（化学工艺专业论文）dl蛋氨酸拆分及氨基酰化酶的固定化研究.pdf

湖北工业大学硕士学位论文 摘要 本文对氨基酰化酶i 的提取、应用氨基酰化酶拆分d l 蛋氨酸及氨基酰化酶的 固定诧进行了研究。重点研究7 氨基酰化酶l 提取工艺及酶鳇酶学性质、氨基酰化 酶i 拆分d l 蛋氨酸实验中各因素对拆分率的影响，并对海藻酸钙凝胶珠包埋氨基 酰化酶固定化进行了初步探讨研究，为氨基酸工业化生产，尤箕是蛋氨酸的酶法 生产提供了理论依据。 蛋氨酸酰化实验研究了温度、溶剂、p h 值、时间等因素对酰化率的影响，通 过正交试验褥出p o 蛋氨酸酰纯最优工艺条件为：蛋氨酸与乙酸酐的摩尔比为l ： 1 0 5 ，反应的p h 值6 2 左右、反应温度在6 2 ，反应时问1 5 h ，蛋氨酸酰化率为 9 7 5 左右。 实验选取氨基酰化酶含量较为丰富的猪肾作为酶源，通过粗提( 水作溶剂) 、调 p h f 涂杂蛋白和硫酸铵盐析等步骤从猪肾中提取氨基酰化酶i ，测得该酶的比活力 为2 8 6 u 触g ，蛋邑质含量为4 。2 搬咖l ，纯化倍数为1 9 。l ，回收率5 2 ，最适磷为7 o 8 0 ，最适反应温度随着作用时问的延长而降低。 实验采用游离猪肾氨基酰化酶l 对n 乙酰d l 蛋氨酸进行拆分研究，分别考察 了p h 、温度、酶的用量及底物浓度、金属离子浓度等对拆分率的影响。得出n - 乙 酰d l 蛋氮酸拆分最优化条件：反应温度3 7 ，缓冲体系p h 7 o ，初始底物n 乙酰 d b 蛋氨酸的浓度为o 2 艄l ，酶用量7 l ，佃m o l 。产品，b 蛋氨酸：o p = 9 6 。2 收率7 3 5 ；d 蛋氨酸：o p 印5 3 ，收率4 9 5 。 实验采用固相漕旋方法对蛋氨酸进行消旋研究，研究中分剐考察了母液浓 缩程度、反应温度、溶液p h 值、加入醋酐量、反应时间等对消旋率的影响，在最 优消旋工艺条件下，d 蛋氨酸的消旋收率可达到8 5 左右。 实验初步探讨了氨基酰化酶固定化工艺，研究发现固定化氨基酰化酶在5 0 7 0 范围内都保持了较高的酶活力，其热稳定性远远高于游离酶，同时酶的泄漏 问题也得到了较好的解决，但是随着反应次数的增加，微胶囊的操作稳定性随之 下降。在应用之前，还需解决微胶囊的易损坏问题。 关键词：氨基酸，蛋氨酸，氨基酰化酶i ，手性拆分，酶固定化 湖北工业大学硕士学位论文 a b s 心凌e 童 t h ee x t r a c t i o no fa m i n o v l 硒ei ，m e 糟s o l u t i o no fd l - m e t h i o n i n ea n dt h e 主l n l n o b i l i z t i o no fa m i n o a c v l a s elw e r es t u d i e di nt h ed i s s i e r t a l i o n 。t h et e c h n i c so f e x 豫媛ea m i n o a c 舅黼e ，d l 哪l e 毫撼o n i n er e s o l 哦i o nb y 螽 e ea m i n o a e 蟠a s elh a _ v e 移嚣髓 s t u d i e di nd e t a 订e d ，a n dt h em e t h o do fi m m o b i l i z e da n l i n o a c y l a s e1w i t hc a l c i u m 鑫l 蠡瓣激eb e 稚sw 鑫s 西l o s 细d i 托弧e 糯e o f 痰 e 越b a s i si s 翻的v i 蠢蠢善b f 羽飘i l 玲鑫c 谴s p r o d u c t i o n ，e s p e c i a i i ym e t h i o n i n eb y 枷i n o a c y i a s e 鼹l e 螽e t o f s 壕融a 鬟每c 专忿t eo fa e 娃酞i o n 铽e h 舔羚a e i o 驻l e 耋毽唰锨秘蕊硝，贼v 壤逢 c a t a l y s t ，e t cw e r er e s e a r c h 丽i nt h ea c y l a t i o no fd l m e t h i o n i n ee x p e n m e n t ，t h eo p t i m a l t e c _ m o l o 西c a le o l 堪i i o n sw e f e 搬蠢n e db y 碳h o 圆o n 蠢糕p e 纛l 髓e 毪垮：也e 氆o l a f 怒l i oo f m e t h i o n i n e da c 烈i ca n h y d r i d ei sl ：1 0 5 ，t h ep ho ft 1 1 es o l u t i o ni sa b o u t6 2 ，m e f e a e t i o nt e 黼p e f a t l l f ei s6 2 ，f e a c 垃o n 墩n ei s1 5b 供戤a n d 也ea c 蛾蛾o n 斑t ei s 骐p 镪 9 7 5 4 p i gk i d l l e yw h i c hc o n t a i n s 蝣c _ h 锄i n o a c y l a s ew a sc h o s e l lf o fl h ep 1 o d u c t i o no f 毅鞋i 觳o a c 毋a s e 主嚣粕s 潞e 静馥。