（食品科学专业论文）嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖的分离提取及其免疫活性的研究.pdf

嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖的分离提取及其免疫活性研究 摘要 嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) 是乳酸菌家族中的重要一员，它能 在肠道中定植，当达到一定数量时，能改善或调节肠道微生物菌群的平衡、增强 机体免疫力及抑制肿瘤细胞的形成等。肽聚糖( p e p t i d o g l y c a n ，p g ) 是细菌等原 核生物细胞壁的特有组成成分。真核细胞中不含肽聚糖，因此肽聚糖成了真核生 物免疫系统识别的理想靶位。研究表明，高等真核生物体中含有若干肽聚糖识别 分子，这些活性分子通过不同的信号传导途径诱导释放免疫调控物质，从而露0 激 免疫系统发挥免疫功能。目前，双歧杆菌细胞壁肽聚糖已被成功分离提取出来， 并被证明是一种新型的非特异性免疫增强剂。而嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖的相关 研究还鲜见报道。因此，在对嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖进行分离提取研究的同时， 结合生理活性试验证明其免疫活性，对深层次开发嗜酸乳杆菌微生态制剂及益生 菌免疫佐剂具有重要意义。 本文在筛选生长期短、产量大的嗜酸乳杆菌菌株，优化增菌培养基的基础上， 分别采用超声波法、溶菌酶法及三氯乙酸法分离提取嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖， 并通过生理活性试验证明得到的嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖具有抗肿瘤及免疫调 节功能，为嗜酸乳杆菌微生态制剂及益生菌免疫佐剂的研究和开发奠定了良好的 基础。实验内容及结果如下： 1 开展了菌株筛选及培养基优化的研究。通过对多株嗜酸乳杆菌菌株进行筛 选，得到了1 株生长期较短、产量较大的嗜酸乳杆菌菌株【丑2 ；在此基础上进行 了增菌培养基的优化。使用优化得到的增菌培养基测定i , a 2 的生长曲线，确定了 增菌培养基培养终止时间为1 2 h ，此时o d 6 0 0 值为2 1 6 7 ，p h 值为4 0 1 ；通过平 板菌落h - 塑t ，活菌数为3 8 x 1 0 9 c f u m l ，是普通b t r s 培养基的5 4 倍。 2 采用超声波法、溶菌酶法、三氯乙酸法分离提取i a 2 细胞壁肽聚糖。其中 超声波法的最优组合为：超声功率4 0 0 w 、超声时间3 0 r a i n 、超声温度4 0 c ， 肽聚糖得率为1 0 2 ；溶菌酶法的最优组合为：溶菌酶添加量4 m g m l ，水浴温 度5 5 ，作用时间5 h ，p h 值7 ，肽聚糖得率为1 0 o ；三氯乙酸法肽聚糖得率 为1 5 8 。通过多重比较，确定使用三氯乙酸法提取嗜酸乳杆菌1 a 2 细胞壁肽聚 糖。 3 对得到的肽聚糖提取物的氨基酸组成进行了分析，其主要氨基酸组成天 冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸均为嗜酸乳杆菌肽聚糖上与n 一乙酰胞壁酸羧 基连接的肽链上的氨基酸分子；同时测得肽聚糖提取物的氨基己糖浓度为 2 8 3 1 m m o l g ，磷含量为0 0 3 1 9 m g g ，分子量主要分布在3 0 k d 左右。 4 证明了l a 2 细胞壁肽聚糖对荷瘤小鼠s - 1 8 0 肉瘤生长的抑制作用。嗜酸 乳杆菌i 北细胞壁p g ( 8 0 m g m l ) ( 抑瘤率为5 4 5 ) 能极显著的抑制荷瘤小鼠 s - 1 8 0 肉瘤的生长( p 0 0 1 ) ，并能极显著的提高荷瘤小鼠的脾指数及肾上腺指 数( p o 0 1 ) 。 关键词：嗜酸乳杆菌。肽聚糖，免疫活性 e x t r a c t i o na n di m m u n i t ya c t i v i t yo fp e p t i d o g l y c a ni n a b s t a c t a sa l li i 】叩吼t a n tm e m b e ro fl a c t i ca d db a c t e r i a , l a c t o l c i u u sa c i d o p h i l a sc a ni n l d l ) i ti n i n t e s t i n a lt r a c t r e h e nc o h o st os u b s t a n t i a la r n o t u l t s l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sc 龃i m p r o v e 讲 r e g u l a t et h eb a l a n c eo f i n t e s t i n a lt r a c tf l o r a , s u n g t h e nb o d yi m m u u l t ya n dr e s t r a i nt h ef o r m