（物理化学专业论文）造血干细胞自动磁分选仪的研制及初步应用.pdf

论文题目：造血干细胞自动磁分选仪的研制及初步应用 学科专业：物理化学 学位申请入：韩林峰 指导教师姓名：沈鹤柏教授 摘要 造血干细胞自动磁分选仪采用微型计算机和现代控制技术，通过磁性纳米粒 子与c d 3 4 单克隆抗体结合，构建磁性纳米粒子生物分子复合物。制成细胞磁分 选溶液，进行造血干细胞分离。对分离过程和管道清洗进行全程自动控制，可以 批量、安全、精确、快速地对干细胞进行分离，用于从外周血或脐带血中分离出 造血干细胞。采用该分离系统后，可以使造血干细胞分离成本成倍地降低。用于 临床后可为众多的肿瘤和免疫疾病的患者带来治疗和治愈的机会，用该分选系统 分选后，在异体p b s c t 中它可去除t 细胞，减少和减轻g v h d 发生，这种大量 细胞磁分选仪采用微型计算机和现代控制技术，对细胞分离和洗涤过程进行全程 自动控制，可以批量、安全、高效，快速地对于细胞进行分离。 本论文主要取得了以下结果t ( 1 ) 造血干细胞自动磁分选仪采用微型计算机和现代控制技术，对细胞分离和 洗涤过程进行全程自动控制。根据仪器的功能及应用，设计该仪器的硬件 系统包括磁分选系统，样品传送系统、电脑控制系统和外壳。硬件设计主 要完成了分选柱研制、管道设计、外壳设计等工作。造血干细胞自动磁分 选仪的硬件系统设计全面、实用，作为一台医疗研究仪器除了具有性能优 越，精确耐用等硬性指标外，更具备美观大方，便于操作的特色。 ( 2 ) 造血于细胞自动磁分选仪是通过电脑编程实现全自动化控割匏，电脑控制 系统可分为：电磁阀控制、磁块电机控制、蠕动泵控制，每个控制系统又 细化为几个部分。控制系统软件编程时要求对仪器运行的每一步骤有精确 的描述和表达。仪器运行分为两个大的步骤，一为系统测试昶管道润洗步 骤，该步骤有3 4 步命令，历时2 分钟；一为细胞自动分选步骤，该步骤有8 9 步命令，历时2 0 分钟。整个仪器运行状态时间为2 5 分钟左右。造血干细胞 自动磁分选仪故分选从冲洗系统薛滤器开始，然后开始标记缨跑的分选。 ( 3 ) 造血干细胞自动磁分选仪采用微型计算机和现代控制技术。实验通过磁性 l i 纳米粒子与c d 3 4 单克隆抗体结合，构建磁性纳米粒子一生物分子复合物， 制成细胞磁分选溶液。磁性纳米粒子大部分粒径都在5 0 8 0 n m ，微粒的分布 窄，是混合型包裹，里面包裹了好几个磁性纳米粒子，分散性也比较好，团 聚现象不是很严重，具有良好的超顺磁性。在造血干细胞自动磁分选仪上进 行造血干细胞分离富集，得到了较好的试验结果，经过流式细胞仪检测获得 分离纯度5 0 以上，分离效率4 0 以上，体外扩增效果良好，具备较强的 实用性。 关键词：造血干细胞自动磁分选仪；c d 3 4 ；磁性纳米粒子；脐带血 论文类型：应用基础 s u b j e c t ：t h ed e v e l o p m e n ta n dp r e l i m i n a r ya p p l i c a t i o no fh e m a t o p o i e t i cs t e m c e l la u t o m a t i cm a g n e t i cs e p a r a t i o ni n s t r u m e n t m a j o r ：p h y s i c a lc h e m i s t r y c a n d i d a t e ：h a nl i n f e n g d i r e c t e db y ：p r o f s h e nh e b a i a b s t r a c t h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l la u t o m a t i cm a g n e t i cs e p a r a t i o ni n s t r u m e n t ，w h i c hw e d e s i g na n dd e v e l o p m e n t ，u s e sm i c r o c o m p u t e ra n dm o d e mc o n t r o lt e c h n o l o g y t h r o u g ham a g n e t i cn a n o m e t e rg r a n u l ea n dt h ec d 3 4 + m o n o c l o n a la n t i b o d yu n i o nt o c o n s t r u c tt h em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sb i o l o g i c a lm o l e c u l a rc o m p l e x e s ，i tm a k e st h e m a g n e t i cc e l ls o r t i n gs o l u t i o nf o rh e m a t o p o i e t i cs t e mc e l ls e p a r a t i o n c a r r y i n go nt h e m 1 1a u t o m a t i cc o n t r o lt ot h es e p a r