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上海海洋大学硕士学位论文 环介导等温扩增技术在副溶血弧菌快速检测中的应用研究 摘要 副溶血弧菌( v i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s ) 是一种重要的食源性致病菌，人们食用 受该菌污染的食物后会引起腹泻、呕吐等，重症患者还会脱水、休克，甚至死亡。 目前，副溶血弧菌引起食物中毒的发生规模以及人群暴露规模呈明显上升趋势， 已成为我国首要的食源性致病菌。常用的副溶血弧菌检测方法包括传统培养方法、 免疫学方法以及p c r 等分子生物学方法，但这些方法在特异性、灵敏度、检测周期、 操作难易度以及检测成本等方面各有缺点。因此，发展新的快速准确、操作简便、 成本低廉的检测与鉴定副溶血弧菌的方法是及时有效地预防和控制此致病菌传播 的前提，对于提高食品卫生水平、保证食品安全具有重要的意义。 环介导等温扩增技术( 1 0 0 p m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n ，l a m p ) 是一种新 颖的核酸扩增技术，它依赖于能够识别靶d n a 上6 个特定区域的4 条引物和一种具 有链置换活性的d n a 聚合酶，在恒温条件下高效扩增核酸，lh 即可完成，具有高 特异性、快速灵敏、高效、操作简便等特点，它的应用可以弥补现有一些副溶血 弧菌检测方法的不足。 本研究首次将环介导等温扩增技术应用于副溶血弧菌的快速检测，建立了一种 针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因( t h ) 的l a m p 检测方法，并应用于水产品中 副溶血弧菌的直接检测。 1 、副溶血弧菌l a m p 检测方法的建立 针对副溶血弧菌种特异性基因不耐热溶血毒素基因( t l h ) 设计了三套l a m p 引物( 包括两条内引物和两条外引物) ，选用其中一套能够成功扩增该基因的特 异性l 蝴p 引物，对扩增反应体系和条件进行优化，建立副溶血弧菌l a m p 检测方 法。经过优化的l a m p 反应体系( 2 5 此) 包括：8m mm g s 0 4 、1 0m m d n t p s 、 0 8m 甜菜碱、1 2 州f i p 3 引物、1 2 肛mb i p 3 引物、0 2 1 a mf 3 3 引物、0 2 i l mb 3 3 引物、8ub s td n a 聚合酶大片段、1 x t h e r m o p o lr e a c t i o nb u f f e r 以及适量的d n a 模 板；最佳反应温度6 0 ，反应时间6 0m i n 。 2 、副溶血弧菌l a m p 检测方法的特异性和灵敏度评价 采用该l a m p 方法对1 2 种实验细菌共3 1 株进行检测，仅副溶血弧菌得到阳性结 果，表明该方法具有很高的特异性；以副溶血弧菌标准菌株为实验菌株，该方法 t 上海海洋大学硕士学位论文 对于基因组d n a 的检测限约为9 0f g 2 5 1 x ll a m p 反应体系，对于细菌纯培养物检测 限约为2 4c f u m l ，直接对食品样品中的副溶血弧菌进行检测的灵敏度为8 9c f u g 。 同时，采用p c r 方法进行平行检测比较，结果显示，两种方法的检测特异性一致， 但l a m p 法的检测灵敏度普遍l b p c r 法高出3 - - 一4 个数量级。 3 、副溶血弧菌l a m p 检测方法的应用 将建立的l a m p 方法应用于水产品样品的实际检测，同时采用p c r 方法和传统 培养方法进行平行检测比较。对于泥蚶、青蛤等4 2 份水产品样品，l a m p 方法和p c r 方法均检出8 份副溶血弧菌阳性( 2 份青蛤、4 份缢蛏和2 份牡蛎) ，传统培养方法 检出6 份阳性( 2 份青蛤、2 份缢蛏和2 份牡蛎) 。 本研究表明，所建立的副溶血弧菌l a m p 检测方法特异性强、灵敏度高，使用 恒温水浴装置1h 即可完成反应，不需要使用昂贵、精密的仪器设备和特殊试剂， 并且可以通过目测反应体系浊度变化进行产物检测，实现反应及产物检测一步完 成，与现有副溶血弧菌检测方法相比，耗时短、操作更简便、检测成本更低，可 作为快速检测副溶血弧菌的有效手段，尤其适用于基层检验检疫机构。 关键词副溶血弧菌( v i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s ) ，环介导等温扩增技术 ( 1 0 0 p m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n ，l a m p ) ，不耐热溶血毒素基因( t l h ) ， p c r ，快速检测，水产品 i i 上海海洋大学硕士学位论文 a p p l i c a t i o no fl o o p m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n m e t h o df o rr a p i dd e t e c t i o no fv i b