（食品科学专业论文）冬枣环磷酸腺苷提取纯化工艺研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名 导师签名 窿恕棒 岛蟛 时间：加刁年b 。月口日时间：多叼7 年 月三日 时间：肋6 7 年莎月c 严日 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使 用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生繇存盘；酝 帆砷年占月口日 导师签名： 鸾蝣时闻：。击p 7 年矿月7 1 一日 沈鬻农业大学硕士学位论文 摘要 本文优化了冬枣中环磷酸腺苷高效液相色谱测定的色谱条件：色谱柱为 h y p e r s i l o d s 2c 1 8 柱( 2 5 c r u x 4 6 m m ，卸衄) ，流动相为v ( 甲醇) ：v ( o 0 5 m o l l 磷酸二氢 钾) = 1 0 ：9 0 ，流速1 0 m 1 m i a ，紫外检测器u v 2 5 4 0 a m x 0 2 a u f s ，柱温3 0 ，迸样t 1 5 9 l 。 测定结果表明：标准曲线在1 o 5 0 0 # g m l 范围内线性良好，加标回收率为1 0 0 0 4 ，c v 为0 8 9 ( n = 6 ) 。利用所优化的色谱条件检测6 种冬枣中c a m p 的含量，结果表明，鲁北 冬枣的含量最高，为1 3 9 1 毗驰枣粉。其生长发育期的动态检测表明，c a m p 含量呈现上 升趋势，至充分成熟时达到最高。 根据环磷酸腺苷的溶解特性，选取水、乙酵、甲醇、丙酮、氯仿、浓度3 0 7 0 的乙醇溶液、p h 值3 o 8 0 的缓冲溶液进行常规浸提，最终选取水为提取溶剂。在此基 础上，考察了超声波和微波辅助提取的效果并确立了最优化工艺条件，试验证明这两种 措施的提取率都明显高于常规浸提。常规浸提方法的提取率为1 3 9 x o # g g 枣粉；超声波 辅助提取的最优化工艺条件为：料液比1 ：1 2 、浸泡时间1 2 h 、处理温度4 0 、处理时间 1 5 r a i n ，提取率为3 0 1 2 5 # g g 枣粉；微波辅助提取的最优化工艺条件为：料液比1 ：2 5 、微 波功率2 0 0 w 、浸泡时间4 h 、处理时间3 r a i n 、，提取率为2 4 1 3 7 u g g * 粉。 选择大孔吸附树脂进行提取液的纯化，根据饱和吸附试验的结果确定采用i - i p d 4 0 0 型树脂。考察了其静态吸附与解吸动力学特性，得到了吸附动力学曲线、吸附等湿线和 解吸动力学曲线。在此基础上进行了动态吸附解吸试验，确定在床层体积为1 0 m l ( 中1 0 c m ) 的情况下，上样液浓度为5 0 0 9 9 m l ，适宜p h 值为4 o 5 0 ，流速为4 b v h ， 流出液体积达到1 2 b v 时吸附饱和。选择3 0 乙醇溶液为适宜的洗脱液，洗脱流速2 b v h ， 根据洗脱曲线。收集流出液体积1 b v 1 2 b v 之间的洗脱液，进行浓缩蒸干。经纯度检测， 纯化后c a m p 的纯度从0 1 0 9 增加n 3 2 4 5 3 ，达到了对提取液进行纯化的目的。 关键词：冬枣；环磷酸腺苷；提取；纯化；大孔树脂 a b s t r a c t i nt h i s s t u d y , t h eh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i c ( h p l c ) m e t h o df o rt h e a n a l y s i so fc y c l i ca d e n o s i n e 37 ，5 m o n o p h o s p h a t e ( c a m p ) i nd o n g z a oj u j u b ai s o p t i m i z e d h y p e r s i l o d s 2c 1 8c o l u m n ( 2 5 c m x 2 6 m m ，靴m ) i su s e d t h em o b i l ep h a s ei sa s f o l l o w s ：v ( m e t h a n 0 1 ) ：、，( o 0 5 m o l lk h 2 p 0 4 ) = 1 0 ：9 0 ，a n dt h ef l o wr a t ew a s1 o m l m i n ， t e m p e r a t u r eo fc o l u m ni s3 0 c ，q u a n t i t yo fi n j e c t i o ni s1 舡l i ti sm e a s a t e db ya nu l t r a v i o l e t d e t e c t o ru n d e r2 5 4 0 n m x 0 2 a u f s t h er e s u l ts h o w st h ec a l i b r a t i o nc l l l v ei sl i n e a rw