膳食纤维含量测定方法.doc

_酶-重量法1.原理：样品分别用-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶进行酶解消化以去除蛋白质和可消化的淀粉。总膳食纤维（TDF）是先酶解，然后用乙醇沉淀，再将沉淀物过滤，将TDF残渣用乙醇和丙酮冲洗，干燥称重。不溶性和可溶性膳食纤维（IDF和SDF）是酶解后将IDF过滤，过滤后的残渣用热水冲洗，经干燥后称重。SDF是将上述滤出液用4倍量的95%乙醇沉淀，然后再过滤，干燥，称重。TDF、IDF和SDF量通过蛋白质、灰分含量进行校正。2.适用范围AOAC991.43本方法适用于各类植物性食物和保健食品。3.仪器3.1烧杯：400或600ml高脚型。3.2过滤用坩埚：玻料滤板，美国试验和材料学会（ASTM）40-60m，Pyrex60ml（CorningNo.36060buchner，或同等的）。如下处理：（1）在灰化炉525灰化过夜。炉温降至130以下取出坩埚。（2）用真空装置移出硅藻土和灰质。（3）室温下用2%清洗溶液浸泡1小时。（4）用水和去离子水冲洗坩埚；然后用15ml丙酮冲洗然后风干。（5）在干燥的坩埚中加0.5g硅藻土，在130烘干恒重。（6）在干燥器中冷却1小时，记录坩埚加硅藻土重量，精确至0.1mg。3.3真空装置：（1）真空泵或抽气机作为控制装置。（2）1L的厚壁抽滤瓶。（3）与抽滤瓶相配套的橡皮圈。3.4振荡水浴箱：（1）自动控温使温度能保持在982。（2）恒温控制在60。3.5天平：分析级，精确至0.1mg。3.6马福炉：温度控制在5255。3.7干燥箱：温度控制在105和1303。3.8干燥器：用二氧化硅或同等的干燥剂。干燥剂两周一次在130烘干过夜。3.9PH计：注意温控，用pH4.0、7.0和10.0缓冲液标化。3.10移液管及套头：容量100l和5ml。3.11分配器或量筒：（1）150.5ml，供分配78%的乙醇，95%的乙醇以及丙酮。（2）400.5ml，供分配缓冲液。3.12.磁力搅拌器和搅拌棒。4.试剂全过程使用去离子水，试剂不加说明均为分析纯试剂4.1乙醇溶液：（1）85%：加895ml95%乙醇在1L量筒中，用水稀释至刻度。（2）78%：加821ml95%乙醇在1L量筒中，用水稀释至刻度。4.2丙酮：4.3供分析用酶：在0-5下储存。（1）热稳定-淀粉酶溶液：Cat.No.A3306，SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO63178，或Termamyl300L，Cat.No.361-6282，Novo-Nordisk，Bagsvaerd，Denmark，或等效的酶。（2）蛋白酶：Cat.No.P3910，SigmaChemicalCo.，或等效的。当天用MES/TRIS缓冲液中现配50mg/ml酶溶液。（3）淀粉葡糖苷酶溶液：Cat.No.AMGA9913，SigmaChemicalCo.，或等效的。4.4硅藻土：酸洗（Celite545AW，No.C8656，SigmaChemicalCo.，或等效的）。4.5洗涤液：两者挑一。（1）铬酸：120g重铬酸钠Na2Cr2O72H2O，1000ml蒸馏水和1600ml浓硫酸。（2）实验室用液体清洁剂，预备急需清洗的（Micro，InternationalProductsCorp.，Trenton，NJ08016，或等效的）。用水配制2%溶液。4.6MES-TRIS缓冲液：0.05mol/L，温度在24时pH值为8.2。（1）MES：2-（N-吗啉代）磺酸基乙烷（No.M-8250，SigmaChemicalCo.或等效的）。（2）TRIS：三羟（羟甲基）氨基甲烷（No.T-1503，SigmaChemicalCo.或等效的）。在1.7L的蒸馏水中溶解19.52gMES和12.2gTRIS，用6mol/LNaOH调pH到8.2，用水定容至2L。（注意：24时的pH为8.2，但是，如果缓冲液温度在20，pH就为8.3，如果温度在28，pH为8.1。为了使温度在20-28之间，需根据温度调整pH值。）