（食品科学专业论文）猪血亚硝基血红蛋白的合成及应用研究.pdf

山东轻工业学院硕士学位论文 摘要 本课题以猪血的开发利用为目的，提取其中的血红蛋白，与亚硝酸钠合成亚 硝基血红蛋白，作为发色剂应用于肉制品。主要研究了亚硝基血红蛋白的合成工 艺，探讨了多个因素对产物的影响，并对主要影响因素进行参数优化，最后系统 的研究了色素的稳定性、溶解性及流变学性质，并对其应用进行了初步探讨。 ( 1 ) 合成亚硝基血红蛋白首先必须将血细胞破壁，采用加入与血细胞等体积的 蒸馏水进行溶胀的方法，细胞破壁率可达9 5 ；用选择性加热的方法对血红蛋白 进行纯化，得率为8 9 4 ，但在操作时需采取有效的抗氧化措施。 ( 2 ) 用亚硝酸钠制备亚硝基血红蛋白，在单因素实验的基础上，采用四因素三 水平正交试验l 9 ( 3 4 ) 对色素的合成工艺条件进行优化，结果表明：最佳条件为 p h 5 9 0 、加热温度6 5 、反应时间2 5 m i n 、亚硝酸钠添加量2 o 。p h 值对结果影 响最大，其次是反应温度和亚硝酸钠添加量，反应时间对结果影响最小。 ( 3 ) 合成的亚硝基血红蛋白色素的吸收图谱与文献报道的亚硝基亚铁血红素 ( d n f h ) 和亚硝基血红蛋白色素的吸收光谱相一致，验证了其结构的一致性。 ( 4 ) 阳光、氧化剂和金属离子c u 2 + 、a g + 和p b 2 + 都对色素稳定性有不良影响， 因此色素应尽量避光、真空保藏；8 0 以下加热6 0 m i n 以内，色素相对稳定，超 过9 0 则易导致色素大量损失，因此，亚硝基血红蛋白作为肉类发色剂时，最佳 应用于低温肉制品。可接受p h 范围为5 - 9 。蔗糖和甘油对其稳定性有增强作用， 其它食品辅料几乎不影响其稳定性。 ( 5 ) 溶剂的种类对亚硝基血红蛋白色素的溶解率影响不大，一般选用蒸馏水即 可。相同条件下，恒温电磁搅拌的助溶方式得到的溶解率相对大一些。 ( 6 ) 2 5 时，1 2 的亚硝基血红蛋白色素溶液为假塑性流体，非牛顿指数 n = 0 5 7 8 2 ，稠度系数k = 0 2 9 1 8 ，溶液的黏流活化能为2 4 1 6 k j m o l 。在4 ，溶液 的表观黏度随浓度的增加而增大，且当浓度9 时，随着溶色素液浓度的增加， 黏度的增大趋势加快。在较高浓度下，溶液表现为典型非牛顿流体的假塑性流动 行为；浓度 8 时，溶液基本表现为理想牛顿流体的性质。 ( 7 ) 将亚硝基血红蛋白作为发色剂应用于肉制品，添加量以0 8 为佳，效果 明显优于亚硝酸钠发色：产品在色泽、口感、风味、质构等方面都表现出优良的 性质，亚硝残留量极少，提高了肉品的安全性；且f e 2 + 含量明显提高，对缺铁性 贫血人群有益，也可预防贫血症的发生。可将亚硝基血红蛋白作为有益因子添加 到功能性食品中，将具有广阔的发展前景。 关键词：亚硝基血红蛋白；提取；合成；性质；应用 山东轻工业学院硕士学位论文 a b s t r a c t t h eo b j e c t i v eo ft h i st o p i ci st h ed e v e l o p m e n ta n du t i l i z a t i o no fp o r c i n eb l o o d e x t r a c tt h eh e m o g l o b i n , t h e ns y n t h e s i z ei ti n t on i t r o s o h a e m o g l o b i nw i t hs o d i u mn i t r i t e t h e nu t i l i z ei ta sc o l o u ra g e n to fm e a tp r o d u c t s t h es y n t h e s i sp r o c e s so fh b n ow a s m a i n l ys t u d i e d s e v e r a lf a c t o r si m p a c t i n gt h er e s u l tw e r ee x p l o r e da n dt h em a i no n e s w e r ec h o o s e dt oo p t i m i z ep a r a m e t e r s i nt h ee n dt h es t a b i l i t ya n dr h e o l o g i c a lp r o p e r t y o fh b n ow e r er e s e a r c h e d ，a n di t sa p p l i c a t i o nw a sa l s op r e l i m i n a r i l ys t u d i e d ( 1 ) h a e m a t i cc e l ld i s r u p t i o ni sn e c e s s a r yb e f o r et h es y n t h e s i so fh b n o ，a d d i n g d i s t i l l e dw a t e ro