（食品科学专业论文）香菇内生甲醛与其特征风味物质代谢之间的相关性研究.pdf

浙江t 商大学硕士学位论文 香菇内生甲醛与其特征风味物质代谢之间的相关性研究 摘要 为阐明香菇的内生甲醛与其特征风味物质代谢之间的相关性，本 研究首先建立了适合鲜香菇样品的内生甲醛含量的h p l c 快速检测 方法。该检测方法改进了香菇样品的前处理过程；即在样品匀浆破碎 后附加了1 0 0 沸水灭酶操作，以消除甲醛代谢相关酶的影响。附加 灭酶的实验表明，甲醛的空白加标回收率为9 7 - - 9 9 ，说明该处理 步骤不显著影响检测结果的准确性。改进方法的检测限为8 9 2 鹇 l 一，精密度为9 5 5 3 ，加标回收率为8 1 5 1 0 3 4 4 。采用该检测 方法，对鲜香菇的菇盖表皮、菇盖盖肉和菇柄进行了分析，对应的甲 醛含量分别为( 3 6 44 - 0 4 8 ) 、( 3 5 04 - o 1 1 ) 、( 1 1 24 - o 2 9 ) m g k g 。此 外，对市售的1 2 种不同品种的食用菌的内生甲醛含量作了调查，结 果为1 8 l 一2 6 8m g k g 。( 鲜香菇) 、3 8 4 5 54 - 7 0 8 6m g k g 。1 ( 干香 菇) ；而在其它批市售食用菌中均未检出甲醛。 本研究还建立了香菇的三种特征的风味物质( 1 ，2 ，4 t r i t h i o l a n e 、 l ，2 ，4 ，5 t e t r a t h i a n e 和l e n t h i o n i n e ) 定性分析和半定量测定方法。所建 立的方法对上述三种风味物质检测的精密度分别为9 4 7 7 、9 1 9 5 和9 0 2 2 ，相对检出限分别为0 0 6 2 、0 0 3 7 和0 0 2 6 ，说明该方法准 确可靠。 采用改进的h p l c 快速检测方法，研究了不同因素对香菇内生甲 浙江工商火学硕十学僦论文 醛产生的影响。( 1 ) 物质方面。在基本营养物质、氨基酸、无机含 硫化合物、信号调控因子相关的化合物以及抗氧化剂五大类、共1 4 种物质及5 种组合中，谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸可显著增加香菇内 生甲醛的产生，v c 则可以显著地减少香菇内生甲醛的产生；而其它 4 种物质和2 种物质组合鞘酸铵、硫酸钠、谷胱甘肽、n o 及半 胱氨酸与谷氨酸的组合，半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸与谷胱甘肽的组 合对香菇内生甲醛的产生的增加作用达极显著水平。( 2 ) 保温处理。 在3 7 下o 一2 。5h 保温处理可极显著地影响香菇内生甲醛的产生寺 另外，在本研究中，以作用最为显著的半胱氨酸和谷氨酸组合和3 7 0 2 5h 保温处理用于探讨香菇内生甲醛与其特征风味物质代谢的相 关性奄 对香菇内生甲醛与其特征风味物质相关性的研究表明：通过半胱 氨酸和谷氨酸的复合添加处理与保温处理，分别得到了香菇甲醛与三 种特征风味物质的线性相关性方程【y - 0 4 1 x + 1 8 ，8 5 、y = 0 0 3 x + 0 6 0 和y = 0 0 9 x + 0 9 5 ( p 0 0l ) 】和相关性系数【0 8 9 9 8 、0 8 8 0 4 和0 9 0 8 2 ( p o 0 1 ) 】。这说明香菇内生甲醛与香菇特征风味物质之间存在着良 好且可靠的相关性。 关键词：香菇，甲醛，特征风味物质，含量，相关性 i i 浙江- t 商大学硕士学位论文 c o r r e l a t i o n sb e t w e e nt h ee n d o q e n o u s f o r m a i ，d e h y d ea n dc h a ra c t e r i s t i c r e i ，a t e d c o n 妒o n e n t si n 乙e 乃w 己毽e d d z ) e s a bs t r a c t t of u r t h e r c l a r i f y t h ec o r r e l a t i o n sb e t w e e nt h e e n d o g e n o u s f o r m a l d e h y d ea n dt h e c h a r a c t e r i s t i c - r e l m e dc o m p o n e n t si nl e n t i n u s e d o d e s ，ar a p i dm o h o do ff o r m a l d e h y d ed e t e r m i n a t i o ni nf r e s hl e n t i n u s e d o d e sb yh p l cw a sd e v e l o p e d ，w i t ht h ei m p r o v e m e n to fs a m p l e p r e p a r a t i o n t or e d u c et h ei n t e r f e r e n c ec a u