（生物化学与分子生物学专业论文）burkholderia+spgxu56脂肪酶基因克隆与表达.pdf

b u r k h o l d e r i as p g x u 5 6 j 肪酶基因的克隆和表达 摘要 脂肪酶是一类应用在生物化工中的重要酶，在食品，制药，清洁剂和 制药等工业领域有着广泛的应用潜力。 本研究以b u r k h o l d e r i a s pg x u 5 6 为出发菌株，构建了含有1 0 0 0 0 个克 隆的部分文库，利用构建基因文库筛选和p c r 补齐的方法成功克隆了脂肪 酶的基因却a 和分子伴侣幼b 。核苷酸序列分析和氨基酸序列比对发t 觅l i p a 基因属于细菌脂肪酶中一型一亚型，却b 是印a 的激活因子。生物信息学分 析显示却a 是脂肪酶的结构基因，编码含有3 6 5 个氨基酸的蛋白质，预计分子 量是3 4 千道尔顿( k d a ) ，基因结构包含一个潜在的信号肽区域，以及s e r 、 h i s 、和a s p 残基组成的三元体保守区域，这个保守区域是脂肪酶蛋白催化 活性功能位点所在。却b 是一个分子伴侣，编码含有3 4 4 个氨基酸蛋白质， 预计分子量是3 7 k d a 。在分子伴侣的n 端基因结构中我们还验证了可能存在 的跨膜疏水结构域。 将却a 克隆到原核表达载体p p e t - b l u e 上，转入宿主表达菌t u n e r ( d e 3 ) 中，诱导表达后表达量可达菌体总蛋白量的4 5 。进一步将却b n 端存在的 跨膜疏水结构域去掉，使却b 能够在大肠杆菌中大量表达活性蛋白，重组 蛋白在总蛋白中达到3 0 。在分子伴侣存在的情况下，通过简单的体外复 性，得到了活性的脂肪酶，酶活产量达到了每克湿细胞6 0 ，0 0 0 个酶活单位。 最近，细胞表面展示技术受到了很大的关注。为了在b a c i l l u ss u b f i l i s 表面生产重组脂肪酶，将却a 基因融合到b a c i l l u ss u b t i l i sc w l b 基因的5 ， 末端。c w l b 基因是编码b a c i l l u ss u b f i l i s 细胞壁水解酶( 自融素) 与细胞 壁结合的主要结构域。s d s - 琼脂糖凝胶电泳表明融合蛋白位于置s u b t i l i s 细胞壁提取液中。但是我们没有检测到明显的脂肪酶活，可能是因为缺 乏分子伴侣或者是表达蛋白被编码细胞壁相关蛋白酶降解了。 关键词：b u r k h o l d e r i as p 脂肪酶基因克隆表达包涵体复性 b a c i l l u ss u b f i l i s 表面展示 c l o n i n ga n de x p r e s s i o no f l i p a s e e n c o d i n gg e n ef r o m b u r k h o l d e r i as p g x u 5 6 a b s t r a c t l i p a s e s ，a r e a n i m p o r t a n tg r o u p o f b i o t e c h n o l o g i c a i l y r e l e v a n t e n z y m e sa n dt h e yf i n di m m e n s ea p p l i c a t i o n si nf o o d ，d a i r y , d e t e r g e n ta n d p h a r m a c e u t i c a l i n d u s t r i e s i nt h i ss t u d y ，t h ep a r t i a lg e n o m i cl i b r a r yo fb u r k h o l d e r i as pg x u 5 6 c o m p o s e d o fa b o u t1 0 0 0 0r e c o m b i n a n t sw a sc o n s t r u c t e d t h eg e n e s e n c o d i n gt h ei i p a s e ( 1 i p a ) a n dl i p a s ec h a p e r o n e ( t i p b ) w e r ei s o l a t e df r o m l i b r a r ys c r e e n i n ga n dc o m p l e m e n t e db yp c r n u c l e o t i d es e q u e n c ea n a l y s i s a n da l i g n m e n t so fa m i n oa c i ds e q u e n c e ss u g g e s tt h a tl i p ai sam e m b e ro f b a c t e r i a ll i p a s ef a m i l y1 1a n dt h a tl i p bi sal i p a s ea c t i v a t o ro fl i p a t h e d e d u c e da m i n