i t ht h e r a n g eo f1 0 5 0 o z g m l t h er e c o v e r yi s1 0 0 0 4 t h ec o e f f i c i e n to fv a r i a b i l i t y i s0 8 9 ( n = 6 ) a l lk i n d so fd o n g z a oj u j u b aa r ed e t e c t e da b o u tt h ec o n t e n to fc a m pi nt h eu s eo ft h e h p l cm e t h o d t h er e s u l ts h o w st h a to fc o n t e n tl u b e id o n g z a o j u j u b ai s1 3 9 1 0 z g gj u j u b a p o w d e r , t h eh i g h e s ti na l lk i n d so fd o n g z a oj u j u b a c h a n g eo fc a m pd u r i n gd e v e l o p m e n to f t h el u - b e id o n g z a oj u j u b ai sm o n i t o r e d ；t h ec o n t e n to fc a m p k e e p sr i s i n gu n t i li tb e c o m e s m a t u r e a c c o r d i n gt ot h ed e l i q u e s c e n c ec h a r a c t e r i s t i co fc a m p , w a t e r , e t h a n o l ，c a r b i n o l ，a c e t o n e ， d d o r o f o 咖，3 0 7 0 a l c o h o ls o l u t i o n , b u f f e rs o l u t i o nt h a tv a l u eo fp hi s3 o 8 0a r e s e l e c t e dt oc a r r yo nt h eg e n e r a le x 扛a c t i o n , w a t e ri ss e l e c t e da se x t r a c t i o ns o l v e n t o nt h eb a s e o ft h er e s e a r c h ，t h ee x t r a c t i o ne f f e c to fu l t r a s o n i ca n dm i c r o w a v e - a s s i s t e de x t r a c t i o na r e i n v e s t i g a t e d ，t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sa t ed e v e l o p e d a c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n t a t i o nr e s u l t ， t h ee x t r a c t i o nr a t i oo ft h et w om e t h o d si s o b v i o u s l yh i g h e rt h a ng e n e r a le x t r a c t i o n 。t h e e x t r a c t i o nr a t i oo fg e n e r a le x t r a c t i o ni s1 3 9 1 0 肛g gj u j u b ap o w d e r ；t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so f u l t r a s o n i ce x t r a c t i o na r ef o l l o w s ：t e m p e r a t u r ei s4 0 ，m a r i n a t e dt i m ei s1 2 h ，e x t r a c t i o nt i m e i s1 5m i l l ，r a t i oo fm a t e r i a la n dl i q u o ri s1 ：1 2 ，t h ee x t r a c t i o nr a t i oi s 3 0 1 2 5 z g gj u j u b a p o w d e r ；t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fm i c r o w a v e - a s s i s t e de x t r a c t i o na r ef o l l o w s ：m i c r o w a v e p o w e r i s2 0 0 w ，m a r