ft h es a m ev o l u m ew i t hh a e m a t i cc e l lt oe x e c u t es o l v e n ts w e l l i n g w a l l - b r o k e nr a t ew a s9 5 s e l e c t i v eh e a t i n gm e t h o dw a su s e df o rt h ep u r i f i c a t i o no f h e m o g l o b i n ，w h e no p e r a t i n gt a k ee f f e c t i v em e a s u r e sf o ra n t i o x i d a t i o n t h ey i e l dr a t e o fp u r i f i e dh e m o g l o b i nw a s8 9 4 ( 2 ) i nt h ep a r to fp r e p a r a t i o no fn i t r o s o h a e m o g l o b i nw i t hs o d i u mn i t r i t et h e o r t h o g o n a le x p e r i m e n tl 9 ( 3 4 ) w a su s e df o ro p t i m i z a t i o no fr e a c t i o nc o n d i t i o n so f p i g m e n ts y n t h e s i s t h er e s u l ts h o w e dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r ep h5 9 0 ，h e a t i n g t e m p e r a t u r e6 5 c ，r e a c tt i m e2 5 m i n , t h ed o s a g eo fs o d i u mn i 仃i t e2 o p hv a l u eh a d t h eg r e a t e s ti m p a c to nt h er e s u l t sf o l l o w e db yt h er e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n da d d i t i o no f s o d i u mn i t r i t e ，t h ee f f e c to fr e a c t i o nt i m ew a st h em i n i m u m ( 3 ) t h es p e c t r u mg r a p ho fp i g m e n te x t r a c t i o nw e r et h es a m e a sd i n i t r o s y l f e r r o h e m o c h r o m e ( d n f h ) a n dh b n or e p o r t e db e f o r ew h i c hi n d i c a t e dt h ec o n s i s t e n c y o ft h e i rs t r u c t u r e ( 4 ) s u n l i g h t , o x i d a n ta n dm e t a li o n sc u 2 + ，a g + a n dp b 2 + h a da na d v e r s ei m p a c to n t h es t a b i l i t yo fh b n o ，t h e r e f o r et h ep r e s e r v a t i o no fp i g m e n ts h o u l db ea sf a ra sp o s s i b l e u n d e rd a r ka n dv a c u u mc o n d i t i o n s p i g m e n tw a s r e l a t i v e l ys t a b l eh e a t i n gb e l o w8 0 。c w i t h i n6 0 m i n ，m o r et h a n9 0 * cw a se a s yt ol e a dt os i g n i f i c a n tl o s so fp i g m e n t h b n o w a ss u i t a b l ef o rp a s t e u r i z e dm e a tp r o d u c t sa sc o l o u ra g e n t a c c e p t a b l ep hr a n g ei s5 9 s u c r o s ea n dg l y c e r o lc a ne n h a n c ei t ss t a b i l i t yw h i l eo t h e rf o o dm a t e r i