（分析化学专业论文）基于信号放大技术的电化学生物传感器研究.pdf

硕士学位论文 摘要 利用化学与生物传感技术进行环境监测、食品分析和疾病的早期诊断，是目 前分析化学中既新颖又极具吸引力的热门研究课题之一。电化学生物传感器由于 其灵敏度高、设备简单、成本低和检测速度快等优点而吸引了研究者越来越多的 关注。本论文结合信号放大技术，发展了一些新的电化学生物传感技术用于金属 离子、核酸和蛋白质的检测。具体包括： 在第2 章中，基于h 9 2 + 可以和两个胸腺嘧啶特异性结合以及生物条形码信号 放大技术，构建了一种生物传感器，实现了对汞离子的高灵敏检测。当h 矿+ 存在 时，连接序列3 半片段与电极表面的捕获探针通过t - h g ( i i ) t 作用相互杂交，然 后引入纳米金功能化报告d n a 与连接序列的5 半片段杂交，使得信号增强。结果 表明，该方法灵敏度高、选择性好，对h 9 2 + 的检测下限为0 5n m 。 在第3 章中，建立了一种基于核酸外切酶i 和生物条形码双重放大的电化学 核酸检测技术，用于h i v - id n a 的检测。当目标d n a 与固定在电极表面的捕获 探针杂交时，其3 末端有9 个碱基突出，而捕获探针3 末端为凹陷末端，核酸外 切酶切割捕获探针，释放出目标d n a 。释放出的目标d n a 继续与捕获探针杂 交，捕获探针再被酶切，多次循环，使得捕获探针不断减少。进而引起之后杂交 的条形码探针减少，吸附的六氨合钌分子数目较少，电化学信号降低。该方法的 动力学检测范围为1 0 0p m 到1 0 0n m 。 在第4 章中，发展了一种基于邻近表面杂交分析方法检测蛋白质的新型电化 学免疫传感器，为建立蛋白分子检测的通用技术平台提供技术依据。该方法以前 列腺特异性抗原( p s a ) 为检测模型，将两条核酸探针分别修饰一对识别p s a 不 同抗原决定簇的单克隆抗体，其中一条探针与电极表面的捕获探针5 半片段互补 且熔链温度较低，该探针3 端修饰二茂铁；另一条与捕获探针3 半片段互补且熔 链温度较低；而且，第二探针尾端序列下游与与第一探针尾端上游有较短的互补 序列，这一短互补序列熔链温度也较低。抗体对与抗原同时结合后，两条核酸探 针由于邻近而相互杂交，杂交体两尾端序列与捕获探针杂交，并使末端标记的二 茂铁分子与电极充分接近，产生了显著的氧化还原电流。结果表明，该方法的动 态检测范围为2 5p g m l 到2n g m l ，检测下限为1 3p g m l ，且该免疫传感器可再 生使用。 关键词：电化学d n a 传感器；电化学免疫传感器；生物条形码；核酸外切酶i i i ； 邻近表面杂交分析：t - h g ( i i ) t 配位；h i v - 1d n a ：蛋白质 i l 基于信号放人技术的电化学生物传感器研究 a b s t r a c t u s eo fc h e m o b i os e n s o rf o re n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g ，f o o da n a l y s i sa n de a r l y d i a g n o s i s ，h a sb e e nan o v e l ，a t t r a c t i v ea n dh o tt o p i ci nt h ec u r r e n ta n a l y t i c a lc h e m i s t r y e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sh a v er e c e i v e di n c r e a s i n ga t t e n t i o nd u et ot h e i rr e m a r k a b l e f e a t u r e ss u c ha sh i g hs e n s i t i v i t y , s i m p l ei n s t r u m e n t a t i o n ，l o wp r o d u c t i o nc o s ta n d p r o m i s i n gr e s p o n s es p e e d i nt h i st h e s i s ，b a s e do nt h es i g n a la m p l i f i c a t i o nt e c h n o l o g y ， as e r i e so fn o v e le l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sw e r ed e v e l o p e df o rt h ed e t e c t i o no fm e t a l i o n s ，d n aa n dp r o t e i n i nc h a p t e r2 ，b a s e do nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h et - h g ( i i ) - ti n t e r a c t i o na n dt h e a m p l i f i c a t i o