（卫生毒理学专业论文）辐射诱发hl7702细胞基因组不稳定性研究.pdf

苏州大学学位论文使用授权声明 ffll t f l fil l i fl lflllfll l t lr u y 17 3 3 4 0 5 本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定， 即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸 质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献 信息情报中心、中国科学技术信息研究所( 含万方数据电子出版社) 、 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子 文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索。 涉密论文口 本学位论文属 在年一月解密后适用本规定。 非涉密论文口 论文作者签名：蔓塑篁如日 导师签名 年气白 1 一 期：土鲤二! 二翌 辐射诱发h l 7 7 0 2 细胞基因组不稳定性研究中文摘要 中文摘要 目的：在细胞、基因和蛋白水平上检测6 0 c o - - 射线诱发人肝细胞基因组的不 稳定性，并用基因芯片和双向电泳质谱技术探讨其分子机制，筛选与辐射诱发基 因组不稳定性相关的基因和蛋白，为阐明辐射诱发基因组不稳定性的分子机制提 供基础资料。 方法：( 1 ) 采用6 0 c o 吖射线照射人正常肝细胞7 7 0 2 ( h l 7 7 0 2 ) ，照射剂量为o g y ( 对照组) 、2c y 、4c j y 、6g y 、8c , y 、1 0g y 。检测受照后7 7 0 2 细胞克隆存活率、 微核形成率、单细胞凝胶电泳( s c g e ) 、细胞凋亡率。( 2 ) 检测各剂量点受照细胞子 代的上述指标。( 3 ) 对各剂量受照细胞克隆子代同时给予2 g y 的二次照射，然后检 测克隆存活率、微核形成率、单细胞凝胶电泳、细胞凋亡率。( 4 ) 分别提取经2 、4 、 6g y7 射线照射后子代细胞的总r n a ，采用i l l u m i n a 人全基因组基因芯片分析基 因表达情况，并筛选出差异表达基因。( 5 ) 用实时荧光定量p c r ( r t - p c r ) 技术验证 部分差异基因。( 6 ) 用g e n e s p r i n gg x1 0 软件对差异表达基因进行生物信息学分析， 并构建差异表达基因相互作用网络。( 7 ) 提取受照射后子代细胞的总蛋白进行2 - d e 分离，考马斯亮蓝染色，差异表达点进行m a l d i t o f 质谱分析，n c b i n r 数据库 搜索鉴定分析结果。( 8 ) 用w e s t e r nb l o t 方法验证质谱鉴定出的差异表达蛋白热休克 蛋白6 0 ( h s p 6 0 ) 和珠蛋白转录因子i ( g a t a 1 ) 在各剂量克隆子代中的表达。( 9 ) 用 激光共聚焦显微技术观察差异表达蛋白h s p 6 0 、g a t a 一1 和真核翻译起始因子5 a ( e i f 5 a ) 在各剂量克隆子代中的定位及表达。 结果：( 1 ) 首次照射后，h l 7 7 0 2 细胞的克隆存活率、微核形成率、s c g e 尾长、 细胞凋亡率与照射剂量之间存在明显的剂量效应关系。( 2 ) 首次照射后各剂量组存 活的克隆子代细胞经传代培养后，克隆存活率、微核形成率、s c g e 尾长与对照组 无显著差异。( 3 ) 首次照射后各剂量组存活的克隆子代细胞经2 g y 的二次照射后， 上述检测结果与首次照射剂量之间存在剂量效应关系。( 4 ) 基因芯片测定2 g y 照射 后子代细胞差异表达显著的基因有2 6 2 个；4 g y 照射组有2 7 4 6 个差异表达基因； 6 a y 照射组有3 4 0 6 个差异表达基因；三个剂量组的共同差异表达基因有7 1 个， 其中上调基因3 5 个，下调基因3 6 个。这些基因的功能涉及细胞周期、细胞骨架 中文摘要辐射诱发h l 7 7 0 2 细胞基因组不稳定性研究 和运动、细胞凋亡、d n a 结合、细胞信号转导、代谢、d n a 复制和修复等。利用 生物信息学分析软件构建了差异表达基因相互作用网络图并分析了r a n , c d t l 、 i e r 3 、v - f o s 等基因的生物学功能。( 5 ) 受照射7 7 0 2 细胞克隆子代细胞双向电泳图 谱与对照组相比，共发现差异蛋白点4 2 个，其中1 0 个上调蛋白，3 2 个下调蛋白。 经质谱分析，成功鉴定出1 7 个差异表达蛋白，这些差异蛋白包括翻译控制肿瘤蛋 白( t c t p ) 、热休克蛋白2 7 ( h s p 2 7 ) 、热休克蛋白6 0 ( h s p 6 0 ) 、珠蛋白转录因子 1 ( g a t a 1 ) 、巯基特异性抗氧化酶( t s a ) 、氯离子通道蛋白i ( c l i c l ) 、真核翻译起 始因子( e i f l a ，e i f 5 a ) 、真核翻译延长因子i ( e e f l a ) 等。