（食品科学专业论文）啤酒酵母多糖的纯化工艺及结构鉴定.pdf

湖北工业大学硕士学位论文 摘要 多糖具有多种生理活性，如抗肿瘤，抗感染，增强机体免疫活性等而为人们 关注。 本论文通过脱蛋白、脱脂、离子交换柱层析和凝胶柱层析对酵母多糖粗品进 行纯化处理，并通过化学分析和仪器分析方法检测多糖的结构，获取酵母多糖的 结构信息。其主要研究内容如下： 酵母多糖的脱蛋白方法的研究：采用s e v a g 法、s e v a g 法与酶法结合的方法， 比较分析得出最佳脱除酵母多糖蛋白质的试验。试验结果表明：s e v a g 法后多糖损 失较严重，且脱蛋白效果不如酶法结合s e v a g 法。酶法结合s c v a g 法的最佳工艺 条件为：水解温度6 0 ，p h 7 0 ，加样量3 ：1 ，通过该方法脱蛋白后样品多糖含 量为7 2 1 2 ，蛋白质浓度为6 8 6 m g m l 。 酵母多糖的脱脂方法的研究：以提取物中的酵母多糖含量为测定指标，考 察溶剂石油醚与乙醚、回流时间及料液比三个因素对脂肪脱除的影响。试验结果 表明当乙醚：石油醚比例为1 ：3 、提取温度为5 0 、提取时间为5 h 效果最佳。 经脱脂处理后，多糖含量可达7 4 0 6 。 酵母多糖的柱层析：采用d e a e - 5 2 离子交换层析和s e p h a d e xg 2 0 0 凝胶柱 层析对脱蛋白和脂肪后的酵母多糖进行进一步分离纯化研究。经离子交换层析和 凝胶层析分离纯化后，得到多糖精制品y p s - i 。 y p s1 分子量的测定：采用g p c r i m a l l s 联机对y p s1 分子量进行测定， y p si 为相对均一多糖，分子量分布相对集中，重均分子量m - 为2 0 8 3 1 0 5 。 y p si 结构的分析研究：通过摸索单糖衍生条件和酵母多糖水解试验，得出 最适衍生条件：温度8 0 、时间2 0 m i n 、衍生剂加入量1 7 0i ll ；酵母多糖的最佳 水解条件为：三氟乙酸浓度3 0 m o l l 、水解时间2 h 。h p l c 检测y p si 单糖组成， 确定其由葡萄糖聚合而成。 对y p si 用i r 检测，图谱显示样品具有多糖的特征吸收峰，y p si 为含b 一糖 苷键的六元葡萄吡喃糖。 通过对y p si 高碘酸氧化和s m i t h 降解，得出y p si 为以l 一3 键型为主链， 并含有部分1 6 键型的支链的葡聚糖。 关键词：啤酒酵母，多糖，纯化，结构研究 湖北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t p o l y s a c c h a r i d ew i t haw i d er a n g eo fp h y s i o l o g i c a la c t i v i t y , s u c ha sa n t i - t u m o r i m m u n ea c t i v i t y , a n t i i n f e c t i v ee t c i sc o n c e r n e db yp e o p l e i nt h i sp a p e r , t h ec r u d ey e a s tp o l y s a c c h a r i d e sw e r ep u r i f i e dt h r o u g hr e m o v i n g p r o t e i n ，r e m o v i n gf a t ，i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n dg e lc h r o m a t o g r a p h yc o l u m n c h r o m a t o g r a p h y w ba d o p t e dc h e m i c a lm e t h o d sa n de q u i p m e n tt od e t e c tt h es t r u c t u r eo f p o l y s a c c h a r i d e s ，i no r d e rt og e tt h ei n f o r m a t i o no ft h es t r u c t u r eo fy e a s tp o l y s a c c h a r i d e t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa r ea sf o l l o w s ： n er e s e a r c ha b o u tt h em e t h o do fr e m o v i n gp r o t e i ni ny e a s tp o l y s a c c h a r i d e s e v a gm e t h o da n ds e v a gm e t h o dc o m b i n e dw i t he n z y m a t i cm e t h o dw e r eu s e dt o r e m o v ep r o t e i n t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e d ：t h r o u g hs e v a