（农产品加工及贮藏工程专业论文）纸片法检测饮料中菌落总数的研究.pdf

西南农业火学x : 00四届硕士学位论文中 文摘 夏 中 文 摘 要 本论文对检测纸片的显色体系， 营养 液配方， 制作: c 艺进行了 优化: 分析了n a c l ， 琼脂， 乳化剂对纸片质量的影响:将纸片法用于饮料类食品的检测作了研究，以国标法 ( 平板计数 法， p c a ) 作对照， 确定了纸片法的精确皮和检测时间，分 析了纸片法与国标法的符合率， 实 验结果表明: l t t c对大肠菌，乳酸菌， 醋酸菌三 种试验菌株的生长均有影响，浓度 在 0 . 0 0 4 % 时显色 情况最好，生成的红色菌落数目 最多; 浓度在 。 . 0 0 4 01 0 以下生成的菌落不能充分显色，高于 0 . 0 0 5 %时细 菌生长则受到抑制. 将贴有0 .0 0 4 / 0 ttc纸片的平板与未加t t c 平板作对照时， 结 果 显示 两 方 法 差 异无 显 著 性 ( 1 = 0 . 3 5 5 8 , p 0 .0 5 ) ， 因 此， 确 定ttc 显 色 剂使 用 浓度 为0 . 0 0 4 01 0 , 2 .根据二次最优饱和设计 3 -4 1 6 - a 0 , 设计营养液优化试验方案， 第8 号与第 1 0 号试验结 果最优;由回归 方程计算得知，当蛋白陈，醉母膏，萄萄糖， 磷酸氢二钾编码值为 ( 1 . 0 .9 . 1 , 0 . 6 5 ) 时 预测值最大， 对应配方与 第8 号和第1 0 号试验配方比 较接近. 经二次优化试验表 明 。 差 异 不 显 著 ( p 0 . 0 5 ) 。 确定 每1 0 0 m l 营 养 液中 加 入 蛋白 陈， 酵 母 膏， 葡 萄 糖， 磷 酸氢 二 钾 分别为2 . 5 9 8 , 1 .0 5 g , 0 . 2 3 9 g , 0 2 5 g . 3 对灭菌时间的 研究表明， 1 1 6 c / 2 0 m i n 和 1 2 1 0 c / l 5 m i n 培养基都可达到无菌状态. 但1 2 1 c 1 1 5 m i n 灭菌条件下菌悬液接种后比1 1 6 c / 2 0 m i n 生长较好，确定1 2 1 c/ 1 5 m i n的灭菌条件， 4 . 经l y ( 3 ) 1l交试验， 纸片的浸演温度， 浸渍时间， 洪烤温度， 烘烤时间对纸片质量都有 较大的影响。实验结果表明， 当 浸溃温度7 0 1 c , 浸渍时间2 m i n , 烘烤温度 5 5 c , 烘烤时间1 h 时 纸片得分最高。 5 . 对培养基中氯化钠( n a c l ) 的使用量进行了 研究，实验结果表明，每 1 0 0 m l营养液中加 入0 . 4 5 g n a c i 时 细菌生长 呈现最好态势。 6 . 琼脂对纸片质量也 有较大影响， 当浓度大于0 . 1 % 时， 随着琼脂用量增加， 纸片得分逐渐 下 降，而且细菌生长 速度也逐渐减慢:当浓度低于 0 . 1 % 时，细菌生长虽不会受到抑制，但纸 片得分偏低。确定每 1 0 0 m l 营养液中加 入0 . 1 g 琼脂。 7营养液中加入乳化剂后纸片质量 有所提高， 单甘酷， 蔗糖酷， s p a n - 4 0 对纸片质星均有 不同程度的影响，当浓度大于 0 . 1 5 m g / m l时，浓度增加对纸片质景不会造成明显的影响:使 用0 . 1 5 m g / m l s p a n - 4 0 纸片得分最高， 细菌生长 也不会受到影响。 8 . 对 纸片检测特性的 研究表明， ( d 当 培养时间大于1 5 h , 菌落数目增加不明显， 与国标 法培养 2 4 h 的结果差异不显著( p 0 . 0 5 ) ;( 2 ) 对混合菌悬液和三类饮料作 1 0次重复试验，变 异系数在0 . 