( 6 ) w e s t e r nb l o t 分析结果 表明h s p 6 0 和g a t a 1 表达与受照剂量的关系与2 - d e 结果一致。( 7 ) 激光共聚焦 结果显示h s p 6 0 与e i f 5 a 蛋白在细胞中表达丰富，主要分布于细胞质中细胞核的 周围。荧光定量分析结果与双向电泳分析结果一致： t h eg c n o m i ci n s t a b i l i t yi n d u c e db yi o n i z i n gi r r a d i a t i o ni n h u m a n l i v e r c e 1 l s t h eg e n o m i ci n s t a b i l i t yi n d u c e db yi o n i z i n g i r r a d i a t i o ni nh u m a nl i v e rc e l l s a b s t r a c t o b j e c t i v e ：r a d i a t i o n - i n d u c e dg e n o m i ci n s t a b i l i t y ( r i g i ) i nh u m a nl i v e rc e l l sw a s d e t e c t e da tt h ec e l l u l a r , m o l e c u l a ra n dp r o t e o m i el e v e l e d n ac h i pa n dp r o t e o m i c a n a l y s i s w a sc o n d u c t e du p o np r o g e n yo fi r r a d i a t e dh u m a nl i v e rc e l l st op r o v i d e e x p e r i m e n t a ld a t af o re x p l o r i n gt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fr i g i m e r h o d s ：( 1 ) t h ec l o n i n ge f f i c i e n c y , m i c r o n u c l e u sf r e q u e n c y a n da p o p t o s i s e f f i c i e n c yo fh u m a nl i v e rc e l l s7 7 0 2 ( h l 7 7 0 2 ) i r r a d i a t e db y6 0 c o - 7r a y sw e r ed e t e c t e d , a n dt h em e t h o do fs i n g l ec e l lg e le l e c t r o p h o r e s i s ( s c g e ) w a su s e dt om e a s u r ed n a c h a i n sd a m a g e ( 2 ) t h ep r o g e n yo fh l - 7 7 0 2c e l l sw e r ei r r a d i a t e db y0 ，2 ，4 ，6 ，8 ，a n d 10 g yo f6 0 c ot - i r r a d i a t i o n , a n dt h ee f f e c t s - m e n t i o n e da b o v ew e r ed e t e c t e di nt h e p r o g e n yo ft h ei r r a d i a t e dc e l l s ( 3 ) t h ep r o g e n yw e r es e c o n d l yi r r a d i a t e dw i t h2 c y o f 6 0 c 0 丫- i r r a d i a t i o n , a n dt h ed e l a y e de f f e c t sw e r ed e t e c t e d ( 4 ) c d n ag e n ec h i pw a su s e d t om e a s u r et h et r a n s c r i p t i o n a lp r o f i l ei np r o g e n yo fh l - 7 7 0 2c e l l se x p o s e dt o0 ，2 ，4 ， a n d6 0 y6 0 c o - - i r r a d i a t i o n , a n dt h ed i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e dg e n e sw e r ef u r