（材料物理与化学专业论文）蛋白质的组装及传感研究.pdf

东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 件日期：掣砌 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位 论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人 电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论 文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包 括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：烨师签名： 日 期： 摘要 纳米材料由于具有高比表面积和良好的生物兼容性，被广泛用于生物医学领域和分子器 件构建。将纳米材料用于生物传感，可以提高生物分子检测的灵敏度和选择性。本文分别利 用c d t e 量子点及z n o 纳米棒，构建了蛋白质大分子和酚类小分子的两类新型传感器，实现 了对甲胎蛋白( a f p ) 、潜伏膜蛋白( l m p 1 ) 抗原以及苯酚的超灵敏检测，具体研究内容 如下： ( 1 ) 将由量子点包裹s i 0 2 小球用于生物分子检测的信号放大实现了甲胎蛋白( a f p ) 和 潜伏膜蛋白( l m p 1 ) 抗原的超灵敏检测。s i 0 2 小球利用改进的“种子生长法”合成，得到的 小球具有良好的单分散性且粒径均一。可将a f p 和l m p - i 两种抗体通过e d c 的偶联作用 连接到s i 0 2 小球表面的量子点上，制得具有生物活性的a f p 或l m p - i 纳米免疫标记物。 s e m 测试结果表明，通过夹心免疫反应量子点包裹的s i 0 2 小球可结合到基底表面，从而实 现两种抗原灵敏检测。a f p 和l m p 1 的检测线性范围为0 0 0 5 6 0n g m l 和0 0 0 1 1 0 n g m l ，线性相关系数为0 9 9 6 和0 9 8 9 7 。由于载体s i 0 2 小球表面存在大量量子点，从而增 加了单次免疫的量子点的负载量，进而放大了由量子点产生的电化学信号，起到了提高检测 灵敏度的作用。 ( 2 ) 研究了酪氨酸酶在z n o 纳米棒表面的吸附作用及其电催化行为。酪氨酸酶是低等电 点酶，在中性溶液中，可由静电作用吸附在表面带正电的z n o 纳米棒表面。扫描电镜照片 和光谱分析证明了这种吸附行为，且吸附在z n o 纳米棒表面的酪氨酸酶仍保持了较高的生 物活性。酪氨酸酶存在时，可形成表面粗糙的，泡囊状的纳米结构薄膜，这种三维膜结构使 得k 3 f e ( c n 6 】k 4 f e ( c n 6 】的透过与电极表面的电子交换更简单，因此加快了电子传递速 率。酪氨酸酶可以催化酚和邻苯二酚的氧化，对苯酚检测的线性范围为0 0 2 0 1 出，灵敏 度为0 8 3 1 0 7 衅m m ，检测限为1 5 5 7 “m 。表观米氏常数( k 一) 为0 2 3 8 6 6m m 。对邻苯 二酚的检测线性范围为0 0 1 - - 一0 4i l m ，灵敏度为2 1 4 l 帅m ，检测限为4p m ，米氏常数 为1 7 5m m 。该方法为研究蛋白质在纳米材料的同定及其电化学性质提供了一种全新的思 路。 关键词：量子点，纳米粒子，生物传感，免疫分析，电化学 a b s t r a c t d u et ot h e i rh i i g hs p e c i f i cs u r f a c ea r e aa n dg o o db i o c o m p a t i b i l i t y , n a n o m a t e r i a l sa lew i d e l y u s e di nt h ef i e l do fb i o m e d i c i n ea n df a b r i c a t i o no fb i o m o l e c u l a rd e v i c e t h eu s eo fn a n o m a t e r i a l s i nb i o s e n s i n gc o u l di n c r e a s et h es e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t yo fb i o m o l e c u l a rd e t e c t i o n h e r e ，t w o k i n do fb i o s e n s o r sb a s e do nu t i l i z i n gt h ep r o p