a t i o n o ft o m o ra n dc i c p e p d d o g l y c a nw h i c hi sa l s oc a l l e dm u c o p e d d e , 0 y c o p e 砸d ea n dm u r e i ni sa s p e c i a lc o m p o n e n ti np r o k a r y o c i eo r g a n i s mc e l lw a l lp e p t i d o g l y c a nb e c o m e st h ei d e a lt a r g e tf o r r e c o g n i z i n gh 1 3 m t m es y s t e mo fe u k a r y o t e sa st h e r ei sn op e p f i d o g l y c a ni ne u c y t e s r e s e a r c h e s i n d i c a t e dt h a tt h e r ew a sal o to fp e p t i d o g l y c a nr e c o g n i z i n gm o l e c u l e si na d v a n c e de u k a r y o t a s , w h i l et h e s ea c t i v em o l e c u l e si n d u c e dt h er e l e a s i n go fh n m u n a lr e g u l a t i n gn 嵋山奠i a i sb yd i f f e r e n t s i g n a l t r a n s m i t t i n gw a y s t h u si m m u s y s t e mw a ss t i m u l a t e d 幻p e r f o n ni m m u n ef t m c l i o n $ p e p t i d o g l y c a ni nt h ec e l lw a l lo fb i f d o b a c t e r i u r ah a da l r e a d yb e e na 【t 曙c t e ds u c c e s s f u l l ya n dw a s p r o v e dt ob ea w n s p c c i 丘ci m m u n i t ye n h a n c e rw h i l ei q 柳sr e l a t e dt op e p d d o g l y c a ni nc e l l w a l lo fl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s 啪ss c a l e e ，i ti so fg r e a t 血p 0 蛐t os t u d yt h ep r o c e s so f e x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no f p e p t i d o g l y c a ni nc e l lw a l lo f l a c t o b a c u sa c d o p h u sw eh a v eg o t a n d c o m b i n e s i t t o p h a r m a c o l o g y a s s a y t o d e v e l o p m e n t o f m e d i c i n e l a c t o b a c l u u sa c i d o p h i l u so fs h o r tu ：_ o p h o p h a s ea n dl a r g ey i e 埘l a 2w a ss c a n n e da n dt h e e n r i c h m e n t m e d i u m f o r l a 2 w a s 哪咄咀i z e d i n t h e e a r l ys t a g e o f t h i s 肼i p l t h e n p e p t i d o g l y e a n w a s e x t r a c t e da n dp u r i f i e db yu l t r a s o n i cw a v em e t h o d , l y s o z y m em e t h o da n dt r i e h l o r o a c e d cm e t h o d , a n t i - t u m o ra n dt m m l ：m t t yr e g n l a t i o ne f f e c tw e r et e s t e db yp h a r m a c o l o g ya s s a ya f t e rt h es t u d ya n d d e v e l o p m e n tt op r o b i t i c si m m u n i t ya d j u v a n t t h ec o n t e n ta n dm a l t so f t h ep a p e rw a s f o l l o w s 1 l a 2w a ss c a n n e da sas