no fb i o b a rc o d e s ，an o v e le l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rf o rt h e s e n s i t i v e d e t e c t i o no fm e r c u r yi o n sh a sb e e nd e s i g n e d i nt h ep r e s e n c eo fh g 计，3 - e n do ft h e l i n k e rs e q u e n c eh y b r i d i z e dw i t ht h ee l e c t r o d es u r f a c e - t e t h e r e dc a p t u r ep r o b ev i at h e t - h g ( i i ) ti n t e r a c t i o n ，a n dt h eg o l dn a n o p a r t i c l e sf u n c t i o n a l i z e dr e p o r t e rd n a s u b s e q u e n t l yh y b r i d i z e dw i t ht h el i n k e r , w h i c ha m p l i f i e dt h es i g n a l t h er e s u l t ss h o w t h a tt h ef a b r i c a t e ds e n s o re x h i b i t sh i g hs e n s i t i v i t y , g o o ds e l e c t i v i t y , a n dw i t ha d e t e c t i o nl i m i to fo 5n m i nc h a p t e r3 ，an o v e le l e c t r o c h e m i c a ld n as e n s o rf o rd e t e c t i o no fh i v - 1d n a b a s e do nt h ed u a l - a m p l i f i c a t i o no fe x o n u c l e a s ei i ia n dt h eb i o b a rc o d e sw a sd e s c r i b e d w h e n t a r g e ts s d n ah y b r i d i z e dw i t ht h ee l e c t r o d es u r f a c e - t e t h e r e dc a p t u r ep r o b e ，w i t h a3 - o v e r h a n go fn i n en u c l e o t i d e s ，e x o n u c l e a s ei i id i g e s t e dt h ec a p t u r ep r o b e s ，a n d r e l e a s e dt h ei n t a c tt a r g e ts s d n a t h er e l e a s e dt a r g e ts s d n ac o u l dh y b r i d i z ew i t h a n o t h e rc a p t u r ep r o b e ，w h i c hc r e a t e dar e p e a t e dh y d r o l y s i sp r o c e s s ，t h u st h ea m o u n to f c a p t u r ep r o b ew o u l db er e d u c e d a sar e s u l t ，l e s sb i o b a rc o d e sw o u l dh y b r i d i z e ，a n d t h ea m o u n to f 【r u ( n h 3 ) 6 ”a d s o r b e db yt h er e m a i n e dd n ao nt h ee l e c t r o d es u r f a c e d e c r e a s e d ，l e a d i n gt ot h ed e c r e m e n to ft h ec u r r e n ts i g n a l t h ed e t e c t a b l ed y n a m i c r a n g ew a sf r o m1 0 0p mt o1 0 0n m i n c h a p t e r4 ，an o v e l e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o rb a s e do np r o x i m i t y d e p e n d e n ts u r f a c eh y b r i d i z a t i o na s s a yw a sd e s c r i b e d ，w h i c hm i g h tc r e a tau n i v e r s