a l sh a v el i t t l e i m p a c to nt h a t ( 5 ) t h et y p eo fs o l v e n th a dl i t t l ee f f e c to nt h ed i s s o l u t i o nr a t i oo fp i g m e n t ，d i s t i l l e d w a t e rc a nb eg e n e r a lc h o i c e u n d e rt h es a m ec o n d i t i o n sa s s i s t e dd i s s o l u t i o nm e t h o do f t h e r m o s t a t i ce l e c t r o m a g n e t i cs t i r r i n gc a ng e tg r e a t e rd i s s o l u t i o nr a t i o ( 6 ) h b n os o l u t i o no f12 w a sp s e u d o p l a s t i cf l u i da t2 5 ，t h ev a l u eo f n o n - n e w t o n i a ni n d e x ( n ) w a s0 5 7 8 2a n dt h ec o n s i s t e n c yc o e m c i e n tkw a s0 2 9 18 t h e f l o wa c t i v a t i o ne n e r g yo ft h es o l u t i o nw a s2 4 16 k j m 0 1 t h ea p p a r e n tv i s c o s i t ya t4 0 c l a r g e n 弱t h ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d w h e nc o n c e n t r a t i o nw a s 伊e m e rt h a no re q u a lt o 9 t h ei n c r e a s i n gt r e n do fv i s c o s i t ya c c e l e r a t e d a th i g h e rc o n c e n t r a t i o n st h es o l u t i o n e x h i b i t e das h e a r - t h i n n i n gp h e n o m e n o nw h i c hw e r et h ec h a r a c t e r i s t i c s o ft y p i c a l n o n n e 眦o n i a nf l u i da n db e h a v e da si d e a ln e w t o n i a nf l u i d sw h e nc o n c e n t r a t i o nw a s l e s st h a n8 ( 7 ) u s i n gh b n o 嬲c o l o u ra g e n ti n m e a tp r o d u c t sw a so b v i o u s l yb e t t e rt h a n s o d i 啪n i t r i t ea 1 1 d8 o fa d d i t i o nw a st h eb e s t p r o d u c t ss h o w i n gf i n en a t u r ei nc o l o r ， t a s t e n a v o ra n dt e x t u r ec o n t a i n e ds ol i t t l er e s i d u e so fn i t r i t et h a tt h es a f e t yo fm e a t p r o d u c t sw a s 伊e a t l ye n h a n c e da n dw e r eb e n e f i c i a lf o rp e o p l eo f i r o nd e f i c i e n c ya n e m i a , a n da l s oc 趾p r e v e n tt h eo c c 硼r e i l c eo fa n e m i aa st h ec o n t e n to ff e 2 + m a r k e d l yi m p r o v e d i nv i e wo ft h i sh b n oc a nb eu s e da sf u n c t i o n a lf a c t o ri nf o o da n dw i l lh a v e 丽d e d e v e l o p m e n tp r o s p e c t s k e y w o r d s ：n i t r o s o h a e m o g l o b i n ，e x t r a c t i o n ，s y n t h e s i s ，p r o p e r t y , a p p l i c a t i o n u 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名： 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 导师签名：趱 日期：皇乒年上月旦日 日期：丝华年上月华日 山东轻工业学院硕士学位论文 1 1 立题背景与研究意义 第1 章绪论 肉制品加工在我国有着悠久的历史，我们的祖先从原始时代的“茹毛饮血， 生吞活嚼到火的发现和利用，知道了兽肉用火烧烤滋味香美，这是火烹加工的 起源。