u a i no fl o c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u so fs h o r tu o p h o p h a s ea n dl a r g e y i e l d 丘_ 0 ml o to fl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s 捌r 缸璐a n de n r i c h e dm e d i n mw a so v e m i z e d 凼r o u g h o p t i m i z i n gb a s i cm e d i n t na n de n r i c h m e n tf a c u r sb ys i n g i cf a c t o ra n d 茁t h o g n n a lt e s tg r o w t h c u l v ew i t ho p t t m i z e de n r i c h e dm e d i u i nw e r ed e t e r m i n e db yf o l l o w i n gt h ec h a n g eo f p na n do d e e e a c c o r d i n gt ot h eg r o w t ho v e 。t h et e r m i n a lt i m ew a sa t 1 2 h 1 _ a 2g o tt o3 8 x 1 0 9 c f _ i 】m li nt h i s c u l t u r ef o r1 2 h 缸3 7 w h 既o d e e ow a s2 1 6 7 w h i l ep hv a l u ew a s4 0 1 2 p e p f i d o g l y c a ni nl a 2c e l lw a l lw a se 】【檀a c t e da n dp u r i f i e db yu l t r a s o n i cw a v em e t h o d , l y s o z y m em e t h o da n du i c h l o r o 日c e t i cm e t h o d t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o ru l t r a s o n i cw a v em u l t r a s o n i cp o w e r4 0 0 w , u l t r a s o n i ct i m e3 0 m i n 。i l l 嗽l s 伽血t e m p e r a t u r e4 0 。y i e l dr a t eo f h i p e p t l d o g l y c a nw a s1 0 2 ：t h eo p a m a lc o n d i t i o n sf o rl y s o z y m em e t h o dw e r el y s o z y m e4 m g m l , t e m p e r a t u r e5 5 1 ：+ t i m e5 1 1 , p hv a l u e7 y i e l dr a t eo fp e p t i d o g l y e a nw a sl o ：y i e l dr a t eo f p e p f i d o g l y c a nb yt r i c m o r o a c e t i cm e t h o dw a s1 5 8 s ou i c h l o r o a c e f i cm e t h o dw 罄i t e dt o “妇c cp e p t i d o g l y c a ni ni a 2c e l lw a l lt h r o u 9 1 am u l t i p l e m l m i s o 蚰 3 p e p t i d o g l y e a ni ni a 2c e l lw a l lw a si d e n t i f i e d c o m p o n e n t sa n dc o n t e n to f a l l i l l oa c i dw a s d e t e r m i n e db y 艘m e t h o dt h a t 鲫 g l u , g l y , l y sw 曲a l l l i l l oa c i dm o l e c u l a rc o n n e c t e d p e p t i d o g l y c a no fl a 2a n dn - a c e t y i m u r a m i ca e i e kd n sm e t h o dw a su s e dt oa u a l y s i st h e c o n c e n t r a t i o no fa m i n o h e x o s e ，r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no ft m f i n o h e x o s ew a s 2 8 3 1 m m o l g ；c o n t e n to fp h o s p h o r u sw h i c hw a s0 0 3 1 9 m g gw a sd e