a t i o np r o c e s sa n dt h ep i p ec l e a n ，m a ys e p a r a t et h e s t e me e l lb a t c h ，s a f e l y ，p r e c i s e l ya n df a s t i r to r d e rt oi s o l a t es t e mc e l l sf o rt h eb l o o do l r c o r db l o o df r o mt h ei s o l a t e dh e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s u s i n gt h i ss e p a r a t i o ns y s t e m ， m a yc a u s et om a k et h ec o s to fb l o o ds t e mc e l ls e p a r a t i o nr e d u c em u l t i p l i e d c a nb e u s e di nc l i n i c a la sm a n yt u m o r sa n da u t o i m m u n ed i s e a s e si np a t i e n t sb r o u g h tt r e a t a b l e a n dc u r a b l e 。u g e 斌t h ee l e c t i o ns y s t e ma f t e rt h ee l e c t i o n ，i nw h i c hi ta l i o g e n e i ctc e l l s c a nb er e m o v e dt or e d u c eg v h do c c u r r e d s u c hl a r g em a g n e t i cc e l ls o r t i n ga d o p t s m i c r oc o m p u t e rc o n t r o la n dm o d e mt e c h n o l o g y , o nt h ec e l ls e p a r a t i o na n dw a s h i n g e n t i r ep r o c e s sc o n t r o l ，b a t c h ，s a f e ，e f f i c i e n ta n dr a p i dm e t h o dt oi s o l a t ec e l l s t h i sp a p e rm a i n l yi n c l u d e st w oa s p e c l s 髂f o l l o w s ： ( 1 ) h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l ls o r t e ra u t o m a t i c a l l yu s i n gm a g n e t i cm i c r o - c o m p u t e r s a n dm o d e mc o n t r o lt e c h n o l o g y , c e l ls e p a r a t i o na n dw a s h i n gt h ew h o l e p r o c e s sa u t o m a t i c a c c o r d i n gt ot h ef u n c t i o na n da p p l i c a t i o ng 芏e q u i p m e n t 。 d e s i g no ft h eh a r d w a r es y s t e mo ft h ea p p a r a t u s i n c l u d i n gm a g n e t i cs e p a r a t i o n s y s t e m ，t h es a m p l ed e l i v e r ys y s t e m s ，c o m p u t e rc o n t r o ls y s t e ma n ds h e l l h a r d w a r ed e s i g no ft h em a i ns e p a r a t i o nc o l u m nc o m p l e t e dd e v e l o p m e n t ， p i p e l i n ed e s i g n 。