随着陶器的发明，可以将肉用水蒸煮，为水烹的开端【1 1 。由于食盐的发现， 人们学会了对食品的烹调加工，认识到食盐不仅能调味，还能消毒抑菌，成为食 品腌制技术的启蒙。早在三千多年前，就已经开始加工肉干，以后有肉脯灌肠等 制品出现。到了距今一千四百多年前，北魏末期的贾思勰所著齐民要术一书， 总结了前人经验，搜集了大量肉制品加工和烹调技术的资料，记录了烧烤、灌制、 糟卤、酱汁等各类制作方法。相传腊肉始于唐朝，驰名中外的火腿始于宋朝。到 了明、清时代，各地具有特色的肉制品如广东烤乳猪、苏州酱汁肉等均名扬全国【2 j 。 清乾隆年问，袁枚所著的随园食单一书中，有关肉制品的记载就有五十多种。 一直到现在，随着科学技术的不断发展，肉制品加工无论是质量、品种，还是规 模，都有了前所未有的提高【3 】。 随着肉类行业的发展和壮大，围绕肉类食品加工的必备条件，如食品加工机 械、包装机械、包装材料、食品添加剂等也得到了快速发展，特别是从肉类加工、 流通，到销售冷链的形成为肉类食品行业的发展提供了良好的平台 4 1 。肉类食品生 产企业加工条件的提高，社会扶助条件的改善，为肉类食品产品质量的提高创造 了有利的环境。近年来在肉类食品行业涌现出一些知名的品牌，在这些名牌产品 的带动下，肉类食品的产品质量有了明显提高【5 。 1 1 1 肉的腌制及其发色剂的发展概况 据联合国粮农组织( f a o ) 统计：2 0 0 2 年我国生猪存栏数为4 6 4 6 9 5 万头，占 世界存栏总数的4 9 4 7 ；屠宰数为5 7 6 3 4 万元，占世界屠宰总数的4 8 1 ；猪肉 总产量为4 4 2 8 6 万吨，占世界猪肉总产量的4 7 3 ；2 0 0 6 年，我国猪肉总产量达 到5 1 9 7 万吨，占全世界总产量的5 0 1 。改革开放以来，我国肉类产品总产量从 1 7 9 0 万吨增加到7 4 0 0 万吨( 2 0 0 4 年为7 2 4 4 8 万吨) ，增长3 倍以上，人均消费肉类 食品达5 6 蚝年。我国肉制品总产量占世界肉制品总产量的2 7 3 ，这些数字表明 3 0 多年来我国肉类食品行业发展迅猛并取得了长足进步【6 7 1 。2 0 0 7 年，国内肉类总 产量达到8 7 6 5 万吨，其中，猪肉制品总产量为5 9 1 7 万吨，占肉类总产量的6 7 5 ， 且已能生产各种各样的产品：乳化型香肠、发酵香肠、金华火腿、三文治火腿等， 生产技术也由手工操作变为机械化、自动化的方式；肉制品加工所用添加剂的种 类也极为丰富，且效果奇佳，已从传统的食盐和硝的干腌发展到现在的多种添加 第l 章绪论 剂混合快速腌制，配合斩拌、注射、滚揉等不同技术措施强化腌制效果，产品质 量得到极大地提高】。 “腌制”最初的含义是“保留 或“保存 ，可能古代的人们发现腌肉色泽的 产生是由于硝酸盐以杂质形式，即作为钠盐( 智利硝石，n a n 0 3 ) 或钾盐( 孟加拉硝 石，k n 0 3 ) 出现在食盐中。因而，肉类腌制更新的概念应该是向肉中添加食盐和 硝酸盐亚硝酸盐以产生稳定、独特的腌制色泽和风味【9 j 。 现代肉制品加工中，为使产品具有鲜艳的颜色，通常使用一定量的发色剂。 硝酸盐和亚硝酸盐是肉制品生产中最常用的发色剂。据研究，亚硝酸盐添加量在 o 0 2 4 9 k g 以下时，发色作用较差；在0 0 2 4 - - 0 0 4 9 k g 时，发色程度随剂量增加而 增强；添加量在o 1 3 2 9 k g 时发色较好，亚硝残留量为4 0 p p m 。然而，亚硝酸盐本 身就是一种有毒物质，一般成年人体摄入0 3 o 5 9 即可引起中毒，3 9 即可致死， 所以，必须限制亚硝酸钠的使用量【l0 1 。据天津市红十字会医院的潘立军报道，在 2 0 0 2 年就有一个两岁多的儿童由于进食火腿肠约l o o g 而发生急性亚硝酸盐中毒引 起的高铁血红蛋白血症。因此，肉类研究者一直在积极寻求安全可靠、经济实用 的替代物 1 1 , 1 2 1 。这里简要介绍一些无硝腌制剂的研究历史： ( 1 ) 氨基酸 有学者经实验研究称某种氨基酸和肽对肌红蛋白有发色效果。其发色效果随 氨基酸和肽的种类和p h 值的不同而异。使用一种氨基酸和肽的组成物，同时并用 l o p p m 的亚硝酸钠，其发色效果可高于仅用1 0 p p m 亚硝酸钠发色的样品。