e r t yo fc d t eq d sa n dz n on a n o r o d sw e r ep r e s e n t e d f o ru l t r a s e n s i t i v ed e t e c t i o no fu - f e t o p r o t e i n ( a f p ) a n de p s t e i n - b a r rv i r u s - d e r i v e dl a t e n t m e m b r a n ep r o t e i n1 ( l m p 一1 ) ，r e s p e c t i v e l y ( 1 ) an o v e ls t r a t e g y t h a tm a k e su s eo ft h e p r o m i s i n ga p p l i c a t i o n so fq u a n t u md o t f u n c t i o n a l i z e dn a n o p a r t i c l e si ns i g n a la m p l i f i c a t i o nf o ru l t r a s e n s i t i v ed e t e c t i o no f b i o m a r k e r sw a s p r e s e n t e d s i 0 2n a n o p a r t i c l e sw i t hg o o dm o n o d i s p e r s i t ya n du n i f o r m l yr o u n ds t r u c t u r e sw e r e s y n t h e s i z e du s i n ga “s e e a l p a r t i c l eg r o w t h ”m e t h o d t h e s en a n o p a r t i c l e sw e r ee m p l o y e da st h e c a r r i e r sf o rq u a n t u md o t sa n da n t i b o d yi m m o b i l i z a t i o n a f po rl m p 一1 a n t i b o d y ( a n t i a f pa n d a n t i l m p l ，s e c o n d a r ya n t i b o d i e sd e n o t e da b 2 ) w a se o v a l e n t l y b i n d e dt oc d t eq d so nt h e s u r f a c eo fs i l i c an a n o p a r t i c l e si nt h ep r e s e n c eo fe d ca c t i v a t o r t h r o u g ht h e s a n d w i c h e d i m m u n o r e a c t i o n , q d s - c o a t e ds i l i c an a n o p a r t i c l el a b e l s ( s i q d a b 2 ) w e r ea t t a c h e dt ot h es u r f a c e o fc a r r i e r s t h i sw a sc o n f i r m e db yt h es e mi m a g e s t h ec a l i b r a t i o nr a n g ef o ra f pa n dl m p - l d e t e c t i o nw a sf o u n dt ob ef r o m0 0 0 5t o6 0r i g m ea n d0 0 01t o 10n g m lw i t hac o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n to fo 9 9 6a n d0 9 8 9 7 ，r e s p e c t i v e l y t h ee n h a n c e ds e n s i t i v i t yf o rd e t e c t i o no f b i o m a r k e r s b a s e do nc d t eq u a n t u md o tf u n c t i o n a l i z e ds i l i c an a n o s p h e r el a b e l sc a nb ea c h i e v e db ya ni n c r e a s e i nc d t eq d l o a d i n gp e rs