t h e r i d e n t i f i e db yq u a n t i t a t i v er e a l - t i m ep c r ap a t h w a y - b a s e dn e t w o r kw a sc o n s t r u c t e d u s i n gas o f t w a r e ( g e n e s p r i n gg x l0 ) t oa n a l y z et h ef u n c t i o n a lr e l a t i o n sa m o n gt h e d i f f e r e n t i a lg e n e s ( 5 ) t w o - d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s ( 2 一d e ) w a su s e dt os c r e e nt h e p r o t e i n sd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e di nt h ep r o g e n yo fh u m a nl i v e rc e l l ss u r v i v i n gf r o m i o n i z i n gr a d i a t i o n ，a n dm a s ss p e c t r o m e t r yw a su s e dt oi d e n t i f yt h ep r o t e i n - s p o t s s i g n i f i c a n t l ya l t e r e di ne x p r e s s i o n ( 6 ) t h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o np r o t e i n so fg a t a 1 ， h s p 6 0w e r ev e r i f i e db yw e s t e r nb l o t ( 7 ) l a s e rc o n _ f o c a ls c a n n i n gm i c r o s c o p y ( l g s m ) w a su s e dt od e t e c tt h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o np r o t e i n so fe i f 5 a a n dh s p 6 0t oc o n f i r i l l t h e 2 d er e s u l t r e s u l t s ：( 1 ) t h ec l o n i n ge f f i c i e n c yd e c r e a s e d 谢t ht h ei n c r e a s eo fd o s e sa f t e rt h e i n i t i a li r r a d i a t i o n ，w h i l em i c r o n u c l e u sf r e q u e n c y ，p e r c e n t a g eo fa p o p t o s i sa n dc o m e tr a t e i n c r e a s e d 谢t ht h ei n c r e a s eo fd o s e s ( 2 ) d a m a g eo ft h es u r v i v a lc e l l ss e c o n d l y i i i a b s t r a c t t h eg c n o m i ci n s t a b i l i t yi n d u c e db yi o n i z i n gi r r a d i a t i o n i n h u m a nl i v e r c e l l s i r r a d i a t e dw a sc o r r e l a t e dw i t ht h eo r i g i n a li r r a d i a t i o nd o s e s ( 3 ) at o t a lo f7 1 d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e sw e r es c r e e n e d ，m o s to fw h i c h a s s o c i a t e dw i t h t r a n s d u c t i o n , c e l lc y c l er e g u l a t i o n , c e l l u l a ri m m u n i t y , c y t o s k e l e t o na n dm o v e m e n t ，c e l l r e p l i c a t i o na n dr e p a i rm e c h a n i s m ap a t h