o a c i ds e q u e n c e sf o rt h el i p aw a sf o u n dt oe n c o d em a t u r e p r o t e i n s o f3 6 5a a ( 3 4k d a l t h el i p a s ec o n t a i n e dap u t a t i v el e a d e r s e q u e n c e ，a sw e l la st h ec o n s e r v e ds e r 、h i sa n da s pr e s i d u e sw h i c ha r c k n o w nt of u n c t i o na st h ec a t a l y t i ct r i a di ni i p a s e s 1 i p bw a sf o u n dt oe n c o d e m a t u r e p r o t e i n s o f 3 4 4 a a ( 3 7 k d a ) ap o s s i b l e t r a n s m e m b r a n e h y d r o p h o b i ch e l i xw a si d e n t i f i e di nt h en - t e r m i n a lr e g i o no f t h ec h a p e r o n e i i i h i g hl e v e l so fe x p r e s s i o no f i n a c t i v el i p a s e ( 4 5 ) w e r ea c h i e v e dw i t h e s c h e r i c h i ac o l it u n e r o d e 3 ) h a r b o r i n gp p e t b l u e - l i p a h e n c e ，f o rt h e c h a p e r o n e 却b ，t h ep u t a t i v e m e m b r a n ea n c h o rw a sr e m o v e d t h e t r u n c a t i o no f t h eg e n el e dt oo v e r e x p r e s s i o no ft h ea c t i v ec h a p e r o n e ( u pt o 3 0 ) i ne c o l i w i t ht h i sc h a p e r o n e ，i tw a sp o s s i b l et oo b t a i ni nas i m p l e i nv i t r or e f o i d i n gp r o c e d u r eaa c t i v el i p a s ew i t has p e c i f i ca c t i v i t yo fu pt o a y i e l do f6 0 , 0 0 0u go fe c o l iw e t c e l l s r e c e n t l y , c e hs u r f a c ee n g i n e e r i n gh a sb e e na t t r a c t i n gag r e a td e a lo f a t t e n t i o n t op r o d u c t i o no far e c o m b i n a n tl i p a s ea r t e r i a l l yl o c a l i z e do nt h e b a c i l l u ss u b t i l i sc e l ls u r f a c e , l i p ag e n ew a sf u s e dt ot h e5 - t e r m i n a lr e g i o n o ft h ec w bg e n ew h i c he n c o d i n gt h ec e l lw a l l b i n d i n gd o m a i no ft h em a j o r c e l lw a l lh y d r o l a s e ( a u t o l y s i n ) s d s - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s r e v e a l e dt h a t t h ef u s e dp r o t e i ni sl o c a l i z e di nt h eas u b t i l i sc e l lw a l l f r a c t i o n h o w e v e rw ec o u l d n td e t e c to b v i o u ss p e c i f i c a c t i v i t yo fi i p a s e ， p o s s i b l yb e c a u s el a c ko fc h a p e r o n eo rd e p r e d a t e db yc e l lw a