a n d w i c h e di m m u n o r e a c t i o n ( 2 ) t h ea d s o r p t i o no ft y r o s i n a s eo nz n on a n o r o d sa n di t se l e c t r o c a t a l y t i cb e h a v i o r sw e r e i n v e s t i g a t e d t h em u s h r o o mt y r o s i n a s ew i t hl o w i s o e l e e t r i cp o i n tw a se x p e c t e dt oa d h e r eo nt h e p o s i t i v e l yc h a r g e ds u r f a c eo fz n o n a n o r o d sb ye l e c t r o s t a t i ca t t r a c t i o ni nan e u t r a ls o l u t i o n s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ei m a g e sa n ds p e c t r o s c o p i ca n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h ea d s o r p t i o no f t y r o s i n a s eo nz n on a n o r o d sa n dt h ea d s o r b e dt y r o s i n a s er e m a i ni t sb i o a c t i v i t yt oal a r g ee x t e n t i n t h ep r e s e n c eo ft y r o s i n a s e ，ar o u g h l ya n dc y a t h i f o r mo fn a n o s i z e dz n of i l m sw a so b t a i n e d t h i s o p e n , t h r e e d i m e n s i o n e dr a m i f o r ms t r u c t u r em a d et h ek 3 f e ( c n 6 k 4 f e ( c n 6 m o v et h r o u g h a n de x c h a n g et h ee l e c t r o nw i t hg c em o r ee a s i l y , a n dt h u sa c c e l e r a t i n gt h ee l e c t r o nt r a n s f e r b e t w e e ne l e c t r o a c t i v ek 3 f e ( c n 6 】k 4 f e ( c n 6 】a n dg c e t h ea d s o r b e dt y r o s i n a s e c o u l d c a t a l y z et h eo x i d a t i o no fp h e n o la n dc a t e c h 0 1 t h el i n e a rc o n c e n t r a t i o nr a n g e sw e r ef r o mo 0 2t o n 1 i i 目录 j 商要i a b s t r a c t i i e j录1 1 - r 第一章绪论1 1 1 蛋白质组装与传感1 1 2 蛋白质在电极上的同定1 1 2 1 静电吸附法2 1 2 2 共价键合法2 1 2 3 包埋法3 1 2 4 交联法3 1 3 免疫分析3 1 3 1 免疫分析方法4 1 3 2 电化学免疫分析中的标记物6 1 3 3 基于量子点的免疫分析7 1 4 电化学信号放大技术9 1 5 本文研究的内容1 0 参考文献12 第二章量子点包裹s i 0 2 小球纳米生物探针制各及其甲胎蛋白的超灵敏检测1 7 2 1 前言17 2 2 实验部分18 2 2 1 试剂与仪器18 2 2 2 c d t e 量子点免疫标记物的制备1 8 2 2 3f e 3 0 4 磁性纳米颗粒的制备与修饰1 9 2 2 4 铋膜工作电极的制备与使用2 l 2 2 5 电化学检测21 2 3 结果与讨论2 2 2 3 1 量子点包裹s i 0 2 小球的免疫标记物制备及表征一2 3 2 3 2f e 3 0 4 磁性小球与第一抗体的结合2 5 2 3 3 铋膜电极对量子点中c d 元素的检测2 6 2 3 4 量子点包裹s i 0 2 小球作为免疫标记物的夹心免疫电化学检测。