9 %4 . 7 1 4 % 之间， 表明纸片法具有较高的精确度;( 3 ) 以国 标法作对照， 对 3 6 3 份 饮料样品 作了 检查， 纸片法合格3 1 6 份， 合格率8 7 . 0 5 % ， 国标法合格3 2 1 份， 合格率8 8 . 4 2 % ; 两法均合格3 0 2 份，均不合格4 6 份.符合率为9 5 . 8 7 % . 两者检出的绝对菌落数比国标法: 纸 片法为1 : 0 . 9 3 4 2 ; ( 4 ) 检测纸片用于方便面酱包， 菜包， 粉包等食品的检测， 与国标法比 较获 西南农业大学-0 0四 届硕士学位论文中x摘要 旦 旦 旦旦 旦 旦巴 旦 巴里 巴里 巴 口口 里 里粤 里 粤里 口 只口 巨旦 旦 巴. 组 里里 旦 旦旦 巨升旦 旦 旦 旦 旦 旦 旦 旦 旦旦坦 口 . 口 -. . . -. . -. . . - 得的菌落数比直为1 : 0 . 7 5 7 6 - 1 : 0 . 9 1 之间， 两者具有不同程度的差异; ( 5 ) 纸片保质期久1 8 0 大 。 9 . 经粗略 计算， 纸片 法和国标法作一次饮料菌 落总数检测， 成本分别为 1 2 . 6元和 1 8 . 3 元人民币， 纸片法比国标法经济。 关键词:纸片 菌落总数 饮料 西南农业大学二00四届硕士学位论文ab s t r a c t s t u d y o n p e t r if i l ms f o r d e t e c t i o n o f t o t a l c o l o n i e s i n b e v e r a g e s li ti e n i u c o l l e g e o f f o o d s c i e n c e , s o u t h w e s t a g r i c u l t u r a l u n i v e r s i t y , c h o u g g i n g , c h i n a a b s t r a c t t h e c h a n g i n g c o lo u r s y s t e m . c u lt u r e m e d i u m f o r m u la a n d m a k i n g t e c h n o l o g y o f t e s t p a p e r w e r e o p t i m i z e d i n t h i s p a p e r , e f f e c t o f n s c r i l l i 等m 报 道了 用a r t e k 9 . 3 0 5 计 数器 计 数 牛 奶 培 养 后的细菌，当计数直径大于0 . 7 。 的 菌落时有较满愈的准确度 ( 与肉 眼计数相比) ，每小时可 计 数2 4 0 个 平 皿。 在 国内 ， 杨 玉 琴 等 l e i报 道了自 动菌 落 计 数 软件 的 研 究. 用不 同 菌 悬 液 进 行 了 活菌计数实验，采取平板涂抹接种且菌落数3 0 0 ，用软件程序自 动计数的 结果与肉 眼计数相 差 7 4 . 7 6 % 时，用 两种计数法计算的结果基本一 致，小于该杀灭率时两者 也相近;该自 动计数法受不同 微生物菌 落形态、大小的影响不明显，但受琼脂倾注法接种的 影响，该程序仅适用于平板涂抹法接种 所长出的菌落。目 前关于菌落计数器的 研究报道比 较 少。 1 . 2 . 2放射测量法 放射测量法 ( r a d i o m e t r i c m e t h o d , r m )的工作原理是根据细菌生长繁殖过程中可利用 培养基中 加 标记的碳水化合物或盐类的 底物代谢产生 c a , 然后通过仪器 测量 c o z 含量 增 加与否，来确定标本中有无细菌存在以 及细菌含量的多少。