c a s i n gd e s i g na n ds 0o i l h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l ls o r t e r a u t o m a t i c a l l ym a g n e t i ch a r d w a r es y s t e md e s i g nac o m p r e h e n s i v e ，p r a c t i c a l ， a sam e d i c a lr e s e a r c h e q u i p m e n ti n a d d i t i o n t o s u p e r i o rp e r f o r m a n c e ， d u r a b i l i t ya n do t h e rh a r dt a r g e t sa c c u r a t e l y , b u ta l s oh a v e t h e e l e g a n t ， u s e r - f r i e n d l yf e a t u r e s ( 2 ) h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l ls o r t e ra u t o m a t i c a l l ym a g n e t i cc o m p u t e rp r o g r a m m i n g t h r o u g ht h ec o n t r o lo ff u l l ya u t o m a t e d ，c o m p u t e r - c o n t r o l l e ds y s t e mc a nb e d i v i d e di n t o ：c o n t r o ls o l e n o i dv a l v e ，m a g n e t i cm o t o rc o n t r o ib l o c k ，c o n t r o io f p e r i s t a l t i cp u m p ，e a c hc o n t r o ls y s t e mf o rp a n sa n d r e f i n e m e n t c o n t r o ls y s t e m s o f t w a r et or u nw h e nt h er e q u e s t e de q u i p m e n tf o re a c hs t e pa n dd e s c r i b et h e p r e c i s ee x p r e s s i o n i n s t r u m e n to p e r a t i o ni sd i v i d e di n t ot w om a j o rs t e p s ，o n e i l l f o rs y s t e mt e s t i n ga n dp i p er u nw a s h i n gs t e p s ，t h es t e pc o m m a n d s t e p st o3 4 ， s p e n d2m i n u t e s s e c o n d ，c e l l u l a ra u t o m a t af o rs o r t i n gs t e p s ，t h es t e p c o m m a n d s t e p st o8 9 ，s p e n t2 0m i n u t e s m a c h i n e sr u n n i n gt h ee n t i r et i m ei s 2 5m i n u t e s h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l ls o r t e ra u t o m a t i cm a g n e t i cs e p a r a t i o n w a s hs y s t e mf r o mt h eb e g i n n i n go fp r e - f i l t e r , a n dt h e nb e g a ns o r t i n gt h e l a b e l e dc e l l s ( 3 ) h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l ls o r t e ra u t o m a t i c a l l yu s i n gm a g n e t i cm i c r o c o m p u t e r s a n dm o d e mc o n t r o l t e c h n o l o g y e x p e r i m e n tt h r o u g h t h e m a g n e t i c n a n o p a r t i c l e sw i t hc d 3 4m o n o c l o n a la n t i b o d yw i t hm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e st o b u i l d c o m p l e xb i o l o g i c a lm o l e c u l e s ，m a d eo fm a g n e t i cc e l ls o r t i n gs o l u t i o n m o s to fm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e si nt h es i z e5 0 - 8 0 h m ，n a r r o wd i s t r i b u t i o no f p a r t i c l e s i sah y b r i dp a c k a g e ，w h i c h p a c k a g e