w a y - b a s e dn e t w o r kw a sc o n s t r u c t e dt or e v e a l t h eb i o l o g i c a lf u n c t i o n so fr a n , c d t l 、i e r 3 、v - f o s ( 4 ) at o t a lo f4 2d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e dp r o t e i n sf r o mt h ep r o g e n yo f i r r a d i a t e dc e l l sw e r es c r e e n e d ，o fw h i c h17w e r e i d e n t i f i e d b y m a l d i t o f - m s a n a l y s i s ，i n c l u d i n g 4 u p - r u g u l a t e d a n d13 d o w n - r e g u l a t e dp m t e i m t h eu p r e g u l a t e de x p r e s s i o no ft w op r o t e i n s ，m i t o c h o n d r i a l h e a ts h o c k6 0 k dp r o t e i n ( h s p 6 0 ) a n dg l o b i nt r a n s c r i p t i o nf a c t o r1 ( g a t a - 1 ) ，w e r e f u i r t h e rc o n f i r m e db yi m m u n o b l o t t i n g ( 5 ) t h ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dp r o t e i n so f h s p 6 0a n de i f 5 aw e r el o c a l i z e di nt h ec y t o p l a s m ，a n dt h ee x p r e s s i o no fh s p 6 0w a s u p - - r e g u l a t e di nt h ep r o g e n yo fi r r a d i a t e dc e l l si nad o s e - - d e p e n d e n tm a n n e r , w h i c hw a s c o n s i s t e n tw i t ht h er e s u l to f2 d e c o n c l u s i b n s ：( 1 ) r a d i a t i o n - i n d u c e dg e n o m i ci n s t a b i l i t ym a ys u s t a i ni n t h e p r o g e n yo fs t t r v i v i n gc e l l s t h ed e l a y e dd a m a g ea f t e r as e c o n di r r a d i a t i o nw a s c o r r e l a t e dt ot h eo r i g i n a li r r a d i a t i o nd o s e ( 2 ) as e c o n di r r a d i a t i o np l a y sa ni m p o r t a n t r o l ei nt r a n s f o r m i n gt h eg e n o m i ci n s t a b i l i t yt ot h ep r o g e n y , t om a k et h ed a m a g em o r e e a s i l yt ob ed e t e c t e d ( 3 ) i r r a d i a t i o nc a l l i n d u c ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e sa n d p r o t e i n si nt h ep r o g e n y o fi r r a d i a t e dc e l l s ，w h i c hm a yb ea p p l i e da sp o t e n t i a lb i o m a r k e r s o fr a d i a t i o nd a m a g ei nf u t u r es t u d i e s k e yw o r d s ：r a d i a t i o n - i n d u c e dg e n o m i ci n s t a b i l i t y , h u m a nl i v e rc e l l ，e d n ac