2 8 2 3 5a f p 实际血清样品的检测3 0 2 4 本章小结。3 0 参考文献31 第三章量子点包裹s i 0 2 小球免疫标记物对潜伏膜蛋白的超灵敏检测3 3 3 1 前言。3 3 3 2 实验部分。3 4 3 2 1 试剂与仪器3 4 3 2 2a f p 传感器的制备3 4 3 2 3l m p 一1 夹心免疫电化学分析方法3 5 3 3 结果与讨论3 6 3 3 1s i q d a b 2 制备及分析3 6 i v 3 7 3 9 4 0 4 2 4 6 4 6 4 7 4 7 4 7 4 7 4 3 结果与讨论4 8 4 3 1 酪氨酸酶在z n o 纳米棒上的吸附与电子传递。4 8 4 3 2 光学分析5 1 4 3 3n a i l o n f f y r z n o 修饰电极的电化学行为5 2 4 4 本章小结。5 4 参考文献5 5 第五章总结和展望5 7 攻读硕士学位期间发表文章5 8 已申请专利5 8 至| 【谢5 9 v 1 1 蛋白质组装与传感 氧化还原蛋白质和电极之间有效的电子传递是构建各种生物传感器的关键，已受到国内 外化学家和生物化学家的广泛关注【1 1 。蛋白质与电极之间的电子传递是异相的电子传递过 程。实现生物大分子与电极之间的电子传递必须最大限度的缩短生物大分子的电化学活性中 心与电极之间的距离f 2 l ，或使生物分子与电极表面活性基团键合，以形成电子传输通道同。 但蛋白质在同体电极表面的直接组装将使蛋白质的生物活性下降甚至失去活性。 蛋白质的生物活性是由其特定的化学结构和空间结构决定的，化学结构不变，而空间结 构破坏会导致蛋白质变性或去折叠，引起蛋白质生物活性下降以至完全丧失。将蛋白质进行 化学修饰以有效地保持蛋白质的生物活性，克服蛋白质免疫原性和毒性方面的缺点，同时赋 予蛋白质一些新的优良性能，是现代医学及传感科学研究的热点。 1 2 蛋白质在电极上的固定 通过对电极表面的修饰，制成具有良好生物兼容性的界面，实现蛋白质的固定化和优异 的电催化性能。常用的电极修饰材料包括聚合物，天然高分子材料，溶胶一凝胶膜和纳米粒 子。常用的修饰方法包括静电吸附，包埋，交联和共价键合四种方法。在实验的过程中常常 将其中几种同定方法结合使用。 了广亏r 广 静电吸附 1 圆o 奄 国 共价键合 包埋 交联 图1 1 固定蛋白质的几种方法 1 2 1 静电吸附法 静电吸附主要是根据蛋白质、修饰材料和基底表面在溶液中的电性不同实现蛋白质的固 定化。w u 等1 4 1 报道了一种基于羧基纤维素与聚烯丙胺盐酸盐( p a h ) 之间的静电作用而进 行自组装的可反复更新的尿酶传感器。g o n z f i l e z - g a r c i a 等人1 5 】利用金胶标记，结合电化学方 法来研究生物素亲和素之间的作用。首先生物素化的白蛋白静电吸附在电极表面，然后与 1 0n m 直径胶体金标记的亲和素反应，发现了由金胶引起的电流响应和亲和素浓度线性相关 ( 2 5 x 1 0 - 9 2 5 x 1 0 t o o l l ) 。自从d e c h e r 等t 6 1 提出通过聚电解质层层组装技术构制超薄膜以 来，该项技术已引起了研究者们的广泛兴趣。文献已经报道了在低的蛋白质浓度和适宜的p h 条件下，一些蛋白质和聚合物静电吸附形成多层蛋白质膜u - s l 。静电吸附得到的蛋白质层在 不同的方位形成很多接触点，很大程度上保持了蛋白质的生物活性，但这种固定方法容易导 致蛋白质的低附着能力，在试验过程中可能会因缓冲溶液的冲洗而脱落。 1 2 2 共价键合法 蛋白质与基底表面以共价键结合的固定化方法称为共价键合。通常要求材料表面具有 - o h 、- c o o h 、- n h 等基团，使材料表面具有这些基团是固定化的前提条件。目前蛋白质键 合常采用的共价键合方法包括：活化羟基的溴化氢法和乙基氯甲酸酐法，活化羧基的碳二亚 胺法和活化氨基的戊二醛法，常用的偶联活化剂有氨丙基三乙氧基硅烷( a p t e s ) 等硅烷化试 剂。硅烷偶联剂由于其特殊的结构，具有能够同时与有机基团和无机基团发生反应的特征。 一般的过程是在富含- o h 的材料表面使用硅烷化试剂得到含氨基或梭基的活性表面，最后进 行生物体系的固定或使用双功能交联剂( 如戊二醛等) 形成s c h i f f 键。w a n g 及其合作者 9 1 报道 了一种基于胱胺与聚苯乙烯磺酸盐自组装的压电免疫传感器，s i n g h 等人【1o 】用s o l - g e l 方法合 成单分散性较好硅纳米颗粒，其直径为2 0n l n 或2 0 0n m 。将该纳米颗粒用于固定乙酰胆碱 脂酶，构建了有机磷农药生物传感器，结合离子敏场效应管检测，响应迅速( 1 0s ) ，灵 敏度高，对p a r a o x o n 杀虫剂的检测下限可达1x l o m o l l 。