（农产品加工及贮藏工程专业论文）钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的提取分离及稳定性研究.pdf

江苏大学硕士学位论文 摘要 钝顶螺旋藻是属蓝藻门( c y a n o p h y t a ) 、蓝藻纲( c y a n o p h y c e a 园、颤藻目 ( o s c i l l a t o r i a l e s ) 、颤藻科( o s c i i l a t o r i a c e a e ) 、螺旋藻属( 助加，脚中的 一种古老的原核生物( p r o k a r y o t e ) 。钝顶螺旋藻( s p j 川j j 朋p a t e n s e s ) 中藻 蓝蛋白含量高达1 0 左右，是一种藻蓝蛋白含量较高的藻类品种。藻蓝蛋白 ( p h y c o c y a n i n ) 是藻类中的一种具有重要生理活性的色素蛋白，常用于药物和食 品领域。本文研究了钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的提取分离及其稳定性等问题。 作者用超临界c o ：萃取技术对钝顶螺旋藻干粉进行了脱脂处理，以藻蓝蛋白 的提取率为指标，对冻融提取法和超声辅助提取法进行了比较研究：以藻蓝蛋 白的纯度和回收率为指标，采用盐析法、柱层析和膜分离的方法对藻蓝蛋白进 行了分离纯化研究，并用s d s - p a g e 和排阻色谱法对其分子量进行了测定，最后 对藻蓝蛋白的稳定性进行了研究。 提取试验表明：超临界c o ：处理不仅能脱除脂肪，而且能够提高藻蓝蛋白的 提取效率；冻融法提取藻蓝蛋白的最优工艺参数为：料液比1 ：2 2 ( g m l ) ，提 取温度3 5 ，提取时间2 5 h ：藻蓝蛋白的提取率为3 1 9 。超声辅助提取的最 优工艺参数为：超声全程时间9 0 m i n ，超声功率1 4 0 0 w ，超声发出时间6 s ，间 隙时间9 s ，循环泵1 2 r s ；藻蓝蛋白的提取率为1 3 5 。其提取率远远高于冻 融提取法。 纯化试验表明，硫酸铵盐析法分离纯化藻蓝蛋白的最佳工艺条件是：首先 用饱和度2 0 的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再用饱和度7 0 的硫酸铵沉淀藻蓝蛋 白，所得藻蓝蛋白的纯度( & 加a ：舳) 为1 4 7 ，回收率达9 8 1 。d e a e 一5 2 纤维 素柱纯化藻蓝蛋白，所得藻蓝蛋白的纯度为1 8 7 ；回收率为5 7 9 。 s e p h a d e x g - 2 0 0 纯化藻蓝蛋白，所得藻蓝蛋白的纯度为1 0 4 ，回收率为 6 4 9 。羟基磷灰石纯化藻蓝蛋白，所得藻蓝蛋白的纯度为2 8 3 ，回收率为 6 2 3 。两次d e a e - 5 2 纤维素柱纯化藻蓝蛋白，所得藻蓝蛋白的纯度为3 8 3 ， 回收率为3 6 9 。两次s e p h a d e x g - 2 0 0 纯化藻蓝蛋白，所得藻蓝蛋白的纯度为 3 0 7 ，回收率为4 9 5 。两次羟基磷灰石纯化后所得藻蓝蛋白纯度为4 2 1 ，回 收率为3 8 1 。膜分离法所得藻蓝蛋白的纯度为0 9 l 。 江苏大学硕士学位论文 s d s p a g e 法测得藻蓝蛋白的分子量为4 00 0 0 d a ，排阻色谱法测得藻蓝蛋白 的分子量为4 32 0 0 d a 。 稳定性试验表明：温度、酸碱度和乙醇对藻蓝蛋白稳定性有较大影响。 n a c l 、苯甲酸钠、柠檬酸等对其稳定性影响较小。钠离子、钾离子和镁离子对 藻蓝蛋白的稳定性影响较小；钙离子、锌离子、铜离子和铁离子对其稳定性影 响较大。5 葡萄糖和蔗糖溶液都会使藻蓝蛋白的吸光值发生不同程度的降低： 当溶液中维生素c 的浓度为0 4 m g m l 以下时，藻蓝蛋白较稳定。 综上，本试验为不同级别藻蓝蛋白的生产和应用提供了一套切实可行的方 法和工艺参数。 关键词：藻蓝蛋白：提取；纯化；稳定性 l i 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t s p i r u l i n ap l a t e n s i si s a na r c h a i cp r o k a r y o t ew h i c hb e l o n g st oc y a n o p h y t a p h y l u m ，o s c i l l a t o r i a c e a ef a m i l y t h ep h y c o c y a n i ni nt h es p i r u l i n ap l a t e n s i sr e a c h a r o u n dt e np e r c e n t s ，i ti so n eo ft h ea l g a e s 谢t l lm u c hp h y c o c y a n i n p h y c o c y a n i ni sa l ( i n do fp h y s i o l o g i c a la c t i v ep i g m e n tp r o t e i n i ti su s u a l l yt ob eu s e di nm e d i c a t i o na n d f o o df i e l d s i nt h et e s tt h ea u t h o rs t u d i e dt h ee x t r a c t i o n ，s e p a r a t i o n ，p u r i f i c a t i o na n d t h es t a b i l i t yo fp h y c o c y a n i n a tf i r s tt h ea u t h o rp r e t r e a t e dt h ed r yp h y c o c y a n i np o w d e rb ys c f e c 0 2 w i t h t h ee x t r a c t i o nr a t i oo fp h y c o c y a n i n ，r e p e a t e df r