全文预览已结束
下载本文档
版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
精品文库PCR实验报告7月19日 高遄实验目的:了解PCR技术原理,掌握最基础的PCR实验步骤。实验试剂:模板DNA,Mg2+,buffer,dNTPs,Taq DNA聚合酶,引物,H2O,石蜡油。实验原理:l PCR全称聚合酶链反应,是体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法。l 基本原理:首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成2条单链DNA分子,DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的DNA互补链。PCR反应时,只要在试管内加入模板DNA、PCR引物、四种核苷酸及适当浓度的Mg2+,DNA聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。(1) 双链模板DNA分子首先在高温下解开成长的单链,短链引物分子立即与该模板DNA两端的特定序列相结合,产生双链区。(2) DNA聚合酶从引物处开始复制其互补链,迅速产生与目标序列完全相同的复制品。(3) 在后续反应中,无论是起始模板DNA还是经复制的杂合DNA双链,都会在高温下解开成为单链,体系中的引物分子再次与其互补序列相结合,聚合酶也再度复制模板DNA。(4) 由于在PCR反应中选用的一对引物,是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则设计的,因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的,每一条新合成的DNA链上都有新的引物结合位点。(5) 整个PCR的反应全过程,即DNA解链(变性)、引物与模板DNA结合(退火)、DNA合成(链的延伸)三步可以被不断重复。经多次循环之后,反应混合物中所含有的双链DNA分子数,即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数,理论上的最高值应该是2n,能进一步满足遗传分析的需要。l 试剂作用:(1) 引物:DNA复制的起始点,针对复制DNA片段的两端,有5引物和3引物(2) Taq DNA聚合酶:促进dNTPs与模板结合。(3) Buffer:Tris-HCl反应缓冲液,Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。(4) Mg2+:对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。(5) dNTPs:底物,在引物引导下合成与模板互补的DNA新链。(6) 石蜡油:防止PCR加热过程中DNA蒸发。l 试剂配置体积:20l体系中各试剂配置如下表:试剂H2OBufferMg2+dNTPsP(引物)T(模板)E(酶)体积/l9224210.4l 温度和时间:(1) 热启动:94,510min(2) 变性:94,4560s。(3) 退火:5065,1min。退火温度计算:Tm-(510),Tm(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)。(4) 延伸:72,11.5min。(5) 步骤(2)(4)热循环2530个周期(6) 保温:延伸72,10minl 产物检测:凝胶电泳。实验步骤:(1)设计20l体系各试剂配比:试剂H2OBufferMg2+dNTPsP(引物)T(模板)E(酶)体积/l9224210.4(2)按照预先设计的20l体积配置6管试管量,实际加入量如下表试剂H2OBufferMg2+dNTPsP(引物)T(模板)E(酶)6x加入体积/l541212暂不加入12暂不加入2.4将以上试剂按体积加入EP管中,震荡混匀后离心(3)完成后分6管加入pcr管中,每管15l体积,标注1-6号码。(4)在前1-4号PCR管中加入模板DNA,在5号管中加入C3H模板作为阳性参照,6号中不加任何模板DNA,作为阴性参照。(5)在加完模板的6管试剂中各加入20l石蜡油(6)将PCR管放入PCR仪,按之前设定的加热温度与时间设置a热启动:94,2min;80,1min;此时在各管中加入dNTPs 4lb变性:94,30s;c退火:65,1.5min;d延伸:72,2min步骤bd循环40次e保温:72,10min(7)完成后用3%琼脂糖凝胶(60ml)电泳进行检测。实验结果:PCR目标产物约为295bp琼脂糖凝胶电泳结果如下图所示 1 2 3 4 5 6 Marker1、2号泳道为
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 肿瘤微创治疗医疗器械行业市场调研分析报告
- 智能冷链物流行业市场调研分析报告
- 专业医疗图书出版行业风险投资态势及投融资策略指引报告
- 清洁燃料与废物利用行业三年发展预测分析报告
- 新兴市场跨境电商行业相关项目经营管理报告
- 小众市场电商行业相关项目诊断报告
- 《 带有伪故障的Geo-Geo-1离散时间排队系统的研究》范文
- 2023年浙江省交通投资集团有限公司招聘考试试题及答案
- 2023年物产中大(金华)物流有限公司招聘笔试真题
- 河南省五岳在线考试2025届高考物理一模试卷含解析
- 贵金属材料在航空航天中的应用
- CHT 1021-2010 高程控制测量成果质量检验技术规程
- 《计算力学》课件
- 异常子宫出血规培教学查房讲课
- 市场销售问题及整改措施
- 义务教育数学课程标准(2022年版)解读与案例分析
- 小学生服装设计课
- 八-《三颗枸杞豆》原文
- 妇产科抗生素的应用现状及合理应用原则分析
- JTS202-2011 水运工程混凝土施工规范
- (高清版)TDT 1036-2013 土地复垦质量控制标准
评论
0/150
提交评论