i n a t e dt i m ei s4 h ，e x t r a c t i o nt i m ei s3m i n ，r a t i oo fm a t e r i a la n dl i q u o ri s 1 ：2 5 ，t h ee x f f a c t i o nr a t i oi s2 4 1 3 7 1 , g gd a t ep o w d e r m a c r o p o r o u sr e s i n sa r eu s e dt op u r i f ye x t r a c t i o ns o l u t i o n a c c o r d i n gt ot h er e s u l to f s a t u r a t e de x p e r i m e n t ，h p d 一4 0 0m a c r o p o r o n sr e s i ni ss e l e c t e d s t a t i ca b s o r p t i o nd y n a m i c s c u r v e ，a b s o r p t i o ni s o t h e r mc u r v ea n ds t a t i cd e s o r p t i o nd y n a m i c sc u r v eo fh p d 一4 0 0r e s i na r e o b t a i n e da f t e rs t a t i ca b s o r p t i o na n dd e s o r p t i o nd y n a m i c sc h a r a c t e r i s t i ca r es t u d i e d i nt h eb a s e o ft h ee x p e r i m e n t ，d y n a m i ce x p e r i m e n to fa b s o r p t i o na n dd e s o r p t i o no fh p d - 4 0 0r e s i ni s p e r f o r m e d t h ec o n d i t i o n so fp u r i f i c a t i o na l ef o l l o w s ：v o l u m ei s1 0 m l ( 由1 0 c m ) s o l u t i o n c o n c e n t r a t i o ni s5 0 叩m lf e a s i b l ev a l u eo fp hi s4 0 5 o s o l u t i o nf l o ws p e e di s4 b v h ， 2 沈阻农业大学硕士学位论文 a b s o r p t i o ni ss a t u r a t e da f t e rt h ev o l u m ea t t a i n1 2 b v 3 0 e t h a n o ls o l u t i o ni ss e l e c t e da s d e s o r p t i o ns o l u t i o n , d e s o r p t i o ns o l u t i o nf l o ws p e e di s2 b v h a c c o r d i n gt ot h ed e s o r p t i o n c 哪e r e s o r p t i o ns o l u t i o nb e t w e e n1 b va n d1 2 b vi sc o l l e c t e d a f t e rt h ec o n c e n t r a t i o na n d e v a p o r a t i o no fr e s o r p t i o ns o l u t i o n , p u r i t ye x p e r i m e n tw a sp e r f o r m e dt h cp u r i t yo fc a m p i n c r e a s et o3 2 4 5 3 f r o m0 ，1 0 9 1 h ca i mo fp u r i t yi so b t a i n c d k e yw o r d s ：d o n g z a oj u j u b a ，c a m p ，e x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，m a c r o p o r o u sr e s i n 3 刖莓 枣树是原产中国的果树之一，是我国的一大特色和优势资源，有3 0 0 0 多年的栽培历 史，栽培区域主要集中在黄河中下游地区的陕西、山西、河南、河北、山东等省。据统 计，全国现有枣树7 0 多万公顷，年产鲜枣1 6 0 多万吨，占世界的9 8 。枣果实营养丰富， 除含有丰富糖分之外，钙、磷、铁等矿物元素以及维生素a 、b 、d 的含量都很高，是我 国民间传统的营养保健食品。随着人们对枣营养价值认识的不断加深以及鲜枣特有的口 感和风味，近年来鲜枣及枣制品在国内市场上日益受到青睐。