l la s s o c i a t e d k e yw o r d s ：b u r k h o l d e r i as p ；l i p a s eg e n e ；c l o n i n g ；e x p r e s s i o n ；i n l u s i o nr e f o l d i n g ； b a c i l l u ss u b t i l i s ；s u r f a c ee n g i n e e r i n g i v 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和 相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本 论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也 不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个 人和集体，均己在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：万钜珐，卯年7 月歹日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名磁兹 导师签名镢缇叩年7 sy 日 前言 1 1 脂肪酶简介 脂肪酶( 1 i p a s e ，e c 3 1 1 3 ，甘油酯水解酶) 是分解脂肪的酶，在动植物组织及多种微 生物中普遍存在，其天然底物是生物产生的天然油脂是最早被研究的酶类之一。自1 9 3 4 年兔胰脂肪酶的活性报道至今，有关脂肪酶的研究已有上百年的历史【l 】。2 0 世纪初国外 科研人员首次发现了微生物脂肪酶。脂肪酶是水解酶，大多数脂肪酶作用于三脂酰甘油 的初级位( 1 ，3 一位) 酯键。脂肪酶的自然底物是在水中微溶的长链三酰甘油脂，催化反应 发生在水与有机相的交接处。 在微粒的状态下脂肪酶能很好地进行酯化，醇化，酸化的反应。尽管特异性很高， 脂肪酶的底物范围还是很广 2 - 8 1 。脂肪酶的催化能力可以通过分子生物学的新发现有选 择性地提高和工业化，如蛋白质工程以及选择性进化伊1 0 l 。在应用的情况下，脂肪酶的 特征需要通过固定化和恢复来发展。针对不同的底物，这些特征是通用的，但是同时脂 肪酶对不同的催化反应有很高的特异性。脂肪酶是丝氨酸酶，作用在油脂与水的交接处。 它的催化中心由g 1 ) ) 【s e r - x g l y 组成，并且通常是保守的环绕在催化中, t ：, s c r 周围。脂肪 酶的三维结构揭示了它“b 水解酶折叠的特，征1 1 1 】。 产脂肪酶的菌主要来自系统分析树的两大分支，一是原核细胞细菌，另一个分 支为真核细胞，包括动物、植物、和真菌，还有就是古细菌【1 2 1 。微生物脂肪酶种类多， 比动植物酶的作用p h 、作用温度以及对底物的专一性类型更广，便于进行工业化生产 和获得高纯度酶制剂，这些因素促进了微生物脂肪酶的研究，我们的实验主要关注细菌 分泌的脂肪酶，也叫做胞外脂肪酶。他们的出现可以追朔到1 9 0 1 年b a c i l l u s p r o d i g i o u s , b p y o c y a n e u s 和b f l u o r e s c e n s 的发现，他们在今天是研究脂肪酶分泌的最热门的 菌株，已经被重新命名为s e r r a t i a m a r c e s c e n s , p s e u d o m o n a a e r u g i n o s a 和p f l u o r e s c e n s 1 1 3 】 1 2 脂肪酶催化机制 与传统化学催化剂相比，脂肪酶所催化的反应具有更加优越的特点。酶反应具有高 广1 j 擘阉e 士尊啦量曾文 b u r k h o l d e r i a 叩g x u 5 6 詹肪i l 目克蕾曩毫避 催化活性和较强的专一性与选择性，反应的副产物少，在较温和的条件下进行反应，耗 能少，设备投资小，对环境无污染，产品质量好一系列的特点f 1 4 】。 脂肪酶可催化酯化、转酯、酯交换、对映体拆分等化学反应。其按底物专一性可分 为三类：非专一性脂肪酶、l ，3 专一性脂肪酶、脂肪酸专一性脂肪酶。脂肪酶的主要 来源是微生物、哺乳动物、植物。不同来源脂肪酶可催化同一反应，但在相同反应条件 下，催化效率不同。从已知结构的几种脂肪酶来看，分子量在2 00 0 0 d - 6 00 0 0 d 之间， 脂肪酶作用在体系的亲水一疏水界面层，这是区别于酯酶的一个特征。长期以来，人们 对非生物体系内的酶反应的研究均局限于水相体系中，并且认为酶只能在水溶液中使用， 而有机溶剂则是酶的变性剂。直到1 9 8 4 年美国m i t 的k l i b a n o v 等用脂肪酶粉或其固定 化酶在几乎无水的有机溶剂中成功地催化合成了肽、手性的醇、酯和酰胺5 。1 6 j ；n 本的 稻田佑二等用聚乙二醇对脂肪酶进行了修饰，使其可溶于苯等有机溶剂中，并成功地催化 了酯化反应【1 7 j 。有机相酶反应研究的兴起为酶工程的发展确立了一个新的里程碑。 