s e db ye n d o g e n o u se n z y m e s ， t h e s a m p l ew a st r e a t e d f o r5m i ni n b o i l i n gw a t e r , p r i o rt oa h o m o g e n i z a t i o n t h eh i g hr e c o v e r yr a t e ( 9 7 - 9 9 ) i n d i c a t e dt h a tt h e a d d i t i o n a lt r e a t m e n td i dn o ti n f l u e n c et h em e a s u r e m e n to ff o r m a l d e h y d e c o n t e n t f u r t h e r m o r e ，t h ei m p r o v e dm e t h o dw a ss e tu pi nt h i ss t u d y , w i t h t h ed e t e c t i o nl i m i to f8 9 2l a g l ，r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no f4 6 7 a n dt h er e c o v e r yr a t eo f8 1 5 - 10 3 4 4 u s i n gt h ei m p r o v e dm e t h o d ， i n v e s t i g a t i o n si n t of o r m a l d e h y d ec o n t e n tw e r ec o n d u c t e di nl e n t i n u s e d o d e s t h ef o r m a l d e h y d ec o n t e n t sw e r ed e t e r m i n e dt ob e3 6 44 - o 4 8 i i i 浙江t 商大学硕士学位论文 m g k g 1f o rm u s h r o o m h a tc o v e r 3 5 04 - o iim g k 分f o rm u s h r o o m h a ta n dl 。1 24 - 0 2 9m g 。k g f o rm u s h r o o mf o o t ，w h i l et h e yw e r e1 8 1 2 6 8m g 蚝f o rf r e s hl e n t i n u se d o d e sa n d3 8 4 5 54 - 7 0 8 6m g k g - 1 ， f o rd r yl e n t i n u se d o d e si n12s a m p l e sf r o mm a r k e t s h o w e v e r , n o f o r m a l d e h y d ec o n t e n tw a sn o td e c t e c t e d i no t h e rs a m p l e so fe d i b l e m u s h r o o m sf r o mm a r k e t s i nt h i ss t u d y , as e m i q u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o nm e t h o do ft h e c h a r a c t e r i s t i c - r e l a t e dc o m p o n e n t si nl e n t i n u se d o d e sb yg cw a sa l s o d e v e l o p e d t h eq u a l i t a t i v ea n a l y s i so ft h e t h r e ec h a r a c t e r i s t i c r e l a t e d c o m p o u n d s ( 1 , 2 ，4 一t r i t h i o l a n e ，1 , 2 , 4 ，5 一t e t r a t h i a n e a n dl e n t h i o n i n e ) i n l e n t i n u se d o d e sw a sm a d eb yg c m s ，w h i l et h es e m i q u a n t i t a t i v e a n a l y s i sw a sp e r f o r m e db yg c f i d ，w i t ht h er s d so f5 2 3 ，8 0 5 a n d 9 7 8 a n dt h ed e t e c t i o n l i m i t so f0 0 6 2 ，0 0 3 7a n d0 0 2 6f o r 1 , 2 ，4 t r i t h i o l a n e ，1 , 2 a ，5 一t e t r a t h i a n ea n