枣树在国外栽培数量还很 少，是目前惟一的一种原产中国但还没有在国外大面积栽培的果树树种，随着中国加人 w r o ，这一具有中国特色的水果有很大的国际竞争力。特别是近年来，在苹果、梨等大 宗果树效益下滑的发展趋势情况下，枣树以其适应性强、栽培简便、早果速丰、食疗价 值高、经济和生态效益显著等优点，已成为全国果树发展中一个新的热点。当前，许多 地方的政府都把发展枣树和鲜枣产业作为当地调整农业产业结构的重要内容来抓，农民 发展枣树的积极性也空前高涨，正在掀起一股发展枣树的热潮。随着栽培面积的扩大和 产量的提高，发展枣制品生产及开展精深加工研究的工作也日益迫切。但迄今枣的加工 增值环节尚十分薄弱，尤其缺乏能突出枣果营养和独特食疗价值的高附加值产品，这一 现状已成为枣树生产再上新台阶和可持续发展的关键性制约因素。 一冬枣的栽培历史、种质资源和产业发展现状 1 冬枣的栽培历史 冬枣是枣种质资源中极其宝贵的部分，是我国枣类中的名、优、稀、特产品之一， 也是我国北方地区主要特色水果之一，主要分布于山东省的滨州、德州、聊城、东营和 河北省的沧州、黄骅、衡水等地区。查解历史资科，冬枣最早见于打枣谱中，打 枣谱为元代柳贯所著，成书于公元1 3 0 0 年左右，这说明，冬枣栽培距今已有近千年的 历史了( 郭继胜，2 0 0 0 ) 。山东省果树研究所的研究报告浅谈我国的冬枣资源( 内 部资料) 中对冬枣的概述是：冬枣系指果实生育期1 2 0 天以上的晚熟品种枣类，在淮河秦 岭以北的北方，其果实都在l o 月上、中旬成熟，特晚熟的品种延迟到1 0 月下旬成熟，因 其成熟晚而称为冬枣( 郭裕新，1 9 9 2 ) 。其果形美观，色泽鲜艳，果肉脆嫩多汁、浓甜 微酸，品质极上，是一种风味极佳的红枣鲜食品种。北京营养源研究所1 9 9 4 年对冬枣的 分析结果( 李守勇等，2 0 0 4 ) 表明它富含1 9 种人体所需的氨基酸和多种维生素，还含有 4 沈阳农业大学硕士学位论文 丰富的钙、钾、铁、锌、铜等多种矿质微量元素和较多的药用物质，如环磷酸腺苷、环 磷酸鸟苷以及黄酮类物质，有很高的食疗价值和多种保健功效，作为礼品和珍稀果品很 快被人们所接受。 2 冬枣的种质资源 关于冬枣的种质资源尚未见系统的研究报道，其起源也没有定论，据中国枣树志 编委会统计冬枣品种约有2 0 个，而品质表现优良，果实较大，平均果重超过1 0 9 ，有发 展前途的仅有6 个( 郭裕新，1 9 9 2 ：王奎武，2 0 0 0 ) ：成武冬枣、鲁北冬枣、薛城冬枣、 长条枣、驴奶头枣、九月青。但目前对于冬枣品种类型及分布也存在着不同的学术观点， 各地也亦相继出现了一些以产地命名的冬枣品种。续九如等( 2 0 0 3 ) 通过对各种所谓冬 枣的有关性状详细比较后，认为许多所谓冬枣并非真正的冬枣，并认为冬枣，即上文中 提及的鲁北冬枣，是一个优良鲜食枣品种，不应包含任何其他晚熟品种，不能将晚熟品 种与冬枣相混淆，关于冬枣的定义，必须以中国果树志枣卷为准。彭建营( 2 0 0 0 ) 从r a p d 分析入手，对鲁北冬枣、薛城冬枣、成武冬枣等多个品种进行研究表明，鲁北 冬枣与成武冬枣亲缘关系较近，二者与薛城冬枣关系较远，认为利用r a p d 分析，进行 枣的种质鉴定是可行的。同时，彭建营( 2 0 0 0 ) 对6 7 个枣品种和酸枣类型进行了花粉形 态研究，证明根据花粉形态也能有效地对枣种质进行分类。今后应加强冬枣良种选育、 繁育工作，严防品种混杂，进一步明确冬枣的起源和适宜栽植区域。通过分子标记，区 分不同的栽培品种；对冬枣资源鉴定筛选，开展冬枣的胚胎培养、花药培养研究，选育 冬枣新品种，以获得优良品系，促进良种化。 3 冬枣栽培及产业发展现状 过去冬枣基本上是散生于黄河下游几个县的农家庭院中，只能随熟随采食、加工， 除少量在城镇集市销售外，多为栽培者自用，只是小宗的庭院果树。大田栽培始于上世 纪8 0 年代中期，而大面积栽培则是自1 9 9 8 年开始的。早期由于产量不高，冬枣只是作为 礼品和珍稀果品，价格居高不下，因此各地都把发展冬枣栽培和保鲜产业作为增加农民 收入的重要手段，冬枣的栽培面积每年以3 4 倍的速度发展，总产量以4 巧倍的速度增加。 目前，以由东、河北、天津等地为主，形成了环渤海湾地区为中心的几十万亩的冬枣主 产区，产量达数十万t 。产量的增加使之迅速转成大众化消费的时令果品，销售价格一降 再降。冬枣作为时令果品，目前主要用于鲜食和保鲜供应，但是由于产量的逐年提高和 市场歼拓的不足，采收价格稳中有降，保鲜延长供应阶段持平或稍低，部分惜售和不及 时出售的保鲜业者后期无保鲜增值甚至亏本。今后如何提高栽培经济效益，如何获取保 鲜增值及维持可持续发展，是产区果农十分关注的问题。另外，任何一种果晶，在常规 管理条件下其残次果都在1 0 左右，冬枣也是如此，再加上保鲜过程中不适宜鲜食的枣 果，在产量较小的情况下它们不被人们重视，但随着产量的迅速增加，其数量将变得十 分巨大，怎样给它们找条出路将变得十分重要。解决这些问题的根本出路就在于对冬 枣进行加工增值。世界果品生产发展的历史表明，当果品生产发展到一定程度，必须靠 加工业来推动，发达国家每年加工量占果品总产量的4 0 5 0 。