又有报道 称添) j n o 5 1 0 赖氨酸盐和精氨酸等量混合物，同时并用l o p p m 的亚硝酸钠，灌 肠制品的色调可以发挥的很好。 ( 2 ) 甜菜色素 将甜菜色素作为一种着色剂用于香肠产品中，似乎有可能替代一些亚硝酸盐。有 学者称，在烟熏大香肠等产品中使用了从甜菜中提取的一种色素“甜菜红”获得良好 效果。天津轻工业学院与天津市第二食品加工厂协作，用甜菜红对火腿肠进行了 着色实验。结果表明甜菜红在大火腿肠中，由于水煮时间过长而退色或变色。当 改用小肠衣灌装并减少水煮时间以后，经感观评价，认为添加甜菜红3 2 p p m 的样 品，其色泽与添加5 0 p p m 亚硝酸钠发色的对照样品相似，但风味稍差些。而在添 加甜菜红的同时在添加约5 0 0 p p m 的抗坏血酸，其色泽和风味均与添加亚硝酸盐的 样品相仿。不过到目前为止，还没有有关这方面的进一步研究【l 引。 ( 3 ) 红曲红色素 红曲红色素是从红曲米中提取的天然色素，对蛋白质有很好的染色性，而且 颜色正常。在使香肠着色的实验中红曲红色素使用量从4 0 0 p p m 至u 3 2 0 0 p p m ，发现 使用1 6 0 0 p p m 时制作的香肠颜色最接近1 5 0 p p m 亚硝酸钠制作的香肠，且色泽随时 间变化不大。所以，将其应用于香肠中是可行的，但此系统还需进一步完善，还 2 山东轻工业学院硕士学位论文 要考虑风味和微生物学的变化。 ( 4 ) 抗坏血酸和葡萄糖 抗坏血酸具有抗氧化作用，葡萄糖可被微生物利用产生乳酸，乳酸具有抑菌 作用。在配方中还需加入玫瑰酒，这可能是着色物质，这样制作的无硝香肠肉质 柔软，但其他方面没有报道。 ( 5 ) 麦芽酚和有机铁 麦芽酚具有甜的和蜜饯样的水果香气和焦糖香味。麦芽酚和氨基酸反应后， 能增加肉品的香味。有报道在肉品加工中，不用亚硝酸盐，而是在某个工序中加 入麦芽酚，配合使用铁盐，会呈现和使用亚硝酸盐相同的色泽，麦芽酚最重要的 化学性质就是遇铁离子变紫红色，配合使用的铁盐可以是葡萄糖酸铁、柠檬酸铁 等有机铁盐，既达到了发色的目的又增加了微量元素的含量。制成品贮存一段时 间后，颜色和1 2 1 感可以被接受。这一腌制系统还需进行成品的微生物学实验【1 4 1 。 ( 6 ) 亚硝基血红蛋白 通常认为能使腌肉发色的物质是在加热时形成的亚硝基亚铁血色原。肉经亚 硝酸盐( 或硝酸盐) 腌制后产生红色的一氧化氮肌红蛋i 兰t ( m b n o ) ，在盐和加热的作 用下又会因珠蛋白变性而转变成比较稳定的色素亚硝基亚铁血色原。这种亚 硝基肌红蛋白或亚硝基血红蛋白也称为腌肉色素，是一种粉红色的色素。由于肌 红蛋白和血红蛋白结构的相似性，亚硝基亚铁血色原不仅可以由肌红蛋白转化而 成，也可以由血红蛋白制备。亚硝基血红蛋白与亚硝基亚铁血色原结构的一致性 决定了它将是一种很理想的肉制品添加剂。而且，作为原料之一的血红蛋白来源 广泛且安全可靠。据资料显示，猪血占猪活体总重的5 ，屠宰后所能收集到的血 液约占总量的6 0 - - 7 0 。以屠宰一头毛猪可收集2 5 - 3 o k g 血液计，全世界每年 可以利用的畜禽血液总量是相当可观的【”】。中国从1 9 9 3 年以来，肉类生产量一直 居于世界第一的位置。2 0 0 5 年，猪牛羊出栏总数达到7 亿6 千万头，畜血总量达2 2 0 多万吨，且在过去的十年中，中国的肉类年平均增长率是世界最高的【1 6 】。因此， 用猪血作为原料合成亚硝基血红蛋白在经济上是可行的。此外，猪血营养丰富， 全血含有1 7 - - - 2 1 的蛋白质，从氨基酸组成来看，血液蛋白质是一种优质蛋白质， 其必需氨基酸含量高于人乳和全蛋，尤其是赖氨酸含量很高，接近9 o 。从蛋白 质互补的角度来看，由于谷物蛋白质中赖氨酸含量低，蛋氨酸和肮氨酸含量高， 异亮氨酸含量适当，血液的高赖氨酸含量使其成为很好的谷物蛋白互补物【1 7 】。此 外，血红素铁是血液的另一种重要营养素，每1 0 0 9 猪血中铁含量高达4 0 m g ，因人 体对这种铁的吸收率是无机铁的3 倍，可作为很好的补铁剂【l 引。因此，用猪血合成 亚硝基血红蛋白不仅不会破坏血液的营养价值，而且亚硝基血红蛋白将是一种多 功能的食品添加剂。 第l 章绪论 1 。1 2 亚硝酸盐在肉制品中的作用及其毒性 腌制是肉制品加工中一道重要的加工工序，自古以来，人们就使用硝酸盐、 亚硝酸盐来制作腌肉制品，但系统的使用亚硝酸盐作为肉类加工添加剂是从1 9 2 5 年开始的，因为在那时研究人员发现，硝酸盐和亚硝酸盐除了能改善和保持肉制 品特有的鲜艳色泽外，还能抑制肉类的腐败，延长贮藏时间，尤其是抑制肉毒梭 状芽胞杆菌的生长、防止肉毒素的产生；此外，还能使产品具有独特的芳香味及 抗氧化能力，有效的预防熟肉制品“过热味”的产生【1 9 , 2 0 。 1 1 2 1 亚硝酸盐的发色作用 腌制肉的颜色取决于三个因素：肌肉组织中肌红蛋白的浓度；转化为 亚硝基色素的程度；肌肉蛋白的状态。为了使肉制品呈现鲜艳的红色，在加工 过程中常添加硝酸盐或亚硝酸盐。产生最佳腌制色泽的亚硝酸钠最低添加量为 4 0 m g k g 原料肉【2 。