dl e n t h i o n i n e ，r e s p e c t i v e l y u s i n gt h ei m p r o v e dh p l cm e t h o d ，t h ee f f e c t so f v a r i o u sf a c t o r so n f o r m a l d e h y d ec o n t e n ti nl e n t i n u se d o d e sw e r ee x a m i n e d a m o n g14 c o m p o u n d si n5v a r i o u sg r o u p s ( b a s i cn u t r i m e n t ，a m i n oa c i d ，i n o r g a n i c s u b s t a n c e s c o n t a i n i n g s u l f u rg r o u p ，s i g n a l - r e l a t e dc o m p o u n da n d a n t i o x i d a n t ) u s e di nt h i ss t u d y , 3s u b s t a n c e s ，s u c ha sg l u ，g l ya n dc y s ， e x h i b i t e dar e m a r k a b l ei n c r e a s eo nf o r m a l d e h y d ec o n t e n t ，1s u b s t a n c e s ， s u c ha sv ce x h i b i t e dar e m a r k a b l ed e c r e a s eo nf o r m a l d e h y d ec o n t e n t ， w h i l ea n o t h e r4s u b s t a n c e s ，s u c ha sn h 4 n 0 3 ，n a 2 s 0 4 ，g l u t a t h i o n e ，n o ， 浙江工商人学硕士学位论文 a n d2c o m b i n a t i o n s ，s u c ha s ( g l u + c y s ) a n d ( g l u + c y s + g l y + g l u t a t h i o n e ) ， h a dv e r ys i g n i f i c a n te f f e c t s i na d d i t i o n ，v a r i o u si n c u b a t i o nt i m eo ft h e h o m o g e n e o u sl e n t i n u se d o d e sw a se x a m i n e da n di tw a sf o u n dt h a tt h e i n c u b a t i o nd u a t i o no f 旧5he x h i b i t e ds i g n i f i c a n te f f e c t s t h u s ，t h e c o m b i n a t i o no fc y sa n dg l y , a n dt h ei n c u b a t i o nt i m eo fo - 2 5hw e r e u s e dt of u r t h e ri n v e s t i g a t et h ef o l l o w i n gc o r r e l a t i o ns t u d y a p p l i c a t i o no ft h ea d d i t i o n a lc y sa n dg l ya n di n c u b a t i o nt r e a t m e n t s s h o w e dt h a tt h e f o r m a l d e h y d ep r o d u c t i o n i nl e n t i n u se d o d e sh a s s i g n i f i c a n tl i n e rc o r r e l a t i o n sw i t h1 , 2 ，4 - t r i t h i o l a n e ，1 , 2 ，4 ，5 - t e t r a t h i a n e a n dl e n t h i o n i n e ，w i t ht h ee q u a t i o n so fy = 0 4 1 x + 18 8 5 ，y = 0 0 3 x + 0 6 0 a n dy = 0 0 9 x + o 9 5 ，a n drc o e f f i c i e n t so f0 8 9 9 8 ，0 8 8 0 4a n d0 9 0 8 2 ，a t t h e0 01 r i s kl e v e l ，r e s p e c t i v e l y k e y w o r d sl e n t i n u s e d o d e s ， f o r m a l d