u g bp r e l i m i n a r ye x 妇e 扣越舒w a sa s 讯es o l v 燃峡 a d i u s tp ht or e m o v et h eo t h e rp r o t e i n ，a m m o n i u ms u l f a t ea n da c e t o n ef h c t i o n a t i o nt o 疽玲蠡e 瓣i 麓鑫c y l 豁e | 晒氆蠹e 照委g 靶i d 建e y 。弧e 警蹦蠢a 蘸证移妞瓣i 黯a c y l 擞 1w a s2 8 6u m g ，t h ep u r i c i c a t i o nr a t i oa n dr e c o v e ww a s19 1 ，a n d5 2 r e s p e c t i v e l y 强eo 雠i m 越p 差o f 黼i 辩a e 耍鑫s elw 鑫s7 e 8 。e ，l e 逊啦e 懿l 蹿s i o n 醴稔r e d u c 岛a 桶。 w i t ht h ei n c r e a s eo fc a t a l y s i st i m e ，t h eo _ p t i m a lr e a c t i o nt 啪p e r a t u r ed r e a s 。d e o 嚣i e s p o n d 证g b & t l h en 。a c e t y 重- d m e m i o i n er 鹪o i u t i o nb y 蠹够e 锄i n o a c y l a s ei ，锄df a c t o r so f f 器o l u t i o n a c 垃o nw e f ed i s c u s s 耐，i n c l u & p hv 越u e ，r c a c t i o nt m p e r a 瞻f e ，a m o u l l to f 勰i n o a c y l a s e ，c o n e e n t r a t i o no fs 曲s l f a t e 黼d c 0 2 + 耄h eo p t i m a l 协c _ 耋1 n o l o 香c a 重_ c o n d i 虹o n s w e r e3 7 ，p h7 o ，n a c c t y l d l 。m e t l l i o i n ec o n c e n tr a t i o no 2 m o l l 1 ne l l d o 礅酬匿蕊o 。p = 9 6 2 ，镰e l d s 7 3 。5 ：d m 蔽h i o n i 狂e ，0 + p = 9 5 3 ，y i e l 泰4 多5 。 t h em e t h o do ft h es o l i dr a c 蝴i cw a sa d o p e dt or a c 帅i ct h en - a c 烈y l d m e m i o n i 曩e 颀氇i sa n i 羹e ta 芤强弱b 嚣o f i 魏翳碉蘧c 主娃g 是c 毫。辐协氇譬f 锚o l h 蛀。廷嘲c l i o 珏w e f e d i s c u s s e d ，i n c l u d el i q u i dc o n c e n t r a t e dd e g r e e ，r e a c t i o nt ：m p e r a t l j r e ，p hv a l u e ，i ? a t eo f a d d i n g 曩磕蝌蠢d e ，f e 鑫e 耄主。旺t i 您e 呶量ne n d ，p 唾喇u c l i 鼹o v e 穗l ly i d 豫a c _ & d8 5 。 t h ea m i n o a c y l a s e1w a si m m o b i i i z e dw i n lc a l c i 哪 a l 西n a t eb e a d si n1 1 1 l i s e x p 蕊趣鼹t ，像贰l h ei m 赫i l i z 甜踬z y 豫ek e p 篷h i 馥娥、哇t yb e 鲰e 既5 0 繇d7 0 e ，跹d t e m p c r a t l l r e8 t 两i l i t yo fm ei m m o b i l i z e d 伽固佣ew a sm c hb e t t e rt h a nf k ee 譬】i z y m e b u t t l l eo p e r a t i o ns t a b i l i t yo fm i c r o c a p s u l e sw a sd e c r e a s e da sl h eo p e f a t i 溅t i l n 锚i 琳粼选 s o 撬eb f e a 薹( a g eo f m i e 内e a p s u l e ss h o u l db es 。l v c db e 论糟a p p l i c a t i o n 。 