掺杂丁二炔单体可以进入两亲 性的磷脂纳米颗粒小体，在紫外照射下聚合后，形成稳定的微组装结构。在聚丁二炔的头端 修饰上具有特异识别功能的生物分子，在溶液状态下，待测分子的结合会拉动聚丁二炔纳米 颗粒的结构变化，从而产生肉眼可见的蓝红颜色变化，结合紫外检测，结果更为灵敏，该 方法有可能发展成一种简单，方便的新型智能生物传感器【1 1 - 1 2 。共价键合与基体表面的结合 牢固，不易发生脱落，但在反应过程中蛋白质的空间结构容易发生变化而导致蛋白质失活。 2 第一章绪论 1 2 3 包埋法 包埋法是将蛋白质分子截留在具有特定网状结构的半透性载体中的一种固定化方法。其 优点是蛋白质本身不参与水不溶性载体的形成，无须对蛋白质进行化学修饰，很少改变蛋白 质结构。k u n z e l m a n n 和b o t t c h e r l l 3 葡萄糖氧化酶( g o d ) 固定在二氧化硅的凝胶中，从而 对葡萄糖进行了测定。l e v 和g l e z e r l l 4 懈掺有g o d 的v 2 0 5 溶胶一凝胶膜涂在铂电极上，采用循 环伏安法对葡萄糖进行了测定。n a r a n g 等 1 5 1 对比研究了g o d 的三种固定方式即物理吸附、 掺入到t e o s 的溶胶一凝胶膜中及将g o d 夹心于两层的溶胶。凝胶膜中。包埋技术用于固定其 它的酶蛋白如辣根过氧化物酶( h r p ) 和酪氨酸酶( t y r ) 也有文献报道【幡1 7 1 。d i 等1 8 1 将超 氧化物歧化酶固定在硅p v a 溶胶凝胶薄膜，大大提高了酶的响应速率以及酶的稳定性。此 外，采用包埋技术，新型纳米材料及高聚物可用于电流型生物传感界面的构建并用于电化学 免疫分析。c u i 等【1 9 】利用硼掺杂硅纳米线( s i n w s ) ，制作了一种基于电流测量的小型、快 速、灵敏度高的实时检测生物和化学样品的传感器。s a b a h u d i n 等【2 0 i 通过电化学刻蚀和电化 学共沉淀固定化酶，制各了单根纳米铂丝生物传感器，在对葡萄糖含量的检测中背景电流低 于l 1 0 j 2a ，响应时间仅为2s ，检测下限达到2 0 州。 1 2 4 交联法 利用双功能或多功能试剂在蛋白质与载体间进行交联反应，形成网络结构的蛋白质固定 化方法称为交联法。与共价结合法一样，两者都是靠化学结合的方法使蛋白质固定化，其区 别在于交联法使用了交联剂，常用的交联剂有戊二醛、靴酸、已二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。参与交联的蛋白质功能基团有- n h 2 ，。c o o h ，s h ，o h 和酚基等，但如果蛋白质 活性中心及其附近的基团参加了反应的话，很可能导致酶活性降低和失活，所以在蛋白质的 固定化设计上要避免蛋白质活性中心附近的基团反应。将此法与吸附法或包埋法联合使用可 以达到良好的加固效果。 1 3 免疫分析 免疫分析方法的理论基础是抗体一抗原之间的特异性反应。特异性是免疫应答最重要的 特点，也是免疫学诊断与防治的理论依据。抗原和抗体间通过相互作用力，使得抗原可以被 抗体高特异性识别，形成稳定的复合物。常用的免疫分析方法为竞争免疫分析和夹心免疫分 析。竞争免疫分析可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。该方法在应用过程 3 东南大学硕士学位论文 中，抗体或抗原的一种必须过量，以保证高的灵敏度。夹心免疫分析常用于测定抗原，第一 抗体( a b l ) 往往预先固定在9 6 孔板或其他载体上，当其与待测样品( 抗原) 温育后，可将 抗原通过与抗体之间的识别反应而附着在孔板内或载体表面上。然后，洗去游离抗原，加入 已标记的第二抗体( a b 2 ，通常是酶标或放射性标记物) ，使之与载体表面捕捉到的抗原发 生第二个免疫识别反应，从而在载体表面生成夹心结合物。最后，通过检测夹心结合物上标 记物的光、电等信号强度，推算出样品中的抗原含量。此法适用于大分子抗原的检测，而不 能用于测定半抗原等小分子物质。现代免疫分析方法主要是标记免疫分析，通过特别的分析 设计引入标记物，使之成为行之有效的灵敏分析方法。 1 3 1 免疫分析方法 目前常用的免疫分析方法包括：放射免疫分析法( r a d i oi m m u n o a s s a y ，r i a ) ，固相酶联 免疫测定法( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) ，化学发光免疫测定法 ( c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y ，c l i a ) ，免疫荧光免疫分析法( f l u o r e s c e n c ei m m u n o a s s a y ， f i a ) 和电化学免疫分析( e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a y ，e c i a ) 。 