gm e t h o dt or e m o v e p r o t e i n ，p o l y s a c c h a r i d el o s s e sw e r em o r es e r i o u s ，a n dt h em e t h o do fr e m o v i n gp r o t e i n w a sl e s se f f e c t i v et h a nt h a to fe n z y m a t i cm e t h o dc o m b i n e dw i t hs e v a g t h eb e s t c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：h y d r o l y s i st e m p e r a t u r ef o r6 0 ，p h 7 0 ，t h ev o l u m eo f s a m p l ec o m p a r e dt oe n z y m a t i ci s3 ：1 ，a f t e rt h e s er e m o v i n gs t e p s ，t h ec o n t e n to ft h e s a m p l ep o l y s a c c h a r i d ew a s7 2 1 2 ，p r o t e i nc o n c e n t r a t i o nw a s6 8 6 m g m l ( 固，n l er e s e a r c ha b o u tt h em e t h o do fr e m o v i n gf a t t h ec o n c e n t r a t i o no fy e a s tp o l y s a c c h a r i d e sa st h ei n d i c a t o r s 。p e t r o l e u me t h e ra n d e t h y le t h e r 、t u r n i n gt i m e 、t h ev o l u m er a t i oo fs a m p l es o l v e n tw e r er e v i e w e dt os e et h e i m p a c to ff a tr e m o v a l t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e d ：e t h e r ：p e t r o l e u me t h e rw a s1 ：3 。 e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s5 0 ，e x t r a c t i o nt i m ew a s5 h ，t h e nw ec a l lh a st h eb e s t e f f e c t a f t e rr e m o v i n gf a t t h ec o n c e n t r a t i o no fp o l y s a c c h a r i d eu p p e dt o7 4 0 6 ( 勤t h er e s e a r c ho fc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y u s i n gd e a e 5 2i o n e x c h a n g ea n ds e p h a d e xg 2 0 0g e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y f o rf a r t h e rr e s e a r c ho ft h ey e a s tp o l y s a c c h a r i d e sw h i c hh a db e e nr e m o v e dp r o t e i na n d f a t a f t e rs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n w eg o tp u r ep r o d u c t sn a m e da sy p s i ( 缈t h ed e t e r m i n a t i o no fy p si sm o l e c u l a rw e i g h t u s i n gg p c r i m a ij ，st od e t e r m i n et h em o l e c u l a rw e i g h to fy p slt h er e s u l t s h o w e dt h a ty p siw a sar e l a t i v e l yh o m o g e n e o u sp o l y s a c c h a r i d e ，a n dt h em o l e c u l a r w e i g h td i s t r i b u t i o nw a s r e l a t i v ec o n c e n t r a t i o n m o l e c u l a rw e i g h tm ww a s2 0 8 3 1 0 5 t h er e s e a r c ha