r i op a r a h a e m o l y t i c u s a bs t r a c t v i b r i op a r a h a e m o l y t i c u si sac r u c i a lf o o d b o r n ep a t h o g e nt h a tc a r lc a u s ea c u t e g a s t r o e n t e r i t i si nh u m a n c l i n i c a lm a n i f e s t a t i o n so f 矿p a r a h a e m o l y t i c u si n f e c t i o n s i n c l u d ed i a r r h e a , h e a d a c h e ，v o m i t i n g , n a u s e a , a b d o m i n a lc r a m p s ，l o wf e v e r , a n dc h i l l s ， 、析mt h ei n c u b a t i o np e r i o dr a n g i n gf r o m4t o9 6h f o o d b o r n eo u t b r e a k sa n di s o l a t e d c a s e so f 形p a r a h a e m o l y t i c u sh a v eo c c u r r e dt h r o u g h o u tt h ew o r l d n o w a d a y s ，i nc h i n a , t h eo c c u r r e n c eo ft h ef o o dp o i s o n i n gc a u s e db y 矿p a r a h a e m o l y t i c u sh a si n c r e a s e d r e m a r k a b l y ，a n dt h i sb a c t e r i u mh a sb e c o m et h el e a d i n gf o o d b o r n ep a t h o g e no fo u r c o u n t r y t h eg e n e r a ld i a g n o s t i cm e t h o d so f 矿p a r a h a e m o l y t i c u sa r et h a to f m i c r o b i o l o g y ，i m m u n o l o g ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y ，w h i c hh a v es o m es h o r t a g ei n s p e c i f i c i t y ，s e n s i t i v i t y ，c o n v e n i e n c ea n d d e t e c t i o nc o s t t h u s ，t h e s ef a c t sh a v ep r o m p t e d i n t e r e s ti nt h ed e v e l o p m e n to fr a p i d s i m p l ea n dc o s t e f f e c t i v ea s s a y sf o rd e t e c t i o no f 矿 p a r a h a e m o l y t i c u st oc o m p l e m e n tt h ec u r r e n tm e t h o d s ，w h i c hw o u l dp r o v i d et h es e a f o o d i n d u s t r ya n dc o n s u m e r sw i t l le a r l yw a r n i n go fp o t e n t i a lh e a l t hr i s k sa s s o c i a t e dw i t h p o t e n t i a l l yc o n t a m i n a t e ds e a f o o da n d a l l o wa p p r o p r i a t em e a s u r e sp r e v e n t i n gd i s e a s e o u t b r e a k st ob es w i f t l yu n d e r t a k e n l o o p - m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n ( l a m p ) i san o v e lm e t h o df o rn u c l e i c a c i d sa m p l i f i c a t i o n i ta m p l i f i e sd n au n d e ri s o t h e r m a lc o n d i t i o n sw i t h i nll l ，w h i c h e m p l o y