e h y d e ， c h a r a c t e r i s t i c c o m p o n e n t s ，c o n t e n t ，c o r r e l a t i o n v 浙江工商人学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得浙江工商大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 签名： 醐：冲；月日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文 的规定：浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：j 悼 导师签名： 嗍如移年；月f 日 浙江jf ：商入学硕士学位论文 l 。l 研究的背景和意义 第1 章引言 近年来，随着人民生活水平的不断提高，食品安全问题已日益成为人们r 常 生活中关注的焦点。我隔作为食品生产和消费大国，对食品安全的基础性工作自 然相当重视。不过，近年来不断有报道指出，多种食品含有不同程度甲醛( 金华 丽，刘艳，2 0 0 7 ；鲁敏，昌淑清，2 0 0 7 ：b i a n c h ie ，c a r e r im 。，m u s c im ，或a 1 ， 2 0 0 5 ) 。随着甲醛这一食品安全问题的出现，不但严重地危胁着人民群众的身体 健康，更对我国的食品产业产生了巨大的影响。 食品中含有甲醛已被证明是相当普遍的现象。越来越多的研究结果表明；许 多生物体在其生长发育或死亡过程中会自身代谢产生并积累甲醛，如鱿鱼和香菇 ( 至阳光。李碧清，2 0 0 5 ) 。因此，建立食源性甲醛的形成祝理及其控制研究平 台也就显出其重要的地位。 在上述含有甲醛的有关食品中，香菇作为真菌性食品最有代表性。中国是食 用菌的生产和出口大国，香菇更是中国传统出口的拳头产品。目前，中囡香菇年 产量已超过9 万吨，占全世界香菇总产量的7 8 以上；产品远销欧美和东南亚 1 1 7 个国家和地区，占全球香菇外销市场的9 2 。浙江省是全国食用菌产品的出 口大省，拥有“庆元”香菇等知名晶牌。2 0 0 4 年，浙江食用菌直接出口贸易总额 达4 4 4 8 5 6 万美，其中鲜食用菌出瑟2 1 5 0 。1 6 万美元，干食用菌出墨1 6 6 7 。9 7 万 美元，分居全国的第二和第五位( 省农业厅外经办，2 0 0 5 ) ；但是近几年在也口 过程中，浙江省的香菇产品却因甲醛含量过高等“技术壁垒”和“绿色壁垒”问题 而屡屡受挫。如2 0 0 2 年，日本的食用菌“甲醛事件”( 网本海关要求进口的香菇 产品甲醛含量= 6 3 p p m ) ，使我国的鲜香菇全部停止了出口；仅香菇停止出口后的 近2 周时间，就给浙江省丽水市菇农及有关经营单位造成直接经济损失l 亿元以 上，生产面积从6 9 2 亿袋下降到3 6 亿袋( 顾新伟，2 0 0 4 ) 。因此，迫切需要对 香菇肉生甲醛的科学闽题进行深入研究，骧晰这一现象的内在机理，并找到有效 的控制香菇内生甲醛的方法。 3 浙江：1 ：商人学硕+ 学位论文 1 2 香菇 1 2 。l 菇的生物学特性( 上海农韭科学院食用菌研究所，1 9 9 1 ) 香菇( l e n t i n u se d o d e s ) ，又名香蕈、椎茸、香信、冬菰、厚菇、花菇、栎菌、 板栗菌等，在分类学上属于担子菌亚门( b a s i d i o m yc o t i n a ) 、层菌纲( h y m c n o y c e t e s ) 、无隔担子菌亚纲( h o m o b a s i d i a e ) 、伞菌目( a g a r i c a l e s ) 、1 2 1 蘑科 ( t d c h o l m a t a c e a e ) 、香菇属( l e n t i n u l a ) 中的一种腐生性真菌。 香菇生长分秋、冬、春三季，群生或丛生于麻栎、柞栎、水冬瓜、红椎、山 毛榉、赤杨、枫香等二百多种阔叶树本上，冬季生长的香菇肉厚，品质好。 1 。2 2 香菇的营养价值( 上海农业科学院食用菌研究所，1 9 9 1 ) 具分析，在1 0 0g 干香菇巾含蛋自质1 8 6 4g 、脂肪4 8g 、碳水化合物7 lg 、 热量1 5 5 0l o 、粗纤维9 6g 、灰分5 5g 、硫胺素0 0 7m g 、核黄素1 1 3m g 、尼克 酸1 8 9 m g 。 香菇中含有1 8 种氨基酸，其中7 种是人体必需氨基酸，并含有大量谷氨酸、 赖氨酸和精氨酸。维生素d 含量高达1 2 8 个国际单位，是大豆的2 l 倍，海带的 8 倍。香菇还含有一般蔬菜所缺乏的麦角甾醇。 1 2 3 香菇的药用价值( 上海农业科学院食用菌研究所，1 9 9 1 ) 由于维生素d 是钙质成骨的重要因素，因此长期食溺香菇能增强人的体质 和抗病能力，防治软骨病，尤其是对儿童骨骼的健康发育更为有益。在医药工业 上，香菇可以提取香菇素和香菇多糖等，可降低入的胆固醇，调节身体免疫反应， 刺激抗体的形成和活化巨噬细胞，降低甲基胆葸诱发肿瘤的能力；并在某种程度 上，有抑制癌细胞生长酶作用。 