a l m e t h o d o l o g yf o rd e v e l o p i n gh i g h - p e r f o r m a n c eb i o s e n s o r s i ns e n s i t i v ed e t e c t i o no f p r o t e i n s t a k e np s aa s am o d l ea n a l y s t e ，ap a i ro fm o n o - a n t i b o d i e sr e c o g n i z e d d i f f e r e n ta n t i g e n i cd e t e r m i n a n t so fp s aw e r eu s e dt oc o v a l e n t l yc r o s s l i n kt w o o l i g o n u c l e o t i d e s o n ep r o b eh a sae l e c t r o a c t i v ef e r r o c e n e l a b e l e dt a i ls e q u e n c ea tt h e i i l 3 - e n dt h a ti sc o m p l e m e n t a r yt ot h es u r f a c e t e t h e r e dc a p t u r e p r o b ea ty - e n dw i t ha p r e d e s i g n e dl o wm e l t i n gt e m p e r a t u r e s i m i l a r y , t h eo t h e rp r o b eh a sat a i ls e q u e n c ea t t h e3 - e n dt h a ti sc o m p l e m e n t a r yt ot h ec a p t u r ep r o b ea t3 - e n dw i t h ap r e d e s i g n e d1 0 w m e l t i n gt e m p e r a t u r e f u r t h e r m o r e ，t h ef i r s tp r o b ea tt h eb a c k w a r dt a i ls e q u e n c ea n dt h e s e e o n d ep r o b ea tt h ef o r e w a r dt a i ls e q u e n c eh a v eas h o r tc o m p l e m e n t a r y r e g i o nw i t ha l o w m e l t i n gt e m p e r a t u r e a n t i b o d i e s s i m u l t a n e o u s l y b i n dt ot h e a n t i g e n e t w o o l i g o n u c l e o t i d e st a i ls e q u e n c e sa r eb r o u g h ti n t oc l o s ep r o x i m i t yw i t ht h e i rl o c a l c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e ds u b s t a n t i a l l yt oh y b r i d i z ee a c ho t h e ra n da l l o wt h ep a i ro ft a i l s e q u e n c e st oh y b r i d i z et o g e t h e rw i t ht h es u r f a c e t e t h e r e dd n as t r a n d s t h e nt h e f e r r o c e n el a b e l so ft h et a i ls e q u e n c ea r ed r a w nc l os et ot h e e l e c t r o d es u r f a c ea n d p r o d u c ead e t e c t a b l er e d o xc u r r e n t t h ep s aw a sd e t e r m i n e di nt h er a n g eo f2 5p g m l t o2 n g m lw i t had e t e c t i o nl i m i to f13p g m la n dt h ei m m u n o s e n s o rc o u l db e r e u s a b l e k e yw o r d s ：e l e c t r o c h e m i c a ld n as e n s o r ；e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r ；b i o b a rc o d e s ； e x o n n c l e a s e 1 1 1 ；p r o x i m i t y - d e p e n d e n t s u r f a c e h y b r i d i z a t i o n a s s a y ； t h y m i n e h g ( 1 i ) t h y m i n e ；h i v - 1d n a ；p r o t e i n i v 硕十学位论文 第1 章绪论 生物传感技术是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相 渗透成长起来的高新技术。