s an u m b e ro f m a g n e t i c n a n o p a r t i c l e s ，d i s p e r s i o na l s ob e t t e rr e u n i o np h e n o m e n o ni sn o tv e r ys e r i o u s ，a g o o ds u p e r - p a r a m a g n e t i c h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l si nt h ea u t o m a t i cm a g n e t i c s e p a r a t i o na p p a r a t u sf o rs e p a r a t i o na n de n r i c h m e n to fh e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s ， h a v eb e e nab e t t e rt e s tr e s u l t s ，a f t e rt h es e p a r a t i o nb yf l o wc y t o m e t r yt oo b t a i n m o r et h a n5 0 p u r i t y , m o 咒t h a n4 0 s e p a r a t i o ne f f i c i e n c y , g o o de f f e c ti n v i t r oa m p l i f i c a t i o nw i t hm o r ep r a c t i c a l k e yw o r d s ：h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l la u t o m a t i cm a g n e t i cs e p a r a t i o ne q u i p m e n t ； c d 3 4 ；m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ；c o r db l o o d p a p e rt y p e ：a p p l i c a t i o ni n f r a s t r u c t u r e i v 上海师范大学硕士学位论文论文独创性声明、论文使用授权声明 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他入或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 名巧辛卿呷孙字目 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名玛幸讯舡燧名：m 嗍吼沙7 多，孑 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 研究意义 自2 0 世纪8 0 年代起，造血干细胞移植成为恶性肿瘤( 如一些恶性血液病和 实体瘤等) 大剂量放疗、化疗后造血支持治疗的主要措施。有了造血干细胞移植 的支持，临床医生就可以使用超大剂量的放射线摧毁患者体内造血和免疫系统， 然后植入造血干细胞，重建造血和免疫系统，提高了恶性肿瘤的治疗效果和病人 的生存期。由于成人体内造血干细胞主要存在于骨髓中，因此最初最多是对骨髓 来源的造血干细胞进行移植。后来动员的外周血成为造血干细胞移植的另一来 源。与骨髓移植相比，外周血干细胞移植具有几个显著的优点，如采集方便、造 血功能重建快、免疫功能恢复早、并发症轻等。1 9 8 8 年，第一例应用人类脐带 血移植治疗凡科尼贫血症的成功开创了人类脐带血移植的先河。脐带血含有丰富 的造血干细胞祖细胞，并且其免疫细胞的抗原性较弱，移植相关的移植物抗宿 主病( g v h d ) 相对骨髓和外周血发生较低、严重程度较弱，因此被认为是极具潜 力的继骨髓和外周血后的第三种造血干细胞的来源。随着同胞问脐带血移植的发 展，人们又把目光转移到非血缘脐带血移植上来，其前提是建立脐带血库。2 0 0 5 年6 月4 日青年报报导了上海市脐带血采集重新启动。脐带血造血干细胞是用来 根治白血病的有效手段，据统计，我国白血病患者以每年十万分之四的速度增长， 每年新发病的患者就达4 万一5 万人，其中少年儿童占5 0 。虽然造血干细胞捐 献者资料库的入库人数已经达到了2 6 万人，但还是远远满足不了白血病患者移 植的需求c 。 进行造血干细胞移植翦首先必须对干细胞进行分离纯化，其目的在于：在异 体外周血干细胞移植( p b s c t ) 中它可去除t 细胞，减少和减轻g v h d 发生，尤其 是提高了供受者2 - 3 个人类白细胞抗原( h l a ) 相合配型位点；在自体p b s c t 中 它可净化残留肿瘤细胞丽减少移植后的复发；对难治性自身免疫性疾病可经干细 胞纯化除去异常免疫细胞；同时经纯化后可以提高干细胞体外扩增及基因转导的 效率等。最初分离富集造血干细胞的方法是依据造血干细胞具有细胞体积小，浮 力密度低等物理学特性。采用包括速度离心沉淀，密度梯度离心以及后来的逆流 离心淘洗等技术进行分离。