8 与繁殖率较高的 单倍体菌株y k p 5 进行杂交，得n - 者性状均优良的菌株，麦角固醇含量最 高可达3 2 5 。 1 4 4 原生质体融合法 原生质体对紫外线的敏感性大大强于完整细胞，其d n a 突变的几率也就 可能增强 3 9 1 。基于这个原理，国内外研究者对原生质体融合法作了深入研究。 a v r a m 等1 3 5 】用电融合技术获得酿酒酵母属的种间融合子及种内融合子， 种内融合子的麦角固醇含量比亲株提高1 1 9 ，种间融合子的含量比亲株提高 8 2 ，而且能稳定保持高的麦角固醇含量。 孙启玲等对原生质体诱变育种法进行了探讨，发现经诱变后的原生质体 最初再生时麦角固醇含量比原菌株有所下降，连续恢复几代后，麦角固醇含 量又逐渐恢复到原菌株水平。她们认为：象麦角固醇这类结合在细胞膜上的代 谢产物的育种，不宜采用原生质体育种法。但王敬东等1 4 0 认为由于连续再生 其麦角固醇产量能够恢复，所以原生质体育种法仍适于麦角固醇生产菌的选 育。采用原生质体育种法能够突破杂交法的诸多局限性，成为麦角固醇生产 菌有效的育种方法之一。这还有待进一步深入研究h ”。熊宁波3 9 1 研究了一株 麦角固醇生产菌的原生质体制备和再生条件，并在此基础上进行了原生质体 诱变育种，选育到一株麦角固醇含量和生物量均有显著提高的突变菌株，并 且此菌株具有遗传稳定性，麦角固醇含量从1 6 提高到2 4 ，同出发菌相比， 提高了5 0 。张博润【2 8 】运用原生质体融合法选育到具有双亲株优良性状的两 菌株，其生物量及麦角固醇含量的综合值分别是原始亲株y e 2 2 7 的1 8 倍和 1 7 倍，是y e l 8 0 的1 4 倍和1 3 倍。 1 4 5 离子注入法 低能离子注入技术被广泛的应用于工业微生物的诱变育种，并且取得了 重要进展 4 1 a 2 。 王纪等【4 3 1 通过离子注入诱变筛选到产麦角固醇酵母高产菌，得率较出发 菌提高5 5 6 0 ，达3 5 5 。蒋海波等1 4 4 用1 0 k e v 、剂量为2 6 1 0 ”n + c m 2 _ 8 0 x 1 0 1 4 n + e m 2 氮离子注入产麦角固醇酵母，可产生可遗传的变异，最 6 山东轻丁业学院硕士学位论立 终筛选到的高产菌株麦角固醇含量达3 3 ，得率较出发菌株提高了6 0 ，麦 角固醇产量为2 3 l m g l ，经复筛及传代实验表明高产菌株遗传性能稳定。但 是近几年并没有此方法应用方面的报道。 1 4 6 多种方法综合使用 孙启玲等【38 】采用群体杂交法、完整细胞与原生质体诱变法和诱变与杂交 结合等方法选育高产麦角固醇酵母菌种，实验表明：单倍体诱变与杂交结合的 方法是选育含麦角固醇、遗传性能稳定的酵母菌株的有效方法之一，麦角固 醇含量达4 0 7 ，但菌体量改变不大。 张博润等【4 5 】通过单倍体分离、亚硝基胍诱变、属间原生质体融合技术成 功的构建了高产麦角固醇的优良菌株，麦角固醇含量可达细胞干重的2 7 。 后来张博润等【2 8 】又通过初筛、单倍体分离、诱变及酵母菌种间原生质体融合 技术构建了2 株麦角固醇产量明显提高的优良菌株，并对培养条件进行了优 化，麦角固醇含量达到3 0 7 。经遗传稳定性分析，没有发现标记基因的分 离现象，即获得的融合亲株是遗传稳定的。 1 4 7 代谢调控法筛选高产麦角固醇菌株 s w m o l z a h n 等人根据抗性突变株所带抗性基因的不同，把其分为五类， 分别称p o l l ，p 0 1 2 ，p 0 1 3 ，p 0 1 4 和p 0 1 5 ，不同菌株体内所含固醇物也不尽相同。 