放射测量法需要有测量 c o , 气体 放射性的仪器，最常 用的有闪 烁计数法和电 离室法. 在微生物学早期研究中所采用的 放射测量法多为闪烁计数器测 量法。其具体程序是浸有 b a ( o h : ) 和氨基乙醇或n or 的混合液 ( 按1 : 2比 例溶于乙醇内) 滤纸板吸收 c a , 后，7 n 入 闪烁液仁 2 份 0 . 5 % 2 , 5 一 二烯氧氮戊环 ( p p o ) 和0 . 0 0 5 % -1 , 4 双 ( 5 一 苯基一 呢哇基- 2 ) 苯 ( p o p o p ) 甲 苯溶液 和 1 份 t r i t o n - 1 0 0 ) ，在液体闪 烁器中测量放射性。电离室测量法是通过测量 射线 电离作用所产生的电 离电流来间 接测定 细菌的含量，它是由一个密闭的气体 室、两个电 极和 一个很薄的云母窗组成，在一 个灵敏 度极高的振簧静电器或电 流计的作用 卜 ，便可连续测出 被引进电离室内放射性气体的电 离电 流，通过电 流的强弱则可测量出 细菌含 量的多少。 在细菌诊检工作中首先应用放射测量法的要数l e v i n ( 1 9 5 9 ) . r m 用于检测食物中 细菌 的 偿试， 始于p r e v i t e ， 他把鼠 伤寒杆菌 和金 黄色葡萄球菌接种于含0 . 0 1 3 9 微居里 c - 葡萄 搪 / 毫升 t s b 培养基中，每毫升肉汤含1 0 - 1 了个细菌时， 其检出 时间为 1 0 - 3 小时，实验表明 ， t l-r 2k中wmr增加 1 0 倍.r m 枪出 时间可缩短1 - 2 小时。r o w l e v 等， 报道用b a c t e c 3 0 1 型 仪 西南农业大学- 0 c 四届硕士学位论文文献综述 . . .曰 口.日 . . . . . . .曰. . . . . . . 鱼 鱼口 皿国 皿 里旦 口口 . 皿. 国口 . 口里 口. 门 . . .口 . . 口. . 口. . 口恤 皿 里. 鱼鱼 鱼 鱼 鱼 鱼旦 鱼 旦 器检查熟食 ( 包括油煎鸡、熟肉 包、各式牛排、烤猪肉、羊肉 等)中的细菌含量， 7 3 % 的样本 可在6 - 7 小时内获得结果， 2 7 % 的 可凝标本则需用常规法作进一步检查， w e i n s t a i n : 用b a c t e c 放射检测仪对 3 3 2 份食物标本中 的细菌总 数进行了 检测，当食品 细菌含量 0 .0 匀 。 许 欣 等 143)报 道 利 用 微 菌 落 技 术 建 立 了 一 种 对 细 菌 进 行 快 速 定 童 测 定 的 方 法 ， 其 基 本 方法为将待渊标本定量接种于醋酸纤维素薄膜上， 经 3 7 5h 培养。 染色后对标本区的 微 菌落作显微镜计数， 用本法与平板计数法同时对大肠杆菌和金 黄色葡萄球菌悬液进行 测定， 得到很好的相关性， 对7 2 份 尿液标本铡定结果作统计学分析， 二者差别无显著性。 2 0 0 1 年 许 欣s s 又 对2 3 份 矿 泉水 样品 作 了 检 测 ， 结 果与 国 标 法比 较 无 显 著 差 异( p a . 0 5 ) e 杨国 武 等 14 5 1 用聚碳酸微孔滤膜 ( 孔径 0 . 0 3 ) . 微菌落技术由于采用大面 积加样和显微因子的计数计算方式， 使得该方法的最低检出限 局限于 1 晚 f u l m l以上，在培养后需对菌落染色， 镜检， 操作繁琐，限制了该技术的推) 一 应用。 2 . 