b o u tt h es t r u c t u r eo fy p si t h es t r u c t u r eo fy p s1w a sd e t e c t e db yh p l c t h eo p t i m a ld e r i v a t i v ec o n d i t i o n s ： 8 0 ，2 0 m i n ，t h ev o l u m eo fd e r i v a t i v ea g e n ta d d e dw a s1 7 0ul t h eb e s th y d r o l y s i s c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：t h ec o n c e n t r a t i o no ft e aa c i d3 o m o l i r e a c t i o nt i m ef o r 2 h y p sid e t e c t e db yh p i c 。s h o w e dt h a ti tw a sf o r m e db yt h eg l u c o s e u s ei rt od e t e c tt h es t r u c t u r eo fy p slg r a p hd i s p l a y e dt h a ty p siw a sak i n do f p o l y s a c h h a r i d ew i t hb - g l y c o s i d i cb o n do ft h es i x - g l u c o p y r a n o s y l t h r o u g l lp e r i o d a t e o x i d a t i o na n ds m i t hd e g r a d a t i o no fy p si ，s h o w e dt h a ty p s1w a sag l u c a nw h i c hh a d t h em a i nc h a i no f1 3 b u t t o n t y p e a n dc o n t a i n sp a r to f1 6b r a n c h e d c h a i n k e y w o r d s ：b e e ry e a s t ，p o l y s a c h h a r i d e ，p u r i f a c t i o n ，s t r u c t u r er e s e a r c h n 湖班二堂大謦 学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取 得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：越摆衫k 日期： 哆年哆月i f 侈日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权湖北工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文储始起燕，认指导教师始娲 日期：刁年口妇，b 日 日期：p 歹年朔4 日 湖北工业大学硕士学位论文 第1 章引言 1 1 酵母多糖的研究进展 1 1 1 酵母多糖的研究概况 多糖( p o l y s a c c h a r i d e s ，p s ) 又称多聚糖，其存在于动物、高等植物、微生 物( 细菌和真菌) 及海藻等机体中，是所有生命有机体的重要组成成分与维持生 命所必须的结构材料阴1 。糖是人和动物的主要能源物质也是生命必需的物质： r i c 0 2 4 - i i i h ：o 一一光c 。( h 2 0 ) - + 0 2 近年来，有关多糖的研究进展迅速，从各种生物材料中提取的有生理活性的 多糖成分已成为天然药的一个新来源。因此，糖的研究逐步活跃起来，1 9 9 3 年美 国召开了第一届糖工程年会，并指出糖生物这一生物化学的最后一个重大前沿正 在迅速来临。糖类化合物将成为蛋白质、核酸之后生命科学领域中的又一研究热 点。其中，一些分子量在几千以上，具有很强生物活性的活性多糖的研究受到日 益重视。研究这些活性多糖的生理活性及构效关系成为多糖研究的前沿，并取得 了很大的进展吼j 。 对于啤酒酵母( s c e r e v i s e a e ) 的研究和综合利用也已有很多年的历史了。 酵母( y e a s t ) 是一类与人类生产生活密切相关的真核微生物，功能性低聚糖和酵 母抽提物的研究开发与生产为这一传统课题注入了新的活力。 酵母的细胞壁厚度随种系、年龄、营养条件而异，啤酒酵母细胞壁厚约2 5 n m ， 约占细胞干重的2 5 - - - 3 0 n 钉。酵母细胞壁的化学成分较特殊，主要由“酵母纤维素 组成，它的结构类似三明治。外层为甘露聚糖( m a n n a n ) ，约占细胞壁干重的4 0 - - - 4 5 ；中间层是一层蛋白质分子，约占细胞壁干重的1 0 ，其中有些是以与细胞壁 相结合的酶形式存在，例如葡聚糖、甘露聚糖、碱性磷酸酶和脂酶等，大部分形 成甘露聚糖一蛋白质复合物( 碱溶性) ；内层为葡聚糖( g l u c a n ) ，约占细胞壁干重 的4 0 5 n 巩1 。酵母的细胞壁如图1 - 1 所示。 