七十年代中后期流式细胞分析及分选技术和单克隆抗 第一章文献综述上海师范人学硕士学位论文 体的出现和发展，使细胞分离技术出现了质的飞跃。应用单克隆抗体荧光染色与 流式细胞分选相结合的荧光激活细胞分选技术极大地提高了细胞分离纯化的效 率，使得高效快速分离纯化一些含量极少的细胞群成为可能。但由于流式分选不 能保证分离过程完全无菌，因此分离得到的 造血干细胞很难应用于体外培养等后续的 实验。近年出现的免疫磁珠细胞分离技术， 进一步简化了分离的程序并提高了分离效 率，目前正在逐步替代离心分选、流式分选 等传统的细胞分离技术。本项目将磁珠的粒 径由微米级缩小至纳米级，制备出磁性纳米 粒子用于细胞分离。其分离原理是在磁性纳 米粒子表面修饰着能识别、结合细胞的生物 ：。上，粒。 强孙黼 “y 。_ m n 畸 圈1 一l 造血干细胞磁分选原理图 分子。构成磁性纳米粒子生物分子复合物。用该复合物去捕获目标细胞，再在 外磁场作用下将目标细胞阻留实现分离( 见图卜1 ) 。该技术将免疫磁珠技术中 磁珠的粒径缩小到5 0 n m 左右，使其具有超顺磁性和巨大的表面积，可以大大提 高分离效率和分离速度，而且确保分离细胞的生物活性，分离效率达9 0 以上 纯度达9 5 以上，分离出的造血干细胞经体外培养，证明有很强的扩增能力。 该免疫磁性纳米粒子细胞分离技术已进入世界先进水平行列“。 国外m i l t e n y i 公司根据免疫磁珠分离原理开发了细胞分选仪c 1 i n i m a c s 能 够在密闭系统内无菌地分选大量细胞( 分选细胞个数可达l o “个) 。c 1j n i m a c s 经欧洲的临床实践证实，可以提供高纯度和回收率的c d 3 4 + 细胞，是目前临床应 用较理想和广泛的细胞分选系统之一，也是目前在中国唯一获准临床应用的分选 系统。其主要特性是自动、省时、安全、有效。整个过程在完全密闭系统中进行， 采用无菌、无致热原的液体通道，避免污染，易于操作，所用结合于c d 3 4 抗体 的超顺磁铁一葡聚糖微球体积微小，不需要外加酶降解，也不影响细胞的活力和 功能。分选后，c d 3 4 + 细胞的纯度和回收率皆分别在9 5 和6 7 以上，t 细胞去除 率在9 5 以上。分选得到的细胞可以直接进行细胞的移植和输注。临床移植后所 有移植物皆较快植活，且在未给预防g v h d 的情况下移植也是安全的。同时，由 于有效的去除了b 细胞，也预防了e b 病毒相关的淋巴增生性疾病的发生。但 c 1 i n i m a c s 根昂贵，使普通病人无法使用。目前国内尚无厂家生产此类仪器，因 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 此迫切需要研发造血干细胞自动磁分选仪n 仉1 。 造血干细胞自动磁分选仪的研制成功将可得到大量高纯度的目标细胞，作为 体外培养和临床应用的细胞源。造血干细胞移植的临床应用将给众多的肿瘤和免 疫性缺陷性疾病的患者带来缓解和治愈的机会，在分子生物学，细胞学，临床诊 断及医疗等领域也有着非常广泛的应用，具有巨大的社会效益和经济效益。 1 2 磁性高分子微球的研究进展 1 2 1 磁性高分子微球的结构和性质 磁性高分子微球的结构与其制备方法有关，一般有三种类型。即：核壳型、 壳核型和壳核壳型【1 2 1 。 o 擅一震墨琵一援墨琵一撮一党搿 0 离分予辅斟；一翻胜村杩 图1 2 各种核壳型结构图 核壳型是由磁性材料组成核，高分子材料组成壳层：壳核型是由高分子材料 为核，磁性材料料为壳层，壳核壳型结构的外层和内层为高分子材料，中间为 磁性材料。其中磁性材料指具有导向性的磁性的金属氧化物，通常的无机磁性材 料主要包括铁、钴、镍、锰分离及其合金、氧化物和稀土金属永磁材料等，高分 子则是具有亲和性的、携带有多种反应性功能基的天然高分子，如壳聚糖、纤维 素、琼脂、淀粉、乳清蛋白、牛血清白蛋白和磷脂等，及合成高分子材料如聚丙 烯酞胺、聚丙烯酸、聚苯乙烯和聚乙二醇等。磁性高分子微球由于其特有的磁性 性质，具有在外加磁场下进行可控运动的特点，从而使其在生物活性物质的富集、 药物运输和定向治疗等方面具有巨大的应用潜力。由于壳层为具有多种功能基的 高分子，这种粒子还可通过表面改性，在其表面修饰上多种反应性功能基团 ( 如：o h ，c o o h ，c o h ，n h 2 , - s h 等) ，利用功能化磁性纳米粒子的表面配体与受 体之间的特异相互作用来实现对靶向生物目标的快速分离。目前，磁分离方法已 广泛地用于细胞、蛋白质、核酸和酶等多种生物物质的分离与纯化【1 3 。1 6 1 。 高分子磁性微球纳米粒子处在原子簇与宏观物质交界的过渡区域，是一种典 3 第一章文献综述 上海师范大学硕士学位论文 型的介观系统。纳米粒子由于其尺度与特质的的许多特征长度，主要有以下特性 1 ) 表面效应是指纳米粒子的表面原子数与总原子数之比随着粒径变小而急剧 增大，表面原子的晶体场环境和结合能与内部原子的不同，具有很大的化学活性， 其表面能大大增加。球形颗粒的比表面积( 表面积体积= 3 r ) 与半径成反比，随 着颗粒直径变小，比表面积将会显著增加【1 7 - 2 0 l 。 颗粒直径, i i u i # l p5 p1 0 j1 0 0 p 原子总数? 