放射免疫分析法又称为体外竞争放射分析，是利用放射性同位素检测技术的高灵敏度和 免疫学反应的高度特异性相结合而发展起来的一种定性和定量技术。 固相酶联免疫测定法( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 是目前应用最广泛 的免疫分析方法。 样品 洲瓣登： 斋畛薯 3 4 图1 - 2 固相酶联免疫法示意图 其原理如图1 2 所示：首先将单克隆抗体用物理吸附或共价结合的方法嫁接在固相载体 或9 6 ：f l 板上，测定时加入待测样品，样品中抗原被固相载体上的抗体捕捉到载体表面，再加 4 。- 第一章绪论 入酶标多克隆抗体，该酶标抗体与固相载体上捕捉到的抗原结合，洗去未结合的游离酶标抗 体，再加入酶的底物和显色剂，已结合在围相载体上的酶催化显色反应，反应液的颜色深浅 与结合在固相载体上的抗原量有关，利用比色的方法可测定反应液在一定波长下的吸光度， 从而计算出样品中的抗原量。 化学发光免疫测定法( c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y ，c l i a ) 以化学发光物质或催化 发光反应的酶作为免疫标记物进行测定，它结合了化学发光反应和免疫反应，既具有免疫反 应的特异性，又兼有发光反应的高灵敏性。其原理是将化学发光试剂、酶( 催化剂) 或者荧 光物质标记到抗原( 抗体) 上，通过特异性免疫反应与抗原( 抗体) 结合后，用化学发光反 应测定标记物的化学发光强度，以确定被标记的抗原( 抗体) 的量。鞠烷先课题组f 2 1 - 2 2 1 将抗 原固定于溴化氢活化的琼脂糖凝胶得到免疫亲和柱，采用流动注射分析和化学发光免疫分析 相结合的技术，在免疫反应混合物通过免疫亲和柱时，其中未结合的辣根过氧化物酶标记抗 体被免疫亲和柱捕捉而得到分离，利用流出的辣根过氧化物酶标记的抗体抗原结合物或保 留在柱上的辣根过氧化物酶标记抗体催化化学发光反应，成功发展出了两种流动注射化学发 光免疫分析方法( 图1 3 ) 。 l - 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一j 图1 3 流动注射免疫分析方法。( p ) 蠕动泵，( v ) 多通道阀，( c ) 免疫亲和柱，( p m t ) 光电倍增管，( d ) 转换卡，( p c ) 计算机，( w ) 废液 随后，利用不同酶标记不同抗体，与免疫亲和柱中相应的固定化抗原竞争免疫反应或固 定化抗体夹心免疫反应后，依次通入不同酶的底物，其间用缓冲液相隔，形成底物缓冲液底物 5 东南大学硕士学位论文 区带，分别进行不同抗原的顺序检测，可实现多组分免疫分析法。或在不同通道( 免疫亲和 柱) 内固定不同的抗原，分别通入相应的酶标抗体和样品，温育后注入化学发光底物，在光门的 辅助下分别在不同通道内可得到不同酶标抗体对应的发光信号，用于相应抗原的多组分顺序 免疫检测2 4 1 。 免疫荧光免疫分析法( f l u o r e s c e n c ei m m u n o a s s a y ，f i a ) 是以荧光物质作为标记物，与 己知的抗体( 或抗原) 结合，根据荧光的强度来测定抗原或抗体的含量。根据荧光物质的不 同性质，可以采用不同荧光分析方法。目前用于医学检验的免疫荧光测定仪器可分为三类： 时间分辨荧光免疫测定，利用时间分辨荧光测量方法可以排除样品中非特异荧光的干扰，最 大限度的提高测定方法的特异性和灵敏度。荧光偏振免疫分析，是利用荧光物质经单一波长 的偏振光照射后，能吸收光能并发射出相应的偏振荧光，其光强大小与荧光分子的大小相关， 依此而建立起来的一种定量免疫分析技术。酶联免疫荧光分析，是用荧光物质作为底物进行 酶联免疫分析的方法，只是最后用荧光计对其荧光强度进行测量，从而进行定量分析。 电化学免疫分析法( e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a y ，e c i a ) 电化学免疫分析法是用电化 学分析技术测定用作标记物的无机离子或有机功能团，或酶标记物的催化反应产物，因而， 原则上各种电化学分析技术均可以作为电化学免疫分析的检测手段。现在已用于电化学免疫 分析的电化学分析测定技术主要有离子选择性电极、安培法、极谱法、伏安法、阳极溶出伏 安法和电位溶出分析法等。伏安法和极谱法是电化学免疫分析中一种高灵敏的检测方法，常 用的技术有线性扫描伏安法( l s v ) 、微分脉冲极谱法( d p p ) 、阳极溶出伏安法( a s v ) 等。 