不同类型的脂肪酶具有非常相似的立体结构。脂肪酶的氨基酸顺序可能有较大的差 别，但却具有相似的折叠方式和活性中心。一般地，脂肪酶的多肽链折叠成两个结构域， 即n 一末端和c 一末端结构域。n 一末端的活性部位有一条可结合长链脂肪酸的疏水性的 通道，该通道从催化部位的s e r 直到分子的表面。几乎所有的脂肪酶的活性部位都由组 氨酸饵i s ) 、色氨酸( s e r ) 、天冬氨酸( a s p ) 组成1 1 叼。但也有一些学者认为活性部位的氨基 酸序列为h i 卜- ) 卜y 二g l y z s e r - w o l y ( g l y 为甘氨酸，x 、y 、z 、w 为其他氨基 酸) 【1 9 1 。通常情况下，脂肪酶的活性部位被一个螺旋片段( 又称为“盖子”) 所包住。在底物 ( 如酵、酸或酯等) 存在的情况下，酶的构象发生变化，“盖子”打开，含有活性部位的疏 水部分就暴露出来。“盖子”中a 一螺旋的双亲性会影响脂肪酶与底物在油，水界面的结 合能力，其双亲性的减弱将导致脂肪酶活性的降低。“盖子”的外表面相对亲水，而其面 向催化部位的内表面贝相对疏水。由于脂肪酶与油，水界面的缔合作用，使盖子张开， 活性部位得以暴露，这使得底物与脂肪酶的结合能力增强，此时底物就容易进入疏水性 的通道而与活性部位结合，形成酶一底物复合物【2 0 】。与其它水解酶不同，脂肪酶只有 在油，水界面时才能被活化。关于脂肪酶在油。水界面的酯交换反应的机理有多种模型， 其中以乒乓机制较为合理【2 l 】。 手性新药的开发，通常采取的方法是选择化学合成路线中某一个手性中间体进行不 对称合成或拆分，再合成单一手性药物。由于酶法拆分副反应少，产物容易分离纯化，降低 了环境污染；反应条件温和，常温常压下就可以进行，降低能源消耗；另外酶具有高度立体 r 1 叮，叫蝴士掣啦童 文 b u r k h o l d e r i a 叩g x u 5 6 詹j 舯日史麓与- l 琏 选择性，制备的单一手性化合物光学纯度高等优点，因此酶法拆分在单一手性药物中间体 的科学研究和产品开发中已经越来越受到人们的青睐，在酶法拆分中所采用的酶大多数 是水解酶，其中绝大多数为脂肪酶。脂肪酶属于丝氨酸水解酶，酯、醇、酸、酸酐以及酰 胺等都可以成为它们很好的反应底物。自今为止国内外已经有很多相关方面的报道。 h o n g w e i 笔；1 2 2 1 在7 种离子溶液中用皱落假丝酵母脂肪酶催化布洛芬与1 一丙醇进行 酯化反应，结果表明对映选择性和收率都很高。王智 2 3 1 等利用脂肪酶作为催化剂，在 双液相反应体系中对外消旋缩水甘油丁酯进行立体选择性的酯水解反应，缩水甘油丁酯 的光纯度可以达到9 3 ，3 以上。 b e v i n a k a t t i 2 5 1 等在有机溶剂中，利用脂肪酶p s 对外消旋的萘氧氯丙醇酯进行水解， 得到了( r ) 2 酯的e e 值( 对映体过量值) 大于9 5 ；而利用脂肪酶p s 对消旋的萘氧氯丙醇 进行选择性酰化，也碍到了大于9 5 的光学活性的限) 2 醇。 w a n 9 1 2 6 等在水溶液中利用脂肪酶p p l 对消旋的萘氧氯丙醇酯进行水解，得到了 e e = 7 2 的( r ) 2 酯。 美国的k a l a r i t i s l 2 刀等对用于生产治疗高血压和自细胞拮抗药物用的中间体2 2 卤代 己酸酯用l i p a s ep s 使其水解，达到二种对映体拆分的目的。 o o v i n d a r a j u l uv a r a d h r r a j t 2 8 】利用来b u r k h o l d e r i ac e p a c i a 的脂肪酶手性水解消旋体 3 一苯基丁酸甲酯产生 9 8 e e ( e 5 0 ) 的r 构型的3 一苯基丁酸甲酯，处理1 5 0g 消旋体3 一 苯基丁酸甲酯能够产生6 8 7g 9 8 e e ( e 5 0 ) 的r 构型的3 一苯基丁酸甲酯。 脂肪酶对大多数的一级醇和次级醇表现出高度的手性1 2 9 1 ，使他们成功地催化制备 重要的手性药物。尽管大多数脂肪酶对二级醇表现出高度的手性，仅有少数的酶如伯克 霍尔德菌脂肪酶c l ) ，p o r c i n ep a n c r e a t i cl i p a s e ，以及爿c h r o m o b a c t e rs p 脂肪酶对一级醇 起作用。a l e s s a n d r am e z z e t t i 3 0 - 3 2 1 等报道了伯克霍尔德菌脂肪酶在 2 - m e t h y l 3 - p h i ：i p r o p a n o l 的手性催化反应中的分子机制。 1 3 脂肪酶活性检测方法 检测脂肪酶活力的方法有很多种，所使用的底物也很多，一般根据目的的不同选择 底物和方法。三油酸甘油酯，三丁酸甘油酯和橄榄油等常有的检测脂肪酶活力的底物， 通过检测反应释放的脂肪酸和甘油来检测酶活力；另外还有人用乙酸对硝基苯酚酯和辛 酸对硝基苯酚酯作为测活底物，利用水解产生的具有颜色的对硝基苯酚检测酶活力。 ! 查竺! 主竺苎竺奎璺! 塑苎! 苎! 塑塑：竺兰望堑! 竺! 兰里兰! ! 苎兰 在比色法中，利用脂肪酶分解1 ，2 一二酰甘油产生甘油单酯，同时在甘油单酯脂 肪酶的作用下释放甘油。