sas e to ff o u rs p e c i a l l yd e s i g n e dp r i m e r st h a tr e c o g n i z eat o t a lo fs i xd i s t i n c t s e q u e n c e so nt h et a r g e td n a a n dad n a p o l y m e r a s ew i ml l i g hs t r a n dd i s p l a c e m e n t a c t i v i t y n el a m pm e t h o dh a sa d v a n t a g e so fh i g hs p e c i f i c i t y ，h i 曲e f f i c i e n c y ，r a p i d i t y a n dl o w - c o s t , w h o s ea p p l i c a t i o nw i l lo v e r c o m et h es h o r t a g e si n v o l v e di nt h ec u r r e n t m e t h o d s i nt h ep r e s e n ts t u d y ，w ea p p l i e dt h i sr e c e n t l yd e v e l o p e dl a m p t e c h n i q u ef o rr a p i d d e t e c t i o no fv p a r a h a e m o l y t i c u sf o rt h ef k s tt i m e al a m p a s s a yw a sd e v d o p e da n d a p p l i e di nt h ed i r e c td e t e c t i o no fv p a r a h a e m o l y t i c u si ns e a f o o d sc o l l e c t e df r o ml o c a l s e a f o o ds t o r e s 。 i i i 上海海洋大学硕士学位论文 1 d e v e l o p m e n to fl a m pa s s a yf o rt h ed e t e c t i o no fep a r a h a e m o l y t i c u s t h r e es e t so fl a m ps p e c i f i cp r i m e r sw e r ed e s i g n e dt a r g e t i n gt h es p e c i e s s p e c i f i c g e n eo fep a r a h a e m o l y t i c u s t h et h e r m o l a b i l eh e m o l y s i ng e n e ( 砌) ，a n do n es e to ft h e p r i m e r sw a ss e l e c t e df o ri tc a ns u c c e s s f u l l ya m p l i f yt h et hg e n e t h e n ，t h e a m p l i f i c a t i o nc o n d i t i o n so ft h el a m pa s s a yw e r eo p t i m i z e da n dt h el a m pa s s a yw a s e s t a b l i s h e dt od e t e c te p a r a h a e m o l y t i c u s t h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n sw e r ef o u n dt ob e t h eo p t i m a lo n e sf o rc o n s i s t e n tl a m p a m p l i f i c a t i o n ：8m mm g s 0 4 ，1 0m md n t p ，0 8 m b e t a i n e ，1 2j x me a c ho ff i p 3a n db i p 一3 ，o 2 1 x me a c ho ff 3 - 3a n db 3 3 ，8u b s t d n a p o l y m e r a s el a r g ef r a g m e n t ，1x t h e r m o p o lb u f f e r , a n da p p r o p r i a t ea m o u n to f t e m p l a t ed n ap e r2 5p , ll a m p r e a c t i o nm i x t u r e b e s i d e s ，t h eb e s tr e s u l t sw e r e o b t a i n e d 丽t l lt h ef o l l o w i n gp r o c e d u r e s ：i n c u b