这种方法是测定直接标记在抗原上的电活性物质如偶氮、硝基、h g ( 1 1 ) 、i n ( 1 i d 、p b 、c o 、 n i 等，或测定酶标记抗原的催化产物。 本文中的免疫分析主要采用电化学免疫分析法，首先通过夹心免疫反应将量子点标记物 结合在基底表面，多步清洗洗去基底表面上没用特异性结合的物质，以消除非特异性吸附的 影响，然后通过一个氧化还原反应，检测免疫反应所引起的电流变化。 1 3 2 电化学免疫分析中的标记物 电化学免疫分析中，需要给抗原或抗体连接一个具有氧化还原性能的标记物，以便采用 电化学方法检测。电化学免疫分析的标记物主要有两类：生物酶及电化学活性物质。 由于酶具有高效的催化能力，利用酶作为标记物可以放大信号，而且酶产物可以方便的 利用电位、电容或安培传感器测定。最常见的标记物酶是辣根过氧化物酶( h r p ) 。h r p 经 常作为典型代表用于研究过氧化物酶分子的结构，动力学和热力学性质。它的生理作用是催 化h 2 0 2 还原以及以h 2 0 2 为中问产物众多底物的单电子氧化。k e a y 和m c n e i l t 2 5 1 将抗体和 6 第一章绪论 h r p 同时同定在电极表面，当葡萄糖氧化酶标记抗原与电极表面固定的抗体结合，在葡萄 糖存在的条件下，h 2 0 2 可以通过酶通道传递剑h r p 上。本体液体中产生的h 2 0 2 通过催化 反应被分解而不能到达电极表面。由于h r p 的活性可以通过电极在5 0m v 下测定，所以结 合的葡萄糖氧化酶标记的抗原可以被定量测定出。鞠烷先课题组的众多工作也是基于h r p 标记物。例如用t i 0 2 凝胶分别同定检测癌胚抗原( c e a ) ，竞争免疫反应结合h r p 标记抗 体后，利用h r p 直接电子传递进行检测，提出了c a l 2 5 的无试剂免疫传感器【2 6 1 。将h r p 标记抗体和电子传递媒介体同时共价交联在电极表面，免疫反应结合c e a 后，酶与媒介体 作用受到空间阻碍，信号降低，提出了检测c e a 的准无试剂免疫传感矧2 7 1 。用电子传递媒 介体修饰金电极，检测包被孔夹心免疫反应后带入的h r p 标记c e a 抗体的酶活性，进行 c e a 检n t 2 8 1 。用可溶性碳纳米纤维键合c a l 2 5 抗原和硫堇，构建了c a l 2 5 的免分离免疫传 感器。被同定的酶标抗体能够有效地催化过氧化氢氧化硫堇的反应。该传感器检测c a l 2 5 的线性范围为2 0 - 7 5u m l ，检测限为1 8u m 【l 【2 9 】。用壳聚糖将h r p 标记a f p 或c e a 抗 体固定在印刷电极表面，免疫反应结合a f p 或c e a 后进行电化学检测，提出了检测a f p 或c e a 的免疫传感芯片1 3 0 l 。 用作标记物的电化学活性物质为具有电化学氧化还原性质的金属离子和电活性的有机 功能基团。金属离子通过螯合剂如二亚乙基三胺五乙酸与抗原( 抗体) 结合，经过酸化再释 放出来，可用电化学方法测定。二茂铁及其衍生物是最常用的电化学活性物质。a k r a m 等p l l 将二茂铁酸与抗体的免疫复合物同定在预处理过玻碳电极表面，对人绒毛膜促性腺激素 ( h c g ) 进行分析。v i s w a n a t h a n 等3 2 1 研制了检测c e a 的一次性电化学免疫传感器。单克隆 c e a 抗体被固定在聚乙烯包裹的多壁碳纳米管修饰的丝网印刷电极表面，c e a 抗原被捕捉 到电极表面，并与二茂铁酸标记的c e a 抗体结合。用方波伏安法测定从免疫标记物中的二 茂铁的氧化还原信号，c e a 测量的线性曲线的范围是5 l o 。6 至0 5i | g m l ，检测限为1 1 x 1 0 由 i t g m l 。 1 3 3 基于量子点的免疫分析 量子点( q u a n t u md o t s ，q d s ) ，也称半导体纳米晶( n a n o e r y s t a l s ，n c s ) ，它是由i i 一 族元素或r l l - v 族元素组成的小于1 0 0n m 的半导体纳米微晶体，当这些半导体纳米微晶体 的直径小于激子的波尔直径( - - _ _ _ _ _ - d c 鹏 图2 - 4c d t e 量子点包裹s i 0 2 小球免疫标记物制备示意图 如图2 - 4 所示，a t p s 与s i 0 2 小球表面的羟基反应后，可在s i 0 2 小球表面形成带有氨基末 端的自组装单层。c d t e 量子点1 j n a 后，迅速均匀地固定在s i 0 2 小球表面。在整个修饰过程中， 可以观察到明显的颜色变化，具有光泽的白色s i 0 2 小球在修饰c d t e 量子点后会带有c d t e 量 子点特有的橙色( 图2 - 5 左) 。