甘油通过与一系列酶反应，如甘油激酶，甘油磷酸氧化酶，和 过氧化酶，产生的紫色物质对苯二酮，通过测定5 5 0 r i m 时的吸收值确定定甘油的浓度【3 3 l 另外一系列的伴随酶反应使用n a o h 的氧化作为最后一步。1 3 4 在酯分解过程中产生的游 离脂肪酸能够与罗丹明6 g 产生复合体，显出桃红色，在5 1 3 r m a 处测定吸收值，就能得到 脂肪酸的量。利用阳离子显色染料番红因光交色的特性，通过检测番红吸收值的改变， 测定水相与有机相交接处阴离子网络的改变。应用这个方法可以测定微量存在的酯解酶 1 3 5 游离的三酰甘油水解后产生的脂肪酸用苯萃取转变为相应的c u 盐并且用分光光度计 测1 3 6 1 其他的分光光度法还可以用醋酸盐 3 r l 或者2 ，3 一二琉基丙醇1 三丁酸甘油酯为底 物，2 硝基苯甲酸为染色中介 3 s l 。 也可以利用荧光物质进行酶活检测。脂肪酶水解产生长链脂肪酸时引起了荧光标 记的脂肪酸探针1 1 十一烯酸从脂肪酸结合蛋白上移位，测量移位的量便可以测量酶的 活力印- 4 0 l 。也可以利用荧光标记三酰甘油酯的羟基，作为反应的底物【4 1 也1 还有就是直接 滴定法，在三角瓶中加入p h 为9 。4 的甘氨酸- n a o h 缓冲液以及底物聚乙烯醇乳化剂，放 于3 7 水浴预热5 m i n ，加入酶液，保温一段时间加入乙醇终止反应，用n a o h 滴定游离 的脂肪酸，测定酶活力【4 3 】。测定脂肪酶的活力还有就是通过高效液相法【4 “5 1 。脂肪酶 和8 一醋酸月桂酸盐反应后，通过高效液相测量释放的醋酸的含量来测量脂肪酶的活力。 利用三丁酸甘油酯作为作为底物，检测到的酶活力是用橄榄油作为反应底物的2 3 倍。般认为是由于前者的结构简单，酶容易发生反应，而另外两个底物由于结构比较 复杂，而且受到乳化条件的影响，因此活力比较底：另外用三丁酸甘油酯作为底物最大 的优点在于反应只需震荡或搅拌，不用加乳化剂就能分散，因此在筛选和连续滴定中特 别适用。利用橄榄油，通过适当的乳化和检测方法的选择，可以大大地提高酶活检测的 可靠性。 1 4 脂肪酶基因结构、表达和分泌机制 1 4 1 雇肪酶基因结构研究 有关细菌脂肪酶的分子生物学，己测定了假单孢菌、葡萄球菌、链霉菌和枯草杆菌 等众多的细菌脂肪酶基因序列和对应的氨基酸序列。例如：st a p h y l o c o c c u sh y i c u s s u b s p b u r k h o l d e r i a 叩g x u 5 6 詹肪1 日克蕾与表迭 h y c u s 的脂肪酶基因d n a 片段长度为2 5k b ，d n a 序列分析确定了脂肪酶基因的位 置、核糖体的结合位点、信号肽序列m 分别克隆了来源于4i c a l i g e n e sd e n i t r i f i c a n s 、 p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 4 7 】、p s e u d o m o n a s f r a g i 的脂肪酶基因。g e o t r i c h 各菌株分别具 有编码同源性很高的l p a s ei 和i i p a s ei i 的不同脂肪酶基因，而c o n d i d a 具有5 个不同的脂 肪酶基因，编码同源性在8 0 以上的5 个脂肪酶【蚺】，该现象被称为脂肪酶基因的多态 性，b r o c c a 等报道了c a n d i d ag 勉同一菌株具有7 1 0 个脂肪酶基困编码众多的同功 酶1 4 9 。 苎堡丝! 型苎墨 鬟绿照姐霸浇 一 e 瑚l 蟾爵2 十氢蕊弛倍每序冀，粥十氯簋羹蝮熬冀督辩i 姻凸籼毫嚣鬣酸谗廑1 2 ) ， 蛾o c 一聃出臻粥三宵酹上) 栩母颤难鞋藉 舞埭段擘毫瘫m 甓绿簸臻臌唾说t 赞搬瓣雉密壤窘s 刺 袭党随筚如再s i k w i i 拜 蠡单麴强m t s l o ? l i 2 p | h 蠹雄，o 弘谴 hh 弘i f 0 1 2 0 4 9 h 婶r _ m l m l h 姊i “蹰d ；蝴用 赣攀匏哺鼻l 掰p i l a f f ) 嫠新壤雄黼嬲粥 国i 牺袭黼黝晰嚣基睡链予獬下越妯p 豫酗e 精舫酶墓瑗程絷包既上燕 鳃舶隧 l 蜮警爵2 6 个氛墓馥信弩昝弼 噶1 h 缎羁2 ；i 令筑躺姻练譬瓣拈，l 蔫h ，1 懈o c i 位子坤 下瓣：确，凫精砖 袭选翱癸莹瓣瓣篓 编码n 个氯墓黢锯每捧判撕十舞勰辩黪蔫帮辩j 脚心 编码4 1 十氰慧酸酝髂酶噼 甜蔚1 ) 端辩”十氟簿蕴戗蜘孥弼蝴个氨荔靛搿舫醇簖射1 7 霸i 配，e + c ( 7 ，佟) 艇再l l 千戴纂酸馏獬黜，羁密巾餍栩褥单爱嘲n 一葛灞序弼锏豫由。 l 赫牛氯纂酸精髂黪秘 西i l 敖簦翌街擘摩列编弼2 前个氟韵黢暾麟毫簖羚9 e 囝l l ( 1 ) 缩再“个氯鹱靛盛擎f 笋魁j 十毓墓嬲助臻雠3 4 曲) 圆媳码- x ，“中氯鏊墩掰白露，铺带纛齄曲的话性 对绾玛l 科4 “舢个氟蕻酸嚣弩蹿梦i 3 2 e 拿氯善濑鹈秣秘；，i 搬3 o + c 氆铀码i m a ) t l 千氟燃越由睡谭节麟翳篱嚣l 耋和努澎 c 1 ) 籀玛h 中氟撅豁擎糊。 