h i p ， t w od i m e n s i o n a le l e c r o p h o r e s i s w r i t t e n b y ：y a h u iz u o s u p e r v i s e db y ：p r o f j i a nt o n g p r o f z h o n g - w e nw a n g i v 目录 引 言1 第一部分电离辐射诱发人肝细胞基因组| 钚稳定性4 1 材料与方法4 2 结果8 3 讨论2 0 第二部分6 0 c o q , 射线照射后子代细胞的基因差异表达一2 3 1 材料与方法2 3 2 结果“i ooooooooooo oo 0 2 9 3 讨论3 9 第三部分c o y 射线照射后子代细胞的蛋白质组学改变4 6 1 材料与方法一4 6 2 结果 5 4 3 讨论”6 8 结论7 3 参考文献7 4 综述8 6 攻读学位期间公开发表的论文”9 9 中英文缩略语对照表1 0 0 致谢1 0 1 辐射诱发h l 7 7 0 2 细胞基因组不稳定性研究引言 引言 d n a 作为辐射作用的靶分子一直是电离辐射的生物学基础，是引起细胞一系 列生理、生化和病理学改变的关键。染色体畸变、基因突变及细胞死亡等辐射效 应被认为是辐射诱发d n a 损伤的结果。近年来在非受照细胞中出现的d n a 损伤 效应对这一概念提出了挑战。在直接受照射细胞的子代及培养基转换后受照细胞 的子代中都观察到了损伤效应，即非靶效应【l 】，基因组不稳定性是其中的一种表现 形式。辐射诱发的基因组不稳定性是指细胞在受到照射后，在某一延迟时间内发 生在受照射的存活细胞子代中的遗传效应，它是一个描述基因组变化速率增加( 在 细胞周期的许多代中) 的含义广泛的术语，其特点是许多延迟应答反应，包括延迟 的染色体畸变、基因突变频率的升高、延迟的增殖性死亡和延迟凋亡等 2 1 。 研究证实体内产生的基因组不稳定性与辐射致癌之间有着密切的关系。一般 情况下，正常细胞内存在一系列保持细胞过程平衡的分子机制，这些分子机制能 使大部分受辐射损伤的d n a 得以修复。但是在受损的存活细胞中，当原发性分子 损伤发生在编码修复酶及与细胞增殖和细胞周期调控相关蛋白的基因时，受损 d n a 得不到修复而被错误的复制，修复基因、周期素、周期素依赖性激酶及其抑 制基因发生突变或异常表达，导致基因组不稳定性形成；原癌基因及肿瘤抑制基 因发生突变，致使癌症发生 3 , 4 1 。因此基因组不稳定性可能作为多级致癌阶段中的 早期事件，使整个基因组处于突变的边缘，随着细胞的复制积累足够多的突变， 特别是某些二次事件的推动作用，促进癌症的发生、发展。 自从w e i s s e nb o m 和s t r e f f e r1 9 8 8 年首次提出小鼠胚胎中的染色体不稳定性 后，有关辐射诱发基因组不稳定性的体外研究不断广泛和深入，发现不同品质的 射线( 如x 射线、( i t 粒子、高l e t 铁离子) 都会增加受照射子代细胞中的染色体畸 1 变频率【5 川。目前，研究人员已经在多种细胞中证实了辐射诱发的基因组不稳定性， 主要有小鼠造血干细胞系5 1 、人二倍体纤维原细胞【胡、仓鼠杂交细胞系【9 】以及哺乳 动物上皮细胞【1 0 】等。基因组不稳定性的特征是基因组中突变频率的增加，表现为 各种类型的异常改变，如单核苷酸突变、基因组拷贝数增加或减少、基因扩增、 重排和缺失。可供检测的生物学终点有染色体畸变、微核形成、基因突变和扩增、 引言 辐射诱发h l 7 7 0 2 细胞基因组不稳定性研究 克隆形成率的减少、小卫星和微卫星【l l 】。除此之外，体内辐射诱发基因组不稳定 性也有报道。w e i s s e nb o r n 和s t r e f f e r 最先描述了体内照射小鼠胚胎后产生的基因 组不稳定性【1 2 】。另外，切尔诺贝利事故人群资料表明，该污染地区儿童的小卫星 突变率是英国对照家庭儿童的两倍，其它地区也有相似的情况【l3 1 。这些资料表明 小卫星的不稳定性不是电离辐射诱发d n a 损伤的直接结果，而是由于辐射诱发了 基因组不稳定性，使一些基因处于易突变的临界状态，表现为小卫星位点或其他 基因位点的突变频率升高。 虽然大量的实验数据证明了辐射诱发基因组不稳定性的存在，但潜在的生物 学机制目前尚不十分清楚。有研究表明辐射诱发的基因组不稳定性很可能涉及 d n a 损伤细胞应答的缺陷，基因表达的持续改变或者细胞内环境平衡的紊乱。参 与d n a 复制、修复、端粒稳定和染色体分离的基因发生的初级变化可能会启动基 因组不稳定性；d n a 双链断裂是启动基因组不稳定性的一种分子信号；信号转导 途径的激活和基因表达的改变可能是导致基因组不稳定性的一个间接途径。基因 组不稳定性一旦被启动，就会通过一系列内源性细胞过程在子代细胞中得以保持 【1 1 1 。另外，遗传外因素也会影响基因组不稳定性的发生。有研究证实活性氧的持 续增加可能是基因组不稳定性的一个诱因【1 4 】。 