由于多种原因，我国 的贮藏、保鲜工业一直比较落后，尽管近十年来发展非常迅速，但是，目前每年的贮藏 量也只果品总产量2 0 左右，加工量只占果品总产量的l o 左右，通过采摘后进行分级、 打蜡、包装、贮运的水果还不到总产量的1 ，远远满足不了市场的需求。过去，冬枣加 工量少的主要原因有三：一是发展初期鲜食畅销，且价格高，此时加工原料昂贵，产品利 润低或无利润甚至亏本，进行加工不合时宜；二是对该品种的加工研究较少，可利用的成 果和新技术不足；三是冬枣不能进行加工的舆论和专业技术误导。目前，这些制约因素 已经逐步被消除：首先，随着销售价格的下降，采收时价也逐渐降至一个合理水平，加 工增值也有了一定的利润空间，制约冬枣加工的价格因素已不再是主要因素；其次，对 于冬枣的加工研究已经展开，1 9 9 4 年起山东省果树研究历利用俣鲜试验中失去鲜食价值 的鲁北冬枣进行了冬枣酥片、冬枣果肉饮料、果汁饮料、冬枣酱泥、冬枣酒、醋等制品 的加工试验，工艺和配方也有了一定积累，证明冬枣完全可以加工，它不仅是鲜食品种。 作为加工原料也是优质资源( 鲁默森，2 0 0 2 ) ；在舆论和专业技术方面，也正在逐步转 变过去的某些偏见和误导，冬枣深加工转化也已经开始破题。 传统的枣制品加工技术含量较低，很难保证可靠的保健功效，制约了这一宝贵资源 的高效利用与经济效益的充分发挥。目前，利用生物技术从植物当中提取具有特殊活性 的功能因子成为研究热点，这为充分利用冬枣资源提供了可行之路，即选择较高起点的 高附加值产品加工模式，一方面实现深度增值，另外也能够减少对原料加工适应性的要 求。枣作为我国传统的药食兼用的果品，富含多种功能因子，尤其环磷酸腺苷是枣果中 最具特色的生物活性物质，极具开发价值，也是现在的研究热点。 二环磷酸腺苷的结构、生理活性和制备、检测方法 环磷酸腺苷( c y c l i ca d e n o s i n e 3 7 ，5 m o n o p h o s p h a t e ，简称c a m p ) 是核苷酸 的衍生物，为蛋白激酶致活剂，是有机体中广泛存在的一种具有生理活性的重要物质， 沈阳农业大学硕士学位论文 是细胞内传递激素和递质作用的中介因子，其灭活酶为磷酸二脂酶，是当前分子生物学 研究的重要内容之一。1 9 5 7 年，s u t h e r l a n d 及其同事在进行肝糖原代谢的调节研究时发 现，用肝细胞匀浆加a r p 和m 矿+ ，与肾上腺素或胰高血糖素一起保温，能产生一种耐热 的、可透析的因子，这种因子可以模拟胰高血糖素对糖原的分解作用，很快这种因子就 被确定为c a - l v l p ，它是在腺苷酸环化酶作用下由a t p 分解并环化产生的。1 9 6 5 年， s u t h e r l a n d 据此提出了著名的第二信使学说。由于s u t h e r l a n d 在信号传导机制研究中的这 一突出贡献使他荣获7 1 9 7 1 年的诺贝尔生理医学奖( 孙志贤，1 9 9 5 ) 。之后，人们相继 从植物和微生物中发现了c 舢订p ，并证明它是生物界普通存在的一种生物活性物质，一 般含量极微，具第二信使作用( 激素为第一信使) 。基础医学研究证明至少4 0 多种疾病( 包 括癌症、高血压、冠心病、心肌梗塞和心源性休克等重大疾病) 与c a m p 的代谢有关；临 床医学研究证明c 镰佃能舒张平滑肌、扩张血管、改善肝功能、激活蛋白、促进神经再 生、抑制皮肤外层细胞分裂和转化异常细胞的功能、促进呼吸链氧化酶的活性、改善心 肌缺氧并对心肌梗塞、冠心病、心源性休克、牛皮癣等疾病有显著疗效。国内外对其生 理活性、作用机理进行了大量研究，涉及疾病治疗、信号表达、基因复制等方面( 樊君， 2 0 0 5 ) 。 1 环磷酸腺苷的结构、性质与功能 ( 1 霸环磷酸腺苷的结构、性质 环磷酸腺苷的结构式如图1 所示，分子式：c 1 0 h 1 2 n 5 0 d h 2 0 ，分子量3 4 7 2 3 。其 性质较稳定，耐热，为白色或类白色淡黄色粉末，无臭；在水中微溶，不溶于乙醇、乙 醚；【a d - - - - - 5 1 3 俨，c = 0 6 7 9 m l ，熔点2 1 9 2 2 0 c ( 欧阳平凯，2 0 0 1 ) 。 i o h 宙1 环磷酸腺苷结构 f i gls t i _ l l c t l l r ef o r m u l ao f c a m p ( 2 ) 环磷酸腺苷的第二信使作用 7 1 9 6 5 年，s u t h e r l a n d 提出了著名的第二信使学说( 孙志贤，1 9 9 5 ) ，其主要论点是： 激素作为“第一信使”与靶细胞膜上的受体结合，再通过激活腺苷酸环化酶产生c a m p ， c a m p 作为第二信使，引起一连串的胞内反应并产生生理效应。细胞受体信号传导机制 是十分复杂的，一是细胞表面的受体及其接收的信号种类繁多，二是各种细胞由于受体 组成不同，信号传导机制也不相同，但人们还是能够把握它的一些基本特征。首先，胞 外刺激信号作为第一信使与细胞表面的受体结合并使之活化，活化的受体通过偶联蛋白 ( g 蛋白) 或直接使效应酶活化，于是在胞内产生第二信使的信号分子，再进一步对胞 内效应酶活化，信号就这样逐级传递，最终产生细胞的功能性应答。