4.7盐酸溶液：0.561mol/L，加93.5ml6mol/L盐酸到700ml水中，用水定容至1L。5.操作方法5.1.样品制备：（1）固体样品：如果样品粒度0.5mm，研磨后过0.3-0.5mm（40-60目）筛。（2）高脂肪样品：如果脂肪含量10%，用石油醚去脂。每克样品用25ml，每次提取完静置一会儿再小心将烧杯倾斜，慢慢将石油醚倒出，共洗三次。（3）高碳水化合物样品：如果样品干重含糖50%，用85%乙醇去除糖份，每克样品每次10ml，共洗三次轻轻倒出，然后在40烘箱中不时翻搅干燥过夜，并研磨过0.5mm筛。5.2.样品消化（1）准确称取双份1.0000.005g样品（M1和M2），置于高脚烧杯中。（2）在每个烧杯中加入40mlMES-TRIS缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌直到样品完全分散。（防止团块形成，使受试物与酶能充分接触）。（3）用热稳定的淀粉酶进行酶解处理：加100l热稳定的淀粉酶溶液，低速搅拌。用铝箔片将烧杯盖住，在95-100水浴中反应30分钟。（起始的水浴温度应达到95）。（4）冷却：所有烧杯从水浴中移出，凉至60。打开铝箔盖，用刮勺将烧杯边缘的网状物以及烧杯底部的胶状物刮离，以使样品能够完全的酶解。用10ml蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。（5）用蛋白酶进行酶解处理：在每个烧杯中各加入100l蛋白酶溶液。用铝箔盖住，在60持续摇动反应30分钟（开始时的水浴温度应达60），使之充分反应。（6）pH值测定：30分钟后，打开铝箔盖，搅拌中加入5ml0.561mol/LHCL至烧杯中。60时用1mol/LNaOH溶液或1mol/LHCL溶液调最终pH为4.0-4.7。（注意：当溶液为60时检测和调整pH，因为在较低温度时pH会偏高。）（7）用淀粉葡糖苷酶溶液酶解处理：搅拌同时加100l淀粉葡糖苷酶溶液。用铝箔盖住，在60持续振摇反应30分钟，温度应恒定在60。5.3测定5.3.1.总的膳食纤维测定（1）用乙醇沉淀膳食纤维：在每份样品中，加入预热至60的95%乙醇225ml，乙醇与样品的体积比为41。室温下沉淀1小时。（2）过滤装置：用15ml78%乙醇将硅藻土湿润和重新分布在已称重的坩埚中。用适度的抽力把坩埚中的硅藻土吸到玻板上。（3）酶解过滤，用78%乙醇和刮勺转移所有内容物微粒到坩埚中。（注意：如果一些样品形成胶质，用刮勺破坏表面，以加速过滤。）（4）抽真空，分别用15ml的78%乙醇，95%乙醇和丙酮冲洗残渣各2次，将坩埚内的残渣抽干后在105烘干过夜。将坩埚置干燥器中冷却至室温。坩埚重量，包括膳食纤维残渣和硅藻土，精确称至0.1mg。减去坩埚和硅藻土的干重，计算残渣重。（5）蛋白质和灰分的测定:取成对的样品中的一份测定蛋白质，用本书前述或GB-960.52方法测定。用（N6.25作为蛋白质的转换系数）。分析灰分时用平行样的第二份在525灼烧5小时，在干燥器中冷却，精确称至0.1mg，减去坩埚和硅藻土的重量，即为灰分重量。5.3.2.不溶性膳食纤维测定：（1）称适量样品按5.2进行酶解，过滤前用3ml水湿润和重新分布硅藻土在预先处理好的坩埚上，保持抽气使坩埚中的硅藻土抽成均匀的一层。（2）过滤并冲洗烧杯，用10ml70水洗残渣2次，然后再过滤并用水洗，转移到600ml高脚烧杯，保留用以测定可溶性膳食纤维，按5.3.3。（3）用抽滤装置，分别用15ml78%乙醇，95%乙醇和丙酮各冲洗残渣2次。（注意：应及时用78%乙醇、95%乙醇和丙酮冲洗残渣否则可造成不溶性膳食纤维数值的增大。）（4）按5.3.1.5用双份样品测定蛋白质和灰分。5.3.3.可溶性膳食纤维测定：（1）将不溶性膳食纤维过滤后的滤液收集到600ml高脚烧杯中，对比烧杯和滤过液，估计容积。（2）加约滤出液4倍量已预热至60的95%乙醇。或者将滤液和洗过残渣的蒸馏水的混合液调至80g，再加入预热至60的95%乙醇320ml。（3）室温下沉淀1小时。下面按5.3.1测定总膳食纤维，