在仅有的几篇研究与辐射诱发基因组不稳定性相关的基因报道中，应用含有 1 1 5 2 条人肿瘤相关基因的芯片检测丫射线照射后染色体不稳定的人仓鼠杂交细胞 g m l 0 1 1 5 。结果表明6 8 个基因为差异表达基因，这些基因与d n a 修复、细胞周 期调控、信号转导等相关【l5 1 。由于这些研究所用的芯片只包含人基因组中的部分 基因或肿瘤相关基因，利用人全基因组基因芯片研究辐射诱发基因组不稳定性鲜 有报道。因此，为了更全面揭示辐射诱发基因组不稳定性的起始和维持机制，需 要高通量技术手段，分离出更多的相关基因，并对其功能进行系统的研究。 国际放射防护委员会( i c r p ) 及联合国原子辐射效应科学委员会( u n s c e a r ) 等 国际组织近年来也开始关注基因组不稳定性的研究进展。i c r p 在2 0 0 7 年的建议 书中指出：对于所诱发的各种形式的基因组不稳定性，其生物学基础还不十分清 楚。有一些生物化学数据表明，这涉及到细胞应激反应与氧化过程；另有细胞遗 传学研究提示，可编码d n a 重复序列的d n a 片断具有潜在不稳定性【1 6 j 。因此， 对于辐射诱发基因组不稳定性的研究尤其是起始和维持机制的研究仍十分必要。 2 辐射诱发h l 7 7 0 2 细胞基因组不稳定性研究 引 言 基因组不稳定性只是使基因组处于一种损伤易感态，它以潜在损伤的形式存 在于子代细胞中，可以放大与累积损伤，而本身并不以某种特定的损伤形式出现。 因此利用一些常规的放射生物学终点检测方法( 如克隆存活率、单细胞凝胶电泳 s c g e 以及微核发生率等) 直接检测基因组不稳定性还存在一定的困难，必须借助 其它方法放大基因组不稳定性的效应以便于对其进行检测。 肝脏的辐射敏感性仅低于骨髓、小肠及淋巴细胞等增殖性较高的组织，属于 中度放射敏感器官，是人体最为重要的脏器之一，承担着极其重要的生理生化功 能，其本身的基因调控网络也极为复杂【l7 1 。电离辐射可引起肝功能以及肝脏酶学 的改变，但肝脏损伤的分子机制尚未明确： 由于辐射诱发基因组不稳定性是辐射致癌过程中的重要生物学事件，因此进 行基因组不稳定性的效应标志物研究，有助于理解辐射致癌的生物学过程，提高 辐射危险度评价的客观性和准确度。以往用于研究基因组不稳定性的指标主要有 染色体畸变、姐妹染色单体交换( s i s t e r c h r o m t i d e x e h a n g e ，s c e ) 、微核( m 等【1 8 - 2 0 1 ， 但随着人类基因组和蛋白质组学的发展，这些指标已明显不足。因此，进一步寻 找新的分子水平上的生物标志物具有重要意义。 基因芯片技术是一种新型的基因功能分析技术，具有高通量、微型化和自动 化的特点。被广泛应用于各种组织的表达谱分析，能够大规模筛选对某种特定条 件反应的相关基因，可在同一次实验中完成多达上万个基因的检测，甚至实现全 基因定位筛查。双向电泳技术是当前分离复杂蛋白混合物的有效方法之一，用于 多种器官、组织和细胞的高通量蛋白质的分离、分析和鉴定。分析蛋白表达的差 异变化，已成为蛋白质组学研究的一个重要手段。目前，质谱与双向电泳的有机 结合广泛应用于蛋白质组研究。利用基因芯片技术和差异蛋白质组学技术研究辐 射对细胞的影响，并且寻找多个或一组差异表达基因和蛋白作为辐射损伤的分子 标志物，具有十分重要的现实意义。 本课题采用细胞生物学技术、分子生物学技术分别在细胞、基因、蛋白水平 上对6 0 c o - t 射线诱发人肝细胞基因组不稳定性进行检测，并利用基因芯片和双向 电泳质谱技术从基因和蛋白水平探讨其分子机制，从中筛选出与辐射诱发基因组 不稳定性相关的基因和蛋白，为深入阐明辐射诱发基因组不稳定性、辐射致癌的 分子机理以及辐射对肝脏的损伤机制提供科学依据。 第一部分 辐射诱发h l 7 7 0 2 细胞基因组不稳定性研究 第一部分弟一鄙万 电离辐射诱发人肝细胞基因组的不稳定性 大量研究已证实基因组不稳定性是d n a 受到损伤因素作用后的重要生物学效 应。它不仅增加受损细胞的敏感性，而且可传递到细胞的子代，在细胞后代出现 延迟的遗传效应。其表现形式多样，如突变、染色体畸变、细胞凋亡、细胞增殖 性死亡以及基因扩增等【2 1 2 2 】。可供检测的生物学终点包括：微卫星序列突变、端 粒长度的变化、染色体畸变的诱导、增殖性细胞死亡、致突变作用等【2 2 】。基因 组不稳定性与辐射致癌之间有着密切的关系，作为多级致癌阶段中的早期事件， 基因组不稳定使整个基因组的突变频率大大增加，随着细胞的复制和突变的积累， 并在某些二次事件的推动作用下便可导致细胞癌变【2 4 j 。 虽然很多生物学终点可用于检测基因组不稳定性，但由于其主要是以自发突 变的形式表现出来，不仅所需观察时间长，而且发生率低，难以在常规的实验条 件下观察到。为了克服这一技术困难，本部分根据多级致癌理论中二次事件的推 动作用，采用二次照射的方法，以单细胞凝胶电泳( s i n g l ec e l lm i c r o g e l e l e c t r o p h o r e s i s ，s c g e ) 、克隆存活率、微核发生率和细胞凋亡率等为指标，对6 0 c o 吖 射线照射人正常肝细胞后诱发的基因组不稳定性进行检测。 