个一 粥1 1 0 3 3 , - , 1 0 4 3 -1 0 6 , , ；表面原子所占比例，o 神 9 9 p4 0 3 2 0 p2 p 表1 1 超微颗粒表面原子所占比例与颗粒直径关系 可见对于直径大于l o o n m 的颗粒，表面效应可以忽略不计。当尺寸小于l o o n m 时，其表面原子所占的比例急剧增长，这时的表面效应将不容忽略。当颗粒直径 降至1 l n m 时，表面原子数比例将达到9 9 以上，原子几乎全部集中到纳米粒子表 面。由于纳米粒子的表面原子数增多以及表面原子配位数不足和高的表面能，使 这些原子易与其他原子相结合而稳定下来，故有很高的化学活性。 体积效应：是由于超细微粒包含的原子数减少使带电能级加大，从而使物质 的一些物理性质因能级间歇的不连续而发生异常【2 1 , 2 2 。 上述两种效应可具体表现为比表面激增，微球官能团密度及选择性吸附能力 变大，达到吸附平衡的时间大大缩短，粒子的稳定性大大提高。 3 1 磁效应：具有磁性可使生物高分子微球在外加磁场作用下方便地进行分离和 磁导向。当磁性f e 2 0 3 晶体直径小于3 0 h m 时，具有超顺磁性，即在磁场中有较强 磁性，没有磁场时磁性很快消失，从而使生物高分子微球能够在磁场中不被永久 磁化。 钔生物相容性：磁性微球在生物工程，特别是在生物医学工程中应用时，有一 个重要方面就是要有生物相容性。多数生物高分子如多聚糖、蛋白质类具有良好 的生物相容性。它们在人体内安全无毒，可降解，不与人体组织器官产生免疫原 性，这种性质在靶向药物中尤其重要瞄- 2 5 1 。 5 ) 功能基特性：生物高分子有多种反应活性功能基团，如o h c o o h 。n h 2 ， 可连接具有生物活性的物质，如免疫蛋白，生物酶等【矧。 4 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 1 2 2 磁性高分子微球的制备 制备高分子磁性微球的方法可分( 王) 先制备磁性纳米粒子，然后在对其进 行表面修饰，制备核壳型的磁性高分子微球如包埋法、聚合法( 2 ) 首先制得致 密或多孔聚合物微球，此微球含有可结合铁、钻、镍、锰等金属离子的基团，随 后依靠高分子在金属盐溶液中的溶胀以及功能基团与金属离子的作用来制备磁 性高分子微球，如活化溶涨法【2 7 ，2 8 】。 1 。磁性纳米粒子的制备 在磁性纳米粒子的选择及制备过程中，要充分考虑到作为磁核的粒子的磁性 强弱、粒径大小及表面性能等特点。综合细胞毒性、稳定性【1 3 l 及磁化强度各方面 的因素，虽然氧化铁的比饱和磁化强度较低，但是由于其良好的氧化稳性和较低 的毒性，常被用来选作磁性高分子微球中的磁核，在许多领域具有非常好的应用 前景。目前，用得最多的氧化铁是f c 3 0 4 和f e 2 0 3 。 磁性纳米粒子的制各方法有物理法、生物法以及化学法。物理法最主要以机 械球磨为代表，但是由于得到的粒子粒径分布较宽，时间较长，不适用于生物医 用方面。生物法与物理法相比，生物法制得的纳米粒子体现出更明显的优势，尤 其是生物相容性方面。而且磁性纳米粒子广泛存在于各种生物体如细菌( 球菌、 螺菌等) 以及蚂蚁、蜜蜂、鸽子等体内，但该方法细菌培养困难，粒子提取过程 十分烦琐。目前磁性纳米粒子的制备主要依赖于化学法。磁性纳米粒子的化学制 备方法又可分为均相制备法和非均相制备方法，前者主要包括共沉淀法和高温分 解法，后者有微乳液法、溶胶凝胶法、超声化学法、水热法、激光分解法和电 化学沉淀法等【2 9 3 2 1 。 在均相体系中，纳米粒子的形成过程主要包括成核过程和生长过程。在非均 相体系中，由于有反应微区，所以粒子的生长过程不仅受到其自身生长动力学的 控制，还同时受反应微区性质的控制。 在均相制备法制备纳米粒子的过程中，一般可以采用图1 3 所示的l a m e # 成 核扩散控制模型实现对纳米粒子单分散性的控制1 3 3 矧。 第一章文献综述上海师范大学硕士学位论文 t 。 皇 量 堇 8 暑 曼 赛 s u p e r s a t m - a l i o n 厂f 一、。、 。n 一、crr以owth ， ii f ；i l - l t i t a 露_ 图1 - 3 均相反应体系制备纳米颗粒的过程，i 代表l a m e r 模式，i i i 代表其他模式 在均相反应体系中，纳米粒子的形成过程主要包括两个过程：( 1 ) 成核过程， 当反应物或反应中间物的浓度达到临界值时，便形成晶核；( 2 ) 生长过程，通过 反应物或反应中间物向晶核表面的扩散与吸附，晶核逐渐长大直到最终颗粒。这 两个过程通常强烈的依赖于反应体系中组成粒子物质的浓度和溶解度的差值。根 据该模式，要得到单一分布的颗粒，其晶核的形成与长大过程必须分开，且在晶 核的长大过程，尽量避免更多的晶核形成。但也有部分科学家提出，除l a m e r 模 式，还应存在i i 、i 两种路径，即晶核间也可以通过互相碰撞长大成更大的颗粒， 而不是单纯的依靠反应物或反应中间物向晶核表面的扩散与吸附使得晶核长大。 共沉淀法是通过水溶液中同时水解不同价离子的方法实现磁性纳米粒子的 制备【3 5 。3 8 】。将摩尔比为2 ：1 的三价铁盐与二价铁盐混合溶液直接加到强碱性的 水溶液中，铁盐在强碱性水溶液中瞬间水解、结晶，形成f e 3 0 4 微粒，主要形成 机理为：2 f e 3 + + f e 2 + + 8 0 h - - f e 3 0 4 + 4 h 2 0 【5 3 1 。