a t e da t6 0 f o r1ha n di n a c t i v a t e da t8 0 f o r1 0m i n 2 e v a l u a t i o no ft h es p e c i f i c i t ya n ds e n s i t i v i t yo f t h el a m pa s s a yf o rt h ed e t e c t i o n o fe p a r a h a e m o l y t i c u s t h e s p e c i f i c i t yo f t h el a m pa s s a yw a sc o n f i r m e du s i n g31s t r a i n sf r o m12 d i f f e r e n ts p e c i e s d n aa m p l i f i c a t i o nw a so b s e r v e di na l lt h e 矿p a r a h a e m o l y t i c u s ，b u t n o n eo ft h es t r a i n sf r o mt h e s er e l a t e dv i b r i os p e c i e so ra n yo t h e rn o n - v i b r i ob a c t e r i a l s p e c i e st e s t e di nt h es t u d y ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tt h ea s s a yi ss p e c i f i cf o rd e t e c t i n g 矿 p a r a h a e m o l y t i c u s o u rl a m pa s s a yw a sc a p a b l eo fd e t e c t i n gam i m m u mo f9 0f g 2 5 此l a m pr e a c t i o nm i x t u r ef o r 矿p a r a h a e m o l y t i c u sg e n o m i cd n a a n d2 4c f u m lf o r p u r ec u l t u r e s t h ea s s a yw a st h e nd i r e c t l ya p p l i e di nt h es e e d e ds e a f o o ds a m p l e sa n dt h e d e t e c t i o nl i m i tw a ss h o w nt ob e8 9c f u go fs e a f o o dt i s s u e d e t e c t i n g 矿 p a r a h a e m o l y t i c u sb yt h ep c ra s s a ya tt h es a m et i m e ，t h es p e c i f i c i t yo ft h et w oa s s a y s w e r et h es a m e ，h o w e v e r ，t h es e n s i t i v i t yo ft h el a m pa s s a yw a s10 3t o10 4t i m e sm u c h o ft h a to ft h ep c r a s s a y 3 a p p l i c a t i o no f t h el a m pa s s a yf o rt h ed e t e c t i o no fe p a r a h a e m o l y t i c u s t h ee s t a b l i s h e da s s a yw a sa p p l i e dt od e t e c t 矿p a r a h a e m o l y t i c u si n4 2s h a r e so f n a t u r a ls e a f o o d s ，a n dd e t e c t e dt h i sb a c t e r i u mb yp c ra s s a ya n dt h ec o n v e n t i o n a l m i c r o b i o l o g i c a lm e t h o d sa tt h es a m et i m e 8s a m p l e s ，i n c l u d i n g2s h a r e so fc y c l i n a s i n e n s i ，4s h a r e so fs i n o n o v a c u l ac o n s t r i c t aa n d2s h a r e so fo y s t e r , w e r er e c o r d e d p o s i t i v ef o r 矿p a r a h a e m o l y t i c u sb yt h et h t a r g e t e dl a m pa s s a ya n dp c ra s s a