1 材料与方法 1 1 细胞株 人正常肝细胞7 7 0 2 ( h l 7 7 0 2 ) ，购于中科院上海细胞库。 1 2 主要试剂与仪器 1 2 1 主要仪器 超净工作台：吴江市净化设备总厂，y j 8 7 5 s b p h 计：d e n v e ri n s t r u m e n tc o m p a n y , c 0 2 细胞培养箱：h e r a e u s 公司，美国 4 辐射诱发h l 7 7 0 2 细胞基因组不稳定性研究第一部分 8 06 c 超低温冰箱：f o r m as c i e n t i f i c 公司，美国 细胞培养板：c o n i n g 公司，美国 倒置显微镜：o l y m p u s 公司，日本 荧光显微镜：n i k o n 公司，日本 光学显微镜：o l y m p u s 公司，日本 6 0 c o 丫射线治疗仪：中国辐射防护研究院附属医院 。 电子天平：b p 2 1 0 ss a r t o r i u s 公司，德国 电泳仪：s a v a n t 公司，美国 台式高速离心机：s a n y o 公司，日本 冷冻高速离心机：s i g m a 公司，美国 流式细胞仪：b e c k m a n 公司，美国 1 1 2 主要试剂 r p m i 1 6 4 0 培养基：g i b c o 公司，美国 小牛血清：杭卅四季青生物制剂公司 胰蛋白酶：华美生物工程公司 青霉素，链霉素t 华北制药集团 琼脂糖：华美生物工程公司 t r i t o nx 1 0 0 ：华美生物工程公司 t r i s ：华美生物工程公司 细胞松弛素b ：s i g m a 公司，美国 二甲基亚砜( d m s o ) ：s i g m a 公司，美国 正常熔点琼脂糖、低熔点琼脂糖：s i g m a 公司，美国 s d s - s i g m a 公司，美国 、 a n n e x i nv - f i t c 细胞凋亡检测试剂盒：南京凯基生物科技发展有限公司 1 3 实验方法 1 3 1 细胞培养 7 7 0 2 细胞在含2 0 d 、牛血清、1 0 0u m l 青霉素和1 0 0l x g m l 链霉素的 r p m l l 6 4 0 培养基中，于3 7 、5 c 0 2 条件下恒温培养至对数生长期。 第一部分 辐射诱发i l l - 7 7 0 2 细胞基因组不稳定性研究 1 3 2 细胞照射 1 3 2 1 一次照射 取对数生长期的肝细胞7 7 0 2 消化后，将其按l x l 0 5 个“浓度接种于培养瓶 中。在冰浴条件下进行丫射线照射，吸收剂量率为o 3 3c y m i n ，照射视野为 2 0 x 2 0 e m 2 ，源距为8 0 c m ，照射剂量为06 y 、2g y 、4 g y 、6 g y 、8g y 、1 0g y ( 未 经照射为对照组) 。 1 3 2 2 二次照射 对经过单克隆化处理的( 详情见1 3 4 ) 各剂量点受照细胞子代分别进行传代培 养，待其均传至1 5 代时，各剂量点受照细胞子代统一给予2 g y 剂量的6 0 c o q 射线 照射。 1 3 3 克隆形成率测定 取不同剂量点照射后的细胞，经0 4 5 胰酶消化后，用含有2 0 d x 牛血清的 r p m l l 6 4 0 培养基对受照细胞做梯度稀释，取所需数量的细胞植入培养皿中，平行 三份，放入恒温培养箱中培养1 5 2 0 天。弃培养液，加入1 0 1 甲醛固定5 分钟。晾 干后，再用5 龙胆紫染色1 0 m i n 。冲洗后晾干，4 显微镜下计数以大于5 0 个细 胞的细胞集落为一个克隆，用菌落计数器进行计数。 1 3 4 受照细胞的单克隆化 对用于测定克隆存活率平皿中的细胞进行单克隆化处理。消化细胞单克隆， 3 m i n 后，吸管吹吸数次，移至相应孔板中，每个剂量点挑选6 个克隆以上，加含 有血清的培养液至2 0 0 1 d ，培养箱中培养。3 - 4 天后细胞基本铺满孔底，消化并转 移至培养瓶中扩大培养，得到克隆化的子代细胞。 1 3 5 单细胞凝胶电泳( s c g e ) 测定 1 ：3 5 1 凝胶板的制备 。 磨砂的载玻片上滴a n - 层琼脂糖凝胶，从下至上一次为1 0 0 1 d0 5 o , 4 正常熔点琼 脂糖( p b s 配制) ，8 5 t ! 含有1 0 0 0 个左右受检细胞的o 5 低熔点琼脂糖，7 5 m o 5 低熔点琼脂糖。具体方法如下：将预热4 5 。c 的第一层凝胶滴在磨砂载玻片上，盖 上盖玻片，于4 。c 放置1 0 m i n ，使胶凝固。随后将含有受检细胞的第二层凝胶滴在 第一层胶上，盖上盖玻片于4 c 放置1 0 m i n 。最后移去盖玻片，滴加第三层凝胶， 盖上盖玻片，于4 c 凝固。 6 一。