f i g 1 1t h es t r u c t u 障o f y e a s tp o l y s a c c h a r i d ec e l lw a l l 啤酒酵母细胞壁葡聚糖舍有碱不涪性、碱溶性、酸溶性三种“”，靠近外面的 是碱溶性葡聚糖。最内层的是碱不溶性葡聚糖，约占3 0 3 5 。酵母细胞壁物质对 酸解过程比较稳定，其碎片能完好无损的通过胃或皱胃。它们在人的消化道中难 以被消化，可作为膳食纤维发挥作用，并具有增强细胞免疫力，提高巨噬细胞活 性及治癌等功效“。 葡聚糖是低能量的食品原料，食用后不易被人体消化吸收，可减少血中葡萄 糖量的增加，能预防糖尿病及控制肥胖症，防止心血管疾病的发生，并在口腔内 不会产生龋齿。葡幂糖有吸水膨胀的性质，能促进肠道蠕动，达到预防肠癌的作 用。此外，葡聚糖还有保温、成膜、无刺激性的特点，故广泛用于医药、食品、 化妆品等行业，也被称为“生物反应修饰物一b 删”。有研究表明，病原菌( 大肠 杆菌、沙门氏菌、梭状芽孢杆菌等) 的细胞表面或绒毛上具有类丁质结构，通过 识别动物肠壁细胞上的特异性糖类而与之结合，在肠壁上繁殖，导致肠道疾病的 发生，甘露低聚糖( t d o s ) 与病原菌在肠壁上的受体非常相似，并与病原菌细胞膜 表面的类丁质结构有很强的结合能力。可竞争性的与病原菌结合，从而避免了病 原菌与肠壁细胞的亲和。由于甘露聚糖不会被消化酶降解并携带病原菌通过肠道， 因此可以起到防止病原菌定殖的作用“”1 。m o $ 还具有抗原作用，町以引起直接的 抗体应答，充当免疫刺激因子、增加动物体及细胞免疫能力，m s 可以吸附动物体 毒素，例如整合动物胃肠道释放的黄曲霉紊“。 1 2 多糖的分离、纯化研究进展 多糖的纯化工艺研究般包括提取、除脂、脱色、除蛋白、醇析、柱色谱分 离纯化、透析等基本步骤。多糖的提取及分离纯化直接影响到成品中多糖的纯度， 从而影响到多糖类有效部位的质量控制，最终影响到成品的疗效”。多糖是极性 湖北工业大学硕士学位论文 强的大分子化合物，提取时一般先将原料用水、盐或稀碱水在不同温度下提取， 提取物浓缩后加沉淀剂( 如丙酮、乙醇等) 离心沉淀，冷冻干燥得粗多糖。 提取后的多糖常含有蛋白质，需要去除，常用的去蛋白质的方法有s e v a g 法 慨2 3 绷、b e c m 法、三氯乙酸法汹1 、三氟三氯乙烷法、酶法及酶法结合s e v a g 法汹1 等。前两种用于微生物多糖，后者多用于植物多糖。下面对几种方法作介绍： s e v a g 法：根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用氯仿：戊醇( 或 正丁醇) 5 ：1 或4 ：1 ，混合物剧烈振摇2 0 - - 3 0 r a i n ，蛋白质与氯仿一戊醇( 或正丁 醇) 生成凝胶物而分离，离心，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种方法 在避免多糖降解上有较好效果，但效率不高，如能配合加入一些蛋白质水解酶， 再用s e v a g 法效果更佳。 三氟三氯乙烷法：多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温下搅拌 l o m i n 左右，离心得上层水层，水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多 糖溶液，此法效率高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量应用。 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴力1 5 - - 3 0 三氯醋酸，直至溶液不再继 续混浊为止，在5 - - 1 0 放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液。此法 会引起某些多糖的降解。 以上三种方法均不适合糖肽，因糖肽也会象蛋白质那样沉淀出来。对于对碱 稳定的糖蛋白，在硼氢化钾存在下，用稀碱温和处理，可以把这种结合蛋白质分 开。 粗多糖还含有一些的脂肪，脂肪的提取方法很多，大多采用低沸点溶剂直接 萃取，或用酸、碱破坏有机物( 碳水化合物、蛋白质等) 后，再用溶剂萃取或离心 分离。最常用的溶剂为乙醚，也有用石油醚和汽油的。用乙醚萃取时，除各种甘 油三酸脂外，还有许多杂质溶解到乙醚萃取物中，如游离脂肪酸、苹果酸、酒石 酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸以及各种蜡状物、磷脂、色素、树脂、香精油、硫 化物、醛、酮等物质，故用乙醚萃取法测得的脂肪常称为醚浸出物或粗脂肪。乙 醚或样品中如果含有水分，将大大增加粗脂肪中的杂质含量，乙醚和样品必须脱 水或干燥。 索氏提取法( 即索克斯列特抽提法) 是一种常用的、比较准确的经典方法随硼。 这种方法适用于脂类含量较高，与组织成分结合的脂肪少的食品。索氏提取器由 接收瓶( 脂肪瓶) 、提取筒和冷凝管三部分组成。 粗多糖中的一些色素( 游离色素或结合色素) ，根据不同性质采用不同的方法 乜7 1 。常用的脱色方法有离子交换法乜8 圳、氧化法伽1 、吸附法( 纤维素、硅藻土、高 岭土、活性炭等) ，离子交换法是目前常用的脱色方法，通过d e a e - 纤维素离子 3 湖北工业大学硕士学位论文 交换柱不仅可以达到脱色的目的，而且可以通过摸索条件进行多糖的分离。