鲜肉中的肌红蛋白为还原型( 含f e 2 + ) ，呈暗紫色，很不稳定， 易被氧化变色，其中的f e ”上的结合水被分子状态的氧置换，形成氧合肌红蛋白， 色泽鲜红。这种结合不是氧化而称氧合，所以，此时铁仍为二价。当氧合肌红蛋 白在氧或氧化剂的存在下进一步将f e 2 + 氧化成f e ”时，则生成高铁肌红蛋白，呈褐 色【2 2 】。 亚硝酸钠用于肉制品发色的呈色反应基本分三步：首先，硝酸盐被还原性细 菌在酸性条件下作用形成亚硝酸盐，亚硝酸盐在微酸性条件下形成亚硝酸。一般 屠宰后成熟的肉含乳酸，故不需再额外添加酸性物质即可生成亚硝酸。反应过程 如下： n a n 0 3 - - n a n 0 2 + 2 h 2 0( 1 1 ) n a n o ：+ c i - 1 3 c h o h c o o h ，h n o 。+ c h 3 c h o h c o o n a ( 1 2 ) 其次，亚硝酸是一个非常不稳定的化合物，在腌制过程中被还原性物质作用 形成一氧化氮( n o ) 。n o 的形成速度与介质的酸度、温度以及还原性物质的存在有 关。所以，形成n o 肌红蛋白( m b n o ) 的过程需要有一定的时间。亚硝酸盐的发 色速度比硝酸盐的快，在工业化的肉制品生产中常被更多地选用。此外，加抗坏 血酸( v c ) 或生育酚( v e ) 等还原剂能加速n o 的形成。 2 h n 0 2 - 2 n o + h 2 0( 1 3 ) 最后n o 与还原状态的肌红蛋i 刍( m b ) 反应结合生成亚硝基肌红蛋白( m b n o ) ， 赋予肉特殊的腌制红色。抗坏血酸的存在可以阻止m b n o 被空气的进一步氧化， 使其形成的色泽更加稳定。 n o + m b - - - m b n o ( 1 4 ) 在烹制或加热过程中，亚硝基肌红蛋白转变为亚硝基血色原，呈独特的粉红 色。 4 山东轻工业学院硕士学位论文 由( 1 3 ) 式可知，亚硝酸分解生成n o 时，也生成少量硝酸，而n o 在空气中 也可被氧化生成n 0 2 ，n 0 2 再与水反应生成硝酸。反应如下： 2 n o + 0 2 2 n 0 2 ( 1 5 ) 2 n 0 2 + h 2 0 h n 0 2 + h n 0 3 ( 1 6 ) 如式( 1 5 ) 、( 1 6 ) 所示，不仅亚硝基被氧化生成硝酸，而且还抑制了亚硝基肌 红蛋白的生成。硝酸具有很强的氧化作用，即使肉中含有很强的还原性物质，也 不能防止肌红蛋白部分氧化成高铁肌红蛋白。因此，在使用亚硝酸盐时，应该同 时使用l 抗坏血酸及其钠盐等还原性物质来防止肌红蛋白被氧化，这样也可以把 褐色的氧化型高铁肌红蛋白还原为红色的还原型肌红蛋白，以助发色【2 3 j 。 1 1 2 2 亚硝酸盐的抑菌作用 亚硝酸盐可以抑制肉毒梭状芽胞杆菌的生长及其毒素的产生，其抑菌能力的 大小与其在肉制品中残留的浓度成正比渊。此外，它还具有抑制许多其它类型腐 败菌生长的作用，但抑菌机理仍不甚明了。有研究认为，亚硝酸盐的抗氧化能力 改变了含铁离子的酶的作用机制，破坏了细菌的正常生长代谢，从而抑制其生长 和代谢产物的生成。也有研究认为，抑菌作用机理是亚硝酸钠与蛋白质具有亲和 力，并用猪腹部的肉制作的咸肉，发现，当添加n a n 0 2 的量为1 5 6 m g k g 时，约 1 4 的亚硝酸钠以某种形式与蛋白质结合，其中5 , - - - 1 5 与巯基结合【2 5 j 。 亚硝酸盐用量在1 0 - 4 0 m g k g 时，就能使腌肉产生良好的色泽和风味，但这 样低的使用量，仅能满足亚硝酸盐全部与肉的基质结合，在腌肉中只有游离的亚 硝酸盐具有抑菌效果【2 6 】，因此，在腌制过程中一般使用1 2 0 - 1 5 6 m g k g 的亚硝酸 盐，其最低抑菌浓度见表1 1 。可以看出，同等浓度的亚硝酸钠对细菌的抑制作用 在真空条件下比有氧条件要明显的多。 表1 1 亚硝酸盐对部分为生物的最低抑制浓度 t a b 1 1m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o no fn i t r i t e so nb a c t e r i a 细菌 m i c ( 加热后硝酸钠的最低抑菌浓度) p p m 真空有氧 目前，比较被学者认同的亚硝酸钠抑菌方式有以下4 种：亚硝酸钠结合细菌 5 第l 章绪论 细胞壁上的毓基；阻断蓝绿色假单胞菌的氧传输及氧化磷酸化；n o 与发芽细胞中 的含铁化合物如铁氧化还原蛋白反应；亚硝酸钠抑制某些代谢反应的酶 2 7 , 2 8 】。 1 1 2 3 亚硝酸盐的对风味的影响 亚硝酸钠的另一个重要特性是产生典型的腌肉风味 2 9 1 。有学者报道，在香肠 中添加2 5 - - 一5 0 m g k g 的亚硝酸钠，就足以产生典型的腌肉色泽和风味。研究表明， 腌肉风味是由许多化合物累加效果产生的复合感觉。此外，亚硝酸盐有一定抗氧 化能力，能够抑制肉制品中脂肪颗粒的自动氧化，降低由脂肪自动氧化而生成的 羰基化合物的浓度，从而抑制脂肪氧化味的产生【3 。 1 1 2 4 亚硝酸盐的抗氧化性 原料肉中的多不饱和脂肪酸易于被氧化，在不同的产品中不饱和脂肪酸含量 的顺序是：羊肉 猪肉 鸡肉 d c ，即终产物受p h 值影响最大， 其次是反应温度和n a n 0 2 添加量，反应时间对结果的影响最小。 