十氟藕酷黯胁赡嚣嚣i ，i ( 2 ) 编码；甜中氟藕睃鬣白质秘弘，l j ，遵进2 蚺折叠爆期爵瞧 编码挣十氍篓馥绉哮停列，i g 脂麟耐3 ， c l 龋秘l t 怂个懿撅嚣母睁勇，3 1 1 个舞纂藏鹰齄精羁 4 l 捞1 ) a 篮确虹l 蛐十蠢籀壁藩盘鬟嚣卵，d i 键予下鹫蛙曲嘞托壤张髓麓转谧寝砖麓 群鹩产量 表1 一l 各种脂肪酶基因片段比较( 单志文工鲁，周晓云2 0 0 1 ) t a b l el | 1c o m p a r a t f i o n o f l i 豫g e n e so f l j p a 踮 按照氨基酸的同源性，脂肪酶可以分为六型【5 0 1 。1 型脂肪酶包括2 2 个成员，其中可 以分为6 个亚型。在细菌脂肪酶中受到重视，并且应用最多的就是p s e u d o m o n a s 族的脂 肪酶亚型1 1 和i 2 就是通常说的p s e u d o m o n a sia n di i 系列脂肪酶剐，这类脂肪酶的基 因结构通常由编码脂肪酶结构基因的o r f 和同源的分子伴侣组成。这类脂肪酶主要采用 “ ： ：= ： 摊 ，1 ，叫壮疆士孽t 乞嘲蜡乞 b u r k h o i d e r i a 叩g x u 5 6 詹防i l 因克蕾胃毫琏 二型分泌系统，而p s e u d o m o n a s l l l 系列脂肪酶主要采用一型分泌系统【5 2 1 。 p s e u d o m o n a s l l l 系列脂肪酶的基因结构分析表明：脂肪酶基因长度大多数是大约 1 3 k b ，只有个别如p s c e p a c i 2 a d s m3 9 5 9 脂肪酶基因片段长达6 k b ，g 屺的含量比例很 高，且大多数是出现在第三密码子上。脂肪酶基因都编码信号序列肽，大多数信号序列肽 氨基酸数目在2 3 2 6 个和4 0 4 4 个之间。编码的脂肪酶氨基酸数目在2 6 9 3 2 0 个之间和 4 6 0 个左右，都是以s e t 为活性中心的酶。原核微生物脂肪酶基因可读框从朋昭开始编码 甲硫氨酸，在a r g 上游处有s d 序列，核糖体和s d 序列结合编码氨基酸。t a n i s 3 】等人对 p s u e d o m o n a s f l u o r e s c e n s b 5 2 脂肪酶基因进行研究( 见图1 - 1 ) 。s d 序列在d n a 片段第8 1 个核苷处，编码甲硫氨酸的a t g 在9 3 的位置出现，第6 9 7 7 2 3 处是编码酶与底物结合区片 段，终止子在1 5 1 9 处出现。 ol i 诏6 9 1 7 玛 婚1 9 图1 1 脂肪酶基因片段( r a n y p 1 9 蚴 f 遮1 1t h eg e n el i p a s eo f p s u e d o m o n a s f l u o r e a e e n s b 5 2 s d ；s 砬i e - d a l g 撇o s e q 嘲c e ，峨n 端序列肽片段，s b r ；- 与酶和底物结合部位 我们研究的革兰氏阴性茜 4 b u r k h o l d e r i a 属于亚型i 1 ，因此基因结构由脂肪酶结构基 因和分子伴侣基因组成，并采用二型分泌系统进行分泌。例如：s t e e n l 5 4 1 等人对 p s u e d o m o n a s c e p a c i a ( b u r k h o l d e r i ac e p a c i a ) 的脂肪酶基因进行了研究。发现其基因结构 与假单胞属的脂肪酶的基因结构是一致的，含有两个主要部分z 牵纠，工垂厩砌4 编码脂肪酶 的重要结构，l i p b 编码的蛋白质称为伴侣蛋白，主要与脂肪酶的构相折叠和分泌有关。 p s u e d o m o n a sc e p a c i a ( b u r k h o l d e r i ac e p a c i a ) 基因的调控除主要的基因外，还受到上下游 基因的产物的调控( l o w - t e m p e r a t u r el i p a s ef r o mp s y c h r o t t o p h i c ) 。 j u n 9 1 5 5 1 x c 乎p s u e d o m o n a sc e p a c i a 的脂肪酶基因结构进行研究发现这段基因包括一 个1 0 1 7 b p 的l i p 鹤e a 和一个1 0 9 0 b pl i p a s e b 伴随子的o r f 训工谚b 结构如下： i - l ，u 簟鼍t 士增q 氲论文 b u r k h o l d e r i a 叩g x u 5 6 詹肪i l 目竞蕾与毫莲 圈1 2 包含均m a 和啦e b 脂肪酶基因片段 飚1 2n l eg e n e so f l i p m c o n t a i nl i p a s e al i p m b p s e u d o l o n a a l c a l i g e n e sm l 产碱性脂肪酶，该酶具有极好地去除脂肪污垢和适合 洗涤条件的特性，o j s 掣5 q 将该酶的结构基因在各种宿主菌进行了表达但表达活性 都很低进一步的研究发现与脂肪酶基因功d 相邻被称之为辅助基因功培的d n a 片段有关，l p b 对l i p 4 的表达复性起重要的作用多研究人员也发现了这一影响脂肪 酶基因表达的辅助基因，分别称为l i p h 、l i m l 和够等。 