y w h i l e ，6s a m p l e s ，i n c l u d i n g2s h a r e so fc y c l i n as i n e n s i ，2s h a r e so fs i n o n o v a c u l a c o n s t r i c t aa n d2s h a r e so fo y s t e r ，w e r ep o s i t i v eb yt h ec o n v e n t i o n a lm i c r o b i o l o g i c a l t v 上海海洋大学硕士学位论文 m e t h o d s i nc o n c l u s i o n , t h el a m p a s s a yd e v e l o p e da n do p t i m i z e di nt h i ss t u d yi sh i g h l y s p e c i f i ca n ds e n s i t i v ef o r t h ed e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f 矿p a r a h a e m o l y t i c u sb o t hi n c u l t u r ei s o l a t e sa n di ns e a f o o ds a m p l e s b e s i d e s ，t h ea s s a yp e r f o r m sw i t ha s i n g l e t e m p e r a t u r es t e pa t6 0 f o ra b o u tih a n dt h ed e t e c t i o no fl a m pr e a c t i o nc a nb ed o n e b yj u d g i n gt h ep r e s e n c eo fa c c u m u l a t e dp r e c i p i t a t ea f t e rc e n t r i f u g a t i o na sw e l la sv i s u a l j u d g m e n to f t u r b i d i t y ，t h u s ，i ta l l o w so n e s t e pi d e n t i f i c a t i o no ft hg e n ea m p l i f i c a t i o n w i t h o u tu s a g eo fa n yo t h e re x p e n s i v ee q u i p m e n to rs p e c i a l i z e dr e a g e n t s w h e n c o m p a r e d 、析t l lt h ec o n v e n t i o n a lm i c r o b i o l o g i c a lm e t h o d sa n ds o m ep c r b a s e d t e c h n i q u e s ，i ti se a s i e rt op e r f o r m ，m o r ee f f e c t i v ea n dw i t hl o w e rc o s t t h e r e f o r e ，t h e p r e s e n tl a m pa s s a yi se x p e c t e dt ob e c o m eav a l u a b l et o o lf o rr a p i dd e t e c t i o na n d i d e n t i f i c a t i o no f1 4 p a r a h a e m o l y t i c u s ，b e n e f i c i a lt on o to n l yt h es e a f o o di n d u s t r yb u t a l s ot h ec o n s u m e r sb ye n s u r i n gt h es a f e t yo ft h ef o o dp r o v i d e df o rc o n s u m p t i o n k e yw o r d sh b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s ，l o o p m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n ( l a m p ) ，t h et h e r m o l a b i l eh e m o l y s i ng e n e ( 砌) ，p c r , r a p i dd e t e c t i o n ，s e a f o o d v 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： e l 期：勿孵年占月 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位 。