k e y w o r d s ：a m i o na c i d s ，m e m i o 芏l i n e ，赳n j n o a c y l a s el ，c h i r a lf 黜o l u t i o n ，e l l z y m e i 麓m o b i l 注e d 珏 湖咖j 案大学 学位论文原创性声明和使璃授权说明 原创性声明 本人郑重声萌：所呈交的学彼论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取 得的研究残果。除文中已经标明孳 用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标鞠。本声镶靛法律结采由本天承趋。 学位论文俸者签名：；f 蓦凌罐 基期：砷蛞年岁月笤嚣 l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保耀 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权澳携工韭大学可以将本学位论文的全部或部分态容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文作者签名： 崞勰 日期：沙符p 月笤日 指导教师签名：留个仁受 日期：炒彦年兮月拶日 湖北工业大学硕士学位论文 第1 章文献综述 1 1 手性药物的应用与研究 1 1 1 手性药物拆分与测定的重要性 一个半世纪以前，人们就对手性分子有了认识。l8 4 8 年，l o u i sp a s t e u r 用放 大镜和镊子成功地分离了酒石酸铵盐的外消旋体，健的先驱工作标志着手性分离 的开始。随着生命科学和有机立体化学的发展，提供药效高、毒副作用小的光学 纯医学和农药己成为现代医药学和农药学研究的重要内容。生物体内的手性环境， 如酶、受体、抗体等与药物对映体的生物活性密切相关，药物对映体和它们的代 谢物常常表现出不同的药理和药代特性【l 2 1 ，使用外消旋体药物能导致错误的药代 行为和作用模式。但遗憾的是在过去相当长的时闻墨，在制备医药、农药时这种 差别没有予以充分的考虑，大多数手性化合物只以外消旋体化合物开发出来就作 为产品吼 在美国医药药物名称词典所列出的2 0 5 0 种药物中，大约有一半药物分子中至 少包括一个手征性中心，有4 0 0 多种药物以外消体或菲对映体异构化形式服用， 限予分离测定技术上的困难，其大部分对映体的疗效及药物动力学、对哺乳动物 的毒性、体内的吸收、代谢等方面的惹别远未被深入研究1 4 】。基于已发现许多手性 药物各对欧体生物活性的显著差别和产生的严重后粟，1 9 粥年，美国食品药物管 理局作出第一个政策性规定：今后凡研制具有不对称中心的药物，必须对其各个 对映体进行测定和评价l 飘。 1 2 手性药物拆分的迫切性 对于药物丽畜，籀若外清旋混合物的两种异构体对标靶生物的选择性有很大 程度的不同( 如其中一种异构体为无效的或拈抗的、或作用方式或作用部位点有差 异的) ，将手征性药物以药效更高的单一对映体使用是合理的。随着立体化学的发 展和对药物光学结构研究的不断深入，人们更多地关注光学活性产品的开发。目 前单一构型手性药物及其中问体的合成与药理学研究是现代有机合成工业和医药 工业中的一个热点研究领域。乎性药物已成为国际新药研究与开发的新方向之一， 现在手性药物市场以每年2 0 以上的速度增长，1 9 9 9 年手性药物市场销售额达到 1 1 5 0 亿美元，占世界药品市场的3 2 ；2 1 年达到1 3 3 0 亿美元，占世界药品市 湖北工业大学硕士学位论文 场的4 0 ；丽2 0 0 3 年己达到1 5 亿美元。在1 9 9 4 到1 9 9 6 的三年中全世界批准上 市的新药中有一半以上是单一对映体，预计到2 0 0 8 年全球上市的新化学药品将有 超过6 0 为单一异构体。目前，手性化合物己经在医药、农药、香料、功能材料 以及其它精纲纯工行业中发挥着十分重要的作用。 在农药中手性问题也很突出，目前已商品化的6 5 0 余种农药中，有1 7 0 余种 属于手性农药，在这商晶化的1 7 0 余种手性农药中，年销售额超过l 亿美元的有 3 0 余种，超过2 5 0 0 万美元的6 0 余种，其中含高活性手性体成分的手性农药销售 额超过1 0 0 亿美元，纯手性异构体的手性农药年销售额己接近3 0 亿美元，手性农 药占到全球农药市场的3 5 【引。 现代社会对单一异构体药物需求快速增长的原因之一是药物异构体具有不同 生理活性：有的手性药物的异构体没有活性，如许多杀虫剂只有一种异构体具有 杀虫活性：有的手性药物的异构体有严重的副作用，如反应停，化学名为肽胺哌 啶酮( 2 - ( 2 ，6 - d i o x o 一3 p i p 战i d i n y l ) 一lh i s o i n d o l 昏l ，3 ( 2 h ) d i o n e ) 是上个世纪五六十年 代谣方广泛使用的一种镇静剂和止吐药，用于缓解孕妇的妊娠爱应，但是许多孕 妇服用后产下畸形婴儿。有文献报道在1 9 5 6 1 9 6 1 年问反应停就导致1 2 万个类似 “海豹”没有胳膊翻手的畸形婴，l 出生1 7 吲，随后豹研究发现肢胺哌啶酮是一个手性 化含物，有r - 和s 两个对映体，起镇静功效的是r 。