董3 香菇内生甲醛问题的研究进展及存在问题 1 3 1 食品中甲醛的可能来源及其危害 1 3 1 1 甲醛的性质与危害 甲醛分子式为c h 2 0 ，熔点9 2 ( 2 ，沸点1 9 5 c 。在常温下，甲醛是一种无色 且具有刺激性气味的气体。甲醛易溶于水和甲醇中，在水中的溶解度最大可达到 4 浙江： 商人学硕士学位论文 5 5 ；而人们所说的“福尔马林”即为4 0 的甲醛水溶液( 汪小兰，1 9 9 7 ) 。 甲醛有凝固蛋白质作用，从而其有杀菌和防腐的能力。因此，甲醛常在工业上常 被用作清洁剂和防腐荆。然而，科学研究表明：甲醛对人体健康的影响表现在嗅 觉异常、刺激、过敏、肺功能异常、肝功能异常和免疫功能异常等方蘧( 予立群， 何风生，2 0 0 4 ；李纯颖，吴成秋，2 0 0 6 ；杨玉花，袭著革，晁福寰，2 0 0 5 ) 。发 生甲醛急性经口中毒蠢可直接损伤人的霹腔、咽喉、食道和胃黏膜；同时产生中 毒反应，轻者头晕、咳嗽、呕吐、上腹疼痛，重者出现昏迷、休克、肺水肿、肝 肾功能障碍，导致出盘、肾衰竭和呼吸衰弱面死亡。长期接触低浓度甲醛，可爱 起神经系统、免疫系统、呼吸系统和肝脏的损害，出现头昏( 痛) 、乏力、嗜睡、 食欲减退、视力下降等中毒症状( 孙续剩，1 9 9 0 ) 。另井，甲醛已经被世界卫生 组织确定为致癌和致畸物质。由于甲醛具有如此高的毒性，所以在我国有毒化学 品优先控制名单上甲醛高属第二位，并且国家明令禁止在食品孛使焉甲醛。美国 环境保护局给出的建议是：甲醚每日的容许摄入量( a d i ) 为每公斤体重0 2m g 。 1 3 。1 2 食品审甲醛的来源 食品中甲醛的可能来源有以下几种： ( 1 ) 人秀的添加 由于甲醛能起到消毒、防腐和改变食品外观品质的效果：因此，就有部分生 产企业或商贩向食品中非法添加甲醛或警醛次硫酸氢钠以牟取暴穰。如在面粉、 米粉等食品中加入甲醛或甲醛次硫酸氢钠以增加洁白度( 马永华，2 0 0 7 ) ；而在 水产晶中加入甲醛则可以延长保质期，增加持水性，韧性。如陈秉端等人于2 0 0 0 年对市售水发产品及水产品中使用甲醛溶液浸泡情况进行了抽查( 陈秉端，郑加 武，陈宏靖，等，2 湖) ；结采发现水发产品中均检出掌醛，豆含量高达4 2 5 0 m g 1 k 岔1 ，并得出“市场上使用甲醛水溶液浸泡水产品及水发产品的现象相当普 遍。应加强食晶卫生监督和市场管理，保护消费者链康。”另外，还有啤酒生产 过程中使用甲醛现象。甲醛可以作为一种“啤酒助剂”，它不但可以改善啤酒的外 观品质，还可以大大缩短出酒的时闯，因此，过去啤酒生产中会愚到甲醛( 雷德 志，刘军，赵卫红，2 0 0 4 ) 。 ( 2 ) 食品原、辅料污染 一些工厂使用甲醛作为助剂生产树脂、纺织鼎等产品造成外界环境污染，进 5 浙江：l ：商人学硕+ 学位论文 而污染了食品企业在加工过程中所用到的原辅料，使最终产品含有甲醛( 张爱平， 王华，张文国，2 0 0 7 ) 。 ( 3 ) 食品容器污染 在加工过程中某些容器、管道、包装材料等含有微量甲醛，其中劣质包装材 释放出较大量甲醛，污染了食品。张文德等报道国产的三聚氰胺树脂( m f ) 成型 品检出的甲醛含量高达1 1 9 9m g l 1 ，超过国标允许限量( = 3 0m g l 。1 ) 的4 0 倍； 罐头盒及易拉罐中甲醛溶出量为0 2 6 - - 1 8 5m g l - 1 ，超过国标允许量( = o 1m g l - 1 1 的1 6 一1 7 5 倍( 张文德，王绍杰，李信荣，2 0 0 0 ) 。这些材料如果长期与 食品接触，并受酸、碱、盐等物质的腐蚀、加热、老化等因素的影响，导致甲醛 溶出而迁移到食品中去。 ( 4 ) 环境污染 甲醛用于设施、工具消毒( 1 的福尔马林) ，环境改良剂和消毒剂( 3 4 的 福尔马林) 或立体空间熏蒸消毒剂，造成环境不同程度的污染( 贾斌，任红，郭 丽萍，2 0 0 6 ) 。环境中甲醛污染最终造成食品中甲醛的残留。 ( 5 ) 食品j d t 过程中产生甲醛 食品原辅料本身并不含有甲醛，但在加工过程中诸如加热这样的操作也可能 带来甲醛的产生；这是由于食品中本身虽不含有甲醛，但含有一些热不稳定的大 分子化合物，这些化合物在热过程中分解产生一些小分子物质，这些小分子物质 中即可能含有甲醛。1 9 9 3 年，k a m i n s k i 等人即发现：本底不含有甲醛的牛奶， 经水蒸汽蒸馏后测得含有了甲醛及c 2 和c 6 的醛类物质( k a m i n s k ij ，a t w a la s ， m a h a d e v a ns ，1 9 9 3 ) 。 ( 6 ) 动植物“内生 甲醛 一些动物、植物或微生物会自身代谢产生一定量的甲醛，因此，称之为“内 生甲醛”。这其中较有代表性的是部分水产品的自身代谢甲醛现象。早在1 9 6 3 年， a m l h l o 等就在新鲜的鳕鱼中发现有甲醛的存在( a m a n ok ，y a m a d ak ，b i t om ， 1 9 6 3 ) 。