双氧 水( h 2 0 2 ) ，是一种氧化脱色剂，浓度不宜过高，宜在低温下进行反应，否则会引 起多糖的降解，造成多糖的损失。对于那些同时含有游离蛋白和色素的多糖，可 以通过生成金属络合物的方法脚1 同时除去蛋白和色素，即加入费林试剂生成不溶 性络合物，分离后用离子交换树脂分离络合物。吸附法也常用，但有些多糖也被 吸附，宜造成多糖的损失。 对于小分子物质则可通过流水透析4 8 h ，蒸馏水透析2 4 h 除去。 通过脱蛋白、脱脂和透析后干燥的样品，得到的基本上是没有蛋白质与小分 子杂质的多糖混合物。一般来讲，如果要得到较纯的多糖，还必须对该混合物进 行进一步纯化。柱色谱可分为两类，一类是离子交换色谱口耵，离子交换色谱法是 利用离子交换剂上的可解离基团( 活性基团) 对各种离子的亲和力不同而达到分 离目的的一种色谱分离技术，同时也有分子筛的作用，如d e a e - 纤维素、 d e a e s e p h a d e x 、c m - s e p h a d e x 等。这种离子交换树脂常用水、缓冲液或酸碱液洗 脱；一类是凝胶柱色谱【3 4 筇l ，是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被 分离物质的分子大小不同来进行分离。小分子物质能进入其内部，流下来速度慢， 而大分子物质却被排除在外部，下来的速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤色谱 柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了，如s e p h a d e x 、s e p h a r o s e 、b i o g e l 等。多糖检测手段一般沿用苯酚一硫酸法魄3 ，也常用l k b 柱色谱系统，用比旋光 度、示差折光及紫外检测器，各组分的峰位自动记录，分离效果好且方便。 1 1 3 酵母多糖的结构研究进展 糖的结构分类沿用了对蛋白质和核酸的分析方法随瓤船1 。单糖是糖类的组成单 元，单糖之间脱水形成糖苷键，并以糖苷键线性或分支连接成寡糖和多糖。一般 将少于2 0 个糖基的糖链称为寡糖，多于2 0 个糖基的糖链称为多糖。寡糖和多糖 的结构也可分为一级、二级、三级和四级结构。 一级结构 多糖的一级结构是指糖基的组成，糖基排列顺序，相邻糖基的连接方式，糖 基环化的方式( 五元环或六元环) ，单糖构型( l 或d 以及异构物的q 或6 ) 以及 糖链有无分支，分支的位置与长短等。多糖的一级结构非常复杂，立体异构体， 单糖之间的连接方式( 1 - - - - 2 、l 一3 、1 4 、”) ，位置及糖苷键型的差异使得三 种单糖即可组成1 0 5 6 种不同结构的糖链( 见表1 - 1 ) ，再加上糖残基上可以连接硫 酸基团、乙酯基团、磷酸基团、甲基化基团，这就更加剧了多糖一级结构的复杂性。 图卜1 表示的是寡糖和多肽异构体数随多糖组成的变化，可见多糖结构的复杂性。 4 湖北工业大学硕士学位论文 表1 - 1 寡糖和多肽异构体数的比较 t a b l e 1 1 t h ea m o u n t so fi s o m e r sc o m p a r a t i v eo fo l i g o s a c c h a r i d ea n dp e p t i d e 一- c h i o h 辩玲斗 图卜2 ( 1 3 ) 一b - d 一葡聚糖的二糖结构单元 f i g 12s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no ft h ed i s a c c h a r i d er e p e a t i n gu n i t so f ( 1 3 ) 一8 - d g l u c a n s 三级和四级结构 多糖的三级和四级结构是指以二级结构为基础，由于糖单位之间的非共价相 互作用，导致二级结构在有序的空间里产生的有规则的构象。 由上可知，多糖的结构形态是各个单糖残基在空间相对定位的综合。解析这 些定位，对于理解多糖的生物学功能有极深刻的意义。 在多糖的结构研究中，一级结构即多糖的化学结构研究是最重要的，与蛋白质 和核酸相比，多糖的一级结构非常复杂，如两种氨基酸可形成四种二肽，而两种 单糖能形成1 1 种不同的二糖。多糖结构的描述包括以下方面：多糖的分子量范围， 多糖中单糖的组成，单糖的连接点类型，单糖和糖苷键的构型，重复单元m 】。表 1 - 2 显示的是对于不同的问题常用的解决方法。 表卜2 糖链以及结构测定常用的方法 t a b l e 1 2c o m m o nu s e dm e t h o do fd e t e r m i n es u g a nc h a i na n ds t r u c t u r e 需解决的问题常用方法 5 湖北工业大学硕士学位论文 分子量测定 单糖组成和分子比例 组成单糖为吡喃型或呋喃型 连接次序 a 一或b 一异头碳 羟基被取代情况 糖链一肽链联结方式 凝胶过滤( g p c ) 、质谱法( m s ) 、蒸汽压法 部分酸水解、完全酸水解、薄板色谱、气相色谱 红外光谱( i r ) 选择性酸水解、糖苷酶顺式水解、核磁共振( n m r ) 糖苷酶水解、核磁共振、红外光谱 甲基化反应一气相色谱、高碘酸氧化、n m r 、质谱 单糖与氨基酸组成、稀酸水解、肼解反应 1 1 3 1 多糖分子量的测定 多糖分子量的测定是研究多糖性质的一项重要工作，多糖的性质往往与分子 量的大小有关。