其主要特点是：对设备的要求低， 反应可以在较温和的条件下进行，所用的原材料为廉价的无机盐，工艺流程简单， 完善后易于扩大到工业化生产，且反应过程中成核容易控制，反应产物纯度高， 粒子分散性比较好。然而由于铁在自然界中存在近1 5 种氧化物和氢氧化物，而 且相互之间很容易转化，因此在水溶液中通过水解二价或三价铁离子的方法来制 备磁性纳米粒子，其产物组成的控制是该方法面临的重要问题之一，即便在制备 过程中严格控制反应体系的温度、p h 值、粒子强度、粒子强度，所得产物的表 面结构也往往是铁氧化物和铁氢氧化物的混合物【3 9 , 4 0 1 。 高温分解法是通过在高沸点有机溶剂中加热分解有机金属化合物如 f e ( a c a c ) 3 、f e ( c o ) 5 、c o ：( c o ) s 、f e c u p 3 ( a c a c ) 、c u p 分别指乙酰丙酮与- 亚硝基 6 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 苯胲) 等来制备纳米粒子的一种方法【4 。通常可以采用两种投料方式来制备直径 均一的纳米粒子：一种方式是将反应原料快速注入到含有表面活性剂的高温溶剂 中实现纳米粒子的快速成核，再通过对反应温度和时间的控制得到不同尺寸、同 时具有窄粒度分布的纳米粒子；另一种方式是将反应原料在低温条件下预先混 合，然后缓慢加热至反应开始，在粒子生产过程中通过不断补加反应原料来维持 体系中恒定的过饱和浓度，最后得到窄粒度分布的纳米粒子。经过尺寸选择性处 理粒径分布可减小到5 左右。因此，高温分解法制备的磁性纳米粒子具有粒度 分布窄，尺寸和形貌可控等特点【5 7 拍】。如w o o 等采用在连续通风的条件下热分解 f e ( c o ) 5 制得平均粒径大小为1 1 n m 的氧化铁纳米粒- - 。t 1 8 1 。g a o 等f 2 1 】借鉴了最新发 展的磁性纳米晶体高温热分解制备方法，通过选用高沸点的强极性溶剂a 吡咯烷 酮作为反应传热介质，成功地通过一步反应制各出具有高结晶度和高磁学性能的 水溶性磁性f c 3 0 4 纳米晶体。随后，又进一步将反应原料从昂贵的、高毒性的有 机金属铁盐扩展到廉价无毒的f c c i y 6 h 2 0 ，不仅成功地得到了尺寸形貌可控的磁 性纳米晶体材料，还深入探索了以f e c l 3 6 h 2 0 为单一原料制备f e 3 0 4 纳米晶体的 机理。该研究不仅具有重要的科学意义，同时也为高质量的磁性纳米晶体提供了 简便的制各方法，从而为磁性纳米晶体材料在生物医学领域的应用提供了更广泛 的前景【4 2 4 3 l 。 微乳液和反相胶束法是利用水、油和表面活性剂三元体系形成的微乳液或反 相胶束最为反应场所制备纳米粒子的方法。表面活性剂一方面可以有效地阻止纳 米粒子的聚集和进一步生长，从而实现对纳米尺寸的有效控制；另一方面可以为 粒子提供可溶解性或可分散性【4 叼。用这种方法制备的粒子在粒子的尺寸分布及其 形貌控制方面体现出了一定的优势，但所得到的粒子往往在结晶度和磁响应性等 方面还有待于提高，这主要是由于这一制备方法所采用的反应温度比较低而造成 的。 超声化学法是利用超声波的空化作用瞬间产生的高温( 5 0 0 0 k ) 、高压 ( 2 0 m p a ) 以及极高的冷却速率等极端条件促使氧化、还原、分解和水解等反应得 进行来制备纳米粒子【6 7 , 醴】。尽管超声花絮法操作简便，但由于其是非均相反应方 法，粒子的成核和生长过程受活性物种的生成和扩散等因素的影响，因此该方法 在纳米粒子的尺寸和形貌控制方面仍有待于迸一步提高。本实验室在磁性纳米粒 子的制备方面采用的是经典的化学共沉淀法1 4 5 4 7 】。 7 第一章文献综述 上海师范人学硕十学位论文 2 磁性高分子微球的制备 1 _ ) 包埋法 共混包埋法是研究制备磁性高分子微球最早的一类方法，该方法是将磁性粒 子分散于天然或合成的高分子溶液中，并通过雾化、沉积、蒸发等物理手段制备 得到具有磁响应性、具有一定粒径范围的磁性微球。包埋法主要通过范德华力、 氢键、配位键或共价键等作用，使得高分子链缠绕在磁性颗粒表面，形成聚合物 包被，得到磁性微球【镐1 。 d e k k e r t 4 9 】将磁性粒子悬浮于聚乙烯亚胺( p e i ) 溶液中，通过过滤，干燥处理 得到外包p e i 的磁性微球。c u y p e r - 等 5 0 1 用卵磷脂包埋纳米磁性粒子，制得磁性脂 质体微球，g u p t a 掣5 1 】将磁性粒子与牛血清清蛋白和棉籽油进行超声处理，然后 加热至1 0 5 1 5 0 ，得到外包牛血清清蛋白的磁性微球。 劲聚合法 单体聚合法是在无机纳米粒子和单体存在下，加入引发剂、稳定剂等聚合而 成的核壳结构复合微球。该法得到的高分子微球磁响应性强、粒径均一、粒子 表面有丰富的活性功能团。主要方法有悬浮聚刽5 2 1 、分散聚合、乳液聚合【7 2 捌、 微乳液聚合等，采用不同的聚合方法，可制备不同粒径的磁性微球。 悬浮聚合是通过将磁性粒子直接分敖于含有聚合物单体、稳定剂、引发剂等 的混合体系中进行聚合反应。磁性物质均匀地分布于复合微球。阳承利等以甲基 丙烯酸甲酯( m m a ) 为聚合单体，二乙烯苯( d v b ) 为交联剂，过氧化苯甲酰( b p o ) 为引发剂，聚乙烯醇( p v a ) 为稳定剂，采用喷流式悬浮聚合法制备了磁性聚甲基 丙烯酸甲酯( p m m a ) 微球。