8纸片法 西南农业大学二0 0四届硕士学位论文 文 献 综 述 细菌总数检测纸片法 ( p e t r i f i l m m e t h o d , p f )是指以灭菌滤纸，纤维膜，胶膜等吸收 培养基作为载体，细菌通过附着 在纸片纤维上固定并生长繁殖来测定食品中微生物的方法， 其主 要特点是操作简便、实用、经济、 省去了 大部分用于培养基制备，仪器清洗， 灭菌所需 的 时 间 ， 人力 和 物 力. 1 9 8 6 年 i n n 等【. ， 就用p e t r i f i l m r s n 对 牛 奶进 行 检 侧， s u h r e n ， 用 纸片法和标准平板计数法对牛奶进行检侧， 结 果表明 两者具有很高的相关系数( r - 0 . 9 7 - 0 . 9 9 ) : 姚 景 妞 等 u 用 纸 片 法和国 标 法 作了1 3 8 份肉 与 肉 制品 、 乳 与乳 制品 、 液 体 及固 体 饮 料、 糕 点 、 饼干、面包、调味品、冷荤、豆制品的 菌落计数对比试验， 结果呈现良 好的相关性( p 0 . 0 5 ) h e d d e g h e n 等1 9 1用 美国3 1 1 公 司 纸 片 对 鲜 奶进 行 检测 ， 其重 复 性 较 好。 近 年 来， 美 国3 y 公 司 的 纸 片 作 了 很 大的 改 进， 并 且已 经 上 市， 在样品 接种 后4 8 h 可报 告 准 确结 果. 唐 漪炎 b 报 道， 采用7 3 y 公司p e r t i f i l 。 细菌总 数月定纸片 ( p e t r i f i l m a e r o b i c p l a t e s )， 对消毒奶、 酸 奶、乳酸饮品、黄油、冰淇淋、 脱脂奶粉、奶酪、布丁、 生奶 等十余种奶制品进行检侧4 8 1 3 h 报告结果，经统计表明，两法无显著差别， p f 法检出率较g b 法高。 马 武等 1 i ， 报 道了自 行 研 制的 细 菌 总 数检侧 纸片 在 饮料 检 脸 中 的 应用， 该纸 片 是以 微孔 滤 膜 ( 孔径0 .4 5 微米，直径4 7 毫 米) 祖盖在干操营养垫 上， 再将样品 液加在沈膜上， 营养物质 通过滤膜徽孔的渗透作用供给膜上的细菌生长，形成可见的菌落， 作为计数依据。他们检验 了以 可乐为主的 1 ”件样品， 经3 6 1 i ic 1 8 - 2 4 h 培养后进行菌落计数， 与标准方法相比， 符合 率为9 3 .4 6 % ; 张 湘 等 1 5 2 ，报 道了 用 杭州 新 华造 纸 厂生 产 的 增 强1 1 型 纤 维 纸制 作 检 测胶 膜( 即 检 测纸片)的使用。将纤维体 裁成6 x 4 c m大小， 经6 0 c o 2 0 0 - 2 5 0 r a d 照 射，再浸渍营养液， 制作 胶膜。 应用胶膜法和平板倾注法， 检验省内外1 1 个单位的 食品、水、化妆品等1 0 种2 4 4 5 份 样品的 菌落总数， 经符号秩和统计，p 0 .0 5 ，结果无显著差异。 胡立杰等1 5 -1 1 对测定甜菜食搪 菌落总 数的胶膜法和平皿倾注法进行了 对比. 检验结果表明，胶膜法菌落计数结果低于平皿 倾注法， 但二者计数误差在同一数量级上.样品合格率经 统计学处理，无显著差异( p 0 . 0 5 ) e 卢 秀 琴等 5 4 1 用 纸 片法 对 冷饮 、 水 ， 公 具进 行检 测， 冷 饮 、 水 符 合 率 最 好， 分 别 为 % %、 1 0 0 %，餐具消毒较差为 9 0 ，总符合率为 9 4 %e 目 前研究报道的 纸片法虽然简便、 经济、 但在检测时间上与 p c a法相比无明显优势，仍 需2 4 小时或4 8 小时报告结果。 另外， 我国 广东省微生物研究所开发的检验纸片 可定性分析细 菌总数， 但不能定量分析， 南京三爱实业有限公司也在做菌落总数检测纸片的研究.但日 前还 未见研究成果的报道。