近2 0 多年来，生物传感器以其出色的灵敏度以及高度 的选择性引起了广泛的关注。利用化学与生物传感技术对癌症等重大疾病及早、 准确、快速的诊断，更是当前医学研究上的热点与重点课题之一l l 巧j 。利用生物传 感技术对癌症标志物或者癌细胞的快速检测，是癌症预警和早期诊断的重要方法。 而对于基因疾病，实现对发生在基因编码区的单碱基突变的检测，就可以及早的 对相关基因疾病进行医学诊断。此外，生物传感技术在环境监测中的作用也越来 越重要。尽管目前科研工作者已研究开发了一系列的检测方法，但这些方法大多 存在操作繁琐、费时、仪器昂贵、对操作人员要求高等诸多问题。因此，随着新 理论新技术的发展，发展低成本、操作简便、无辐射、高通量及高准确性的癌症 等重大疾病的检测方法显得尤为重要【6 】。近年来，电化学生物传感器的研究工作取 得了巨大的进步，其检测对象从单糖、氨基酸、酶等发展到更为复杂的多糖、蛋 白质、核酸等多种生物大分子们。在功能方面从检测单一目标发展到多通道多功 能生物传感器【1 1 1 和集成生物传感器【1 2 】。此外，随着纳米技术的不断发展，将功能 化纳米材料应用于疾病的早期检测，基因与药物的靶向输送、生物分离、生物医 学成像等众多方面取得了骄人的成果( 1 3 一卯。这些将为解决上述问题提供了新的方 法。 1 1 电化学生物传感器 生物传感器是以将具有生物活性功能单元作为生物敏感元件，识别目标分子， 通过换能器，将生物化学反应能转换成电信号的一种分析测试装置。所以，生物 传感器一般有两个主要组成部分：其一是生物分子识别元件( 感受器) ，具有分 子识别能力，如酶、抗体、组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、核酸、有机物分 子等；其二是信号转换器( 换能器) ，主要有电化学、光学检测元件、热敏电阻、 场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振器件等，它们可以将生物识别事 件转换为可检测的信号【1 6 , 1 7 】。因此，生物传感器可以按照生物敏感元件和信号转 换器进行分类。根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感物质分为酶传感器、 微生物传感器、组织传感器、d n a 传感器、免疫传感器等；而根据生物传感器的 信号转化器可分为电化学生物传感器、半导体生物传感器、热学生物传感器、光 学生物传感器、声学生物传感器等。其中电化学生物传感器的性能和种类近年来 都得到了很大的发展引。 基于信号放大技术的电化学生物传感器研究 1 1 1 电化学生物传感器的原理 隧溺 雾+ 鬻 黪竭 嘲劁嗡鍪嚼溺磷 1 1 2 电化学生物传感器的分类 电吸附结合法、表面富集法等【2 0 1 。 1 1 3 生物分子在电极表面的固定 将生物分子固定到电极表面的目的。j i n 【2 1 1 等在金电极表面自组装巯基丙酸单层膜 用竞争法检测黄曲霉毒素b l 。时伟杰1 2 2 】等用电化学氧化法使玻碳电极表面氧化生 硕f ：学位论文 离子键以及静电作用力等将生物分子与载体结合，从而将生物分子固定在传感界 面。可以通过物理吸附【2 3 】、静电吸附【2 4 1 、化学吸附【2 5 1 、电化学富集【2 6 】以及l b 膜 技术【2 7 】来实现。它具有耗时少，固定生物材料所构成的生物膜具有保持生物分子 活性好、性能稳定和制作简单等优点。z h o u 2 4 】等在裸金电极表面自组装n a t i o n 膜， 浸入硫堇溶液中，通过静电吸附将硫堇吸附到n a t i o n 膜上面，然后再将纳米金通 过化学吸附组装到硫堇膜上面，最后将甲胎蛋白抗体通过化学吸附组装到纳米金 上，实现对胎蛋白的测定。但这种作用力较弱，容易使生物分子从电极表面脱落。 ( 3 )自组装膜法：自组装膜是分子通过化学键相互作用自发吸附在固液或 气固界面形成的热力学稳定和能量最低的有序膜。它具有较好的稳定性和化学结 构、氧化还原活性，并且简单易得，取向有序，性质多样化，还可以预期膜的结 构。在电化学生物传感器中，一般以金电极为基体电极，利用巯基在干净的金电 极表面的化学吸附固定分子，自发形成一层有序膜。在进行传感器设计时，一般 将巯基探针和其他短链巯基分子( 如巯基乙醇、l ，6 巯基己醇、巯基十一酸等) 混合自组装，这样得到的表面高度有序，稳定性好，表面密度可控，利于探针与 目标分子的结合。l a o 2 8 】等将5 修饰巯基的d n a 探针自组装在电极表面，利用 r u ( n h 3 ) 6 】”作为电化学指示剂，对电极表面d n a 组装及杂交情况进行研究。 ( 4 ) 生物素亲和素反应法：是利用亲和素与生物素之间的亲和作用来固定 探针的一种方法。生物素一端的羧基可以与抗体、酶、d n a 等通过共价键相连。 亲和素由四个相同的含1 2 8 个氨基酸的亚基组成，它的每一个亚基含有一个可与生 物素结合的位点，能与生物素及其衍生物形成高度稳定的化合物，亲和常数是抗 原抗体反应的1 0 1 0 6 倍。与生物大分子如抗体、核酸等标记后的生物素，接着通过 固定化的亲和素将生物大分子固定在基底表面。通常这种方法简便，条件温和， 高效，特异性好，且不会干扰固定后的生物分子的活性。 1 2 电化学d n a 传感器 自1 9 5 3 年脱氧核糖核酸( d n a ) 的双螺旋结构被发现以来，基于基因序列分 析的分子诊断，得到迅速的发展。目前传统的凝胶电泳技术、毛细管电泳、电化 学分析和化学发光分析等技术用于d n a 的测定时，d n a 片段一般需要与放射性 元素 2 9 , 3 0 】、荧光染料【3 1 1 以及量子点3 2 1 等进行标记，操作复杂且花费时间长。聚合 酶链反应( p c r ) 是现在应用最多的测定d n a 的技术f 3 1 , 3 3 , 3 4 】，已被广泛的用于基 因缺失和点突变的检测，但是同样存在分析时间长的问题。因此发展快速、简单、 无标记诊断d n a 分子的方法，对药物分析、临床检测及生物工程都有着十分重要 的意义。 电化学d n a 生物传感器是近年来发展起来的一种新型的生物传感器，它能将 目的d n a 的存在转换为电信号，比较容易实现微型化、集成化及原位、实时、在 基于信弓放大技术的电化学生物传感器研究 线的检测，且体积小、花费低、并能与其它仪器兼容的特点，因而近年来它的发 展非常迅速【3 5 , 3 6 。 1 2 1 电化学d n a 传感器原理 电化学d n a 传感器通常是将单链d n a ( s s d n a ) 探针分子修饰到电极表面 构成d n a 修饰电极，利用单链d n a 与其互补靶序列杂交的高度选择性，使得这 种单链d n a 修饰电极具有极强的分子识别功能。在适当的温度、p h 、离子强度 下，电极表面的d n a 探针分子能与靶序列选择性地杂交，形成双链d n a ( d s d n a ) ， 导致电极表面结构的改变。这种杂交前后的结构差异，可以引起电信号的改变， 从而达到了检测靶序列的目的。 1 2 2 电化学d n a 传感器的检测方法 d n a 传感器对目标基因的选择性识别是靠核酸的杂交来完成的，杂交前后引 起的电信号变化，一是利用d n a 中的鸟嘌呤和腺嘌呤可以在一定电势下具有电活 性这一特性，进行目标基因的直接检测【3 7 4 0 1 ；二是通过一种电活性杂交指示剂或 者在d n a 上标记电活性基团进行指示，利用指示剂的信号间接检测出目标基因。 这些指示剂可以是有机分子、酶、纳米材料等【2 8 , 4 1 - 4 8 1 。 1 2 2 1 无指示剂的直接检测 d n a 的一些组分如鸟嘌呤核苷或腺嘌呤核苷在一定电位下可以发生单电子氧 化反应，能够与某些电极表面发生电子转移，从而实现对目标基因的电化学检测。 无指示剂法传感器方案简单，不用指示剂，检测安全，指示剂引起的毒性污染作 用被消除。第一个无指示剂方案i 由w a n g 提出【37 1 。随后，利用这种无标记方法进行 基因的检测得到了迅速的发展。e s k i o c a k t 4 0 】利用鸟嘌呤核苷的氧化信号对端粒酶 的活性进行检测。端粒酶是一种逆转录酶，在人体内可以合成端粒重复序列 t t a g g g ，该序列5 0 的碱基为鸟嘌呤核苷，故而可以用嘌呤核苷的氧化信号对 端粒酶进行检测，其检测限可以达到l0 01 t g 1 t l 以下。 1 2 2 1 利用指示剂的间接检测 、 d n a 在大多数时候是电化学惰性的，就需要在电化学分析过程中引入电化学 活性识别组分，借助于这些有电化学活性的指示剂来进行杂交检测。 ( 1 )具有电化学活性的杂交指示剂作为标记物：电活性杂交指示剂是通过 静电吸附或者沟槽嵌入，与单链d n a ( s s d n a ) 和双链d n a ( d s d n a ) 具有不同 结合能力的电活性物质。根据杂交指示剂与s s d n a 和d s d n a 结合方式和结合能力 的差异，测定其氧化还原峰电流和峰电位可以识别和测定d n a 分子。常用的杂交 硕十学位论文 指示剂包括染料( 如亚甲基蓝、溴化乙啶等) 4 1 , 4 2 】和金属配合物 ( c o ( b p y ) 3 】3 + , h o e c h s t3 3 2 5 8 ， r u ( n h 3 ) 6 】3 + 等) f 2 8 4 3 4 4 1 、葸环类的抗生素( 如阿霉 素) 4 5 】。g a r c i a t 4 6 】等合成了一种钌的配合物，它与双链d n a 嵌入的作用远远大于 单链d n a ，可用于单碱基测定，并对1 1 0 个碱基长度的d n a 片段中特定序列的检测 性能也较好，其检测限可达9 0p m 。s t e i c h e n l 4 7 1 等将电中性的p n a 组装到电极表面， 不与【r u ( n h 3 ) 6 】”发生静电吸附，当加入目标d n a 后，【r t i ( n h 3 ) 6 3 + 静电吸附于d n a 磷酸骨架上，通过交流伏安进行检测，可以用于单碱基突变的识别。 ( 2 ) 在寡聚核苷酸上修饰电化学活性的官能团作为标记物：带有电化学活 性基团的寡聚核苷酸与电极表面的靶基因选择性地进行杂交反应，在电极表面形 成带有电活性官能团的杂交分子，通过测定其电信号可以识别和测定d n a 分子。 常用的电活性修饰基团主要有二茂铁1 4 8 , 4 9 1 、亚甲基蓝【5 0 】等。f a n 4 9 1 等设计了一端 修饰巯基、另一端连有一个二茂铁分子的发夹结构的探针，构建了一种s i g n a l o f f 型电化学d n a 传感器，首次将信标探针引入到电化学传感体系。由于杂交反应的 发生使茎环结构打开，形成双链，其刚性结构使末端连接的二茂铁分子远离电极 表面。这种距离的改变导致电子传递效率发生变化，通过检测二茂铁分子氧化还 原电流的变化可以方便而快速地指示杂交反应的发生。w u 等【5 l 】结合连接酶与反向 分子信标联用，用5 端标有磷酸基团，3 端标记二茂铁的核酸作为检测探针用于 d n a 杂交检测和点突变识别。 ( 3 ) 在d n a 分子上标记酶作为标记物：标记了酶( 如辣根过氧化酶( h r p ) 【5 2 1 、碱性磷酸酯酶( a l p ) 5 3 】) 的s s d n a 与电极表面的互补s s d n a 发生杂交反 应后，利用酶的催化作用，通过测定反应生成物的变化量可以间接测定目标d n a 。 w i l l n e r 等【5 3 】利用a l p 酶发展了一种用于灵敏检测s n p 的电化学传感技术。在d n a 聚合酶作用下，仅当捕获探针3 末端与靶d n a 的突变点完全互补时，延伸反应才 能发生，从而引入生物素化的核苷。由于生物素与亲和素间的作用力，将亲和素 标记的a l p 酶引入到电极表面，a l p 酶催化5 溴4 氯3 吲哚基磷酸酯，生成不 溶物，沉积在电极表面，使得电化学阻抗值变大。从而通过阻抗值的变化进行s n p 的识别检测。 ( 4 ) 在寡聚核苷酸上标记纳米粒子作为标记物：将纳米材料( 如金属纳米 粒子【5 4 , 5 5 】、量子点f 5 6 , 5 7 】、聚合物微珠【5 8 】和磁性纳米粒子【5 9 1 ) 标记在s s d n a 上， 与电极表面的s s d n a 进行杂交反应后，利用纳米材料的特殊性质，直接进行电化 学检测或者用来放大检测信号。w a n g 等【56 j 采用多种量子点标记d n a ，可实现多 种靶序列的同时检出，并采用溶出伏安法检测，与普通伏安法相比，具有更高的 灵敏度，能获得有效的背景补偿，提高了序列检测能力。 基于信弓放人技术的电化学生物传感器研究 1 - 3 电化学免疫传感器 免疫传感主要是基于抗体( 或抗原) 作为选择性试剂来分析测定各种抗原( 或 抗体) 及半抗原以及能发生免疫反应的多种生物活性物质( 如激素、蛋白质、药 物、毒素等) 。电化学免疫传感器是一种将免疫技术与电化学检测相结合的免疫 分析方法。它将免疫反应的生物信号转化为可测的电信号，从而实现对目标物的 检测分析【6 0 1 。它结合各种电分析技术，如溶出伏安法、脉冲伏安法、脉冲差分法 等，大大提高了其检测灵敏度，目前正朝着更加灵敏、特效、微型和实用的方向 发展。 1 3 1 免疫检测的分析原理 免疫分析原理是利用待测物质( 抗原或抗体) 与其相对应物质( 抗体或抗原) 之间专一免疫亲合力作用，以不同标志物信号的变化表现出待测物质的多少，而 达到检测目的。免疫分析的检测原理一般可分为直接检测、基于竞争反应和夹心 反应的检测。 1 3 1 1 直接检测 直接检测法是在抗体与其相应抗原识别结合时直接转变成可测信号。一般将 抗体或抗原先固定在传感器表面上，传感器与相应的抗体或抗原发生结合的同时 产生可测信号，这种可测信号可以是频率信号、电信号、光学信号等( 图1 2 ) 。 如抗体抗原相结合时，会引起压电石英晶体微天平的响应频率变化，或者是电化 学阻抗值的变化，从而检测出免疫反应。 图1 2 直接检测法免疫传感器原理示意图 电位、阻扰等变化 压电频率变化 表箍折射率变化 1 3 1 2 竞争法 利用标记抗原( a g 幸) 和非标记抗原( a g ) 共同竞争与抗体的结合。固定带 有标记物的抗原的量，与待测样品一起加入反应中。未标记的抗原和有标记物的 抗原之间竞争结合固定于载体的抗体提供的活性位点( 图1 3 a ) 。由于加入的有 o 一 体 ! 扰 0 矮k k k k 黼。群蝰蛳 硕+ 学位论文 标记物的抗原浓度是固定的，当样品中抗原含量越高时，能够竞争结合抗体的标 记抗原越少，样品中抗原含量与检测出的标记物产生的信号大小成反比。 1 3 1 3 夹心法 夹心法则是将包被抗体、抗原和检测抗体结合在一起，形成一种包被抗体抗 原检测抗体的夹心式复合物。一般先将包被抗体( a b ) 固定在载体上，加入待测 样品( 抗原) 后，抗原和捕获抗体反应后除去游离抗原，再加入带有标记物的检 测抗体( a b * ) ，与抗原继续反应，形成a b a g a b 复合物( 图1 3 b ) 。晟后，通 过检测夹心复合物上标记物所产生的信号的大小，来计算样品中抗原的含量。 抗体 f 谨 检测扰原。 传感界面 抗体 ? 