多糖属于生物大分子物质，其分子量具有多分散性，它只代表相 似链长的平均配布，是一个统计平均值。常用的分子量测定方法有渗透压法、蒸 汽压法、端基法、光散射法、粘度法、凝胶色谱法、超滤法、沉淀法、。凝胶电泳 法、高效液相色谱法、超离心分离法、分子筛色谱法等“1 伽。近年来，有入将高 效凝胶渗透色谱法( h p g p c ) 和小角激光散射法用于多糖分子量的测定。方积年“3 1 认 为高效凝胶渗透色谱法是测定多糖分子量最好的方法，其结果和重现性令人满意。 一个分子量较为分散的样品，若用不同性质的分子量测定法测定它的分子量，结 果通常存在一定的差异。王喜云畔l 等采用凝胶渗透色谱( g p c ) 视差折光指数( r i ) 十八角激光散色仪联用技术，以乙二胺改性聚乳酸( d m p l a ) 为样品，溶解于四 氢呋喃呷f ) 中，先单机测定其d n d c ( 比折光指数增量) 值与a 2 ( 第二瑞利系数) 值，后 在不同的浓度、流量、温度条件下，研究其分子量及其分子量分布的变化。 1 1 3 2 多糖中核酸或蛋白质的鉴定 采用紫外分光光谱法( u v ) m 4 引：目前，常采用的方法是将多糖样品配制成 i m g l m l 的溶液，在近紫外区2 0 0 - 4 0 0 n m 范围内进行扫描，以2 6 0 n m 或2 8 0 n m 处有无特 征吸收峰，来判断多糖样品是否含有核酸或蛋白质。 1 1 3 3 多糖红外特征吸收峰的分析 上世纪7 0 年代后，由于红外光谱技术的发展及糖化学研究深入，红外光谱成 为糖结构研究重要手段之一【5 3 5 4 , 5 5 1 。例如8 4 0 c m 1 吸收峰来判别q 一糖苷键的存在， 8 9 0 c r a 1 吸收峰来判别b 一糖苷键的存在。吡喃糖苷在1 1 0 0c m 1 1 0 1 0c m 1 间应有3 个强吸收峰，而呋喃糖苷在相应区域只有2 个峰。在3 6 0 0 - - 3 2 0 0 c m - 1 的强峰是o 一h 的伸缩振动，表明多糖存在着分子内和分子间的氢键；1 6 6 5 - - - - 1 6 2 5 c m - 1 间吸收峰是 糖的水化物的吸收峰；8 1 0c n l 一，8 7 0 锄4 是甘露糖的吸收峰，1 2 6 0c i i l 。1 和1 7 3 0c m d 6 湖北工业大学硕士学位论文 是酯基或。一乙酰基的特征吸收峰。酯在1 7 4 0 锄，羧基离子在1 6 0 0 锄，1 4 1 4 伽，酰胺在1 6 5 0 锄一，1 5 5 0c m d 附近出现振动吸收。且在3 5 0 0c m d 处有无吸收用 来判断甲基化反应是否完全。拉曼光谱的使用范围【5 6 3 7 1 和作用与红外光谱相似， 但具有红外所没有的长处，如可直接用固体样品测定且吸收峰较光滑。 1 1 3 4 多糖的组成分析 对多糖链中的单糖残基组成及摩尔比进行分析，首先要通过完全酸水解将多 糖链分解成单糖，然后通过纸色谱嘲、薄层色谱眠咖、气相色谱陬乱1 、液相色谱嘲 等方法进行鉴定。 薄层色谱是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板( 如玻璃板、 塑料片、金属片等) 上，形成薄层( 常用厚度为0 2 5 r a m 左右) 后，在此薄层上进 行色谱分离的分析方法。 液相色谱和气相色谱一样，都是由两相一固定相和流动相组成。液相色谱的固 定相可以是吸附剂、化学键合固定相( 或在惰性载体表面涂上一层液膜) 、离子交 换树脂或多孔性凝胶：流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入 色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用 或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子( 以下称溶质) 与 溶剂( 即流动相或洗脱液) 以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱 过程的保留行为。 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质嘲。对高沸点化合物、 非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。 致使其应用受到一定程度的限制；液相色谱不受样品挥发度和热稳定性的限制， 它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及 高聚物的分离分析。因此一般文献报道，单糖的组分分析多应用高效液相色谱 【瞄6 4 ，惦】 o 1 1 3 5 多糖连接方式的确定 1 1 3 5 1 甲基化法 甲基化是多糖结构测定中最重要的手段h7 刚。甲基化反应是将多糖中各种单糖 残基中的游离羟基全部甲基化，将甲基化后的多糖水解，水解后得到的化合物， 其羟基所在的位置即为原来单糖残基的连接点，从不同类型的甲基化单糖的比例， 可以推测出糖链重复单位中各种单糖的数目，末端糖的性质以及分支点的位置， 但是无法获知糖的连接顺序。