纸片法是一种实用性比 较强的方法，有必要进行更深入的研究，最关 键的是对纸片培 养基系统的研究，尽量缩短检测时间，以 满足 现代化快速生产的需要。 3发展方向 菌落总数作为卫生检验指标菌的常检项目 之一，不论是生 产厂家还是监督部门， 检测相 当频繁。在使用国标法时， 检测程序比较烦琐，在倾注平板时受 温度影响较大，影响了 检侧 结果。随着经济的发展， 人们生活水平的提高，对食品卫生质量的要求越来越高，现行的 法 西南农业大学二o o四届硕士学位论文文p .( 综述 互巴 目日 斌 巨巴旦旦吧口里里里皿砚 定检测方法 ( pca )不能满足对食品卫生质量日 益严格控制的 要求， 也不能满足日 益加长的商 业贸易需求。因此，发展快退、 简便、 经济的 检甜方法势在必行， 最主要的是缩短检侧 乳 酸菌仕 a c t o b s c i l u s ) i 醋酸菌( a c e t o b a c t e r ) ，由重庆铁路卫生防疫站提供。 供试 样品:生活饮用水， 采自 实验室和学生宿舍:汽水、 冷饮( 包括雪糕和冰淇锵) : 矿 泉 水、纯净水、茶饮料、 可乐等采自 学校超市，重百商店以 及街道集市摊贩处，部分样品采 自 重庆顶 益食品有限公司。 试荆: 酵母膏、牛肉青， 北京奥博星生物技术有限公司 琼脂，上海化学试剂采购供应站试剂厂 胰蛋白 膝，日 本制药 株式会社 t t c . k 2 h p o 4 。中国 医药 ( 集团) _ f 海化学试剂公司 单曹酷、蔗糖酪、 s p a n - 4 0 ，上海化学试剂采购供应站试剂厂 nacl,重庆北陪化学试剂厂 表2 各类 饮料中主 要的细南种类 t a b l e 2 t h e k i n d s o f b a c t e r i a i n d i f f e r e n t b e v e r a g e s 一州.一加. ， ， ， ， ， ， ，山 . 饮料类别主要残留细菌 果蔬汁饮料乳酸菌、醋酸菌、枯草芽袍杆菌、马铃薯芽p - 杆菌、凝结芽抱杆菌、 碳玻饮料醋酸菌、乳破菌、肠膜明串珠菌等 茶饮料耐热性芽泡杆菌 饮用矿泉水肠杆菌属、假单饱菌属、微球菌属、不动杆菌等 3 . 2 主要仪器及设备 g 0 1 - - 2 8 0 型手提式高压灭菌锅 c h 8 0 1 型双人净化工作台 k w g s d d l 控温高速多用电动捣碎机 p w 2 0 0 型台式培养箱 j a / f a系列电子天平 数显恒温水浴锅 c s 1 0 1 一 电热鼓风干燥箱 p h- h j 9 0 b笔式酸度计 成都医疗器械厂 天津医疗 净化设备广 江阴市 科研器械厂 上海跃进医疗器械厂 上海精天屯子仪器厂 上海跃进医 疗器 械厂 重庆试剂设备厂 北京仪器厂 西南农业大学二 x】 四届硕士学位论文 材t与方法 o l y m p u s 光学显微镜 c l - 菌落计数器 日本制造 德国制造 3 . 3试验方法 3 . 3 . 1 方法原理 很 据国 际 微 生物 规 格 委员 会“ c m f s ) 的 定 义， 菌 落 总 数 ( t o t a l c o l o n y ) 是 指 在 被 检 样品 的 单 位 重 量( g ) ， 容 积( m l ) 或 表 面 积( c m 2 ) 内 ， 所 含 能 于 某 种 固 体 培 养 荃 上 ， 在 一 定 条 件 下 培 养 后所生 成的 细 菌 集 落的 总 数闭 . 本 研究 通 过 对 细菌 生 物特 性的 分 析， 在 加 富 现 行国 标 法 检 测 菌落 总 数 培 养荃 的 墓 础上， 结 合ttc ( tr i p h e n y l t e tm z o l i u m， 2 . 3 . 5 - 抓 化三 苯 四 氮 哇) 显色剂，将培养基成分移于纸片上，加速细菌生长并使生 成的菌落具有红色特异性标记，从 而达到对菌落总数实现快速侧定的目 的。 