根据以上实验结论，控制最佳条件，做两次平行实验，产物平均o d 值为0 6 7 5 ， 且稳定性很高，光照下2 天后仍呈较鲜艳的红色，与结论吻合，说明以上实验结论 具有可靠性。 3 3 4 亚硝基血红蛋白色素的鉴定 光谱特性可以反映出血红蛋白的结构性质，主要是其中血红素铁价位的变化 和铁的其他状态如自旋、配位键以及铁在卟啉环平面的位移。合成的色素用8 0 丙 酮抽提，抽提液在4 5 0 n m - - 6 5 0 n m 作光谱扫描，结果见图3 5 。 图3 5 亚硝基血红蛋白色素的光谱扫描图 f i g 3 5t h es p e c t r a ls c a n n i n go f h b n o 3 1 ； 舛 s j 5 ； 第3 章猪血亚硝基j i l l 红蛋白的合成研究 由图3 5 可以看出：吸收峰出现在4 8 0 n m 、5 4 2 n m 和5 6 4 n m 处，根据s h a h i d i ( 1 9 8 5 ) 等人及张坤生( 1 9 9 5 ) 所报道的结果5 6 3 3 n m 、5 3 8 8 n m 和4 7 7 9 n m 处有吸收峰，说明 反应确有亚硝基血红蛋白结构生成，但三个吸收峰发生了一定的位移，推断可能 是由于血红蛋白分子的二级结构被轻微干扰、发生异构而造成的。 3 3 5 亚硝基血红蛋白的分析检测 3 3 5 1 蛋白质、水分、灰分及亚硝酸盐残留量的测定 冷冻干燥后的亚硝基血红蛋白色素为深红色粉末，其组成分析见表3 9 。 表3 9 冻干产物的组成分析 t a b 3 9c o m p o n e n ta n a l y s i so ff r e e z e - d r y i n gp r o d u c t s 3 3 5 2 氨基酸含量的测定 用高速氨基酸自动分析仪测定产物的氨基酸含量，结果见表3 1 0 。 表3 1 0 亚硝基血红蛋白粉末中的氨基酸及含量 t a b 3 10t h ev a r i e t i e sa n dt h ec o n t e n to fa m i n oa c i di nh b n o 从表3 1 0 可以看出，亚硝基血红蛋白的氨基酸组成情况与普通的食物原料，如 大豆、牛肉、蛋类有很大不同，除了异亮氨酸和色氨酸外都显著高于相应的氨基 酸含量，与f a o 要求比较，只有异亮氨酸、蛋氨酸低于其标准，基本可以满足人 体对氨基酸种类及比例的要求。因此，亚硝基血红蛋白不仅可以作发色剂，还可 以作调味剂，同时还能增强着色食品的营养性。 3 2 山东轻工业学院硕士学位论文 3 4 本章小结 ( 1 ) 用猪血血红蛋白经硝基化后合成亚硝基血红蛋白是可行的，合成的优化参 数为：以异v c 钠作抗氧化剂，用柠檬酸调p h 5 9 0 、添加2 o 亚硝酸钠、6 5 。c 加热 反应2 5 m i n 。 ( 2 ) 合成产物在真空冷冻升华干燥机内冻干，产物体积膨大疏松，有特殊的芳 香味，产品得率以原血液计约为1 5 。 ( 3 ) 本实验产物既可用作肉制品发色剂，同时又能提供优质蛋白质、强化营养； 且利用来源广泛的猪血为原料，减少了营养资源的浪费与环境污染，具有重要的 实际意义。随着人们对食品安全性的日渐关注，其研究、开发与应用将会有广阔 的前景。 3 3 山东轻工业学院硕士学位论文 第4 章猪血亚硝基血红蛋白性质的研究 4 1 材料与设备 4 1 1 主要实验材料 亚硝基血红蛋白色素，本实验室自制； 亚硝酸钠，丙酮，氯化钠，抗坏血酸，柠檬酸，氢氧化钠，硝酸银，硫酸锌， 硫酸铜，氯化铁等，均为分析纯； 4 1 2 主要仪器与设备 a l c 2 1 0 4 型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 t d l 5 台式离心机上海安亭科学仪器厂 u v 扫描型紫外可见分光光度计上海优浦科学仪器有限公司 l x j i i 高速离心沉淀机上海医用分析仪器厂 h 1 8 4 2 4 n e w 便携式防水型p h m v c 澳j 定仪北京哈纳科仪科技有限公司 7 2 2 s 可见光分光光度计上海精密科学仪器厂 f d 5 真空冷冻干燥机上海金鹏分析仪器有限公司 n d j 4 旋转黏度计深圳市三诺电子仪器有限公司 7 8 h w - 1 恒温磁力搅拌器金坛荣华仪器制造有限公司 b o h l i n k t b s 0 流变仪英国s t a b l em i c r os y s t e m s 公司 其它仪器均为实验室常用设备 4 2 实验方法 4 2 1 亚硝基血红蛋白色素的稳定性 将冻干色素配成一定浓度的溶液，测定温度、不同的光照、p h 、金属离子、 氧化剂和还原剂、食品辅料、防腐剂、保护剂等对色素稳定性的影响。 4 2 1 1 亚硝基血红蛋白色素的热稳定性 取实验室自制亚硝基血红蛋白冻干粉末样品，配成5 0 9 l 的溶液，各取2 0 m l 装 于1 5 只试管中，每3 支为一组，分别于6 0 、7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0 。