一_ 第一部分辐射诱发h l - 7 7 0 2 细胞基因组不稳定性研究 1 3 5 2 细胞裂解 将载玻片浸入新鲜配制并预冷的4 c 细胞裂解液( 2 5 mn a c l ，1 0 0 r a m n a 2 e d t a ，1 0 m mt r i s h c lp i l l 0 ，1 肌氨酸钠，用前加入1 t r i t o nx 一1 0 0 ，1 0 d m s o ) 裂解2 h 。 1 - 3 5 3d n a 碱解旋 载玻片并列置于水平电泳槽中，加入新鲜配制的碱性苜泳缓冲液0 m m n a 2 e d ，i a ，3 0 r a mn a o h ) ，电泳液超过胶面约0 2 5 c m ，放置4 0 m i n ，使d n a 单链 断裂和碱不稳定性损伤充分显示出来。 1 3 5 4 电泳 在电压为2 5 v ，电流3 0 0 m a 的条件下，电泳4 0r a i n 。 1 3 5 5 中和与染色 电泳结束后，将载玻片浸入o 4m mt r i s h c l ( p h7 5 ) 缓冲液中1 5 m i n ，以中和 凝胶上的碱液。加无水乙醇固定l h 后晾干。按每载玻片加入5 0 山1 3 1 t g m l 溴化 乙锭染色2 0 r a i n 。 1 3 5 6 观察与分析 载玻片在尼康荧光显微镜下观察，e b 染色的d n a 经紫外光激发呈橙黄色。 将观察到的核内d n a 和迁移出核的d n a ( 且p 彗星尾) 进行数码相机拍照，照片转入 计算机进行图像分析。彗星尾长测量值由标准镜台尺校准后，尾长测量由改进的 s c i n i m a g e 单细胞凝胶电泳宏处理软件自动进行。每个剂量点测5 0 个细胞的尾长。 1 3 6微核发生率测定 1 3 6 1 微核制片 收获1 8 h 前加入松胞素c y a - a ( 终浓度为4 m g l ) e g 断细胞中期分裂相。取阻断 分裂的各剂量点的细胞，倒掉培养基后，用p b s 漂洗两次。经消化后于1 0 0 0 r p m 离心6 r a i n 。弃上清，加入4m l0 0 7 5m o l l 的k c l 低渗溶液吹打均匀后搁置3 m i n 。 立即加入新配制的固定液( 冰醋酸：甲醇= l ：3 ) ，1 - 2 m l ，吹打后离心。弃上清后加 入4 m l 固定液固定2 0m i n 。离心后，再加入2 m l 固定液洗一次，作用1 0 m i n 后离 心。加入少量固定液，吹打均匀，制成细胞悬液滴片。待片子干燥后，用 n a 2 h p 0 4 ：k h 2 p 0 4 = 2 ：1 配制的g i e m s a 染液染色2 0m i n 。冲洗后晾干，镜下观察。 1 3 6 2 观察计数 7 第一部分辐射诱发h l - 7 7 0 2 细胞基因组不稳定性研究 计数1 0 0 0 个双核细胞的微核数，每个点三个平行样。微核判断标准及表示方 法：微核系游离于胞浆中的呈圆形或椭圆形小核，与主核完全分离，嗜色性与主 核一致，为主核的1 3 以下，边缘光滑。微核率( m i c r o n u c l e u sf r e q u e n c y ，m n f ) 为 1 0 0 0 个双核细胞所含的微核数，以千分率( ) 来表示。 1 3 7 流式细胞术检测细胞凋亡 培养至对数生长期的7 7 0 2 细胞一次照射后取部分细胞培养至2 4 h 和4 8 h 进行 细胞凋亡检测。各剂量点剩余细胞经0 2 5 胰酶消化后，用r p m l 6 4 0 培养基对 其进行梯度稀释，将一定数量的细胞植入培养皿中，放入恒温培养箱中培养2 0 天， 待其长出细胞克隆后，进行凋亡检测。传代培养至1 5 代时，统一给予2g y 的二 次照射，对照射后2 4 h 和4 8 h 的7 7 0 2 细胞进行细胞凋亡检测。 采用a n n e x i n v - p i 复染法进行细胞凋亡检测。每个样品收集2 x 1 0 5 个细胞， 用p b s 洗涤细胞二次，用5 0 0 肛1 的b i n d i n gb u f f e r 悬浮细胞，加入5 ma n n e x i n v - f i t c ，混匀后加入5 山p i ( p r o p i d i u mi o d i d e ) ，混匀，室温避光反应1 5m i n 后1 h 内利用流式细胞仪进行细胞凋亡检测，激发波长e x = 4 8 8a m ，发射波长e r a = 5 3 0a m 。 1 4 统计学处理 采用o r i g i n7 5 软件进行数据统计分析与作图。本文数据表示为平均值4 - 标准 差( x 4 - s ) ，以t 检验进行显著性分析。 2 结果 2 16 0 c o 吖照射对7 7 0 2 细胞的直接损伤效应 2 1 1 首次照射后的细胞克隆形成率 人肝细胞7 7 0 2 受照后立即进行克隆培养，1 5 2 0 天后收获细胞得到各剂量组 细胞克隆形成率的存活曲线如图1 1 所示。从图中可以看出，随着照射剂量的增加， 细胞存活率明显下降，说明辐射对细胞产生了直接的损伤。 8 第一部分辐射诱发h l 7 7 0 2 细胞基因组不稳定性研究 图1 16 0 c o - o , 射线照射后7 7 0 2 细胞的克隆存活率 f i g1 1t h e