r o d r i g u e z 也曾报道在冷冻过程中一些水产品如沙丁鱼、鳕鱼、鱿鱼中含 有甲醛等挥发性物质，而且甲醛最大含量可达4 1m g k g 一( r o d r i g u e z ，1 9 9 7 ) 。 进一步研究表明，这些水产品中内源性的甲醛主要来自于其前体物质一种 水产品风味的来源氧化三甲胺( t m a o ) 。它可以被水产品体内的氧化三 6 浙江：l ：商火学硕士学能论文 甲胺酶( t m a o a s e ) 作用，而降解产生二甲胺和甲醛的( g i l lt a ，p a u l s o na t ， 19 8 2 ：p a r k i n , k l ，h u l t i n ，h 众，19 8 2 ) 。 1 3 2 包括香菇在内的食品中甲醛含量的检测方法的研究现状 1 3 2 1 食品中甲醛含量检测的一般方法 ( 1 ) 分光光度比色法 叠前，诸多食晶中甲醛含量的检测方法中最为常用的方法之一为分光光度比 色法。由于甲醛为无色物质，且在紫外区也没有理想的特征吸收；因此，需要进 行衍生发色。通常用于甲醛捡测的发色裁有两种：乙酰丙酮和变色酸( 化学名为 l ，8 二羟基萘3 ，6 二磺酸) 。 乙酰谢酮在过量铵盐的存在及酸性的环境下，可与甲醛反疯生成一种显黄色 的化合物二乙酰基二氢二甲基吡啶。该化合物在4 1 4 n m 下具有强吸收， 且这种强吸收与该纯合物的浓度在一定范围内存在着对应关系；因此，可以通过 比色定量该黄色化合物的方法来间接地测定甲醛的含量。目前，图家农业部检测 水产品中甲醛含量的方法之一郎为该方法( s c t3 0 2 5 - 2 0 0 6 ，2 0 0 6 ) 。该方法具 有操作简便、样品检测周期短、运行成本低等优点；但也因为其对样品的纯化要 求比较高( 抗背景予扰能力差) 、仪器的灵敏度低、线性范围窄等不足丽使这种 方法的应用受到了限制。 变色酸法检测甲醛的原理是在浓硫酸的环境中甲醛可以与其反应生成一种 紫色化合物。该化合物在5 8 0n m 下具有强吸收，因此，可通过分光光度计进行 阂接定量 = 。+ 2 n - n h n 瓯二h 声州 n 一厂舻毽 2 , 4 - - - i e j 基苯肼( d n p h ) 图1 2 甲醛与d n p h 的衍生化反应方糕式 f i g 1 - 2t h er e a c t i o no ff o r m a l d e h y d ew i t l ld n p h n 0 2 甲醛的衍生效果的好坏与衍生反疲的完全程度有关。甲醛是否衍生完全直接 对方法的灵敏度造成影响。用同一检测仪器检测，一定浓度的甲醛经衍生后产物 的响应值大，则灵敏度高；反之则低。因此，甲醛的衍生化过程也需要对条件进 行优化。需要优化条件有：衍生剂用量、衍生时间、衍生温度及衍生反应的p h 环境等。 ( 4 ) 甲醛掰生物的检测手段 提取得到的甲醛经衍生后即可用相应的仪器进行检测。一般甲醛通过蒸馏来 富集提取，褥到的甲醛溶液组成相对单一，经乙酰丙酮衍生后又可以得到唯一在 4 1 4n m 波长下有特征吸收的衍生产物，所以可以采用比色法；丽当甲醛提取液 通过超声浸提来获得，则组成相对复杂，用d n p h 进行衍生，所得产物又与过 量的衍生剂在3 5 5l i r a 下有同样强吸收，因此，要求后续的检测过程具有分离的 效果，所以采用h p l c 进行检测较为合适。 比色法和h p l c 法除对样品组成的复杂程度上有不同的要求，在其他许多方 面也各有利弊( 见表1 1 ) ，需要根据实际情况和条件加以选择。 浙江工商人学硕士学位论文 表1 - 1 比色法穰h p l c 法的比较 t a b l e l - lt h ec o m p a r a t i o no f c o l o r i m e t r yw i t hh p l c 1 3 3 香菇中内生甲醛形成机理的研究进展 1 3 3 1 香菇甲醛问题的提出 香菇中含有甲醛最早发现于西班牙( 香港食物环境署风险评估组，2 0 0 4 ) ； 但真难有文献报道是在1 9 7 0 年。当时，y a d a 等报道了香菇内存在着高含量的甲 醛鲜香菇甲醛含量为8 2 4p p m ，干香菇甲醛含量1 0 0 - - 2 3 0p p m ：并依据 实验数据指出：香菇在生长发育过程中甲醛不断地产生并积累，且采收后的干燥 过程甲醛含量会上升3 4 倍，这与其它食用菌相比具有特异性( y a d a , 1 w a i d a , k o b a y a s h i ，1 9 7 0 ) 。 1 3 3 2 香菇内生单醛代谢途径屡面的研究 真正开始对香菇甲醛的代谢途径进行探讨是1 9 7 0 年代。研究的起初目标并 非在于香菇甲醛的形成机理，丽是希望骥晰香菇特征风味的代谢途径。然藤，在 开展这些研究的过程中，日本学者y a s u m o t o 等发现：香菇在产生其风味物质的 同时，还有丙酮、乙醛、甲醛等物质作为副产物丽伴随产生( y a s u m o t o ，1 w a m i ， m i t s u d a , 1 9 7 1 ) 。在第九届东京食用菌栽培科学因际会议上，f u j i m o t o 阐述了他 针对香菇甲醛代谢途径的研究结果，表明未加热处理的香菇匀浆液，在保温处理 2h 内甲醛产生活跃，甲醛含量急剧上升；至2 2 5h 产生趋于平缓，之后甲醛 又随着时闻的延长含量有所降低。