如：野生株以含麦角固醇和2 4 ，( 9 8 ) 脱氢麦角固醇为主，但各抗性突变株都不 含2 4 ，( 2 8 ) 脱氢麦角固醇；p 0 1 2 的麦角固醇合成被完全阻断，而停留在其合 成代谢的某一中间步骤，p o l l 则合成一种新的固醇类物质，且能分泌到体外： p 0 1 3 、p 0 1 4 和p 0 1 5 也仅含极微量的麦角固醇【4 ”。这些工作为建立麦角固醇合 成的代谢调控途径提供了一定的线索。另外，还有部分学者通过对不同麦角 固醇缺陷型菌株的研究，总结了麦角固醇的代谢调控途径【4 q ： 2 n a d p h 2，n a d p 。嚣篙饿产耥“灌递竺一嘣礁黼酯 歪；i ；磊产鲨烯羊毛绺醇7 8 酵母甾醇。麦角固醇 3 0 2 3 ( ；0 2 图1 3 麦角固醇的代谢调控途径 f i g u r e l 3t h em e t a b o l i s mp a t ho f e r g o s t e r o l 在麦角固醇合成的代谢途径中，h m g c o a 还原酶是控制麦角固醇合成 的限速酶，其活性受终产物麦角固醇强烈的反馈抑制。如能打断该反馈抑制 路线，麦角固醇合成的抑制作用可得以解除，从而获得高产量的麦角固醇。 应用这一原理，筛选抗固醇结构类似物突变株，可望获得高产麦角固醇菌株 7 第一章绪论 4 0 】。但是到目前为止还没有用代谢调控法筛选麦角固醇高产菌株的相关报道。 1 4 8 通过优化发酵条件进一步提高菌种麦角固醇产量 现代生物化学中的“发酵”主要指微生物的无氧代谢过程，但发酵工业领 域关于发酵的涵义与此很不相同，它是泛指通过微生物及其他生物材料的工 业培养，达到积累发酵产品的种种生产过程，包括厌氧发酵和好氧发酵。微 生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，还要赋予它合适的环 境条件才能使它的生产能力充分表达出来。因此优化发酵条件，控制发酵工 艺是进一步提高麦角固醇产量的重要手段。 ( 1 ) 碳源对麦角固醇合成的影响 毛宁等【4 8 1 采用大米粉作碳、氮源培养红曲霉，和用大米水解糖、葡萄糖、 蔗糖相比，麦角固醇含量最高达1 7 2 。薛冬桦等【3 】采用生长周期短，易于工 业化生产的酵母为实验菌株，以糖厂副产物甜菜糖蜜为主要原料，通过发酵 工程技术细胞内合成麦角固醇，经中波紫外线照射直接转化为维生素d 2 酵 母，在优化的条件下，每克酵母含维生素d 2 1 5 0 0 0 国际单位。李湘萍等【4 9 】利 用价廉易得的甘蔗糖蜜发酵生产麦角固醇，通过控制发酵条件，后期补加蔗 糖消除糖蜜对菌体及麦角固醇合成的抑制，麦角固醇含量提高至2 5 。 许旭萍掣5 0 】比较了蔗糖、葡萄糖、果糖、糖蜜、麦芽糖得出：以糖蜜为碳 源时麦角固醇含量最高，可达1 8 1 ，但生物量为8 1 l ，蔗糖为碳源时生物 量最高，可达1 4 7 l ，麦角固醇含量为1 4 1 ，综合考虑麦角固醇总量最高 的碳源是蔗糖，为2 0 7 3 m l 。王纪等【4 3 】发现不同的碳源得到的菌体量有很 大差异，酵母在麦芽糖作碳源的培养基中生长最好，但麦角固醇的积累较少： 而蔗糖最有利于酵母生产麦角固醇，在不同蔗糖浓度下，细胞生物量及麦角 固醇含量有一定差异，随着糖浓度的提高，生物量有所提高，但与糖的增加 不成比例。 张博润1 2 8 】采用y e p d 培养基配方，碳源分别为食糖、蔗糖及葡萄糖，结 果发现不同碳源对细胞生物量没有明显的影响，但麦角固醇含量差异则较大， 葡萄糖为最佳碳源。