t e r m i n e db yp h o s p h a l a s c o n t e n ta n a l y s i s ；s d s - p a g ee l e c t r o p h o t e s i sr e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h tw a s k o u n d3 0 k d 4 t h ee f f e c to fp e p d d o g l y c a ne x t r a c t e df r o ml a 2c e l lw a l lo ns - 1 8 0t l l l n o l i ns - 1 8 0l l l l n o l m i c e m o d e lw a st e s t e d r e s u l t ss h o w e dt h a tp e p d d o g l y c a n ( 8 0 m g m l x a n t i - t u m o rr a t i o5 4 5 ) c o u l d e x t r e m e l ys i g n i f i c a n t l yr e s t r a i n e dl h cg r o w t ho fs - 1 8 0t i l i n o gi n8 - 1 8 0t u m o l m i c em o d e l ( p o 0 1 ) w h a tm o r e , p c p t i d o g l y c a n ( 8 0 m g m l ) c o u l de x t r e m e l ys i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dt h e s p l e e ni n d e xa n da d r e n a l9 1 di n d e x ( p 0 0 1 ) a st h e r ew a sn os i g n i f i c a n t l ye f f e c to nt h e i m m u n ea c t i v i t yo f p e p f i d o g l y c a ni nl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sc e l lw a l lo b t a i n e db yt c am e t h o d , t h i sm e t h o dc o u l db eu s e dt oe x a c ta c t i v ep e p t i d o g l y c a ni nl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sc e l lw a l l i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所傲的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 一躲甜琦掷期；纠如2 汩 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文同意吉林农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 学位论文作者签名： 导师签名： 勃一为 签字日期： ，) 。卯年6 月2 珀 厂 签字日期： 刎年月2 2 日 吉林农业大学硕士学位论文嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖的分离提取夏其免疫活性研究 1 本研究的概述 刖吾 本研究作为吉林省科技发展计划项目新型功能性乳制品的研制与产品开发研究” 的重要组成部分，是为了填补国内嗜酸乳杆菌肽聚糖免疫调节活性相关研究的空白，拓 宽嗜酸乳杆菌微生态制剂及相关药品的研究开发思路而开展起来的。其主要内容是在筛 选生长期短、产量大的嗜酸乳杆菌菌株，优化增菌培养基的基础上，通过对分离提取嗜 酸乳杆菌细胞壁肽聚糖的三种方法超声波法、溶菌酶法及三氯乙酸法进行分析比较，确 定了采用三氯乙酸法提取嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖；并通过生理活性试验证明了得到的 肽聚糖提取物具有抗肿瘤及免疫调节活性，为嗜酸乳杆菌微生态制剂及益生菌免疫佐剂 的研究和开发奠定良好的基础。本研究本研究所取得的创新性成果为嗜酸乳杆菌细胞壁 肽聚糖的迸一步研究、嗜酸乳杆菌系列产品的深层次开发利用奠定了基础。同时，为嗜 酸乳杆菌及益生菌系列产品的生产开发提供科学合理的工艺技术，并对益生菌微生态制 剂的规范化生产和工艺质量监控起到了一定的指导作用。 2 国内外研究现状 2 1 嗜酸乳杆菌的研究进展 2 1 1 关于益生菌 益生菌一词源于希腊语，意为“活的，共生的”。由l i l l y 和s t i l l w d l 首先在1 9 6 5 年提出，描述为“由一微生物分泌的能够促进另一种微生物的生长的物质”h l 。1 9 7 4 年 美国学者p a x k e 将益生菌定义为“是维持宿主肠道内微生物平衡的微生物或物质”闭。 目前大家普遍接受的益生菌定义是1 9 8 9 年英国学者f u l l e r 提出的。