这一现象暗示着香菇甲醛的产生是酶促参与的 反应。进一步从香菇中提取粗酶液，加入到灭了酶的香菇匀浆液中，仍然进行保 温实验，结果处理组甲醛含量达到了对照组的3 倍。f u j i m o t o 又分离纯化了香菇 1 2 浙江：i ：商人学硕十学位论文 中甲醛形成的前体物质，得到强活性部分为一种两性化合物。对该化合物作t l c 、 墩及熔点( 分解) 分析，结果其熔点为1 5 7 一1 5 8 ，以b u o h 、水和乙酸( 4 ：l ：1 ) 为展开剂时，t l c 的p f 值为0 0 6 。这些结果与y a s u m o t o 所分离得到的香菇特 征风味物质的前体物质香菇酸( l e n t i n i ca c i d ) 的性质相吻合。髯对代谢 产生甲醛的酶粗提物作性质研究，发现甲醛酶具有一定耐热性：在6 0 下2 0m i n 、 8 0 下5m i n 及9 0 下lm i n 才完全失活。 f u j i m o t o 研究结果从一定程度上支持了香菇内生甲醛的代谢途径即是香菇 特征风味物质的途径( f u j i m o t o ，1 9 7 4 ) ，但是并没有作更多的研究。现在，对香 菇内生甲醛产生机理的认识仍是基于网本学者y a s u m o t o 等人对香菇风味的研 究。在1 9 7 1 1 9 8 0 年闯，y a s u m o t o 等分别分离和纯化了香菇特征风味物质的前 体物质香菇酸和代谢过程中的两个关键酶7 谷氨酰转肽酶 ( ? - g l u t a m y lt r a n s p e p t i d a s e ) 和半胱氨酰甄砜裂解酶( s - a l k y l l - c y s t e i n e s u l f o x i d e l y a s e ) ，并分别研究了三者的性质( y a s u m o t o 1 w a m im i t s u d a , 1 9 7 1 1 9 8 0 ) ，表明香菇酸楚一种硫代7 谷氨酰半胱氮酸缩氨酸，分解温度为1 5 7 1 5 8 ；而两个关键酶的主要性质总结于表l - 2 中。 表l - 2 香菇糖代谢途径中两种酶的主要特性 t a b l e1 - 2t h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h et w oe n z y m e si nt h em e t a b o l i z a t i o no fl e n t h i n i n e 7 谷氨酰转肽酶半胱氨酰弧砜裂解酶 作用 最适p h 最适温度 激活剂 抑制剂 动力学 永解，转移半胱氨酸弧戳的大量分解 水解：6 5 转移：9 08 0 - 9 0 3 7 p a l p ( 磷酸吡哆醚) 、大多数氨基酸、c a 2 + 、m 9 2 + 等 羟铵( 只抑制半胱氨酰孤砜裂解酶作用于脱谷氨酰香菇酸) 、肼、羰基试剂、 c u 2 十、h 9 2 + 、z n 2 + 等 符合米氏动力学，k m = 4 7 xl o 3 1 3 4 香菇内生甲醛研究中存在的问题及今后方向 ( 1 ) 香菇巾甲醛含量的检测方法仍存在着争议。样晶的前处理过程需要将酶的 因素考虑进去；甲醛的提取方法需要更为合理的选择和条件的优化。总之， 如何才舷更为真实地反映香菇中实际甲醛含量仍需进一步探讨。 1 3 浙江t 商大学硕十学位论文 ( 2 ) 香菇内生甲醛形成的机理研究还只是对甲醛在香菇子实体内的代谢途径 的探讨；而今后需要加强。如：香菇内生甲醛代谢在分子生物学层面的调 控方式、香菇甲醛产生的细胞水平机理、伴随香菇甲醛产生的能量平衡及 氧化还原平衡的变化、香菇内生甲醛产生并存在的生物学意义等。 ( 3 ) 香菇内生甲醛代谢与香菇特征风味的研究之间还只是间接地建立了关联 性，尚没有充足箍直接的论据；且已有的论据都是定性层面上的，尚没有 从定量的层面上对香菇内生甲醛代谢和香菇特征风味物质代谢的相关性 进行研究。 l 。4 香菇特征风昧的研究进展 1 4 1 风味研究的一般方法 1 4 1 1 风味物矮的提取方法 ( 1 ) 蒸馏提取法 蒸馏方法出于操作简单方便，因此过去常用于食品的风味物质的提取。提取 风味物质的蒸馏方式可分为：水蒸汽蒸馏法、同时蒸馏萃取法、分子蒸馏法等。 水蒸汽蒸馏法是较为传统的方法。借助水蒸汽通过样晶液时的带动作用，将 样品中的挥发性组分带出，再经过一个冷凝装置将水蒸汽及随带出的样品挥发性 组分冷凝，得到挥发性缀分提取液。一般根据样品的不同，蒸馏的时间控制在2 - - 6h 不等。由于许多易挥发的组分为极性较低的脂溶性化合物，因此，得到的 提取液还需经由定量的乙醚或二氯甲烷萃取，得到样品挥发性组分的精油。杨 开等人采用该方法对香菇中的挥发性风味成分进行了提取，并鉴定了其中的组成 成分的( 杨开，孙培龙，郑建永等，2 0 0 5 ) 。 同时蒸馏萃取法( 又称l i k e n s n i c k e r s o n 提取法) 是为了更有效地提取物料中 的挥发性组分丽专门设计的一套s d e 装置来实现挥发性成分的提取、萃取和浓缩 一步完成的方法。