对映体，s 对映体有强烈的致 畸作用疆弼。此类事件的发生促进了单一构型手性药物的研究与开发，也引起了社 会各界的重视，如美国和欧洲的新药管理部门就已作出特别法规，要求在申报手 性药物时必须给出其各个异构体的具体含量，并尽可能提供各纯对映体及其混旋 体的毒理学和药理学数据f l l l 。 氨基酸为含有氨基的有机酸，构成蛋白质的基本单位。无色晶体，熔点较高 ( 2 以上) ，能溶予水，其两性电离特性，与茚三酮试剂发生灵敏的颜色反应。 1 8 2 0 年在蛋白质的水解产物中发现了结构最简单的甘氨酸，到1 9 4 0 年已发现自然 界中有2 0 种左右的氨基酸。它们为人体或动物合成蛋白质所必需，多属l 型a 氨基酸i l 引。 近年来，随着人类自身需求的增加和科技的发展，氨基酸的应用领域被不断 衍生。氨基酸类抗癌药物、抗病毒药物和新型保健品不断地被开发出来，使得市 场对氨基酸的需求迅猛增加。应用微生物转化法与酶固定化技术发展氨基酸工业， 开发载体激素并对现在的传统工艺进行改造是我国政府予2 0 0 2 年确定的今后生物 医药产业发展的六大重点之一。 随着研究的不断深入，越来越多非天然构型d 氨基酸的作用被发现，它们的 需求也随之产生。如d 。色氨酸f 1 3 h l 、d 丙氨酸1 1 5 l 和d 苯秃氨酸f l q 等菲天然构型 2 湖北工业大学硕士学位论文 氨基酸在医药、食品以及饲料等行业中都具有潜在的应阁价筐。 获得单一构型氨基酸的方法主要有两大类：一类是蛋白质水解、微生物发酵、 利用酶或化学不对称合成，直接得到单一构型氨基酸的方法，另一类是先通过化 学法合成外消旋氨基酸，然后进行手性拆分，从而得到单一构型氨基酸的方法。 对于l 型和d 型都有利用价值的氨基酸而言，后一种方法更具应用前景：首 先，化学法合成步骤简单，成本低豢；其次，拆分后的产品组分单一，较前一糟 方法更易分离和纯化，从而大大降低了生产成本。而在拆分方法的选择上，酶法 具有绿色环保，反应条件温和等优点，极具发展前景。 生物法拆分氨基酸，主要有酶法相微生物法两类。现在常用的方法有氨基酰 化酶( l 型) 法和海因酶( d 型) 法( 包括单独使用酶和宜接使用产酶的微生物) 。 1 2 蛋氨酸理化性质及其研究现状 1 2 1 蛋氨酸理化性质 蛋氨酸( m e m i o n i l l e ，d l c h 3 s c h 2 c h 2 c h i ( n h ) c o o h ) 又名甲硫氨酸【m ，甲硫基 丁氨酸，化学名称为2 氨基番甲硫基丁酸，是唯一含硫醚熊氨基酸，也是一重要 的氨基酸品种。其外观为白色片状结晶或粉末，有特殊气味，味微甜，无旋光性。 熔点2 8 l ( 分解) ，相对密度1 3 4 俅咖3 ，溶于水、稀酸和稀碱，微溶予醇，不溶 于醚，1 蛋氨酸水溶液的p h 值为5 6 6 1 ，对热和空气稳定，对强酸不稳定，可 导致脱甲基作用。被氧化生成l - 蛋氨酸亚砜，进一步氧化即成砜，与硫酸或碘酸 一起加热时即成b 高半虢氨酸内酯。 从立体结构上讲蛋氨酸有左旋体( l 蛋氨酸) 和右旋体( d 蛋氨酸) i 堋。l 蛋氨酸从稀醇孛结晶成六方片磊，解离常数2 5 ) ：p k l 乏2 8 ；p k 2 = 9 2 l ，等电点 为5 7 4 ( 2 5 ) ，熔点为2 8 2 2 8 3 ( 分解) 。溶于水和热稀醇，但其晶体先呈抗水性， 不溶于无水乙醇、醚、苯、丙酮和石油醚。l - 蛋氨酸是唯一一种含硫的必需氨基 酸，与生物体内各种含硫化合物的薮陈代谢密切掘关。墨】f s ：6 7 8 。( 水) ，【1 畸： + 2 2 5 。( 1m 盐酸) 。d 蛋氨酸为白色结晶，溶于水、稀酸及碱，微溶于醇，不溶于 醚。 h ，硪2潮2 s 2 珏淞入2 珏 l - 蛋氨酸d 蛋氰酸 爱l 。l 阮蛋笺馥的立体构像 3 湖北工业大学硕士学位论文 | 1 2 2 蛋氨酸的应用 薹) 在医药工韭中的应用 蛋氨酸是必需氨基酸，对人体有很大营养价值。蛋氨酸能维持机体生长发育 和氮平衡，在动物代谢过程中，对肾上腺素合成胆碱和肝脂肪有一定的作用，蛋 氨酸能促进肝内脂肪代谢，临床用于慢性肝炎、肝硬变、月旨肪肝等的预防和治疗。 亦可用于磺胺类药物、砷或苯等中毒的辅助治疗，还可用作利胆药，用于调节尿 的p h 值，减少脂肪的积聚l 垮l 。蛋氨酸是医用氨基酸输液的重要成份，是l1 种、1 4 种、1 7 种、1 8 种、2 0 种氨基酸输液的主要成分之一。 o 蛋氨酸能维持机体的生长发育和平衡，可用于防治肝脏疾病和砷或苯中毒， 也可用于治疗痢疾和慢性传染病后因蛋白质不足丽引起的营养不良症( 2 0 l 。它可作 为蛋氨酸缺少的病人或蛋白质吸收不足的肝脏病人的蛋白质营养补充剂f 2 i 】；k 蛋 氨酸还可以用来治疗婴儿尿布疹，以及与胍酵、照碱配合可用来治疗高胆固醇盘 症和动脉粥样硬化等病症。 2 ) 在饲料行监中的应用 蛋氨酸是畜禽合成动物蛋白必须的最重要的氨基酸之一，为蛋白质饲料的强 化剂和弥补氨基酸平衡的营养添加剂，由于匿氨酸无法在动物体内合成，需从食 物中摄入，因此将它加入饲料中，可以促进禽畜生长、增加瘦肉量和达到缩短饲 养周期的效果并有效地提高蛋白质的利用率。