论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口 ，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密 口 学位话文作者筝名：，徐午 日期：多镅年易月r 6 日 指导教师签名：滔逆之 日期：吁年1 月i 日 愎丁 徐帅 上海海洋大学硕士学位论文 引言 1 研究背景 副溶血弧菌( v i b r i op a r a h a e m o l y t i c u s ) 隶属于弧菌科弧菌属，是一种革兰氏阴性 菌，形态呈球杆状、杆状、弧状、丝状等多形性，分散排列，常两端浓染，无芽 孢，菌体一端有单鞭毛，运动活泼，为嗜盐性细菌【l l 。它最早由f u j i n o 等于1 9 5 3 年 从日本一位食物中毒患者初次分离得到，该菌因在含食盐较浓( 3 4 以上) 的培 养基中能生长，而在不含盐的培养基内不能繁殖而得名 2 1 。 副溶血弧菌广泛分布于海湾、海岸线区域、盐湖及海产品中，是一种重要的 食源性致病菌，人们食用受该菌污染的食物后会引起腹泻、呕吐等，重症患者还 会脱水、休克，甚至死亡。引起中毒的食品主要为海产鱼、虾、贝类等水产品， 其次为肉类、家禽和咸蛋，偶尔也可由咸菜引起。副溶血弧菌主要通过三种形式 污染食物：鱼、虾、蟹、贝类等在摄取食物时，同时把海水中或海底沉积物中 的副溶血弧菌摄入体内；沿海地区饮食业人员、渔民带菌率高而造成污染： 食物在加工、制作、储存、运输等过程中生熟不分，生食中的副溶血弧菌也可污 染熟食【3 】。副溶血弧菌是进出口水产品检测的重要项目，在饮用水、食品检测和食 品中毒源、传染病源调查等工作中，也经常需要对该菌进行检测。目前，副溶血 弧菌引起食物中毒的发生规模以及人群暴露规模呈明显上升趋势，已成为我国首 要的食源性致病菌【4 j 。 目前，副溶血弧菌的检测方法主要以国家标准为依据，主要是传统的分离培 养、镜检观察、生化鉴定、嗜盐性试验等方法。将样品增菌后进行分离培养使包 括副溶血弧菌在内的嗜盐性弧菌得以分离，可疑菌落经氯化钠三糖铁斜面、革兰 氏染色和嗜盐性实验进行初步判定，最后经生化试验以及动物试验综合判定其是 否为副溶血弧菌【5 。这些方法操作繁琐，费时耗力，检测周期通常需要5 7 天， 难以满足食品安全早期预警、快速准确反应机制的需要 7 1 。此外，在低温条件下、 营养不足、不适p h 或受到应激等情况下，副溶血弧菌还可形成l 型菌或变成球型等 不可培养状态，表型不典型，针对细菌的不同生存状态，用传统方法检测容易出 现假阴性结果，造成检测结果的差异【8 1 0 l ，影响检测的准确性。 此外，免疫学检测技术也应用于副溶血弧菌的检测，这类技术利用抗原抗体 的特异性反应，并结合一些生物化学或物理学方法来进行检测，主要包括免疫荧 上海海洋大学硕士学位论文 光技术、免疫酶技术等i l 仉l l j 。免疫学检测技术所需设备简单，不需要复杂仪器， 抗原抗体反应特异性很强，但是其检测灵敏度有时达不到实际检测或诊断需要， 尤其是对抗原或抗体含量甚微的标本进行检测；其次，这类方法通常操作步骤烦 琐，时间长，对实验技能要求较高，如常用的e l i s a 方法检测需要包括加样、保温、 洗涤、加抗体等步骤，不宜大面积普及推广【1 1 4 1 。 近年来，随着分子生物学的发展，分子生物学方法已广泛应用于副溶血弧菌 的检测。聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n , p c r ) 是应用最广、分支较多的 分子生物学方法，其中，以常规p c r 、多重p c r 及定量p c r 等技术在副溶血弧菌检 测中的应用最为广泛【1 2 】。国内外相关研究报道也比较多1 ”o l 。例如：李志峰等【1 5 】 针对砌基因，使用常规p c r 方法快速检测副溶血弧菌；吴彩云等【 】建立了一套双 重p c r 方法，该方法可同时检测携带有t 和t d h 基因的副溶血弧菌毒力菌株；翁文川 i ls 】等利用荧光定量p c r 技术，建立了快速准确的定量检测副溶血弧菌的方法，实 现扩增和检测单管封闭进行；b l a c k s t o n e 等【1 9 1 建立了一种针对副溶血弧菌t d h 基因的 r e a l t i m ep c r 检测方法，特异性地检测致病性副溶血弧菌。这类分子生物学方法 具有特异、敏感等特点，针对目前食品卫生标准中大量的“不得检出”也有着很好的 应用前景，但由于需要昂贵、精密的仪器设备，通常检测成本高，对实验环境和 操作者技术要求比较高，同时，由于p c r 相关反应需要经过d n a 的热变性、长时 间的温度循环等等，耗时较长，从3h 至u 2 0h 不等，不利于食品安全现场快速检测 和诊断处理【9 1 2 j 。所以就目前情况来看，运用分子生物学方法检测副溶血弧菌在 实验室研究中应用较多，在食品卫生实际检验工作中由于相对要求较高，推广应 用上有一定难度2 1 。因此，发展新的快速准确、操作简便、成本低廉的检测与鉴 定副溶血弧菌的方法也一直是相关研究的热点，对于提高食品卫生水平、保证食 品安全、保障国民身体健康和推动食品国际贸易发展具有重要的意义。 