多糖甲基化的方法较多，有p u r d i e 法、h a m o r t h 法、 m e n z i e s 法、h a k o m o r i 法砸玎等。多糖甲基化完全后，水解成甲基化单糖，经还原、 7 湖北工业大学硕士学位论文 乙酰化后通过g c 或g c - m s 分析，测得的相对保留时间和质谱的主要碎片与文献值对 照，便可分析相邻单糖基的连接方式。 1 1 3 5 2 高碘酸氧化法 高碘酸可以选择性地氧化断裂糖分子中的连二羟基或连三羟基处，生成相应 地多糖醛、甲醛或甲酸。反应定量进行，每开裂一个c c 键消耗一分子高碘酸，通 过测定高碘酸消耗量及甲酸的释放量，可以判断糖苷键的位置、连接方式、支链 状况和聚合度等结构信息溉叫。 1 1 3 5 3s m i t h 降解法 s m i t h 降解是将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解或部分酸水解。由于糖基之 间以不同的位置缩合，用高碘酸氧化后则生成不同的产物，经g c 分析，由降解产 物可以推断糖苷键的位置订羽。 图卜3 显示的是以葡聚糖为例，l 一6 、1 4 键位的多糖经高碘酸氧化、k b h 。还 原和s m i t h 水解后的流程图。1 4 键位的多糖经该反应后产物为赤藓醇和乙二醇； 1 6 键位的多糖经该反应后产物为甘油和乙二醇。再经液相色谱或气相色谱检测 后即可确定该多糖为何种键型。 曩l 一盘鲁 。国， 自墨恳 h 器, o t 臣c i 。, o h + e o h 坠l 知h l ，+ i i l 。 h 印l o h车吃0 h 兰_ 0 舾plh i l 1 喝0 h 如h 图卜3 高碘酸氧化和s m it h 降解 f i g 1 3 p e r i o d a t eo x i d a t i o na n ds m i t hd e g r a d a t i o n 1 1 3 6 核磁共振( n m r ) 核磁共振( n m r ) i t s ：核磁共振是7 0 年代才引入到多糖结构的研究中来的。 早期n m r 主要解决多糖结构中糖苷键的构型以及重复结构中单糖的数目。对于多 糖，n m r 的测定温度最好在7 0 - - - ，9 0 c ，这样峰形较尖，易于分析。此外，多糖的 分子量大，样品浓度最好超过3 0m g m l 。根据多糖在n m r 谱图上的信号，通过对n m r 8 湖北工业大学硕士学位论文 谱图的解析，对多糖的结构进行进一步的推定。 对于结构复杂的多糖，尤其是结构未知的多糖，直接采取n m r 分析结构难度 很大，也不可取，因而在n m r 分析之前最好做一些基础性的工作，主要是单糖组 成的测定和甲基化分析：对于分子量很大而结构又比较复杂的多糖，最好将多糖 进行部分酸水解后再进行n m r 分析。5 0 0 或6 0 0 m h z 的高分辨1 hn m f 能准确测定 结构表征基团的位移和峰宽，1 hn m r 主要解决多糖结构中糖苷键构型的问题。1 3 c n m r 的化学位移较宽，而且通常采用全去耦法，每一种化学等价的碳原子只有一 条谱线，因而谱图的分辨率好，谱线很少重叠。其在多糖结构研究中的作用有： 确定糖残基的数目和相对含量。确定糖链的位置。确定硫酸基的取代位置。 确定某些糖类。确定异头碳的构型。此外，2 d - - n m r 7 4 、n o e 和1 5 n 、3 1 p 的 n m r 数据对糖链一级结构的分析是必不可少的。 在1 hn m r 谱图上，多糖信号大多集堆在6 值4 0 - 5 5 p p m 范围内。1 hn m r 主要 解决的是多糖结构中糖苷键的构型问题。多糖在1 hn m r 谱图上，通常a 一型吡喃己 糖c 质子的6 值超过5 o p p m ，而b 一型贝u j , 于5 o p p m 。此外，不同糖苷键组成的多 糖中c 上质子峰面n m r 积之比代表着各种糖残基的比例。 相对于1 hn m r 来说，1 3 cn m r 谱有较大的化学位移范围，谱线重叠少，较易于解 析叭j 妇。根据1 3 c n m r 可以推测异头碳的构型，多糖中各残基种类和比例，根据化学 位移的变化还可以来判断残基中糖苷键的类型和取代基的位置。如q 一型连接的糖 残基的c 。化学位移为9 7 - - - l o l p p m ，b 一型的为1 0 3 - , 1 0 5 p p m 。 1 1 4 酵母多糖的结构与功能关系的研究进展 目前对活性多糖的研究对象包括植物类、动物类、真菌类、细菌、地衣、藻 类、花粉等，研究方法涉及各种化学分析及仪器分析方法，研究范围涉及多糖的 分离纯化、结构分析、理化性质、免疫学、药效学、毒理学及治疗应用。 多糖具有多种生理活性【5 l 】如抗肿瘤，抗病毒，抗氧化，增强机体免疫活性等 而为人们关注。迄今为止已有近千种多糖得以分离纯化和一级结构的确定。由于 多糖的结构相当复杂，因此研究多糖的构效关系十分有意义。具有何种结构的多 糖才具有活性，结构的改变如何影响多糖活性，诸如此类的工作都是为了解释多 糖的结构和功能的关系，是寻找具生物活性多糖和多糖药物开发的基础“6 一阳。 糖单元的组成 糖单元组成物有均聚多糖和杂多糖。不同种类的多糖，其主链糖单元的组成 不同，生物学活性存在较大差异。 