当畜禽缺少蛋氨酸时就会表现为发 育不良、体重减轻、肝和肾机能受到破坏，斑现瓿岗萎缩和毛质变坯等现象。焉 在动物饲料中添加1 k g 蛋氨酸，相当于5 0 k g 鱼粉的营养价值，一般添加量o 0 5 o 2 。蛋氨酸在禽用配合饲料中的添加量为0 5 2 5 k 歆，猪用配合饲料中为o 5 1 绌：酚，若在肉鸡的日粮中增加o 0 7 5 0 2 5 的蛋氨酸，可使肉鸡体重增l l 。8 1 5 9 ，在反刍动物日粮中同时添加蛋氨酸和密勃隆，可使羊产琵量提高2 5 ，产 奶量提高4 2 以上，产肉量提高1 2 ，并节省饲料l 鑫。 用于饲料添加剂的有d l 蛋氨酸、羟基强氨酸、羟基蛋氨酸钙盐和n 羟甲基 蛋氨酸，均可用化学法合成，另外蛋氮酸金属盐可以提高金属离子( 包括z n ，c r ， m n ，f 曲在动物体内的生物利用1 2 2 1 。 3 ) 其它方面的应用 现在，医学美容发晨也相当快，在蛋氨酸的巍用研究上，翻本首先开发出了 氨基酸美容食品氨基酸埃斯泰。经研究证明，美容效果主要来自九种必需氨 基酸以及谷氨酸、脯氨酸、精氨酸。有的促进蛋自质的合成，有的促进构成皮肤 的胶原蛋白、角爨白等蛋白质的合成，有的促进生长激素的分泌，有助肌肤健康， 4 湖北工业大学硕士学位论文 有的提高睡眠质量和入体免疫功能，从总体上改善营养、体质、睡眠、入的疲激 能力，这些均有助于健康肌肤的形成。 另外，蛋氨酸是一种高效的抗氧化剂，因为它所含的硫能清除自由基。身体 细胞内的核酸胶原蛋白质的合成都需要蛋氨酸，对服用避孕药的妇女，服用蛋氨 酸也有好处。此外蛋氨酸在食品、生化研究、照相技术、化妆品等领域中也有广 泛的应用溺。 i l 。2 。3 蛋氨酸国内外生产现状及市场情况 由于发酵法合成蛋氮酸工艺路线收率极低，不具备工业化生产价值，毽此全 球蛋氨酸生产主要采用化学法【2 4 1 ，按原料路线分主要有丙烯醛法、氨基内酯法、 丙二酸酯法等，酪朊水解法等。近年来还开发出固液相转移催化法。丙烯醛法是 6 0 年代发展起来的蛋氨酸生产工艺，目前世界上主要蛋氨酸生产公司均采用丙烯 醛和甲硫醇为原料生成甲硫基丙醛，甲硫基内醛再进行缩合水解生产蛋氨酸。 目前囡际市场上蛋氨酸主要有四类，分别为固体蛋氨酸、液态羟基蛋氨酸、液 体蛋氨酸钠盐和固体羟基蛋氨酸钠盐。其中固体蛋氨酸和液态羟基蛋氨酸占据国 际市场的第一、二位，蓊美国蛋氨酸商场的主导产品为液态羟基蛋氨酸。 长期以来，全球市场对蛋氨酸的需求快速增长，是需求增长最快的氨基酸品 种之一。特别是饲料添加剂用蛋氨酸，需求更是连年大幅上升，需求的旺盛拉动 了生产。1 9 粥年，全世界蛋氨酸产量为2 6 1 0 5 t ，1 9 9 6 年增至3 o 1 0 5 t ，1 9 9 9 年 达4 5 1 0 5 t ，2 0 0 2 年为5 5 1 0 5 t ，2 0 0 5 年全世界蛋氨酸的年生产能力已达1 0 1 0 6 t ， 年产量达7 o l o 左右，是l o 年前的近3 倍。 目前国内没有饲料级蛋氨酸的生产装置，需求全部依赖进口，而国内生产的 蛋氨酸也主要用于医药方面，且绝大部分用于氨基酸大输液产品的生产嘲。由于 中国是世界第二大饲料生产国，对蛋氨酸的需求量较大，预计今后将以每年7 舛台的速度发展下去，到2 0 l o 年我国作为饲料添加剂的蛋需氨酸求量将由2 0 0 2 年的 5 1 0 4 如上舞至6 5 1 0 4 如。 据预测今后蛋氨酸市场年均增长率约为3 4 ，其中欧洲、日本和韩国市场 趋于饱和，焉东欧、亚渊( 日本除外) 和南美市场歪在发展，特别是中国，囱予 生活标准提高，对肉类的需求增加，中国市场需求的年增长率约为7 8 ，远远 高于全球年均增长水平。 1 2 4 蛋氨酸的酰化 在有机化合物分子中的碳、氮、氧、硫等原子上引入脂肪族或芳香族酰萋的 5 湖北工业大学硕士学位论文 反应称为酰化反应。酰基是指从无机酸、有机羧酸或磺酸等分子中除去羧基后所 剩余的基团。 反应通式： r c o z+g 珏=rcog+珏z 式中r c o z 为酰化剂，z 代表x ，o c o r ，o h ，o 刚，n h r 等。 蛋氨酸的酰纯反应属于k 酰纯反应，它是指胺类化含物与酰纯剂爱应，在氨 基的氮原予上引入酰基而成为酰胺衍生物，是有机合成中一种常用的方法。常用 的酰化剂有羧酸、羧酸酐、酰氯、酯及烯酮类化合物。胺类酰化反应有两种目的， 一种是将酰基保馨在最终产物中，以赋予染料或其它有机化合物某些新的性能。 另一种是为了保护氨基，亦即在氨基上暂时引入一个酰基，然后再进行其它的有 机会成反应，最蜃再水解脱除原先引入豹酰基。焉一种酰化的特点是利用酰氮基 比氨基稳定，不易氧化，又不能发生重氮化反应的原理。 此类n 酰亿反应的难易，与胺类化合物和酰化荆的反应活性，以及空间效应 都有密切关系，氨基氮原子上的电子云密度愈大，空间阻碍愈小，则反应活性愈 强。而脂肪族酰化剂的反应活性随着烷基碳链的增长而减弱，因此，要向氨基引 入低碳链的酰基，仍可采用羧酸( 如甲酸、乙酸) 或酸酐作酰优剂。 1 ) 羧酸的n 一酰化 用羧酸对胺类进行酰化是合成酰胺的重要方法，反应有水生成，是一个可逆 反应，其酰化反应通式如下： r n h 2 + r c o o h r r l 、i h c o r 十h 2 0 由于羧酸是一类较弱魄酰化剂，一般只适用子碱性较强的胺类进行酰化。