3 . 3 . 2菌悬液的制备 将试验菌种接种于营养肉 汤，3 7 1c 培养 2 4 h后，分别 挑取单个菌落适量于无菌生理盐水 混合均匀， 按梯度稀释成 1 0 - - 1 0等不同 稀释度的菌悬液: 制备 1 0 c f u / m l 的菌悬液， 备 中用 3 . 3 . 3部分溶液的制备 t t c 溶液: 称取0 . 5 9 t t c 溶解于1 0 0 m l 蒸馏水中， 制成0 . 5 % t t c 溶液;根据需要， 稀释成 0 . 0 0 1 % - 0 . 0 1 % 等不同浓度的 稀释液，冰箱保存，备用。 1 . 0 % 乳化剂的制备: 称取 1 . 0 g s p a n - 4 0 、单甘 酷、蔗 糖醋分别于 8 0 c 溶解于 1 0 0 m l 蒸馏 水中。备用。 33 . 4菌落总数测定方法 样品采集与处理:按g b - 4 7 8 9 . 1 - 9 4 执行; 清凉饮料检验: 按 g b - 4 7 8 9 . 2 1 - 9 4 执行: 常规测定方法 ( 国 标法) :按g b - 4 7 8 9 . 2 - 9 4 执行12 1 纸片法: 用无菌镊子将纸片夹入无菌平皿中. 用吸管吸取 1 m l 样品液垂直滴于 纸片中心. 使其均匀分布在纸片上， 3 6 11 培养，1 5 小时后计数纸片上的 红色菌落 ( 见附录) 。 3 . 35纸片制作工艺流程图: 见图 滤纸片经一定处理后， 1 2 1 c/ 2 0 m i n 高压灭菌，备用。 各培养基成分8 0 左右溶解 l 西南农业大学二0 0 四届硕士学位论文材丰；与方法 o l y m p u s 光学显微镜日本制造 c l - 菌落计数器德国制造 3 3 试验方法 3 3 1 方法原理 根据国际微生物规格委员会( i c m f s ) 的定义，菌落总数( t o t a lc o l o n y ) 是指在被检样品 的单位重量( g ) ，容积( m l ) 或表面积( c m 2 ) 内，所含筐于某种固体培养基上在一定条件 下培养后所生成的细菌集落的总数1 2 1 本研究通过对细菌生物特性的分析，在加富现行国标 法检测菌落总数培养基的基础上，结合1 r c ( u i p h e n y lt e t r a z o l i t a n 。2 。3 。5 - 氯化三苯四氨唑) 显色剂，将培养基成分移于纸片上。加速细菌生长并使生成的菌落具有红色特异性标记，从 而达到对莹落总数实现快速测定的目的。 3 3 2 菌悬液的镧备 将试验菌种接种于营养肉汤，3 7 培养2 4 h 后，分别挑取单个菌落适量于无菌生理盐水 中，混合均匀，按梯度稀释成1 0 1 - 1 0 1 等不同稀释度的菌悬液；制备1 0 ： c f u m l 的茁悬液，备 用。 3 3 3 部分溶液的制备 兀c 溶液：称取0 5 9 t t c 溶解于1 0 0 m l 蒸馏水中制成0 5 t t c 溶液；根据需要，稀释成 0 0 0 1 - 0 0 1 等不同浓度的稀释液，冰箱保存，备用。 1 o 乳化剂的制备：称取1 o g s p a n - 4 0 、单甘酯、蔗糖酯分别于8 0 c 溶解于l o o m l 蒸馏 水中备用。 3 3 4 菌落总数测定方法 样品采集与处理：按g b - 4 7 8 9 1 9 4 执行； 清凉饮料检验：按g b - 4 7 8 9 2 1 - 9 4 执行： 常规测定方法( 国标法) ：按g b 4 7 8 9 2 9 4 执行【2 】。 纸片法：用无菌镊子将纸片夹入无菌平皿中用吸管吸取i m l 样品液垂直滴于纸片中心 使其均匀分布在纸片上。3 6 4 - l 培养，1 5 小时后计数纸片上的红色菌落( 见附录) 。 