f u l l e r 将益生菌概括 为“以活菌形式提供补充，通过促进肠道内微生物的平衡对宿主产生有益影响的菌 体”【，j 。随着研究的不断深入，1 9 9 4 年德国h e r b o m 会议对益生菌又作了修改：益生菌 是供口服或经由其他粘膜途径投入，存在粘膜表面处改善微生物和酶的平衡或刺激特异 性和非特异性免疫机制，含活菌和( 或) 死菌包括组分和产物的微生物制剂【4 】。 常用的益生菌是产生乳酸的细菌，如嗜酸乳杆菌和双歧杆菌，它们是人类肠道的重 要生理菌，对机体有多种其它正常生理菌群无法比拟的生理作用。目前益生菌及其制品 吉林农业大学硕士学位论文嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖的分离提取殛其免疫看性研究 已成为国内外研究的热点，在食品、保健品、药品等领域已有多种益生菌制剂问世。 2 1 2 嗜酸乳杆菌的生理生化特性 嗜酸乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) 包括嗜酸乳杆菌属、食淀粉杆菌属、卷 曲乳杆菌、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌嘲。最初是由奥地利的m o r o 于1 9 0 0 年从母乳喂养 的幼儿粪便中分离出来的网，也分离自威人的口腔和阴道、火鸡和小鸡的肠道、老鼠的口 腔和肠道。嗜酸乳杆菌为革兰氏阳性无芽孢的细长杆菌，两端圆，通常0 6 - - 0 9 x o 5 - 6 毫 米，无鞭毛，无荚膜。以单个、成双和短链出现，兼性厌氧或微需氧菌。菌落通常粗糙， 用显微镜观察一般显示缠绕或微毛丝状物，从似暗影的菌堆的中心放射出。深层菌落呈 放射或分枝的不规则状。无特有色素。细胞壁肽聚糖为l 赖氨酸- d - 天冬氨酸盐型，通 常缺乏磷壁酸。在某些菌株中可测出少量甘油磷壁酸，细胞中不含任何可鉴别的己糖和 戊糖( c u m m i n s 和h a r r i s1 9 5 6 ) 。 菌株在血清学上表现不同，类群反应未得到证实。需要乙酸盐或甲羟戊酸、核黄素、 泛酸钙油酸和叶酸、不需要外源硫胺素、毗哆醛和胸腺嘧啶核甙。通常不需要维生素 b 1 2 。最适温度3 5 。c 3 8 。c ，生长初始p h 值5 5 , - 6 0 。某些菌株可发酵糖原，通常发酵弱。 某些菌株发酵蜜二糖、棉籽糖或对两者均可发酵。嗜酸乳杆菌属同型发酵，产生d l - 孕l 酸。其它碳水化合物发酵产物通常少于1 0 t 7 1 。 2 1 3 嗜酸乳杆菌及其代谢物的生理功能 嗜酸乳杆菌与人类健康的关系可以追溯到1 9 0 8 年嗍，当时俄国科学家m e t l a t i k o f f 发表了著名的长寿的秘诀 ( t h e p r o l o n g a t i o n o f l i f e ”) ，开启了乳酸菌研究的先 河。2 0 世纪3 0 年代以来，人们逐渐认识到嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等乳酸菌在肠内存在的 可能及其作用，再次掀起了乳酸茵研究的热潮。同时人们也注意到，不能在肠内定殖存 活的乳酸菌代谢产物及溶菌后释放的酶等也能发挥有益的整肠效能。 随着人们对肠道微生物与健康关系的认识和研究的不断深入，以及临床医学、悉生 生物学、微生物学和食品科学相互渗透，作为益生菌的嗜酸乳杆菌正逐步被了解和关注。 近几十年来国外大规模使用的嗜酸乳杆菌菌株有h a c i d o p h i l u sn c f m ( 罗地亚) 、 l a c i d o p h i l u s d d s 1 ( 纳贝斯克) 、h a c i d o p h i l u s s b t 2 0 6 2 ( 日本雪印) , l a c i d o p h i l u s 【a - l ， l a - 2 ( 丹麦汉森) 1 9 】。嗜酸乳杆菌的特殊生理活性通过发酵食品、微生态制剂等多种形 式被广泛的研究。资料表明，当摄人的嗜酸乳杆菌活菌数高于l o f u m u r f ，嗜酸乳杆菌 对人体健康具有明显的促进作用【l 川，主要体现在以下方面。 2 1 3 1 调整肠道菌群平衡，抑制腹泻 自7 0 年代以来，大量临床研究探讨了嗜酸乳杆菌在治疗腹泻和缩短腹泻持续时间方 2 吉林农业大学硕士学位论文嗜酸巍杆菌细胞壁肚聚糖的分离提取及其免艘活性研究 面的作用。实验证实，嗜酸乳杆菌对食品病源微生物和肠道内的病源菌的拮抗作用十分 显著。g i l l i l a n d 和s p e c k ( 1 9 7 7 ) 的研究表明，嗜酸乳杆菌对金黄色葡萄球菌和肠道致病 性大肠杆菌有强烈的抑制作用【l n 。愈来愈多的实验表明，嗜酸乳杆菌主要是通过下述途 径在宿主体内和食物中发挥作用的：在生长代谢过程中产生有机酸、过氧化氢、细菌 素等多种拮抗物质，可以有效的抑制体内有害菌的生长和繁殖，控制肠胃感染，治疗由 抗生素等引起的腹泻。粘附在宿主消化道内并定殖和存活下来形成生物屏障( 占位效 应) ，一方面可以抑制病原菌在消化道粘膜上的粘附，通过与病原菌竞争营养物质抑制 病原菌的生长；另一方面防止毒素等有害物质的吸收，中和有毒产物。 c o c o n n i e r 和k l e a n h a m m e r ( 1 9 9 2 ) 的研究表明i 】2 j ，嗜酸乳杆菌对宿主体内的肠粘膜 上皮细胞表现出较强的粘附能力，它们在细胞表面形成一层强有力的生物屏障，可以抑 制致泻性大肠杆菌等致病菌的侵入。