1 4 2 魔肪酶基因氨基酸组成研究 研究表明，来源不同的脂肪酶，其氨基酸组成数目从2 7 0 6 4 1 不等，其分子量为 2 9 0 0 0 1 0 0 0 0 0 道尔顿。迄今为止，人们已经对多种脂肪酶进行克隆和表达，并利用x 2 衍 射等手段和定向修饰等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构、等电点等参数，确定了 组成脂肪酶活性中心的三元组( 仃i a d ) 结构。表1 列出了几种常见的脂肪酶的结构特征参数 表1 2 部分膳肪酶结构特征参数( m a l o a t afe t a l 1 9 9 2 ) t a b l e i ，2s t r u c t u r ea n df e a t u r ep a r a r a e t e 糕o fl i p a s e s 正如表中所示，多数酶都有变种( 如c c l ( a ) 和c c l ( b ) 、g c li 和g c li i 等) ，不过这 些不同变种的酶具有绝大多数相同的氨基酸序列，其氨基酸组成数目完全相同，不同的只 是个别氨基酸的差异。一般而言，不仅构成活性中心的三元组氨基酸种类相同，而且位置 璺坚竺竺竺竺竺苎丝堂竺丝塑! ：竖型堑! 竺! 兰! 圭! 苎垡 不变：其分子量和等电点略有不刚5 m 9 1 。 1 4 3 脂肪酶二级结构研究 脂肪酶( 1 i p a s e ，e c 3 1 1 3 ) 具有不同的氨基酸组成( 残基数目、分子量、三维空间结 构等) ，但由于生物的同源性和进化过程的保守性，其催化中心拥有相似或相同的特征区 h i s 2 x 2 y 2 g i y 2 2 2 s e r 2 w 2 g i y 或y 2 g l y 2 h i s 2 s e r 2 w 2 g l y ( w 、x 、y 、z 指非特异性氨基 酸1 。 多数脂肪酶都是单链蛋白，比如c c l ( a ) 含有5 3 4 个氨基酸残基，其组成3 个小的和1 1 个大的8 折叠及1 0 个洳螺旋。其催化活性三元组由s e r - 2 0 9 、h i s - 4 4 9 和g l u - 3 4 1 组 成，s e r - 2 0 9 处于超二级结构折叠螺旋c1 3 2 折叠( 2 0 2 2 0 8 ) 2 a 2 螺旋( 2 1 0 2 2 0 ) ) 的转角 处。 图1 3 腊肪酶二级结构的一般形式 f i 9 1 3 s e c o n d a r y s t r u c t u r e o fl i p a ( 摘自v a n t i l b e l l f g he t a l 1 9 9 3 ) 令人感兴趣的特征是s o - - r e s i d u e 被一个螺旋盖”掩蔽起来，与分子表面被一界面所隔 开，形成由暴露疏水基包围的由亲水基组成的脂肪酶亲电区( 氧负离子洞) 。这种结构有 利于催化过程中底物对活性中心亲和力的提高以及活性中间体的稳定。所以界面激活现 象通常与a 一螺旋盖”的重新定向排列( 构象改变) 有关。侧链基团的化学修饰和固定化对 脂肪酶催化活性的改变与“a 螺旋盖，的重新定向排列不无关系【删 b u r k h o l d e r i a 即g x u 5 6 - 脯l l 一竞- 与毫琏 1 4 0 詹肪t 基因囊达，分子伴侣、分泌调控机翻 假单胞菌的脂肪酶表达、分泌调控系统是细菌脂肪酶基因表达的典型范列，如下图 所示； 田1 4 假单胞茸的腾肪酶表速分泌调控系统( f r a n k r o 蝴眦e t a l2 0 0 0 ) f i g l 。4t h ee x p r e s s i o no f l i p mf r o m 只a e r u g j n o s a 只a e r u g i n o s a 脂肪酶分泌调控 6 h 。图上的l i p q ，l i p r 两个构成双组分调控系统的 基因是由i u x - b o x 这段调控基因控制的，而l u x - b o x 由r h l r i 激活因子控制，而r h l r i 激活因子由g a c a 调控的。l i p q 可以由至今尚未得知的环境信号，包括未分泌和错误 折叠的酶激活。双组分调控产物l i p 激活因子能够附着在结构基因坳和矽上游依赖 于5 4 的p 1 启动子o r f 上，p 1 启动后续两个基因的表达。印编码脂肪酶结构蛋白( 即 本研究中的，弛4 ) ，缈编码的酶与脂肪酶空间折叠有关( 即本研究中的坳剀。p 2 启动子 的生理功能还有待发现。 