该s d e 装置出两个蒸馏部分和一个萃取部分组成。一边的蒸馏 部分连接盛有样品的蒸馏瓶，另一边的蒸馏部分连接盛有萃取剂的蒸馏瓶。要求 承载样鼎的溶剂与萃取剂不互溶。当蒸馏开始时，样品的挥发性组分和另一边的 萃取剂同时被蒸出，两股蒸汽于中间的萃取部分相遇并混合进行高效的萃取。经 萃取后的混合蒸汽再经出装置萃取部分下端的冷凝系统而冷凝，并于最下面的小 1 4 浙江工商人学硕+ 学位论文 室内进行溶剂和萃取剂的分层。分层后的溶剂和溶有挥发性组分的萃取剂又由各 自的回流管两回流到原来的蒸馏瓶中，完成一个循环。如此，样品中的挥发性组 分处于不断地被蒸出、萃取和回流的循环中。当蒸馏达一定时间后，这些组分即 被完全地转移到了溶解能力更好的萃取剂中了。使用同一套s d e 装置可以在常压 下进行蒸馏，也可减压蒸馏而降低样晶液沸腾所需要的加热温度。由于所用的萃 取剂体积可以远小于样品的体积，所以挥发性组分在被提取的| 司时亦 ! 导到了初步 的浓缩。正因为同时蒸馏萃取法可以将提取和浓缩过程合并，对挥发性成分的提 取又较完全，且设备费用不赢，因此，在研究各种样品的风味时常被使用。如石 华治等人采用同时蒸馏萃取法提取并分析了千黄酱中的挥发性成分( 石华治，刘 玉平，孙宝圜等，2 0 0 6 ) ，王依春等人对洋葱的挥发性分为成分进行了研究，并 与另一种固相微萃舣法作了对比( 王依春，王锡昌，2 0 0 6 ) 。当然，同时蒸馏萃 取法也存在着明显的缺陷：由于样品长时间处予高温加热状态，阂此挥发性物质 中一些热敏性化合物或热不稳定的化合物则容易在蒸馏过程中发生化学变化或 发生热降解，而使最终的分析结果不能完全反应样品孛真实的挥发性组分的组 成。 分子蒸馏( m o l e c u l a rd i s t i l l a t i o n ) 是一种在高真空度下进行液一液分离操作 的连续蒸馏手段。根据不同物质的挥发性不同，在一定温度下分子的运动距离也 不相同；因此，一种物质的分子只有运动距离大于加热板到冷凝板的距离时，该 物质才能被冷凝分离。由于分子蒸馏可以在高真空度下进行，因此使其具备了蒸 馏温度低、受热时闻短的有点，适用于对高沸点、热敏性物质的分离；且分子蒸 馏的另一显著的优点就是蒸馏过程是不可逆的( 李巧玲，2 0 0 4 ) 。 ( 2 ) 超糕赛萃取法 该法是利用流体在临界点附近某一区域内，与待分离混合物中的溶质异常相 平衡行为和传递性能，量对溶质溶解麓力随莲力和温度改变而在相当宽的范围内 变动这一特性达到分离的一项技术( 郭凯，芮汉明，2 0 0 7 ) 。超临界萃取法使用 的流体最多的是c 侥。c 0 2 的临界温度为3 l ，接近室温，可以避免挥发性组分 中热敏性物质的降解，又隔绝了空气；可以防治一些化合物被氧化；因此，可以 很好墟反映物料中风味的真实状态。另外，当c 0 2 处于超临界状态时，提取能力 很强；而一凰改变压力后又可以与所提取的物质相分离，如此可起到方便浓缩的 1 5 浙江工商人学硕士学位论文 效果，又没有溶剂残留，有利于环境的保护。综合了这些优点，c 0 2 超临界萃取 法在食品风味的研究中应用己越来越广泛。g r a c i a 等人用c 0 2 超临界萃取法从朗 姆酒酒厂的废水中提取和分析了其中的风味成分( g r a c i ai ，r o d r i g u e zj e ，g a r c i m t ，1 9 8 2 ) ，而国内也有许多学者涉足了这一领域( 张忠义，雷正杰，王鹏等， 2 0 0 2 ；李艳辉，易进海，官艳丽等，2 0 0 7 ) 。 ( 3 ) 顶空法 顶空法是对处于一定温度和压力的样品上方的挥发性组分直接取样，进样 g c 或g c m s 进行分析的一种风味分析方法。顶空法又分为静态顶空法和动态 顶空法。 静态顶空法即为直接抽取样品上方含有挥发性组分的空气，以气体进样的方 式进行g c ( g c m s ) 的分析。该方法由于是直接取样空气进样；因此，可以认 为是模拟了现实中人的嗅闻过程，能较真实地反映样品的感官特性；而分析过程 无需其它有机试剂，避免了干扰，又利于环保；但由于静态顶空法是利用挥发性 组分在一定温度和压力下于固( 液) 相和气相间的饱和蒸汽压达到一定的平衡来 进行取样的，在这过程中并没有任何浓缩的步骤，因此，使有些含量较低的风味 物质或信号响应不强的物质及在气相中分配较低的物质都不容易检测到，进而使 分析过程丢失掉重要的信息。这也使该方法的应用范围受到限制。另外，对含水 量较高的样品来说，难免在气相中会有较高的水分，这对部分色谱柱的填料会有 较大的损害。2 0 0 0 年王莉娜等人采用该法对啤酒中的香味组分作过分析( 王莉娜， 周伟，2 0 0 0 ) 。 动态顶空法( 又称吹扫捕集法，p u r g ea n dt r a p ) 是在静态顶空装置上增加了 一个吹扫装置，通过这一装置不断地吹入流动的气体，将挥发性组分吹出；同时 又在气相位增加了合适的吸附性高聚物( 或冷阱) ，对吹扫出的挥发性组分进行 吸附( 或冷凝) ，不断地打破这些组分的饱和蒸汽压平衡，从而实现挥发性组分 一定程度的浓缩，再用溶剂洗脱( 或脱水) 后进样g c ( g c m s ) 进行分析。该 方