如图2 所示： 田2 第二倍便作用图示 f i 9 2 f u n c t i o n o f s e c o n d m e s s e n g e r 受体： 此类受体被称之为g 蛋白偶联型( g p r o t e i nc o u p l e dt y p e ) 受体，这类受体与g 蛋 白偶联，通过g 蛋白间接地控制第二信使或离子通道产生效应。这类受体与配体从结合 到产生效应一般在数秒到数分钟。 偶联蛋白： 它是一种调节蛋白，也就是g 蛋白，全称为g t p 结合蛋白或g t p 结合调节蛋白， 广泛存在于各种组织、细胞的细胞膜上，在受体与效应酶之间起重要的调节作用。g 蛋 白由a 、b 和y 三个亚基组成。a 亚基上具有g t p 或g d p 的结合位点，以及与受体结合 的位点，a 亚基还具有g t p a s e 的活性，可使g t p 水解为g d p ，是决定g 蛋白主要功 能的亚基。b 、丫亚基的主要功能是调节a 亚基的活性。 g 蛋白的效应酶： g 蛋白的效应酶主要是腺苷酸环化酶( a c ) ，参与a c 调节的有g s 和g i ，g s 起激 活a c 的作用( s ：s t i m u l a t i o n ) ，g i 则抑制a c ( i ：i n h i b i t i o n ) 。由于正常哺乳动物细胞膜 上同时具有g s 和g i ，以及相关的受体r s 和r i ，因此，a c 活性受激活型激素h s 和抑 8 沈阳农业大学硕士学位论文 制型激素h i 的双重控制，a c 活化后又催化a t p 反应生成c a m p ，c a m p 成为重要的第 二信使。与a c 作用相反的是c a m p 磷酸二酯酶( p d e ) ，可催化c a m p 反应生成y - a m p ， 从而终止c a m p 对蛋白激酶的激活作用。 c a m p 依赖的蛋白激酶： c a m p 依赖的蛋白激酶，简称a p k 或p k a ，是k r e b s 在6 0 年代后期发现的一种被 c a m p 活化的蛋白激酶。a p k 由两个调节亚基( r ) 和两个催化亚基( c ) 组成，即r 2 q 。 c a m p 的作用是与调节亚基结合，使催化亚基与调节亚基解离而活化。a p k 的底物特异 性较低，既可催化一般蛋白磷酸化，又可催化酶蛋白的磷酸化，还能自身催化其调节亚 基的磷酸化。a p k 主要在物质代谢和基因表达的调节中起作用。 ( 3 ) 环磷酸腺苷的生理活性 c a m p 对很多酶催化的反应具有调节作用，可调节与细胞内贮藏的糖和脂肪反应的 一系列酶的活性，对蛋白质的生物合成也具有调节控制作用，可广泛参与细胞功能的调 节。c a m p 的胞内浓度增高有利于改善心脏内心肌、骨骼肌、横纹肌的疲劳程度，临床 实践证明病人由于骨骼肌疲劳造成的心脏病得到了缓解( b i s h o pa 等，1 9 9 8 ) 。m u l i e r i l a ( 1 9 9 7 ) 等人研究了c a m p 对右冠状动脉疾病、二尖瓣回流( m i t r a lr e g u r g i t a t i o n ) 、 扩张性心疾病、原发性心肌病作用的机理，认为c a m p 浓度的变化改变了钙泵的控制； 在免疫系统的影响方面，研究者发现在兔子的腹膜巨噬细胞中，c a m p 浓度的增高会明 显抑制过氧化物的产生，提示环磷酸腺苷可以在医疗上用作过氧化物过度产生的保护剂 ( s i q s 等，1 9 9 7 ) 。b e v i l a q u a l ( 1 9 9 7 ) 等人研究了c a m p 对脑的作用，在小鼠的后海 马区两侧注入1 2 瓤g 的c a m p 及其他辅助兴奋剂，使细胞内c a m p 浓度升高，经过不同时 间的训练后，测试结果显示其记忆程度衰退，证实海马细胞中c a m p 的浓度影响着记忆 固化。另有研究者对2 0 个月的小鼠进行行为测试，将其分为w o r k e r s 、p a r a s i t e 、i n v e n t o r s 、 l a z y l 四组，分析了四组小鼠的左右半脑细胞中c a m p 的含量。结果发现四组之间存在着明 显差异，说明脑细胞中c a m p 的含量和动物的行为方式相关( s t e p a n i c h e vm 等，1 9 9 6 ) 。 研究还证明c a m p 可以刺激神经产生胆碱能作用，从而影响快眼动期睡眠( r a p i de y e m o v e m e n ts l e e p ) ，c a m p 含量增高，则显著降低快眼动期睡眠( c a p e c em 等，1 9 9 7 ) 。 同时c a m p 对髓鞘的形成、破碎、修复及髓鞘基因的调节、表达、信号传递均有影响 ( w # l i k o n i s r s 等，1 9 9 7 ) 。当小鼠被注射c a m p ( 5 n m o l m i n 1 0 0 9 体重) 时，发现磷、 钠的排泄量显著增高，当剂量增大时，血浆中c a m p 的浓度也增高，说明了c a m p 对肝、 9 前言 肾的影响( a h l o u l a ym 等，1 9 9 6 ) 。