图l 一5 假单胞茵的膳肪酶三型分泌途径( r o s e n s t e i n r ，e t a l2 0 0 0 ) f i 9 1 5s e c r e t i o np a t h w a y su s e db yl i p a s eo f g r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a ， b u r k h o l d 衲s p g x u 5 6j t ，防目，u 膏葺u 毫 r o s e n a u 6 2 1 将革兰氏阴性菌的分泌机制概括为三种类型( 1 ) 含有a t p 结合盒 ( a b e ) 的输出体。这种类型适合于n 段缺少代表性的信号序列，但c 端包含靶信 号序列的脂肪酶的分泌。a b c 输出体包括三种蛋白，由里到外依次是a t p 酶，弓型 的细胞膜融合蛋白和外膜蛋白。三种蛋白组合体横跨细胞膜，从而在周质中形成通道 直接将酶分泌到胞外。( 2 ) 分泌子介导的分泌。这种类型主要有x c p 基因编码的蛋 白质组成，其分布于细胞内外膜，并在外膜形成孔状通道。( 3 ) 自输送体介导的分泌。 通过该途径分泌的脂肪酶尽管分泌到胞外，但仍然要与细胞表面密切联系，或紧紧固 着在细胞表面。脂肪酶包含两个独特的结构域，n 端具有催化活性并且曝露在细胞外， c 端结构与所谓的自动输送蛋白类型类似，通过形成折叠结构的分泌通道协助将脂肪 酶的n 端运出胞外。 分子伴侣是一种能介导蛋白质进行正确的折叠的蛋白质，它能使蛋白质获得正确的 构型。这种过程是通过结合在靶蛋白质在装配过程中暴露的反应表面，并阻止这些反应 表面与其它区域作用产生不正确的构型来完成的。分子伴侣的作用与其说是通过帮助蛋 白质正确折叠完成，还不如说是通过防止蛋白质错误折叠完成的。现在已经发现分子伴 侣能够识别并调控细胞内多肽的折叠。如果宿主体细胞分子伴侣与外源基因表达所需要 的分子伴侣并不匹配，外源基因便不能正确表达。革兰氏阳性菌所产生的脂肪酶首先以 “酶原”的形式表达，酶的前体区域为信号肽，运输酶原到细胞外，在胞外经蛋白酶水解 断裂产生熟酶【5 8 j 。 近年来的研究发现，在大肠杆菌中，脂肪酶的分子伴侣只是依靠n 端锚定在细胞膜 的表面【6 3 删，而这个锚定对于它的作用是没有影响的【6 5 1 。在去掉这个锚定基因片段后， 得到了活性很高的分子伴侣，并且成功协助结构蛋白恢复活性。在对分子伴侣的研究中 比较受关注的是分子伴侣作用的脂肪酶结构基因范围比较广，特异性不高，本属的同源 蛋白都能起作用，也就是说一旦建立了高效的分子伴侣表达载体，就可以协助同属的一 类脂肪酶基因的表达i 的】。 1 4 5 鹰肪酶基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及酵母中的表达 勋n e 发现在对脂肪酶在大肠杆菌中异源表达时，必须调整基因内的密码子成为大 肠杆菌偏好的密码子，以便产生的酶能够很好地分泌出胞外，减少对细胞地伤害【6 7 1 。 p e ! t r ac t r a u b 将p s e u d o m o n a ss p k w i5 6l i p a s e 成功地在大肠杆菌中进行了表达， 表达的蛋白量达到了总蛋白的5 0 ，但是表达的脂肪酶是没有活性的包涵体。在其他的 b u r k h o l d e r i as p g x u 5 6 詹肪圈克- 毫逡 一系列关于其他p s e u d o m o n a sl i p a s e s 文献中也发现，在大肠杆菌中表达脂肪酶，特别是 没有共表达分子伴侣时，表达的脂肪酶都是没有活性的。但是即使将分子伴侣共表达， 表达出的脂肪酶活很低，或者没有活性 6 7 - 7 2 1 。 现在许多文献关注于包涵体的复性，因为重组脂肪酶包涵体的纯化比较简单，产量 也很高，但是单纯复性脂肪酶的结构蛋白只能得到活性低的蛋白，大约只能得到5 - - 1 0 的天然活性【2 7 47 5 1 但是q u y e n 发现在对脂肪酶异源表达时，在分子伴侣的帮助下，大 肠杆菌中表达的p s u e d o m o n a s c e p a c i a k w l 5 6 和cv i s c o s u m 的脂肪酶可以分泌到胞外。 但也有学者发现，能表达的脂肪酶并不意味着能够完全分泌出胞外【7 叼。而在复性中如 果添加特别的添加剂，如4 0 的甘油，可以代替分子伴侣的作用，但是最好还是在复性 液中以一定的比例加入分子伴侣，因为在大肠杆菌表达分子伴侣是可溶的蛋白，能够纯 化并发挥作用。在大肠杆菌表达分子伴侣时，要对分子伴侣基因进行改造，因为分子伴 侣基因前面存在一段疏水跨膜结构域，g c 含量很高，对大肠杆菌中异源表达影响很大， 但是对脂肪酶的复性没有影响，因此在表达时除去了前面的7 0 个氨基酸，降低g c 含量， 使分子伴侣以可溶蛋白形式表达纯化【6 6 】。 一个更高表达的方法是采用离体细胞转录一翻译系统，将改造后的带有结构基因的 表达质粒和带有分子伴侣基因的表达质粒放在离体细胞转录翻译系统中共表达也取 得了较高的酶活( 5 ，9 4 0u r a g ) 7 6 o 在革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌中表达假单胞菌的脂肪酶比较容易得到天然活性的 脂肪酶。s o o j i nh 趾【7 刀在枯草芽孢杆菌中，通过构建合适的表达载体，成功表达了 a c i n e t o b a c t e r s p e c i e s