为 了使反应平衡右移，必须采用过量的反应物。通常是取过量的羧酸，使平衡右移； 或者再同时移去反应生成的水。移去水的方法往往是在反应物中加入二甲苯或甲 苯进行共沸蒸馏，脱除水分。此外也可加化学脱水剂移去水分。若两反应物均为 不挥发的，则可在直接加热反应物料时脱除水分；如果胺为挥发的，则可将胺通 入到熔融的羧酸中反应。此外，也可将胺及羧酸的蒸汽通入热至2 8 0 的硅胶或 2 0 0 的三氧化二铝上进行气固相酰化反应。为了加速n 酰化反应，有时需加入少 量强酸作为催化剂，历程为： r - c o o h + l += r c + ( o h ) 2 r c + ( o h ) 2 + r ，n h 2 = 【r c ( o h ) 2 0 寸+ h 2 - r 1 粼o n hr ，+ h 3 0 + 用于n 酰化的羧酸主要是甲酸或乙酸，一般用乙酸。 2 ) 酸酐的n 酰化 6 湖北工业大学硕士学位论文 用酸酐对胺类进行酰化反应的通式是： ( r c o ) 2o + r n h2 ， r ，n h c o r + r c o o h 反应时无水生成，因此是不可逆的。酸酐的酰化活性较羧酸为强，除了能用 于酰化脂肪族或芳香族饷黢外，还能用于较难酰化的胺类，如伸胺，以及芳环上 含有吸电予基团的芳胺类。最常用的酸酐是乙酐，幽于其酰化活性较高，在2 0 2 9 时反应即能顺利完成。酸瓣的用量一般过量5 l o 。例如邻氨基苯甲羧， 因受环上羧基的影响，碱性较弱；同时，氨基又能与羧基形成内盐，更增加了酰 纯的困难，但是如果用乙酐为酰化剂，仍可得到收率较好的酰化产品。 乙酐在室温下的水解速度很慢，因此对于反应活性较高的胺类，在室温下用 乙酐进行酰化时，反应可以在水介质中进行，因为酰化反应的速度大予乙酐水解 的反应的速度。 用酸酐对胺类进行酰化时，一般可以不加催化剂。强酸对酸酐的催化作用与 对羧酸的作用相类似，是生成反应活性高的酰基歪碳离予。伯胺用酸酐酰化时， 如果酸酐用量过多，并在反应温度较高和反应时间较长时，除了生成酰化产物 外，还可能进一步生成二酰化产物： 爻n h 2一r n h c 瞅一 r m c o r ) 2 但是第二个酰基非常活泼，容易水解消除。因此当将二酰化物( 或一酰化与 二酰纯的混合物 在含水的溶剂( 如稀潘耩) 中重结晶时，最终将只褥到一酰纯 产物。 3 ) 其他 用酰氯合成酰胺是最简便_ 穰有效的方法。但酰氯是强酰化剂，与胺类反应异常 剧烈，而且反应过程中需加碱性物质中和氯化氢，虽然此反应很快，但酰化的收率 不如用酸或酸酐酰化所得，且成本要求较高，在实际生产上不是最理想的。其它如酯 及烯酮类相对与黢及酸酐都不是最好的。 比较重要的其它酰化剂还有：乙烯酮合三聚氯氰。 用二乙烯酮作酰纯剂，是合成乙酰芳胺的最好方法，僵对于蛋氨酸来说，制 备二乙烯酮的成本较高，且条件苛刻。一般来看，它不如乙酸或乙酸酐经济，不过， 这种方法的收率一般均高于9 5 ，也可以作为参考。 用三聚氯氰作酰化剂，由于三聚氯分子中有三个可取代的活泼氯原子，与胺 类可以进行酰化反应，随着反应条件的加剧，主要是反应温度的升高，三个氯原子 可戳依次被取代，壹到生戒三取代物为止。因此，用它酰纯胺类纯合物时，可摄据 需要选择适当的反应温度和p h 值范围，控制氯原子的取代程度。这类酰化反应主 要用于生产活性染料、荧光增臼剂以及某些高效农药。 了 湖北工业大学硕士学位论文 4 ) n 酰佬反应终点控制 在芳胺的酰化产物中，未反应的芳胺能够发生重氮化，丽酰化物则不能。剩用 这一特性可在滤纸上作渗圈试验，定性检查酰化终点。此外利用重氮化方法还可以 进行定量测定，用标准亚硝酸钠溶液滴定未反应的芳胺，控制其含量在o 5 以下。 1 3 氨基酸的手性拆分 1 3 | l 外消旋体的光学拆分 铃消旋体是一对对映体等量混合两组藏静。对映体除旋光方向相反井，其它 物理性质都相同。因此，虽然外消旋体是由两种化合物组成，但用一般的物理方 法( 例如分馏、分步结晶等) 不能把一对对映体分离开来，必须用特殊的方法才 能把它们拆开。将外消旋体分离成旋光体的过程通常叫做“拆分”。 拆分方法很多，一般有下列几种： 【5 5 l 等微生物中 发现并提取到了该酶。 湖北工业大学硕士学位论文 表1 2 三种不同来源a m i n o a c y l a s ei 的基本性质 1 4 2 氨基酰化酶的性质 氨基酰化酶i ( a m i n o a c y l 舔ei ，a c m i ) 其理化性质是立体专一性的水解a - n 酰基l - 氨基酸。对底物化学结构的要求是( 1 ) 单羧基氨基酸；( 2 ) 氨基酸上的私碳原 子上的氨基被酰化，酰化基团不同，其水解速度也不一样。一般是氯乙酰基 丙酰 基乙酰基甲酰基 苯甲酰基。如果酰化基团为苄氧羰基则酶不水解。不同来源的 酰优酶对底物化学结构专一性也不一致；酰纯酶l 水解脂肪族。氨基酸酰优物速 度较快，而从微生物霉菌中制备的酰化酶水解芳香族l 氨基酸酰化物比较快【5 6 】。 氨基酸仡酶l 主要存在子哺乳动物的肾脏帮微生物中，是生物体进行氨基酸代 谢时一个重要的水解酶，它可逆地催化酰化l 氨基酸的水解反应。研究表明，从 猪肾中提取的氨基酰化酶的分予量约为8 6 k d ，是由两个相同的亚基组成的二聚体 酶，二聚体中的每个亚基上各有一个活性部位f s n 。