3 3 5 纸片制作工艺流程图：见图1 。 滤纸片经一定处理后1 2 1 c 2 0 m i n 高压灭菌，备用。 各培养基成分8 0 c 左右溶解 i 蒸馏承定窖 毒 牦懿r m 2 黻了玳 豢骶灭鏊篱蓬茭釜 3 ，3 6 _ 羚显色试验 茬台翅麓 l 挎釜适当零庶淤潢纸片 籼弋壤黼 密封、冰箱保存，备用 3 3 6 i 霸显琶擞疆 州是一种飘化剂，细菌纲胞内具有脱氢酶j 生缯菌脱氯酶孵作用卜_ ，1 t c 接受氢( h ) 藏为红色两稳定的兰苯甲精 t r i p h e n y lf 打嗽z 彻e 即邗) 搜蕊落整现红色，冀葳趣式j j ! 翻2 ， 蠢鬯的t t c耋i 色而毽定的溢擎甲艟( 不藩于承) 图2 坩c 变色原理 f i g2 强e 筘i i 熬# 醴e 酝聪i 雌c o t r 醴i 帮 3 3 ，6 2 竹显色浓度试验 谯纲菌培养中，1 1 可作为鼹恕荆，细菌- 谯定浓瘦_ 丌c 的蜡葬基中生耐形成构菌落 里魏缎惫。亟弧浓菠过赛对缨菠豹生毒：舂帮髑瓣象。蕹掇递，警培葬薹串戆秘浆囊灸 挠5 妇瞧0 1 对罄本_ 无柿蕴现淼m 鲰5 7 。8 ”。本试验在无髓蒸缓承中分割鸯瓣入朝。使浓 度为o 0 0 1 、0 + 0 0 2 、0 0 0 3 、o 0 0 4 、0 0 0 5 、o 0 0 6 、0 0 0 7 、o 0 0 8 、0 0 0 9 、o o i a ， 西南农业大学二o o 四届硕士学位论文 村# 与方法 浸渍纸片约2 0 秒，取出5 0 烘箱烘干，密封、冰箱保存，备用。墩营养琼脂，制成平扳，待 表面干燥后，在平板上贴上含有不同浓度t t c 的纸片然后分别在纸片上接种l m l l 0 - c f u m l 大肠菌，醋酸菌，乳酸苗及其混合菌悬液和矿泉水样品，3 7 ( 2 培养，2 4 小时后计数纸片上的红 色茵落。 3 3 7 纸片营养液配方的优化试验 在参考有关文献阻”。“明的基础上。确定以蛋白胨酵母膏。葡萄糖磷酸氢二钾为 营养液的主要因子。设定各因子的水平( 见表3 ) 。根据经验以及参考文献”，暂定n a c i 为 o 5 9 。 囊3 量优饱和设计营养液组成成分衰 t a b l e3d e s i g no fc p o s i t i o no fm a c e r a t i n gc u l t u r em e d i ab y 。d _ 4 1 6 _ 因子蛋白胨酵母膏葡萄糖 k 2 h p 0 4 编码x lx 2x 3x 4 含量 l qo 扣i 笱o m 3帆5 依据文献。q 所得饱和设h “4 1 e a ”设计表，制定出试验方案( 见表4 、表5 ) 。具体操作为： 将每一试验处理的配方剖成1 0 0 m l 营养液制作纸片，接种i m l l 0 2 c f u m l 的菌悬液。每个处 理做6 次重复，3 6 - - - - 1 培养2 4 h ，计数各处理的红色苗落。通过计算，求出回归方程并对 预测最优处理的试验号进行拟合度检验。 表4 营养液成分因素水平编码表 t a b l e4t h ev a l u eo fm a c e r a t i n gc u l t u r em e d i a 编码值 实际值 x lx 2x 3 x 4 蛋白胨 酵母膏 葡萄糖麟睃氢- ：二钾 1 6 8 51 6 8 5 1 6 8 5 1 7 8 4 31 2 50 3 0 5 lil0 6 4 42 5 9 1 啪0 2 3 9 0 3 4 9 000m9 。b20 8 2 50 1 50 ，2 5 一1 一l l1 4 9 41 4 1 0 疹0 0 6 1 0 0 2 - 1 6 8 5 - 1 6 8 5- 1 6 8 5 一一 0 0 0 1 o 4 0 2 0 3 3 8 纸片制作工艺参数的研究 3 3 8 1 灭菌时间对营养液的影响：在讨论纸片的工艺参数之前。