在肾上皮细胞中，c a m p 抑制了一氧化氮的合成， 可以减少细胞受伤，起保护作用( k i t a m u r ak 等，1 9 9 7 ) 。c a m p 可以活化磷酸化酶蛋 白激酶a ，从而对转录因子起作用( d a n i e l 等，1 9 9 8 ) 。有研究表明c a m p 调节人类肾素 基因的转录( g c r r n a i ns 等，1 9 9 7 ) 。脑白质肾上腺萎缩症( a d r e n d e u k o d y s t r o p h y ) 是一 种遗传的脂肪酸代谢紊乱疾病，增高c a m p 的浓度则可激发过氧化物酶体的活性，反之 则抑制，因此可用于该病的治疗( p a h a nk 等，1 9 9 8 ) 。c a m p 还可促进口腔角质细胞的 增殖( k a p a ss 等，1 9 9 7 ) ，抑制小鼠的主动脉平滑肌细胞中分裂素活化蛋白激酶的活 性( p l c v i nr 等，1 9 9 7 ) ，还可抑制支气管哮喘的炎症。其葡甲胺基衍生物，药品名称 为心先安，作为口服药或针剂己广泛的应用于临床治疗。 2 环磷酸腺苷的制各方法 研究工作和医学临床试验均需大量的c a m p 。过去，c a m p 主要从动物内脏中提取， 因为含量极微，所以市场价格非常昂贵，人们也一直在寻找更为廉价的提取来源或采用 化学合成法、微生物发酵法进行替代生产。 ( 1 ) 化学合成法 s m i t h 等人( 1 9 6 1 ) 在1 9 6 1 年合成了c a m p ，此法主要是用5 核苷酸和4 吗啡啉- n ， n - z 环己基眯在吡啶中用二环己基碳二亚胺( d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m i d e ) 作脱水剂进行 脱水反应，而使5 腺苷酸发生内酯化。为避免分子间的反应，反应必须在高度稀释条件 下进行，因而要用大量无水吡啶，吡啶对人体危害很大，并对环境有污染。因此又有人 采用了二甲基甲酰胺( d i m e t h y l f o r m a m i d e ) 、二甲基亚砜( d i m e t h y ls u l f o x i d c ) 为溶剂， 这两种物质对反应物的溶解性与吡啶相似，但由于其沸点较高，在反应后处理阶段进行 浓缩时，不易除尽，使产物难于提纯( 张今，1 9 7 9 ) 。1 9 8 6 年，我国的研究者又探索了 新的溶剂系统：2 5 9 的5 - a m p 和2 9 的4 一吗啡啉n ，n 二环已基眯溶解于4 0 m l 的乙二酵单 甲醚中，与含4 9 二环己基碳二亚胺的4 5 0 m l 7 , - 醇单甲醚溶液在1 2 0 c 滴加反应，回流 1 h ，降温，加金属钠调p h 值至碱性，继续回流3 h ，蒸干溶剂，将产物溶于水后过滤，再 用5 0 m l 乙醚萃取三次水层减压浓缩，用浓盐酸调p h 值至1 0 2 0 ，然后放置过夜析晶， 用乙醇、乙醚洗涤并干燥，粗品的收率为5 9 ( 韩文炎等，1 9 8 6 ) 。申艳红等( 2 0 0 3 ) 以腺苷为原料，三氯氧磷为磷酰化试剂，用磷酸三乙酯作溶剂，低温下生成腺苷的5 位二氯磷酸酯，将此中间体与反应体系分离，溶入适当的溶剂，于搅拌下慢慢加人至i j k o h 的水和乙腈溶液中，强碱环化得至1 1 3 ，5 - 环磷酸腺苷，从乙醇和水中重结晶后纯度可达 1 0 沈阳农业大学硕士学位论文 到9 8 5 ，总收率5 8 。 ( 2 ) 微生物发酵法 日本研究者( k o k a it o k y y ok o h o ，1 9 9 7 ) 采用基因重组的手段获得了菌种 e s c h c r i c h i a c o f ik - 1 1 ，可发酵生产c a m p 。采用摇床在2 8 0 培养1 4 h ，培养基为：葡萄糖 o 5 ，k h 2 p 0 4 0 6 ，k 2 h p 0 4 1 4 ，( n l - h ) 2 s 0 4 0 2 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 2 ，蛋白胨0 4 ， 酵母粉0 0 2 ，培养液中c a m p 的浓度为3 9 m g 1 5 0 m l 。但生物发酵法受菌种限制且难以 分离。 ( 3 ) 从天然产物中提取 伽的多种生理活性引起了人们的关注，因此寻找富含c a m p 的动、植物组织成为 热点。动物的脑、肾等多种细胞中均含有，但含量均很小，所以，人们把目光投向了植 物，测定了多种植物中c a m p 的含量，结果见表1 。结果表明大枣当中c a m p 的含量最高。 裹1 植物中c a m p 的含量 t a b1c o b t c l l to f c a m pi np l a n t 植物名称 学名 含量( p m o 垤如) ! 丝!翌! ! ! ! 墅竺竺! ! ! ! ! ! 坐! p ! 芝! 墨= 塑! 