不同葡萄糖浓度下，细胞生物量及麦角固醇含量有一定 差异，8 浓度时细胞生物量最高。以后随着糖浓度的提高，细胞生长受到一 定的抑制，而麦角固醇含量则在1 6 糖浓度时最高，在一定程度上与生物量 的降低有关。综合考虑细胞生物量及麦角固醇含量，8 葡萄糖应为最适糖浓 度。而谭天伟等【5 l 】研究认为低浓度蔗糖可使酵母生物量有所增加，但麦角固 醇含量基本不变，而高浓度蔗糖反而使麦角固醇含量下降。张沧桑等【3 e 较 了蔗糖、葡萄糖、乙酸钠、甘蔗废糖蜜、麦芽糖、山梨糖、果糖、乙醇作碳 源后发现蔗糖为最佳碳源，生物量与蔗糖浓度有对应关系，但是糖浓度过高 山东轻工业学院硕士学位论文 对麦角固醇合成有抑制作用，8 为最佳糖浓度。s t a r r 的研究表明，固醇的生 物合成与葡萄糖的浓度成正比1 5 。高浓度的糖蜜可明显地促进酵母生物量的 积累，但是糖浓度过高对麦角固醇合成有抑制作用【5 ”。以糖为碳源的酵母发 酵过程中，残糖浓度应控制在一定范围内。若残糖浓度过高，酵母会将糖转 化为乙醇，从而导致细胞量减小，得率降低，而且乙醇在一定程度上会抑制 菌体生长；若残糖浓度过低，则会影响到微生物对碳源的利用速率，菌体生 长缓慢，降低了设备的生产能力。史新元等【5 4 】认为发酵过程残糖浓度维持在 o 3 0 5 较好。王纪等1 4 3 j 发现糖蜜的初始浓度为4 时，单位浓度糖的麦角 固醇得率最高。可见，对不同的菌种来说，都有其最适的碳源及浓度。 ( 2 ) 氮源对菌体生长及麦角固醇合成的影响 许旭萍等【5 0 】认为黄豆粉利于菌体生长，而蛋白胨利于麦角固醇合成。莫 湘筠等研究发现，酿酒酵母产麦角固醇量随着( n h 4 ) 2 s 0 4 添加量的增加而减 少，而酵母生物量却随着增加。谭天伟等【5 l 】发现，当氮源为n a n 0 3 或牛肉膏 时，酵母菌体中麦角固醇量较高，但生物量较低，而采用蛋白胨或( n h s 0 4 时生物量较大，但麦角固醇量较低，采用复合氮源、选择温度3 0 。c 及p h 5 5 ， 可将酵母产麦角固醇的总量提高3 倍以上。刘海滨等【_ 7 2 l 在研究1 株产麦角固 醇奇异酵母( s a c c h a r o m y c e s p a r a d o x u s ) 时发现n h 4 c l 有利于麦角固醇的合成。 张博润等 2 8 1 研究认为添加( n h 4 ) 2 s 0 4 和尿素以及提高它们的浓度，酿酒酵母细 胞生物量和麦角固醇含量均明显降低，尤其尿素的影响更加突出。张沧烈3 7 】 认为当氮源为n a n 0 3 和牛肉膏时，菌体麦角固醇含量高，但生物量低，说明 这两种氮源对菌体生长不利。而氮源为尿素时，生物量最高，但麦角固醇含 量最低。综合二者结果，以m 1 4 ) 2 s 0 4 为最佳氮源。因此，对不同的菌株而言， 氮源的影响也是不同的。 ( 3 ) 无机盐对菌体生长及麦角固醇合成的影响 无机盐是酵母菌生长必不可少的一类营养物质，培养基中添加无机盐可 促进酵母菌的生长，提高细胞生物量，对麦角固酵的合成也有显著的促进作 用。惠丰立等【2 】从1 2 株产麦角固醇的酵母菌中，筛选出一株麦角固醇产量较 高的酵母菌，当培养基中分别加入2 o 叽的k 2 h p 0 4 、1 5 # l 的m g s 0 4 和 0 0 5 9 l 的f e s 0 4 时，刺激麦角固醇合成作用最强，麦角固醇含量分别增加了 3 9 7 、9 5 和3 5 2 。n a c l 对麦角固醇产量没有太大影响，m g s o 。对麦角 固醇合成有利，c a c 0 3 对麦角固醇合成有抑