每个酶分子中含有2 个z 枣+ ， 分别处于两个亚基各自的活性部位中，并为表现酶的活性所必需【5 8 - 5 9 1 ，脱锌会导 致酶活力丧失豳l 。张彤等剐认为金属z n 2 + 对于维护酶分子活性部位盼特定空阂结 构以及它的空间结构的稳定性都具有重要的作用。 猪肾氮基酰化酶中有1 2 个色氨酸残基，2 0 个酪氨酸残基。硒r d e l 等先后报道 了色氨酸残基6 2 】和组氨酸残基【6 3 l 都是该酶的必需基因。b 摊e 等f “1 报道了羧基位 于酶的活性部位或活性部位附近，并为酶的催化功能所必需。周海梦等【6 5 j 的研究 表明：每个酶分予中有四个可爱应的疏基，其中二个快反应疏基是非必需基团， 而二个慢反应疏基是酶的必需基因，它们的破坏将导致酶活性的丧失。 迄今已知有1 0 0 多种酶含有功能金属锌离子，金属离子在酶中的作用可以是直 接参与底物结合或催化，也可以是只维持酶的结构，特别是酶活性部位的构象， 而这种构象是产生和维持酶活力所必需的。g i l l e s 等蛔用c 0 2 + ，m n 2 + ，n i 2 + ，c d ”重组 氨基酰讫酶，研究了这些金属重组酶酶动力学性质，测定了不同n 乙酰氨基酸傲 底物时的k m 和k 值，发现其它金属的取代对k m 值影响不大，而k 值在大约一个数 量级范围内交纯。张英侠羚7 】等的研究表明天然酶的最适p h 为7 8 左右，用m n 2 和n i 2 + 1 2 湖北工业大学硕士学位论文 取代酶中的z f + 屠最适p 礤眵至8 3 8 4 。m f + 取代了z n 2 + 后，酶的热稳定性没有明显 的改变，丽n i 2 + 取代酶的热稳定性低于原天然酶。在取代酶的重组过程中，金属离 子和脱金属酶蛋白( 印o e n z y i i l e ) 的摩尔比对酶活的影响很大，适当浓度的金属离子 有利予酶活的提高。产生这种现象不仅是由于取代酶的解离常数产生了变化，还 可能是因为在酶中存在着除活性部位以外的其它金属离子结合位点，而这种金属 离子的结合正好可能使酶( 特别是活性部位) 形成最适反应构象。 虽然氨基酰化酶i 广泛存在于各种组织中，但它的生理功能还不是很清楚。一 种观点认为，在分解代谢n 末端的乙酰化蛋白时，氨基酰化酶i 与酰基氨基酸释 放酶( a c y l a m o a c i dr e l e a s i n ge l l z y m e ，一种催化n 末端乙酰基氨基酸从肽链上释放的 酶) 结合【6 8 1 。在工业上，由于氨基酰化酶i 具有光学异构专一性，仅能水解a n 酰 基o 氨基酸生成翻由的b 氨基酸，丽不作用于它的对映体a n 酰基一d 氨基酸， 因此被广泛用来制备具有光学活性的l 型和d 型氨基酸。 1 4 3 氨基酰化酶的提取与沉淀分离 就目前而言，酶的纯化过程还是一门实验科学。酶的纯化过程一般包括以下 步骤【明：( 1 建立一个适当的测活方法；2 ) 选择含酶丰富、取材方便、经济的酶源； ( 3 ) 酶的提取；( 4 ) 酶的提纯：( 5 ) 酶的纯度检验。微生物酶有的存在于细胞内部，有 的透出细胞壁存在于细胞外部。工盈上使用的酶制翔，一般是使用量较大，纯度 不高，通常在提取过程中包括如下步骤：如果是胞内酶，首先分离收集其菌体，使 之破碎，将酶抽提至液相之中，这就是出发酶液；如果是胞外酶，它的深层发酵 液或固体培养物的抽提液就是爨发液，制取工业酶制剂的第一步就是除去出发酶 液中的悬浮固形物，获得澄清的酶液。考虑到后续步骤的经济性，一般用减压浓 缩法进行适当程度的浓缩。第二步，根据质量的要求和经济性采用适当的沉淀手 段将酶沉淀分离( 如盐析沉淀法等) 。第三步是收集沉淀，干燥，研磨成粉，加 适当的稳定剂，填充剂等，做成粉末制荆。如果是生化研究用酶，则要求特别高 的纯度，达到接近于单一蛋白的程度。要达到这一点，还必须采用精制手段如凝 胶过滤，层析，电泳，超过滤等技术【期。 1 ) 影响提取的因素 提取是在一定的条件下用一定的溶剂处理样品，使预分离的物质充分释放到 溶液中的过程，又称为抽提或萃取【”】。影响提取效果的主要因素是被提取物在所 用溶剂中溶解度的大小以及该物质向溶剂福扩散的难易。大多数酶能溶于东或稀 盐、稀碱、稀酸溶液中，因此提取时一般采水溶液提取。其中稀盐溶液和缓冲溶 1 3 湖北工业大学硕士学位论文 液对蛋自质懿溶解度大，稳定性好，在酶提取过程中誊采用。提取时要注意控制 好盐浓度、温度、p h 值等因素。 2 ) 盐析沉淀法 经提取得到的粗酶液中含有各种杂质，必须经过进一步的分离纯化，彳。能获 得纯度较高的酶。分离纯化的方法有很多，归纳起来主要有四种【7 2 】：沉淀分离、 层析分离、电泳分离和超速离心分离等，其中后三种主要用于酶蛋白的精制。沉 淀分离包括两种方法：有机沉淀法和无机沉淀法。盐析沉淀法是蛋自质和酶分离 纯化中应用最早而且至今仍广泛使用的方法。酶在水溶液中的溶解度受到溶液中 盐浓度的影响，一般在低盐浓度的情况下，酶煎溶解度随盐浓度的舞高而增加， 称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，酶的溶解度随着盐浓度的升高而减少， 结果使酶蛋白沉淀析出，郎盐析作用。