环介导等温扩增技术( 1 0 0 p m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n , l a m p ) 是一种 新颖的恒温核酸扩增技术，它依赖于能够识别靶d n a 上6 个特定区域的4 条引物和 一种具有链置换活性的d n a 聚合酶，在恒温条件下高效扩增核酸，lh 即可完成， 具有高特异性、快速灵敏、高效、操作简便等特点【2 1 1 ，将该技术应用于副溶血弧 菌的快速检测可以弥补现有一些副溶血弧菌检测方法的不足。l a m p 技术在国内起 步较晚，相关研究报道不多，而应用l a m p 技术检测副溶血弧菌国内外均未见文献 报道。 2 研究目的及意义 本研究首次将l a m p 技术引入副溶血弧菌这一重要的食源性病原菌的检测中， 2 上海海洋大学硕士学位论文 针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因砌，建立一套检测副溶血弧菌的标准化l a m p 技术体系，并直接应用于水产品中副溶血弧菌的实际检测。与现有的副溶血弧菌 检测方法相比，l a m p 方法在保持p c r 等分子生物学检测技术特异敏感的优点的同 时，仅需要4 条合适的引物、1 种d n a 聚合酶、1 个水浴箱或隔热装置lh 即可完成反 应，不需要精密昂贵的仪器设备和特殊试剂，更为快捷、操作更简便、检测成本 更低，有望作为快速检测副溶血弧菌的有效手段，将具有更强的实用意义和推广 价值，对于提高食品卫生水平、保证食品安全和推动食品国际贸易发展具有重要 的意义。同时，此研究也为l a m p 技术推广并应用到其他致病菌的快速检测奠定了 一定的基础，为开展病原菌的早期预警、监测、分析和调查发挥积极作用。 3 上海海洋大学硕士学位论文 第一章文献综述 核酸扩增技术是生命科学领域最有价值的技术手段之一，相关的研究也较为 广泛和全面。聚合酶链式反应是应用最为广泛的核酸扩增技术，其本身也正以惊 人的速度发展，许多改良的p c r 技术或者由p c r 衍生的新技术不断出现。近年来， 随着分子生物学的飞速发展，在p c r 及其相关技术发展的同时，新的核酸扩增技术 也不断涌现，例如，自序列复制法( s e l f - s u s t a i n e ds e q u e n c er e p l i c a t i o n , 3 s r ) 、链 置换扩增法( s t r a n dd i s p l a c e m e n ta m p l i f i c a t i o n ，s d a ) 等。这些核酸扩增技术都有其 独特的核酸扩增机制，互为补充，有的可结合应用，共同构成了核酸扩增技术的 大家族。n o t o m it 等【2 1 】于2 0 0 0 年开发了一种新颖的恒温核酸扩增技术环介导等温 扩增，本章主要从原理、特点及其在食品工业中的应用几个方面综述l a m p 技术。 1 1l a m p 原理 1 1 1l a m p 弓l 物心门 引物是实现l a m p 扩增的关键。针对靶d n a 的6 个区域设计4 条引物，包括两 条内引物和两条外引物，内引物包括两段特异序列，能识别靶d n a 上的两个区域， 外引物能特异地识别靶d n a 上的一个区域。引物和靶d n a 相对应位点如图1 1 所 示，靶d n a 上用于扩增的6 个特定区域分别命名为f l c 、f 2 c 、f 3 c 、b 1 、b 2 和b 3 ； f i p 和b i p 为内引物，f i p i j 物包括f l c 序列、连接子和f 2 序列( 与f 2 c 互补) ，b i p 引物包括b l c 序列、连接子和b 2 序列( 与b 2 c 互补) ，f 3 和b 3 为外引物，f 3 引物与 f 3 c 互补，b 3 引物与b 3 c 互补。 f i ef 2 肿弓l 物5 e 三r 飞囫3 n 引物 5 圆 3 靶蜊a 3 ，圆圆国圈圆圈 y 5 1 窭习1 z 弦厂1 三三广曩r 区旷匿星可一3 f 31 ：2f l b i c b 2 cb 3 c b 3 3 圆5 髓引物 3 圜峦l 一5 船引物 b 2 b l c 图1 - 1l a m p 引物及靶d n a 示意图 f i g 1 - 1s c h e m a t i cd i a g r a mo fl a m pp r i m e r sa n dt a r g e td n a 4 上海海洋大学硕士学位论文 1 1 2l a m p 扩增机制陉叮 原理上，l m v p 反应大致可分为两个阶段，即扩增循环起始结构的生成阶段和 扩增循环及延伸阶段。在第一阶段4 条引物共同作用，识别靶d n a ，而在扩增循环 及延伸阶段仅两条内引物起作用。 1 1 2 1 扩增循环起始结构生成阶段 在链置换型d n a 聚合酶的作用下，内引物f i p 与靶d n a 的f 2 c 序列互补配对， 启动互补链合成。同时，外引物f 3 与f 2 c 前端的f 3 c 序列结合，在酶的作用下，一 边置换之前f i p i j i 物合成的d n a 链，一边合成自身的d n a ，最终由f 3 i j i 物合成的 d n a 链与模板d n a 形成双链结构。