m a r t e a u 和m i n e k u s 等( 1 9 9 7 ) 设计了计算机控制的 胃肠道动力学模型，模拟人体胃肠道环境n 3 】。设置胃肠道的排空速度以及不同时间胃肠 道不同部位的酸度和胆盐浓度，定时取样检测各部位细菌的存活数。结果表明，酬、时 后，通过胃、十二指肠、空肠、回肠后存活的嗜酸乳杆菌约有5 0 。 2 1 3 2 促进乳糖的消化吸收，缓解乳糖不耐症 乳糖在人乳及牛乳中的平均含量分别为7 o 和4 8 ，是人体重要的营养源，具有重 要的生理作用。乳糖只有在乳糖酶的催化下水解成葡萄糖和半乳糖，才能被人体转化吸 收。在我国成人中约有5 5 1 的人都患有乳糖不耐症【1 4 】。世界上有相当比例的人群患有 乳糖不耐症，因此乳糖不耐症愈来愈多地受到人们的关注。 乳糖不耐症状随着摄入的乳糖含量、乳糖酶缺乏的程度、肠道微生物的适应性以及 是否存在其它补充乳糖酶的途径等发生变化。饮用嗜酸乳杆菌发酵的酸奶有助于乳糖消 化，可大大缓解乳糖不耐症。k i n l 和g i l l i l 卸d ( 1 9 9 3 ) 研究了添加嗜酸乳杆菌的未发酵 奶对乳糖不耐症的影响。b m 铡试【1 5 1 结果表明，服用含有2 x 1 0 f u m i 盾酸乳杆菌的未 发酵奶，7 天后呼吸中氢气的释放量明显降低，乳糖的利用率明显增加。服用含有2 5 x 1 0 e c f u m l 的嗜酸乳杆菌酸奶也获得了类似的结果【1 6 】。 2 1 3 3 增加乳中可消化性的蛋白质、维生素的含量 a l m 发现，由于嗜酸乳杆菌的蛋白质分解作用，酸奶酪中游离氨基酸的含量比牛乳 中游离氨基酸的含量高【1 7 1 。b r e s l a w 和k l e y n 也发现，在酸奶酪制品加工过程中，蛋白质 的可消化性提高了【拥。而且，许多不同的发酵乳制品，如嗜酸菌乳、酸乳酒、酸奶酪等 与未经发醉的乳翻品比较，可提高多种动物的生长和锝养效率 1 9 1 。据报道，酸奶酪等发 酵乳制品比直接酸化的产品含有更多的维生素b 和维生素p p 2 0 。 2 1 3 4 降低血清胆固醇水平 胆固醇在人体生理活动中起着重要作用，是不可缺少的物质。然而，随着人们生活 水平的提高，不合理的膳食结构逐步导致体内胆固醇含量增加。胆固醇过量堆积将导致 3 吉林农业大学硕士学位论文嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖的分离提取及其免疫活性研究 冠心病、高血脂症、动脉粥样硬化以及其它心血管疾病。目前，医学界普遍认为，控制 血清胆固醇水平是预防动脉硬化及冠心病的重要措施【2 1 】。 人体内血清胆固醇的7 0 为内源性合成，其余3 0 为膳食胆固醇。研究认为，人体 内胆固醇的合成速度受膳食胆固醇的影响很大。因此，人们尤其希望通过非药物途径限 制饮食中胆固醇的含量。1 9 7 7 年g i l l i l a n d 提出了嗜酸乳杆菌可通过降解胆盐促进胆固醇 的分解代谢，从而降低胆固醇含量【l ”。k a d n e l 和m o h a n ( 1 9 9 6 ) 认为嗜酸乳杆菌对胆固 醇没有吸收作用，而是借助胆盐水解酶活性将胆盐转化为游离态，导致皿t 值低t 6 0 时， 胆盐溶解度较低，与胆固醇形成沉淀，从而减少了介质中胆固醇的含量 2 2 1 。也有研究认 为，嗜酸乳杆菌可以抑制胆固醇合成途径中的p 羟基争甲基戊二酸单酰辅酶a 还原酶的 活性，从而降低血清胆固醇的含量驯。嗜酸乳杆菌及其相关制品具有减少人体血清胆 固醇含量，降低心血管疾病发病率的功效伫5 蕊2 7 l 。尽管人们对嗜酸乳杆菌降低人体血清 中胆固醇含量的机理还有争议，但嗜酸乳杆菌能降低人体血清中胆固醇含量是毫无疑问 的。 2 1 3 5 抑制癌症的形成和发展 1 9 7 2 年，删h i l l 倡导了一种理论，认为肠道细菌能改变人体肠道内部的化学环 境，因而在抑制癌症的形成和发展中起着重要作用嘲。应用动物模型研究嗜酸乳杆菌抗 癌效果的报道已经有很多，但与人体有关的、直接的研究尚无报道。研究表明，嗜酸乳 杆菌可以改变某些粪便酶的活性，而这些粪便酶是引发肠癌的重要因素。这些酶包括p 葡萄糖苷酸酶( 1 3 - g l u c u r o n i d a s e ) ，胺还原酶( a z o r e d u c t a s e ) 和硝化还原酶( n i t r o r e d u c t a s e ) 等。服用特定的乳酸菌或含有它们的食品显然影响了这些粪便酶的活性溯。g o l d i n 等 ( 1 9 8 4 ) 也报道了嗜酸乳杆菌和双歧杆菌通过抑制致癌前体物的转变和抑制癌细胞生长 等方式降低癌症的发生率。研究中发现，饮用含有2 x 1 0 6 f 。m l 的嗜酸乳杆菌制品可引起 b 葡糖苷酸酶( b - g l u c u r o n i d a s e ) ，胺还原酶( a z o r e d u c t a s e ) 和硝化还原酶( n i t n m ，c l u c t a s e ) 的活力下降2 叫爵，抑制致癌前体物的生成和转化l l 习。也有研究表明，嗜酸乳杆菌能够 显著降低b 葡糖苷酸酶和硝化还原酶的活性，但对胺还原酶的影响并不是很明显。另有 研究认为，嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等益生菌可以降解亚硝胺等致癌物质，预防癌症的发 生，其机理尚在研究中。 