同时c d t e 量子点所具有的荧光特性也并未受到影响，在k = 3 0 0 a m 下，可以观察到在5 2 4l - l m 处较强的特征吸收峰( 图2 5 右) 。 8 c 内 e 8 o w a v e l e n g t h n m 图2 - 5c d t e 量子点包裹s i 0 2 小球的荧光光谱吸收图( 右) ，c d t e 量子点包裹s i 0 2 小球连结 抗体前后颜色对比图( 左) 进一步我们利用t e m 观察c d t e 量子点在s i 0 2 小球表面的固定情况( 图2 6 ) 。从图2 6 a 和图2 - 6 b 中可以看到，种子生长法得到的s j 0 2 小球具有光洁的化学表面，粒径在2 0 0 3 0 n m ， 具有单分散性的均一的小球。当将c d t e 量子点固定在s i 0 2 小球表面后，c d t e 量子点形貌还 是具有完整性，同时可以清晰地在s i 0 2 小球表面观察到分布均匀的c d t e 量子点( 图2 6 c 、图 2 - 6 d ) 。该t e m 结果表明，该合成方法可以成功的将大量的c d t e 量子点【司定在s i 0 2 小球表 面，同时保留c d t e 量子点具有的特性，这也为将纳米级生物材料用于生物标记开辟了一条 翠1乙，y翌rb ，。曩1芦 卜南“孽 ，r一泌h乙 东南人学硕士学位论文 新的道路。 图2 - 6s i 0 2 小球及c d t e 量子点包裹s i 0 2 小球t e m 图 c d t e 量子点使用丙烯酸作为稳定剂，所以在c d t e 量子点表面引入了羧基。大量的未结 合的游离羧基可以在e d c 和n h s 的辅助下与a f p 或l m p - i 抗体上的氨基结合，从而达到抗体 修饰c d t e 量子点包裹s i 0 2 小球的目的。利用光谱分析和x 射线光电能谱仪x p s 分析我们可以 观察n s i 0 2 小球在修饰前后表面元素的变化情况，同时在t e m 中我们也可以清晰观测剑 c d t e 量子点包裹s i 0 2 小球表面的分布，由此我们可以知道免疫标记物自组装的结构及组成。 在高分辨的t e m 照片也可以发现c d t e 量子点在s i 0 2 小球分布均匀，没有明显的团聚现象。 同时c d t e 量子点自身的构型没有发生改变，这为其在标记物方面的应用提供可能。 图2 7 表明在0 0 5mp b s 溶液( p h7 0 ) 中，c d t e 量子点包裹的s i 0 2 d 、球在e d c 和n h s 的活化后，可与a f p 第二抗体通过s c h i 罐结合。在紫外可见光谱分析中，可以观察到c d t e 量子点在5 2 3n m 具有的紫外特征吸收峰，同时也可以在2 8 8n m 观察到蛋白质所具有的一个 特征强吸收峰。由此可知，实验中的唯一蛋白质试剂抗体已成功修饰在c d t e 量子点包 裹的s i 0 2 小球上。 图2 7c d t e 量子点免疫复合物紫外吸收光谱图 而修饰过a f p 抗体的c d t e 量子点包裹的s i 0 2 小球在荧光特性上却存在一定程度的荧光 猝灭( 图2 8 ) ，外观也发生变化。这可能是由于抗体在有e d c 和n h s 存在的条件下，固 定在c d t e 量子点表面，蛋白质将其部分电子空穴遮挡堵塞，进而影响了量子点的荧光特性， 故在荧光显微镜下荧光强度有所减弱。 图2 - 8s i 0 2 小球( a ) ，c d t e 量子点包裹s i o ：小球( b ) ，c d t e 量子点免疫复合物( c ) 荧光光谱图 2 3 2f e 3 0 4 磁性小球与第一抗体的结合 在f e 3 0 4 磁性小球表面修饰氨基是通过a t p s 与磁性小球表面的羟基基团相互作用后得 到的。然后利用戊二醛，将a t p 第一抗体修饰在f e 3 0 4 磁性小球表面，通过外加磁力将f e 3 0 4 磁性小球从溶液中分离出来。 2 5 5 0 01 0 0 0 1 5 0 02 0 0 0 w a v e l e n g t h n m 图2 - 9 修饰a f p 抗体的f e 3 0 4 磁性小球红外光谱图( a 抗体修饰前，b 抗体修饰后) 固定在f e 3 0 4 磁性t j 球表面的a f p 抗体可以通过红外分光光谱进行检测( 图2 - 9 ) 。a f p 抗体是一种是分子量为7 0k d a 的糖蛋白。它由5 9 1 个氨基酸残基组成的多肽链，含糖基 3 4 ，在其蛋白质二级结构中存在多糖醚的结构。在图2 - 9 中可以明显观察到表面修饰过 a f p 抗体的f e 3 0 4 磁性小球( a ) 比f e 3 0 4 磁性小球( b ) 在1 0 7 0c m - 1 处有一个明显的多糖醚键的 特征吸收峰。由此可以确定在f e 3 0 4 磁性小球表面成功固定了a f p 抗体。 2 3 3