糖苷键的类型 9 湖北工业大学硕士学位论文 在单糖的连接位置方面，主要有1 3 、1 6 、1 2 、l 一4 连接方式。具有1 3 连接方式的多糖大多具有生物活性，如香菇多糖嘲，灵芝多糖，从天然冬虫 夏草提取的虫草多糖都以这种结构为主嘲。部分1 6 连接方式的多糖也具有生物 活性，而1 2 、1 4 等连接方式的多糖很少具有活性。 主链的构型 主链构型有a 型和b 型。对于葡聚多糖而言，q 一葡聚糖一般没有活性，而大 多数具有抗肿瘤活性的多糖都具有b 一( 1 3 ) - n - 葡聚糖的主链结构m 1 。 支链的分支程度嘲 支链的分支度对多糖的活性也有影响。只有当多糖达到一定的分支度时，才 能具有生物活性。但并不是分支度越高，活性越强。每种多糖都存在最佳分支度， 使其活性达到理想状态。水溶性d _ 葡聚糖有抗肿瘤活性，特别是那些直链的、无 过长支链的多糖。 分子量的影响哪! 多糖的生物活性也与其分子量大小有关。一般来说，分子量在1 0 0 - - 2 0 0 k d 之 间的多糖片段有较高的生物活性，而相同来源的分子量在5 - - 一l o k d 之间的多糖片 段无生物活性。硫酸葡聚糖抗h i v 病毒活性随着相对分子质量的增加而增加，相 对分子质量1 0 0 0 0 时达到最大，1 0 0 0 0 - 5 0 0 0 0 0 之间保持最大活性。抗肿瘤活性 研究中发现，分子质量5 0 k d a 以上具有三重结构的多糖才有抗肿瘤活性。 多糖的空间构型嘲3 多糖的特定空间构像是其产生生物学活性所必需的，生物学活性较强的多糖， 通常都具有规则的空间构像。一般认为，高级结构呈屈状螺旋的多糖活性较高， 而呈可拉伸带状或皱纹型带状的多糖活性一般较低甚至没有活性。三股螺旋构型 是多糖最具活性的空间构像。 酵母葡聚糖经研究表明，其主要生理功能有呻j l 唧： 增强免疫功能。酵母葡聚糖能够刺激增强n k 细胞、巨噬细胞等免疫细胞的吞 噬活性，刺激释放白介素以增强机体防御有害物质的能力，可以有效提高人体免 疫力； 抗辐射作用。葡聚糖的抗辐射作用是促进造血机能的结果。酵母葡聚糖能增 强血细胞的生成活性，包括粒细胞的生成、单核白细胞以及红细胞的生成，从而 导致更好地从致命剂量的辐射中得到恢复； 调节血脂。研究发现，酵母葡聚糖能够显著降低人体甘油三脂水平、降低l d l ( 低密度脂蛋白) 水平，并升高h d l ( 高密度脂蛋白) 水平，有效预防冠心病、动 脉硬化等心脑血管疾病。 1 0 湖北工业大学硕士学位论文 因此，对于研究酵母多糖的结构有着相当重要的作用。 而研究表明证实，一级结构是1 3 一( 1 2 ) 连接的葡聚糖、甘露聚糖、半乳 聚糖，它们大都有一定的抑瘤活性；b 一( 1 3 ) 葡聚糖、半乳聚糖有较明显的 抑瘤活性，李荣芷经1 3 c 核磁共振分析推断，认为是p 一( 1 3 ) 多糖链骨架上 的多羟基基团对抗肿瘤活性起了重要作用；1 3 一( 1 3 ) 为主链的葡聚糖如有( 1 - - 6 ) 支链的，有的有抑瘤活性，有的没有抑瘤活性。多糖高级结构的改变常伴有 活性的改变，如香菇多糖经某些方式处理后可从有活性变为无活性。 啤酒酵母细胞壁的内层葡聚糖主要含有碱不溶性、碱溶性、酸溶性葡聚糖。 靠近外面的是一种碱溶性葡聚糖哺，在长长的b 一( 1 3 ) 键连接的葡萄糖链中存 在若干1 3 一( 1 6 ) 键连接的葡萄糖残基，这些异常键干扰了附近分子的氢键和微纤 维的组成，像这种非晶型葡聚糖在碱溶液中已经变的可溶解了。最内层是碱不溶性 b 一葡萄糖胶内层，约占3 0 - 3 5 ，即使用热碱萃取也能保持酵母细胞形状和坚固 性。通过电子显微镜观察，碱不溶性葡聚糖在细胞壁中是以一种紧密的微网状而 存在，这是由于葡萄糖残基的1 3 一( 1 3 ) 键连接的链借氢键和( 或) 三级螺旋中 的其它吸引力连接在一起所致。近年来研究表明，这种葡聚糖是两种多糖的混合 物，其中较多的一种( 占8 5 ) 主要为1 3 一( 1 3 ) 键的葡聚糖，分子量约为2 4 0 0 0 0 ； 而作为分支点的是3 的1 3 一( 1 6 ) 键，较少的一种多糖( 占1 5 ) 由具有b 一( 1 - - 3 ) 中间残基键的高度分化的b 一( 1 3 ) 葡聚糖构成。1 3 一葡聚糖分子中的( 1 3 ) 糖苷键使其形成了不规则的分子形状，( 1 - * - 3 ) 糖苷键的含量和比例决定了 分子中葡萄糖单元能否排成稳定的聚合体。因此( 1 3 ) 糖苷键是影响葡聚糖溶 解性和酶解性的根本原因口钉。 长期的研究表明，在多糖骨架上占优势的交替( 卜3 ) 键连接的且- d - 葡聚糖 往往具有较明显的抗肿瘤活性嗍。多糖结构与抗肿瘤活性之间的相互关系不仅涉 及到多糖的初级结构，而且与它们的分子大小、水中溶解性及构象形态等也有关 系，具有该活性的葡聚糖绝大多数具有三股螺旋构象，由氢键把1 3 ( 1 3 ) 键连接 的d 一葡萄糖残基连接起来，经核磁共振谱分析推断，连接在b ( 1 3 ) - o - 葡聚糖 骨架上的多羟基基团对抗肿瘤活性起重要作用哪朋1 。 1 2 课题的目的和意义 1 2 1 课题研究的意义 课题来源： 本课题是湖北省教育厅重点科研项目。项目编号为2 0 0 3 a 0 1 0 。 湖北工业大学硕士学位论文 我国第一家现代化啤酒厂是1 9 0 3 年在青岛由德国酿造师建立的英德啤酒厂 ( 青岛啤酒厂前身) 。此后，1 9 1 5 年在北京由中国人出资建