流行病学的数据表明，肠癌的发病率与人们的生活方式，特别是饮食习惯关系密切。 由于饮食习惯改变，人体肠道内的突变性增加。突变性增加被认为是引起肠癌发生的一 个主要因素。应用嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌和其它非肠道定殖的乳酸菌抑翩突变因子 活性的研究表明，乳酸菌活茵细胞、细胞成份、细胞提取物和发酵乳制品有降低突变的 发生、提高动物存活能力以及抗肿瘤发生的作用 3 0 1 。最近的一项实验研究发现，嗜酸乳 杆菌l a - 2 发酵乳能够显著降低人体肠道粪便突变性和改善肠道微生物菌群的组成。这项 研究认为，由于嗜酸乳杆菌l a 2 存在于人体肠道内，引起粪便微生物菌群发生变化，抑 4 吉林农业大学硕士学位论文嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖的分离提取殛其免疰活性研究 制了粪便突变性的发生。总之，嗜酸乳杆菌的抗癌机理还不是很清楚，需要进一步的研 究。 2 1 3 6 刺激免疫系统，提高免疫功能 乳酸菌的代谢产物、细胞壁成份以及乳酸菌在肠道内的定殖作用等都被看作是影响 免疫调节的重要因素。p e r d i g o n ( 1 9 9 0 ) 等调查了嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌发酵奶对老 鼠免疫成分的影响，发现老鼠的巨噬细胞和淋巴细胞都被激活d l ! 。w a g n 礴( 1 9 9 7 ) 发 现，给免疫缺陷的小鼠喂服嗜酸乳杆菌后( l a c t o b a c u l u a c i d o p h i l u s l 巧m ) ，小鼠体内 产生了抗体，这种抗体对抵御念珠菌引起的疾病具有一定的作用；同时小鼠体内i g g i g a 和垮m 的含量有所增加嘲。我国许靖泰等人研究发现嗜酸乳杆菌胞外多糖对小鼠的免疫 功能有增强的效果 3 3 1 。 2 1 3 7 消除便秘 a i m ( 1 9 8 3 ) 对5 0 位患有便秘的病人进行了研究，病人每天服用3 0 0 - 4 0 0 m l 台- 有嗜 酸乳杆菌的9 种微生物混合发酵的乳制品，9 0 天后，病人便秘的现象有所改善，并且排 便的次数增加踟。研究还发现，就缓解便秘丽言，混合发酵的乳制品所产生的效果不如 单一的嗜酸乳杆菌发酵乳的效果好。而且灭活的嗜酸乳杆菌奶并不能促进便秘患者的胃 肠道蠕动，起不到缓解便秘的效果。有研究解释为，活的嗜酸乳杆菌能够影响宿主体内 的微生态平衡，它们与宿主肠道粘膜表面相互作用，促进胃肠道蠕动，起到改善便秘的 作用。 2 1 3 8 抑制妇女阴道炎症 由粪肠球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌及念珠菌等引起的女性阴道炎症是妇科疾 病的主要原因。对嗜酸乳杆菌的研究表明，以聚苯乙烯为载体，嗜酸乳杆菌可以形成一 层生物保护膜，抑制9 0 的肠球菌对聚苯乙烯的黏附。嗜酸乳杆菌n a i m 对阴道上皮细 胞有一定的黏附能力。将嗜酸乳杆菌n c f m 分别与三种阴道致病性微生物e c o l ih u 7 3 4 ， 五p e n u m n i n o a e 雨d p a e r u g i n o s aa k i 共同培养后发现，嗜酸乳杆菌n c f m 显著抑制了它们 的生长，其抑制水平分别在3 0 ，1 1 和3 0 3 5 1 。 2 2 细菌细胞壁肽聚糖的研究进展 肽聚糖( p e p t i d o g l y c a n ，p g ) ，又称粘肽( m u e o p e t i d e ) 、糖肽( g l y c o p e 硼d e ) 或胞 壁质( m u r e i n ) 是细菌等原核生物细胞壁的特有组成成分。这种剐性结构大分子可以保 护细胞免受渗透压的损伤【弼，对提高细胞壁的机械强度和维持细胞形状起着重要作用 口”。真核细胞中不含p g ，因此，p g 成了真核生物免疫系统识别的理想靶位网。目前的研 究已表明，高等真核生物体中含有若干p 哦只别分子，包括p g 识别蛋白家族( p g r p s ) 、 c d l 4 、t o l l 受体2 、n o d l 和n o d 2 等，这些活性分子通过不同的信号传导途径诱导释放 吉林农业大学硕士学位论文嗜酸乳杆菌细胞壁肚聚糖的分离提取殛其免疫活性研究 免疫调控物质，从而刺激免疫系统发挥免疫功能。 2 2 1p g 的化学组成与结构 p g 是由若干p g 单体组成的一种网络状杂多糖。每个p g 单体由肽和聚糖两部分组成， 其中的肽包括四肽链和肽问桥两部分，而聚糖是由n - 乙酰葡糖胺( g ) 和n - 乙酰胞壁酸 ( m ) 两种单糖通过b 1 , 4 糖苷键相互间隔连接成的长链。对于不同种类的细菌，p g 的含 量和结构均有较大差别，g + 细菌p 眙量较高，占细胞干重的3 0 - 9 5 ；( 3 - 细菌p g 含量 较低，占细胞干重的5 一2 0 。结构的差异主要在于四肽链上氨基酸的组成及肽链间交 联方式的不同，肽链上的四个氨基酸分子按l 埋! 和d 型交替连接。研究证实，所有g 。和g + 杆菌中p g 的结构基本无差别；g + 球菌中，肽链的氨基酸组成和长度的变化却很大。