粒子大小比较均匀，在l o u m 左右。但是由于在反应过 程中，经常采用机械搅拌的方法将液滴进行分散，因而得到的粒子粒径一般在 2 0 0 u m l 5 3 j 4 】以上，在生化研究领域的应用十分有限。 超声波和分散剂是减小单体和液滴尺寸的有效手段。通过在悬浮聚合前期在 反应体系中引入分散剂和超声波预处理分散单休，使单体形成微小的液滴，以便 在聚合反应中得到微米级的微球。万惠文等【5 5 巧7 1 利用磁粉、s t ，d v b 为原料，p v a 为分散剂，采用悬浮聚合法和超声波技术相结合，合成粒径为1 u r n 左右的微球。 乳液聚合法是将磁性粒子分散到含有聚合物的溶剂中进行聚合反应。通常以 磁性粒子为活性中心进行聚合。s o l e l 7 9 1 在分散有磁性粒子的水相体系中乳化单 体，得到稳定的乳化体系，然后应用聚合得到了胶体尺寸的疏水磁性高分子微球。 8 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 邱广明等1 5 8 l 利用乳液聚合法，制备出单分散的亚微米级磁性微球，研究了分散介 质、单体、种子粒子及p h 调节剂等因素对聚合行为和磁性微球影响。并且对乳 液聚合法进行了改进，采用先吸附后溶胀的方法，在磁性微粒表面形成良好的聚 合环境，得到了单分散性好，又具有良好机械稳定性和耐酸性的磁性高分子微球。 微乳液和反相胶束法是利用水、油和表面活性剂三元体系形成的微乳液或反 相胶束最为反应场所制备纳米粒子的方法。表面活性剂一方面可以有效地阻止纳 米粒子的聚集和进一步生长，从而实现对纳米尺寸的有效控制；另一方面可以为 粒子提供可溶解性或可分散性。用这种方法制备的粒子在粒子的尺寸分布及其形 貌控制方面体现出了一定的优势，但所得到的粒子往往在结晶度和磁响应性等方 面还有待于提高，这主要是由于这一制备方法所采用的反应温度比较低而造成 的。d r e s c o 5 9 】等利用反相微乳液聚合法，合成了甲基丙烯酸、羟甲基丙烯酸包裹 的水溶性磁性微球，通过调节单体浓度、水表面活性剂的比例，得到的微球粒 径为8 0 - - 3 2 0n l n 。d a n i e l 删将f e 3 0 4 ( d = 1 0 n m ) 用烃油处理，在乳化剂存在下进行 乳液聚合，得到粒径小于1 0 0 r i m 的聚苯乙烯磁性微球。 3 ) 活化溶胀法 该方法通常是先将用种子聚合等技术制备的单分散大孔聚苯乙烯高分子微 球进行孔内外磺化( - s 0 3 ) 或硝化( - n 0 2 ) 处理以使其具有亲水性界面，然后浸泡于 铁盐水溶液中，使聚合物微球在铁盐溶液中溶胀、渗透，在适当的反应条件下升 高p h 值，使超顺磁性f e 3 0 4 或y f e 2 0 3 在孔内合成，渗透和转化步骤可重复进行直 到合适的磁含量，最后选用一种含活性功能基团的单体对微球进行溶胀、聚合、 包被，使微球孔道封闭，表面功能化，在适当的温度和p h 值下，用铁盐在网状 聚苯乙烯微粒的内部沉淀出铁氧粒子，得到粒径较小磁性微球【6 1 ，6 2 1 。 总之，割各磁性壳聚糖微球的方法多种多样，丽效果则可以概括为以下凡个 方面：( 1 ) 调解和改变粒子的溶解和可分散性；( 2 ) 为粒子提供表面功能性；( 3 ) 赋予磁性粒子特殊的物理化学性质；( 4 ) 提高粒子的稳定性和抗氧化性及其胶体 溶液的稳定性。制备高分子磁性粒子具有重要的科学意义和实际应用价值，在今 后相当长的一段时间内它将是磁性纳米材料研究领域的热点和难点问题之一。本 实验中，制备了壳聚糖包裹的磁性纳米粒子，其效果可以归结为以下几点( 1 ) 可 以屏蔽磁性纳米之间的偶极相互作用，阻止粒子发生团聚；( 2 ) 具有优良的生物 相容性、亲水性以及非常好的稳定性；( 3 ) 壳聚糖分子中自带的活性氨基和羟基 9 第一章文献综述上海师范火学硕士学位论文 为其在生物医学中的应用提供了重要保障【6 3 侧。 1 3 磁性高分子微球在生物医学中的应用 磁性载体在生物医学和生物技术的许多领域都得到了广泛的应用并展现出 广阔的应用前景，具体体现在蛋白质和核酸的分离和纯化、靶向药物、固定化酶、 细胞分离和标记、磁共振成像( m r d 等多个方面。 1 3 1 蛋白质和核酸的分离和纯化 蛋白质和核酸的分离是生物技术中一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还 没有一种成熟和完善的可以把任一组分从复杂生物混合体系中分离出来的方法。 对d n a 而言，通常采用的分离手段包括超速离心和电泳，电泳方法中可分为琼 脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳。虽然电泳的方法在碱基对少 于1 k b p 的短链d n a 的分析和分离方面已经取得了巨大的成功，但对于碱基对大 于l k b p 的长链d n a ，传统的电泳的方法就显得无能为力了。传统的蛋白质分离 方法一般是通过改变p h 值、温度、离子强度等因素来达到分离的目的，分离过 程繁杂且损失大。以磁性微球为固相介质对蛋白质纯化是一项新兴的蛋白质分离 技术，它是通过对磁性微球表面改性，共价结合能被目标蛋白质识别和可逆结合 的