对营养液的灭菌时间进行单 独讨论。在1 1 6 ，1 5m i n 、1 8m i n 、2 0m i n 、2 2m i n 、2 5m i n 、3 0m i n 、3 5m i n 和1 2 1 c 1 0 r a i n 、1 2m i n 、1 5 m i n 、1 8m i n 、2 0 r a i n 、2 5 m i n 、3 0 m i n 灭菌条件分别对营养液进行灭菌 制成纸片然后接种0 5 m l1 0 2 c f u m l 的混合菌悬液，3 7 培养2 4 小时后观察菌落生长情况。 西南农业大学二0 0四届硕士学位论文材料与方法 浸渍纸片约2 0 秒， 取出5 0 c 烘箱烘干，密封、 冰箱保存， 备用。取营养琼脂， 制成平板， 待 表 面 干 燥后， 在平 板 上贴 上 含有 不同 浓 度t t c 的 纸 片， 然 后 分别 在 纸片 上 接 种 1 m l 1 0 - c f u / ni l 大肠菌， 醋酸菌， 乳酸菌及其 混合菌悬液和矿泉水样品，3 7 c 培养，2 4小时后计数纸片上的红 色菌落。 3 卜 3 . 7纸片 营养液配方的优化试验 在 参 考 有关 文 献 1 5 2 . 6 0 . 6 1 . 6 2 . 6 3 1 的 基 础 上， 确 定以 蛋 白 膝. 酵 母膏， 葡萄 糖， 磷 酸氢 二 钾 为 营养液的主要因子， 设定各因子的水平 ( 见表 3 ) 。根据经验以及参考文献1肠，暂定 n a c ， 为 0 . 5 g . 表 3 最优饱和设计营养液组成成分表 t a b l e 3 d e s i g n o f c o mpo s i t i o n o f m a c e r a t i n g c u l t u r e m e d i a b y d-4 1 6 - a 因子 编 码 蛋白膝醉母*翻萄箱k z h p 0 4 x 4 含$ 1 1 - 3 0 . 4 - 11. 2 7 _- 全匹七一一一卫坠翌竺一一一一 依 据文 献 ik 所 得 饱和 设 律4 1 6 - a ” 设 计 表， 制 定出 试 验 方 案( 见 表4 、 表5 ) e 具 体 操 作 为 : 将 每 一 试验 处 理的 配 方 制 成1 0 0 m l 营 养 液， 制作 纸 片 ， 接种1 m l l 0 2 c f u / m l 的 菌 悬液 . 每个 处 理做6次重复，3 6 士1 c 培养2 4 h ，计数各处理的红色菌落。 通过计算，求出回 归方程. 并对 预测最优处理的试验号进行拟合度检验. 襄 4 曹养液成分因亲水平编码表 t a b l e 4 t h e v a l u e o f m a c e r a t i n g c u l t u r e m e d i a 编码值 x i x 2 x 3 x 4 1 . 6 8 5 1 . 6 8 5 1 . 6 8 5 1 . 7 8 4 1 1 1 0 . 6 4 4 0 0 0 - 0 . 9 0 8 磷酸氢二钾 0 . 3 4 9 0 . 2 5 - 1一 1 - 1 - 1 . 4 9 4 - 1 . 6 8 5 - 1 . 6 8 5 - 1 . 6 8 5一 蛋白陈 3 2 . 5 9 2 1 . 4 1 0 . 0 0 1 实际值 醉母膏葡萄糖 1 . 2 5 0 . 3 1 . 哪0 . 2 3 9 0 . 8 2 5 0 . 1 5 0 . 拼0 . 0 6 1 0 .左0 2 0 0 . 0 2 3 . 3 . 8纸片制作工艺参数的 研究 3 . 3 . 8 . 1灭菌时间对营