c 水浴加热，分别在加 热时间为o 、3 0 、6 0 、9 0 、1 2 0 r a i n 时取样l m l ，$ 1 1 9 m l 蒸馏水稀释，在5 4 0 n m 处测 定吸光度。每个样重复测三次，取平均值。 4 2 1 2 亚硝基血红蛋白色素的光照稳定性 ( 1 ) 不同光照射 3 5 第4 章猪j f l l 弧硝基血红蛋白的性质研究 分别取l o m l5 0 9 l 亚石肖基血红蛋白溶液于具塞试管中，于阳光、日光灯、紫外 灯下照射，每隔一定的时间取一个样，离心并稀释同样的倍数，在5 4 0 r i m 处测定吸 光度。每个样重复测三次，取平均值。 ( 2 ) 避光条件 分别取l o m l5 0 l 亚硝基血红蛋白溶液于具塞试管中，避光放置，每隔一定的 时间取一个样，其余操作同上。 4 。2 1 3p h 对亚硝基血红蛋白色素的稳定性的影响 取实验室自制亚硝基血红蛋白冻干粉末样品，配成5 0 9 l 的溶液，分别用4 m o l l 的h c l 和2 m o l l 的n a o h 溶液调节p h 为2 1 1 ，室内避光放置，每隔一定时间观察 颜色变化并于5 4 0 n m 处测定吸光度。 4 2 1 4 金属离子对亚硝基血红蛋白色素的稳定性的影响 取实验室自制亚硝基血红蛋白冻干粉术样品，配成含不同金属离子( n 矿、 m 9 2 + 、c a 2 十、z n 2 + 、c u 2 + 、a r 、f e 3 + 、p b 2 + 、s n 2 + ) 的溶液，离子浓度均为lx 1 0 4 m o l l ， 室温下避光放置，每隔一定的时间，在5 4 0 n m 处测定吸光度值。 4 2 1 5 氧化剂和还原剂对亚硝基血红蛋白色素的稳定性的影响 取定量的实验室自制亚硝基血红蛋白冻干粉末样品，分别配制含0 2 ， o 4 ，0 6 ，0 8 ，1 o 的h 2 0 2 、n a h s 0 3 溶液，室温下避光放置，每隔一段时 间观察颜色变化并在5 4 0 n m 处测定吸光度值。 4 2 1 6 血红蛋白保护剂对亚硝基血红蛋白色素的稳定性的影响 在血红蛋白的保藏过程中，为了防止蛋白质的变性沉淀，常常加入保护剂来 维持血红蛋白的稳定性，常用的保护剂为蔗糖和甘油。现分别检测蔗糖和甘油对 亚硝基血红蛋白的稳定性影响，具体操作为：将实验室自制亚硝基血红蛋白冻干 样品，配成5 0 9 l 的溶液，分别j j l ：l n 1 0 m g m l 的蔗糖和甘油，避光放置。每隔一定 时间取5 m l 离心并稀释相同的倍数测定a 5 4 0 。 4 2 1 7 防腐剂对亚硝基血红蛋白色素的稳定性的影响 以山梨酸钾作为防腐剂，配制含不同浓度山梨酸钾的色素溶液，避光放置， 每隔一定时间测定一次a 5 4 0 。 4 2 1 8 食品辅料对亚硝基血红蛋白色素的稳定性的影响 分别取同等质量的亚硝基血红蛋白粉末加入质量分数为1 0 的淀粉、磷酸盐、 葡萄糖和大豆分离蛋白溶液中，放置不同时间后观察颜色变化并离心取沉淀，用 8 0 丙酮溶液提取色素并过滤，滤液在波长5 4 0n l n 处测吸光度。 3 6 山东轻工业学院硕士学位论文 4 2 2 亚硝基血红蛋白色素的溶解性 ( 1 ) 溶解率的计算 取一张滤纸( 质量为m 1 ) ，称取一定质量的亚硝基血红蛋白( m 2 ) ，将其溶解后 用滤纸过滤，将滤纸置于干燥箱中烘干至恒重( 前后质量差不超过0 0 0 0 2 9 ) ，称其 质量为( m 3 ) ，溶解率的计算公式为： 溶解率( ) =m 2 - ( m 3 - m , ) 1 0 0 m 2 ( 4 1 ) ( 2 ) 溶剂和溶解方式的选择 分别用o 1 m o l ln a 2 c 0 3 、蒸馏水、无水乙醇、体积分数6 5 乙醇和o 1m o l l n a o h 等作为溶剂，用玻璃棒搅拌、电磁加热搅拌和均质作为助溶手段，以亚硝基 血红蛋白溶解率为比较指标，考察亚硝基血红蛋白的溶解性。 4 2 3 亚硝基血红蛋白溶液的流变学性质 4 2 3 1 溶液流体性质的确定 将自制亚硝基血红蛋白冻干样品配成浓度为1 2 的溶液，在不同的剪切速率 下测定其表观黏度【鲫。 4 2 3 2 温度对亚硝基血红蛋白溶液表观黏度的影响 将自制亚硝基血红蛋白冻干样品配成浓度为1 2 的溶液，分别测定其在4 、1 0 、 1 5 、2 0 、2 5 、3 0 、3 5 、4 0 下的表观黏度。 4 2 3 3 浓度对亚硝基血红蛋白溶液表观黏度的影响 分别将自制亚硝基血红蛋白冻干样品配成浓度为1 0 、1l 、1 2 、1 3 、1 4 、 1 5 、1 6 的溶液，在2 5 下测定它们的表观黏度。 4 2 3 4p h 对亚硝基血红蛋白溶液表观黏度的影响 将自制亚硝基血红蛋白冻干样品配成浓度为1 2 的溶液，在2 5 分别测定其 在p h 为3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、1 0 、1 1 下的表观黏度。 4 2 3 5 亚硝基血红蛋白溶液触变性研