大枣z i z ) ，p h u s j u j u b am i l l 3 8 0 5 0 0 0 酸枣 z s p i n o s u s ( b u n g e ) h u 2 3 8 7 0 0 0 君迁子d i o s p i m s l o t u sl1 0 0 ( 3 0 0 0 北酵葡萄 v i t i sv i n i f e mlx v a m u r e n s i sr u p r5 0 0 0 0 0 水枸子 c o t o n c a s t e rs u b m u l t i f l o u sp o p o v2 3 2 5 0 0 苹果 m a l u sp u m i l am i l l 3 3 6 肿 梨lyms b r e t s c h n c i d e r ir c h d1 5 0 0 李prunus d o m e s t i c al1 1 5 0 0 杏 a r m e n i a c av u l g a r i s 协 7 5 0 0 桃 a m y g d a l ”l k r s i e al 1 5 0 0 西瓜l y c o p o t s i c a m c l l j m i l l 7 5 肿 向日葵愈伤组织h e l i a n t h u s 1 2 7 0 迦蓝 k a l a n c h o e6 0 0 龙舌兰a g a v e 1 0 0 在枣果中c a m p 的检测、提取和分离等方面，国内外研究者做了大量工作：j cc y o n g ( 1 9 8 0 ) 等率先利用离子交换柱从枣中分离t b c a m p ，并对c a m p 分离提取工艺进行了优 化：kh a n a b u s a ( 1 9 8 1 ) 等报道了大枣q ，c a m p 的含量在高等植物中是最高的，是鳄梨 含量1 0 倍以上，达至1 5 0 0 r t m o l g e w 。他曾试验从中国大枣中提取c a m p ：将枣粉于5 c 溶 于水，搅拌1 h ，均化，离心，洗涤沉淀，离心，上清液合并后连续上两次d o w e xk 4 型 甲酸盐柱，0 0 5 m o l l 甲酸洗脱，洗脱液上氧化铝柱后，再上一次d o w e xi x 4 型柱，所得 组分冻干，最后得到纯度为3 4 的c a m p ，t l c 纯化后纯度可达9 7 ；刘孟军( 1 9 9 1 ) 等 对犬枣等1 4 种园艺植物中c a m p 含量进行测定，结果表明山西木枣中含量最高；樊君 ( 2 0 0 3 ) 等长期从事环腺苷酸的研究，实验发现大枣中含量较高的多糖、蛋白质和色素 等杂质对过滤和树脂再生影响较大，曾对kh a n a b u s a 的提取方案进行改进，将陕北佳县 油枣粉碎后，室温浸提三次，离心，上清液真空浓缩，上强碱性阴离子柱，用甲酸洗脱， 洗脱液经浓缩处理后得到姗，但收率较前者有较大下降；河北农业大学的硕士研究 生王向红( 2 0 0 4 ) ，在其学位论文中进行了相关的提取研究，筛选出溶剂1 ( 浓度为7 0 ) 进行提取，选择的依据主要是既达到最高的提取率，同时最大量沉淀枣中所含的果胶。 以提取c a m p 为目标，得出的最优水平组合为：固液比1 ：1 0 ，温度6 0 c ，提取时间4 天；根 据极差r 值的大小，各因素作用主次顺序为时间 固液比 温度。同时他还研究了枣果无 损耗分类提取和综合加工技术，利用溶剂2 萃取提取液，分别得到c a m p 浓缩液和枣腊， 残渣用于制造枣膳食纤维；2 0 0 4 年，静海县科学技术委员会的李明润、于文才、杜恩祥、 高向耘、林木强、刘志忠等人申请了从枣中提取环磷酸腺苷的专利技术( 专利号 c n 2 0 0 4 1 0 0 1 8 6 1 7 2 ) ，其工艺是按照以下程序实现的： 浸泡：枣经洗净、晾干、去核后称重，按5 0 0 9 添加蒸馏水5 l 比例，加蒸馏水浸泡 2 4 4 8 h ； 匀浆：将上述浸泡液用组织捣碎机或组织匀浆机进行捣碎匀浆，每次连续3 m i n ， 静止2 0 r a i n ，反复进行3 次，该步骤及以后各步骤均在4 c 1 温度条件下进行； 离心：将上述匀浆液用高速冷冻离心机在转速为1 2 0 0 0 r r a i n 的条件下离一l , 1 5 m i n ， 取出上清液，取出上清液后的沉淀物再用2 5 l 蒸馏水按匀浆项下条件匀浆和按离心项下 条件离心，上清液与前次合并； 浓缩：将合并后的上清液用薄膜蒸发器或水浴锅蒸发，使其最后体积为1 0 0 0 m l 左右： 第一次柱层析：将上述浓缩后的上清液通过阴离子交换树脂柱进行离子交换柱层 析，开始将少许蒸馏水洗脱下来深棕色液体弃去后，收集用0 0 5 m o l l 甲酸洗脱下来的浅 黄色液体。 调整酸碱度：将上述收集的浅黄色液体用l m o l l n i - h o h 调p h 值至7 o ； 第二次柱层析：上述呈中性洗脱液第二次通过阴离子交换树脂柱层析，洗脱液及 其收集同第一次柱层析； 氧化铝柱层析：将第二次柱层析洗脱液通过氧化铝柱层析，先用少许蒸馏水洗脱 弃去棕色液体后，再用t r i s ( ( h o c h 2 ) 3 c n h