在某一浓度的盐溶液中，不同酶蛋白的溶 解度也不一样，借此可到达彼此分离的目的。 1 4 4 氨基酰化酶国内外研究现状和发展动态 目前对于氨基酰化酶的研究主要集中在三个方面： 1 ) 国内外学者不断提取不同来源的氨基酰化酶，比较酶的底物专一性和固定 化载体的筛选及探讨工业化生产最适条件。 2 ) 国内对酰化酶的研究主要集中在酶的结构与功能关系，比较酶在变形过程 中构象和活力的变化等方愿，如s d s 滴定，瓢和繇溶液，s 溶液及热交往鼹氨 基酰化酶活性和构象的影响。 3 | 国外对酰化酶的研究主要集中在不阕来源氨基酰化酶酶基因克隧、序列分 析及表达。目前已报道了人体氨基酰化酶i ( h u n 逸a c 限i ) ，猪肾氨基酰化酶 i ( p o r c i n e k i d n e ya c i ) ，芽胞杆菌脂肪嗜热菌耐热型酰化酶( b a c i l l 髑 s 锨瀚也黜l o 曲i l u sa m i 瀚a c y l 弱e ) ，产碱杆菌属氧化木糖a 5 d 酰讫酶俄l c a l i g 锶鼹 x y l o s o x y d a n ss u b s p x y l o s o x y d 糊sa 一6a m i n o a c y l a s e ) 基因的克隆，序列分析和表达。 来源不同的氨基酰纯酶结构、功能相似，分子量、等电点相近，立体异构专 一性和底物专一性不同。不同来源的氨基酰化酶对带有不同种类r 基、不同长短 酰基及不同个数羧基的氨基酸活性亦不同，有的甚至只对某一种酰化氨基酸起作 用。如：动物肾脏中含有较丰富的酰化酶l 和酰化酶l l ，前者用于拆分消旋酰化单 羧基氨基酸，后者用于拆分消旋酰化二羧基氮基酸：米兰酸化酶、葡酒色青霉酰 化酶、酵母酰化酶及来源于假单胞菌中的& 怼2 9 ，k 陀2 2 ，盯8 3 的氨基酰化酶均 能水解脂肪族与芳香族酰化氨基酸；假单胞杆菌酰化酶只对n 长链酰基谷氨酸有 1 4 湖北工业大学硕士学位论文 水解作用，关于酶的结构与底物专一性的关系，还有待于继续研究。 猪肾酰化酶( 一般指酰化酶i ) 是国内外目前研究得比较多的酶，k 0 r d e lw 对于 其结构、性质做了详细的研究，张龙翔等认为其纯化方法已比较成熟。 1 5 固定化酶技术研究进展 酶是由活细胞产生的具有高效催化功能、高度专一性和高度受控性的一类特 殊蛋自质，它能特定地促成某含化学反应而本身却不参加反应，具有反应效率高， 条件温和，反应产物污染小，能耗低，反应容易控制等特点，因此得到广泛的应 用。但其在酸、碱、热及有机溶液等条件下易发生酶蛋自的交性，从而使酶活降 低或嵌失，而且酶反应多在溶液中进行，反应终了后不易回收，反应产物分离提 纯困难，且难以实现工业上的连续化、自动化生产，因此酶工程的应用发展受到 了缀大的限制。酶固定化( h m 曲i l i z 蘸雌o f 翱z y 翻e s ) 是指用固体材料将酶束缚或限 制予一定区域内，使其仍能进行本身所特有的催化反应、并可回收及重复使用的 一类技术网。与游离酶相比，固定能酶不毽可保持其高效、专一及温和的酶催纯 反应特性，并且其贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及 可控、工艺简便等一系列优点，不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科 学等学科领域得到迅速发展，两且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的 生态环境效应而符合可持续发展的战略要求【州。 1 5 1 酶的固定方法 固定化方法可以归纳为吸附法、包埋法、共价结合法、肽键结合法、交联法 等几大类【7 5 ，7 6 1 。 1 ) 吸附法 吸附法包括：使酶窟接吸附在载体上的方法称为物理吸附法。离子吸附法是 将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体结合，酶吸附予载体上较为牢固，此法 在工业上应用较广泛。 2 ) 包埋法 包埋法是将酶包埋于凝胶或其他聚合体格子内，这种结构可以防止酶渗出， 但底物能渗入格子内与酶相接触。此法的优点是适用范围广，许多种酶都可以用 此法固定，工艺简便，酶分子仅仅是被包理起来，露定化过程中酶未参与化学反 应，故可得到活力较高的固定化酶。但是，用此法制成的固定化酶，不能对大分 湖北工业大学硕士学位论文 子底物的生纯反应起催化作用。包埋法主要有凝胶包埋法，包括克聚糖凝胶、卡 拉胶凝胶、海藻酸钙凝胶和琼脂糖胶等。还有微胶囊法、辅因子微囊法等等。 3 ) 共价键结合法 共价键结合法是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法，此法研究较 为深入。此法的优点是，酶与载体的结合较为牢固，酶不易脱落，但因反应条件 较为剧烈，酶活性有所降低，且制各过程较繁琐。 ) 交联法 交联法是利用有双功能团或多功能团的试剂与酶分予之间进行分予交联的固 定化方法。交联剂有多种，最常用的是戊二醛。此法的缺点在于可能使酶活性降 低，很少单独搜用，一般与其它方法联合使羯。 l 。5 。2 各种固定化方法的比较 酶和细胞的固定化方法虽然很多，但每种方法都各肖