根 据肽链中第三位氨基酸的不同组成，可将p g 粗分为两大类：l - 赖氨酸型( l y s 型) 和二 氨基庚二酸型( d a d 型) ( 见图1 ) ，前者主要存在于g + 细菌中，后者在g 细菌中。 2 2 2i g 的分类 。符 。妒儿4 t - ” 唧 。产 l “ 卜a 帅十一，k 一 咖曩p 6 n 一中 蝴。睁 。产 卜_ 阳一卜u k k 叫 0 由 d i p 曩p g n i i t l 伽型和d a p 型p g 结构 瑰1s u a c u n eo f l y s - s t y l e1 ( 3a n dd a p - s t y l ep g 不同种类的细菌p g 链骨架结构基本相同，其差异主要是四肽链氨基酸的组成以及四 肽链的交联方式【4 1 1 。通过对许多不同的g 。细菌p g 的肽链部分氨基酸组成与顺序的研究 表明，g 细菌的p g 结构变化不大，它们的p g 中只含有以l ：1 ：1 5 1 0 比率的d - g i u 、m - d p m 和d ，l - a l a 。g + 菌的p g 中肽链的组成与结构排列有很大的变化。根据连接在n 一乙酰胞 壁酸上的相邻的两条短肽( 肽亚单位) 之间交联方式的不同，将p ( ；分为a 、b 两群，其 中一条肽亚单位的3 位氨基酸与另一肽亚单位的4 位氨基酸之间交联的p g 属于a 群；一条 肽亚单位的2 位氨基酸与另一肽亚单位的4 位氨基酸之间交联的p g 属于b 群，这群p g 比较 少见，只在某些棒杆细菌特别是植物病原性棒状杆菌中被发现。 6 吉林农业大学硕士学位论文嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖的分离提取爰其免疫活性研究 2 2 3 p g 的代谢 主要存在于哺乳动物和人类血液中的n - 乙酰胞壁酸l 广丙氨酸酰胺酶可以特异性地 水解细菌细胞壁p g 4 习，把p g 水解成肽亚单位和多糖链两个部分。p g 单体作为哺乳动物 血浆水解酶作用的底物进行代谢。这些肽亚单位进一步作为l d ，氨基肽酶的底物，将 l 丙氨酸从肽的氨基末端劈开。p ( 谳少了糖苷部分，其有益和有害的特性都将消失。上 述这些酶虽然没有直接的杀菌活性，但它们的生物学功能就是把那些具有生物学活性的 p g 降解成无活性的产物。在哺乳动物的尿液中可以检测到这些无糖部分的肽的存在。 2 2 4p g 的免疫作用机制 p g 是人类免疫系统的激活剂【4 3 l ，宿主可以通过识别p g 结构，对入侵细菌作出相应的 免疫应答i 蚓。天然免疫系统中存有一系列模式识别受体，可以识别入侵细菌的p g 等病原 体相关分子模式嗍，通过不同的信号传导途径释放相同的免疫调控物质，如白介素、肿瘤 致死因子等多种细胞素，在抵抗 侵病原体中发挥免疫功能 4 s i 。近十年来，人们对诱导 抗菌肽感染的信号途径研究颇为关注。目前已发现有两种调控抗菌肽基因表达的信号转 导途径( t o l l 途径) 和免疫缺陷途径( i m d 途径) ，其中t o l l 途径主要激活抗真菌多肽基 因( 如d r o s o m y c i n ) ，对真菌和g 球菌感染发挥作用；h d 途径主要激活抗细菌多肽基因 ( 如d i p t e r i c i n ) ，对g 细菌和g + 细菌作出反应。研究发现，免疫作用的可能机制是当不同 类病原体( 如g 细菌、g + 细菌或真菌) 侵入宿主时，可被不同的模式识别受体识别，激 活相应的信号转导途径，诱导各种免疫反应。 2 2 5p g 识别蛋白及其作用 2 2 5 1 喇蛋白的发现 p ( 识别蛋白( p g r p ) 是近年来发现的一类重要模式识别分子，可识别并区分不同种 类的细菌病原体，在天然免疫中起着关键性作用。a s h i d a 等a 于1 9 9 6 年在家蚕的血细胞中 分离得到p g r i ) 【4 0 i ，后来在许多昆虫和哺乳类动物中也发现有p ( 珏m 【蛔。大量资料已证 实，p ( r p 是进化中的蛋白质，从昆虫到人类均高度保守。它与p c 洧高度粘附性，可识别p g 和含p g 的细菌，进而激活t o l l 或i m d f 言号途径，在免疫应答中发挥重要的识别和调节功 能。 2 2 5 2p g r p 的结构及其表达 根据p g r p 分子大小不同，可大致分为3 类m ：短型p g r p ( 即p g r p i s ) ，分子量为 2 0 - 2 5 k d ；中型p g r p ( 即p ( 、r p - i ) ，分子量为4 0 - - 4 5 k d ；长型p g r p ( 即p g r p l ) ， 分子量高于9 0 k d 。在人的基因序列中至今共发现4 个p g r p ，除p g r p - s 正源外，还有3 个 p g r p 同源物，分别为p g r p - l 、p g r p - i a 和p g r p - i p 。到目前为止，已确定p ( 3 r p - l 、p g r p - i ， 吉林农业大学硕士学位论文嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖的分离提取夏其免疫活性研塞 为跨膜蛋白，具有细胞表面受体的功能。 昆虫p g r p 多表达于免疫器官，如血细胞、脂肪体、内脏和上皮细胞且注射p g 可上 调其表达。哺乳动物p g r p 主要表达于骨髓细胞、肝细胞和嗜中性粒细胞，而在脾细胞、 胸腺细胞和淋巴细胞中几乎不表达。人