礓 标记抗原m 抗缳o 标记抗体互净 传感界面 图1 3 竞争法( a ) 与夹心法( b ) 免疫传感器原理示意图 1 3 2 电化学免疫传感器的分类 由于抗原( 抗体) 本身直接引起检测信号变化的能力比较弱，能够直接检测 的抗原和抗体并不是很多的。往往需要采用一些具有电活性的外源性标志物来对 抗原或者抗体进行标记，通过检测这些外源性标记物产生的电信号来提高对目标 分析物的检测灵敏度。 根据所检测到的电信号的不同，电化学免疫传感器可分为电流型免疫传感器、 电位型免疫传感器、电容型免疫传感器、电导型免疫传感器、阻抗型免疫传感器。 1 3 2 1 电流型免疫传感器 电流型免疫传感器是目前最为成熟，应用最为广泛的一种。通过测定恒定电 基于信号放人技术的电化学生物传感器研究 压下电流的变化，来达到对目标物的检测。但由于抗原抗体本身不具备电活性， 所以对于电流型免疫传感器，必须借助于抗原或抗体的标记来反映电极上的抗原 抗体的结合反应，从而达到间接测定待测物的目的。一般常用的是酶标记，主要 包括辣根过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶等【6 1 6 4 1 。此外也可以在抗体 ( 抗原) 上标记电活性标记物( 如二茂铁、对氨基酚及其衍生物、金属离子等) 6 5 , 6 6 】。 a i z a w a 6 1j 等人在1 9 7 9 年用h r p 标记的人绒毛膜促性腺激素( h c g ) 与没有酶标记 的h c g 竞争结合固定的抗体，构建了最早的电流型酶免疫传感器，用于h c g 的检 测。此后，通过酶的放大作用，用酶标抗体( 抗原) 进行电流型电化学酶联免疫 分析得到广泛应用。 1 3 2 2 电位型免疫传感器 由于绝缘性的抗体或抗原蛋白在电极表面的结合，减弱了电极的导电性，这 就限制了电流型免疫传感器灵敏度的提高。2 0 世纪6 0 7 0 年代，电位型免疫传感 器逐渐兴起。通过测量敏感膜与目标物发生选择性作用后在膜上产生的膜电位变 化，来进行目标物的检测。电位型免疫传感器结合了酶免疫分析的高灵敏度和离 子选择电极、气敏电极等的高选择性，可以直接或间接检测各种抗原、抗体，具 有可实时检测、响应时间较快等特点。 1 9 7 5 年j a n a t a 【6 7 】首次利用聚氯乙烯膜把抗体固定在电极上，当待测抗原与固定 在电极表面上的抗体结合后，电极上的膜电位发生变化，通过膜电位的变化指示 待测抗原的浓度。袁若【6 8 】等在铂电极表面涂覆上一层n a t i o n 膜后，通过n a t i o n 膜带 负电荷的磺酸酸基团与乙肝表面抗体分子中带正电的氨基之间的静电作用，将抗 体固定到电极表面制备了一种高灵敏、高稳定的电位型免疫传感器。 1 3 2 3 电容型免疫传感器 在电位型酶联免疫分析程序中，一般涉及到异相分离和二抗，而且灵敏度不 高。基于电容测量技术的电容型免疫传感器，由于其具有高灵敏度且无须标记， 近年来得到较大的发展6 9 7 2 1 。当金属电极与电解质溶液接触，在电极溶液的界面 存在双电层，它可以用类似于电容器的物理方程来描述： j 二 c = a c , 1 巳憎 其中c 为界面电容，8 d 为真空介电常数，为电极溶液界面物理介电常数，彳是电极 与溶液的接触面积，d 为界面层厚度。电容型免疫传感器就是基于将抗体固定在电 极表面，当抗原抗体在电极表面复合时，界面电容相应地降低，据此检测抗原的 量。b e r g g r e n 7 0 】等在电极表面自组装硫辛酸，利用十二烷基硫醇封闭，共价修饰 上h c g 抗体，得到一个很好的绝缘界面。结合流动注射，对h c g 进行电容检测， 其检测范围为1p g m l 1n g m l ，检测下限为0 5p g m l 。j i a n g l 7 2 】等把抗体包埋在 硕一i ：学位论文 1 - a 1 2 0 3 溶胶凝胶中制备电容型免疫传感器，由于y a 1 2 0 3 超薄且渗透性好，有着较 高的时间常数，大大提高了检测灵敏度。 1 3 2 4 电导型免疫传感器 电导型免疫传感器是基于免疫反应引起溶液或薄膜的电导发生变化来进行免 疫分析的生物传感器【7 3 。7 5 】。k a n u n g o 7 6 1 等利用聚3 ，4 二氧乙基噻吩膜在电极表面固 定i g g 抗体，利用电导法测定了i g g 。由于被测样品离子强度和缓冲液容积对电导 率的影响比较大，因此导电率型免疫传感器发展比较缓慢。 1 3 2 5 阻抗型免疫传感器 阻抗型免疫传感器是基于抗原抗体之间的结合，降低了电活性探针分子与电 极之间的电子转移速率，即增加了电子转移阻抗。通过测量免疫结合前后电子转 移阻抗的差值实现对目标物的检测。对于电解池，我们可以模拟出图1 4 的等效电 路。等效电路包括电解液阻抗r 。，w a r b u r g 阻抗z w ，双电层电容c d i 和电子转移阻抗 。其中，r 。和z w 分别与溶液和氧化还原探针的性质有关，不受发生在电极表面 上电化学反应的影响。而c d i 和凡。分别由电极电解液界面的非传导性和绝缘性决 定。电极表面的修饰层会改变界面的双层电容和电子转移阻抗，并且这种变化电 容和电子转移阻抗值可以从阻抗谱图上得到。因而通过测量电容变化值和电子转 移阻抗值就可以实现对电极表面修饰层性质的间接检测。 