由f i p 弓i 物合成的d n a 链被f 3 z jj 物链置换后形 成一条单链，这条单链d n a 由于一端存在互补的f l c 和f 1 序列形成环状结构，而此 单链d n a 又可以作为模板结合b i p 和b 3z j i 物。b i p 弓i 物同该单链的b 2 c 序列互补配 对，启动互补链合成，在此过程中环状结构被打开。接着，类似于f 3 引物的作用， b 3 引物也置换b i p 引物合成的单链d n a ，被置换的单链由于两端均存在互补序列， 从而整条链呈现出哑铃状结构。此哑铃状结构d n a 又以自身为模板进行合成延伸 反应，迅速转变成一种一端为茎状、一端为环状的茎环状结构d n a ，这一茎环状 结构d n a 即为l a m p 扩增循环的起始结构。 1 1 2 2 扩增循环及延伸阶段 l a m p 扩增反应以此茎环状结构d n a 为起始物，在内引物和链置换型d n a 聚 合酶的作用下，进行循环和延伸，茎的长度和环的个数都逐渐增加，反应终产物 为一种混合物，包含不同茎长的茎环状结构d n a 和花椰菜状结构d n a ，反应终产 物示意图如图1 2 所示。 图1 - 2a m p 反应产物示意图【2 1 l f i g 1 2s c h e m a t i cd i a g r a mo fl a m pp r o d u c t s l a m p 技术作为一项刚开发不久的核酸扩增技术，研究人员也在不断地对其扩 5 上海海洋大学硕士学位论文 增机制进行改进。例如，为了进一步加快反应速度，在l a m p 反应体系中另外再添 加特异性环引物，环引物在l a m p 扩增循环及延伸阶段作用于靶d n a 翻，使用环 引物后的l a m p 反应比之前的反应时间缩短了近一半，效率大大提高，扩增的特异 性和灵敏度也进一步提高。 1 1 3 产物检测 l a m p 技术特殊的扩增机制保证了其扩增靶d n a 的高特异性，与p c r 法相比， l a m p 法对于靶序列的选择性更高，基本不受反应体系中非靶序列的影响，因此根 据是否扩增就可以判断目的基因存在与否。 在l a m p 反应过程中，核酸大量合成，从d n t p 析出的焦磷酸根离子与反应体 系中的镁离子结合，产生扩增反应副产物焦磷酸镁白色沉淀，反应体系浊度发生 变化，肉眼即可观察，这是判断扩增反应进行与否的最直接参照因素。反应中生 成焦磷酸镁沉淀的反应式如下谬j ： ( d n a ) n 1 + d n t p - ( d n a ) n + p 2 0 7 午 p 2 0 7 4 + 2 m 9 2 + 一m 9 2 p 2 0 7 m o r iy 等【2 3 】研究了l a m p 反应过程中焦磷酸镁沉淀的形成量与所生成的d n a 的量 之间的关系，作者在反应开始1 5m i n - - 一3 0m i n 这段时间内，连续监测了反应体系的 浊度以及所生成的d n a 的量，发现两者之间呈线性关系，并利用这一关系设计了 一种检测l a m p 产物的方法，即直接根据反应体系的浊度来判断反应是否发生，另 外，也可以根据反应物的浊度变化进行实时定量监测以及对靶d n a 进行定量。日 本学者已经利用这一特性研制出了专门用于l a m p 检测的实时浊度仪，可以实现对 于l a m p 反应的全程实时监控2 4 2 6 】。 荧光染料和探针也用于l a m p 产物的检测，在反应体系中加入荧光染料或探 针，通过检测反应体系的荧光值来判断扩增反应进行与否以及靶基因是否存在。 申建维等【2 7 1 在利用多重分子信标l a m p 技术快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 时，使用标有不同荧光素的两种探针检测扩增结果，反应同时扩增金黄色葡萄球 菌耐药基因m e c a 和种特异性基因f e m a ，在反应过程中，两种分子信标荧光探针分 别与m c c a 和f e m a 基因的扩增产物互补序列结合，产生两种荧光，最后通过检测反 应管物的两种荧光值来判定反应结果。y a m a d ay 等f 2 8 】在应用l a m p 技术快速诊断 人细小病毒b 1 9 感染时，以1 0 位b 1 9 急性感染患者和1 6 位其他皮肤病患者为实验对 象，以患者的血清和咽拭子作为扩增模板，通过在反应管中加入荧光染料s y b r g r e e ni 进行产物检测，如果含有扩增产物，反应体系颜色变绿，反之，则保持 橙色不变，结果显示，只有b 1 9 感染患者的血清和咽拭子样品反应管的颜色由橙色 变为绿色，且伴有白色沉淀产生，特异性高。 6 上海海洋大学硕士学位论文 此外，琼脂糖凝胶电泳同样也用于l a m p 产物的检测。但是，与p c r 扩增产物 产生单一大小的电泳条带不同，l a m p 扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上会呈现出其特 有的阶梯状条带，这是由于l a m p 反应的产物是由多重复靶序列茎环状d n a 和花 椰菜状d n a 所组成的混合物。 1 2l a m p 在食品工业中的应用 基于上述原理，l a m p 技术具有很高的特异性，并且扩增反应于等温条件下进 行，不会因为温度的循环改变而造成时间的损失，故扩增效率也很高；其次