z w k 图1 4 电化学阻抗传感器等效电路示意图 由于电化学阻抗具有良好的界面表征作用，微小振幅正弦电压或电流不会对 生物大分子造成干扰，敏感性高，使其有可能成为一种良好的生物传感技术，具 有广阔的应用前景。d i n g 等1 77 】用多孔的、高表面积的三维结构导电i r o x 膜和蛋白a 同时定向固定癌胚抗原( c e a ) 抗体，发展了一种电化学阻抗免疫传感器，快速 检澳i j c e a 。c h e n 等【7 8 】在玻碳电极表面电沉积一层多孔的纳米结构金膜，然后用其 直接吸附蛋白质，经过夹心免疫过程和酶催化沉积过程后，采用法拉第阻抗法测 定酶沉积物的量而间接实现免疫信号的检测。 基于信号放大技术的电化学生物传感器研究 1 4 电化学传感器信号放大方法 在环境保护、食品安全、早期疾病诊断等这些与人类生活密切相关的领域中， 进行痕量分析越趋重要。而采用常规的生物传感技术，对这些含量很少的物质很 难达到检测目的。因此，发展高灵敏度的传感器越显重要。其中，最有效且最常 用的方法就是通过某种放大方法来使分析检测信号得到增强，来提高分析灵敏度。 目前常用的主要有以下几种信号放大方法。 1 4 1 基于生物酶的电化学信号放大 在电化学生物传感器中，利用酶分子高效的催化活性，进行信号的放大应用 非常广泛【7 9 培2 1 。一般将酶分子标记在抗体或d n a 上，与抗原结合或者互补d n a 序列杂交，将酶分子引入电极表面，利用酶的催化活性催化相应的酶底物，将抗 体抗原之间的结合或者互补d n a 之间的杂交过程信号变化相应的放大。p a t o l s k y 【8 3 j 利用夹心法，将标记有h r p 酶的d n a 捕获到电极表面，h r p 酶在h 2 0 2 作用下， 催化4 氯1 萘酚生成不溶产物，沉积到电极表面，阻碍了电化学探针 f e ( c n ) o 弘佴 与电极间的电子传递，引起电化学阻抗值的增加，进行d n a 的检测。这种方法也 可以引起基于质量效应的压电信号的变化，用于电化学和压电检测 8 4 , 8 5 1 。l i u 等【8 6 1 在电极表面固定赭曲霉素a 和卵清蛋白偶联物，利用游离的赭曲霉素a 与偶联物 竞争结合其抗体，再用a l p 酶标记的二抗结合赭曲霉素抗体。a l p 酶催化其底物 1 萘酚磷酸酯，水解生成具有电活性的1 萘酚，提高了分析灵敏度。此外，还利 用酶的底物在检测过程中能不断地循环来增强的分析信号【87 1 。近年来，为了增加 酶的标记量以实现检测信号的增强，研究人员发展了一些多酶标记的方法。即先 将大量的酶修饰在功能载体上，然后再和蛋白质或d n a 分子结合，从而使分析信 号增强【8 8 。9 0 】。w a n g 8 8 1 等以碳纳米管作为酶的载体，将亲合素化d n a 或蛋白质， 和碱性磷酸酯酶同时修饰于碳纳米管上，这种修饰过的碳纳米管可以直接用于免 疫或d n a 分析。这种方法极大地提高了酶的标记量，大大地提高了分析灵敏度。 1 4 2 基于纳米材料的电化学信号放大 1 9 9 0 年7 月，在美国巴尔的摩召开的第一界国际纳米科技会议标志着纳米科 技( n a n o s c i e n c ea n dt e c h n o l o g y ) 的正式诞生。纳米材料是纳米科技的一个重要部 分，纳米科技的发展伴随着纳米材料与各种纳米器件的不断更新。由于在纳米尺 度下物质中电子的量子力学性质和原子的相互作用将受到尺度大小的影响，因此 纳米材料具有许多普通材料不可比拟的优良性能。因此，在生物传感领域，将纳 米材料用于生物传感器的构建，能够有效改善传感器性能，提高传感器的灵敏度。 硕 ：学位论文 1 4 2 1 基于纳米金颗粒的信号放大 纳米金是通过氯金酸( h a u c l 4 ) 在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒， 形成带负电的疏水胶体溶液。由于纳米金颗粒具有独特的物理、化学性质及生物 相容性，纳米金颗粒得到了更为迅速的发展，已被广泛应用于生物学和医学等众 多领域 8 9 , 9 0 】。 由于纳米金粒子具有高比表面积和生物相容性，当用于生物分子的固定时可 以增加所固定生物分子的数量，保持其免疫活性，从而增强反应信号，提高生物 传感器的灵敏度【9 1 。9 引。c u i 等【9 5 】在纳米金上同时固定二抗和辣根过氧化物酶分子， 引入多个酶分子，酶分子进一步催化底物产生电活性物质，使电信号显著增强， 对人i g g 的检测可低达4 0p g m l 。w a n g 9 6 】等在纳米金表面同时修饰链霉亲合素和 巯基二茂铁电活性分子，提高二茂铁的分子数目。将该纳米金标记物应用于核酸 杂交分析，对目标序列的检测限可低至5p m 。 此外，利用纳米金的催化作用，也是信号放大的常用方法。纳米金的晶核可 以催化一些金属离子( 如金离子、银离子、铜离子等) 还原并沉积于纳米金表面， 使纳米颗粒体积变大，在一定条件下溶解后进行电化学检测【9 7 - 9 9 1 或者测其电化学 电 阻抗值的变化【1 0 叭。c h u 9 8 1 等人利用纳米金标记抗体，进行夹心反应。在免疫反应 结束后，向微孔板中加入银增强溶液，利用纳米金的催化金属还原沉积作用，在 纳米金上形成了一层银单质，通过溶出伏安法检测银的含量，