e e z i n ga n dt h a w i n gm e t h o da n d u l t r a s o n i ca s s i s t a n te x t r a c t i o nw a ss t u d i e da n dc o m p a r e d w i t ht h ed e g r e eo fp u r i t y a n dt h er e c l a i mr a t i o ，c o l u m nc h r o m a t o g r a p h i cm e t h o d ，s a l t i n g o u ta n du l t r a f i l t r a t i o n w a ss t u d i e d i tw a sd e m o n s t r a t e db ys o d i u md o d e c y ls u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i sa n dc o l u m nc h r o m a t o g r a p h i cm e t h o d ，y i e l d i n gt h em o l e c u l a r4 00 0 0 a n d4 32 0 0 d ar e s p e c t i v e l y a tl a s ts t u d i e dt h es t a b i l i t yo fc p c i ne x t r a c t i o n ，r e s u l ts h o w e dt h a tw i t ht h es c f e - c 0 2 ，t h ey i e l do fc p cw a sm o r e h i 曲i nr e p e a t e df r e e z i n ga n dt h a w i n gm e t h o dt h eo p t i m a lt e c h n o l o g i cc o n d i t i o na s f o l l o w s ：e x t r a c t 晰t l lw a t e ri nar a t i o1 ：2 2 ( g m l ) ，t e m p e r a t u r ew a s35 ，e x t r a c t t i m ew a s2 5h o u r s ，t h ee x t r a c t i o nr a t i oo fc p cw a s3 19 i nu l t r a s o n i ca s s i s t a n t e x t r a c t i o n ，t h eo p t i m a lc o n d i t i o na sf o l l o w s ：e x t r a c tt i m ew a s9 0 m i n u t e r s ， u l t r a s o n i cr u nt i m ei nac i r c l ew a s6 s ，u l t r a s o n i ci n t e r i mt i m ei nac i r c l ew a s9 s ，t h e p o w e ro fu l t r a s o n i cw a s14 0 0 w ，t h ep u m pr o t a t es p e e dw a s12 r s ，t h ee x t r a c t i o n r a t i oo f c p cw a s1 3 5 ，w h i c hw a sm o r eh i g ht h a nf r e e z i n ga n dt h a w i n gm e t h o d i np u r i f i c a t i o n , t h eo p t i m a lt e c h n o l o g i cc o n d i t i o no fc p cp u r i f i c a t i o n 、i t l l s a l t i n g - o u tm e t h o da sf o l l o w s ：f i r s t t om a k et h es o l u t i o ns a t u r a t e t o2 0 、i t l l a m m o n i u ms u l f a t et og e tr i do ft h ei m p u r ep r o t e i n ，t h e nm a k et h es o l u t i o ns a t u r a t et o 7 0 t og e tc p c ，a f t e rt h a tt h ep u r i f i c a t i o n ( 氏a 瑚) o fi tw a s1 4 7 ，t h er e c l a i mr a t i o w a s9 8 1 a f t e r p u r i f i e db y d e a e 一5 2 i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，t h e p u r i f i c a t i o no fc p cw a s1 8 7 ，t h er e c l a i mr a t i o w a s5 7 9 a f t e r p u r i f i e db y s e p h a d e x 一2 0 0 ，t h ep u r i f i c a t i o no fc p cw a s l 0 4 ，t h er e c l a i mr a t i ow a s6 4 9 a f t e r p u r i f i e db yh y d r o x y a p a t i t e ( h a ) c h r o m a t o g r a p h y ，t h ep u r i f i c a t i o no fc p cw a s2 8 3 ， t h er e c l a i mr a t i ow a s6 2 3 c p cw a sp u r i f i e db yd e a e - 5 2t w i c e ，t h ep u r i f i c a t i o no f i i i 江苏大学硕士学位论文 c p cw a s3 8 3 ，t h er e c l a i mr a t i ow a s3 6 9 b ys e p h a d e x 一2 0 0t w i c e ，t h ep u r i f i c a t i o n o fc p cw a s3 0 7 ，t h er e c l a i mr a t i ow a s 4 9 5 b yh at w i c e ，t h ep u r i f i c a t i o no fc p c w a s4 2 1 ，t h er e c l a i mr a t i ow a s3 8 1 a f t e ru l t r a f i l t r a t i o nt h ep u r i f i c a t i o no fc p c w a s0 9 1 i ns t a b i l i t y ，r e s u l ts h o w e dt e m p e r a t u r e ，p ha n da l c o h o lh a dm a r k e da f f e c tt oc p c ， t h o u g hn a c l ，s o d i u mb e n z o a t ea n dc i t r i ca c i dh a dl i t t l ea f f e c tt oc p c k + ，n a + a n d m 9 2 + h a dl i t t l ea f f e c tt oc p c ，t h o u g hc d + ，z n 2 + ，c d 十a n df e 3 + h a dm a r k e da f f e c tt o c p c t h es t a b i l i t yc h a n g e dw h e nc p cs o l u t i o nw i t h5p e r c e n t sd e x t r o s ea n ds u g a r c p cw a ss t e a d yw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fv i t a m i ncb e l o w0 4 m g m l i nc o n c l u s i o n ，p r a c t i c a lm e t h o d sa n dl o t so fu s e f u ld a t at oo u t p u td i f f e r e n tk i n d s o fc p cw a sf o u n d e db yt h et r i a l k e yw o r d s ：p h y c o c y a n i n ，e x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，s t a b i l i t y i v 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：弥俘雾 日期：蜮月) 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学位 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论 文。 本学位论文属于 保密画，在3 年解密后适用本授权书。 不保密口。 学位论文作者签名：；长瞎霖 珈3 咖2 日 名。 圜 江苏大学硕士学位论文 1 1 螺旋藻简介 第一章绪论 螺旋藻是一种古老的原核生物( p r o 勋r y o t e ) ，属蓝藻f - ( c y a n o p h y t a ) 、蓝藻纲 ( c y a n o p h y c e a e ) 、颤藻目( o s c i l l a t o r i a l e s ) 、颤藻科( o s c i l l a t o r i a c e a e ) 、螺旋藻属或 节旋藻属( s p i r u l i n a a r t h r o s p i r a ) 。螺旋藻是属于众多水生微藻中的一种，是地球 上最早出现的光合生物，在地球上已存在3 5 亿年，是呈蓝绿色的多细胞可食性 藻类。个体呈丝状螺旋卷曲，长度为2 0 0 3 0 0 m m ，宽5 l o m m 。由于螺旋藻中 氨基酸种类齐全且蛋白含量高，特有的生物活性物质藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白具 有奇特的生理功能，除此之外它还含有丰富的不饱和脂肪酸、维生素、矿物 质、b 胡萝卜素及多糖类物质，因此成为近年来研究的热点。该属中的钝顶螺 旋藻( s p l a t e n s i s ) 和极大螺旋藻( s m a x i m a ) ，在十几年前已开始大规模养殖，已 成为我国最大的微藻产业。 螺旋藻最早发现于非洲乍得湖，1 9 6 3 年法国石油研究所的c h e m e t 博士分 离出乍得湖的螺旋藻，并在实验室进行了培养实验。世界上第一个螺旋藻工厂 于1 9 6 8 年在墨西哥的t e x c o c o 湖畔建成；1 9 7 3 年墨西哥通过了螺旋藻的人体试 验并于1 9 8 0 年得到联合国工业发展组织( u n i d o ) 的肯定( 李志勇等，1 9 8 6 ) 。现 在螺旋藻产地主要分布在乍得、墨西哥、美国、秘鲁、泰国、印度、菲律宾、 日本、以色列以及中国的海南、台湾等省分。螺旋藻是具有开发前途的绿色食 品新资源，因其富含蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸等多种营养成分，被认为是 人类未来最理想的食品( 张学成等，1 9 9 9 ) 。 “七五 攻关以来，我国的螺旋藻研究和开发已全面展开，正在向大规模 应用的方向发展，大规模生产其有效成分对于开发食品资源和发展海洋药物都 具有十分重要的意义。 1 2 藻胆蛋白的生理及生化特性 相对于陆地高等植物，海藻的进化程度较低，从原核的蓝藻和原绿藻到真 核的红藻、褐藻和绿藻等都是在严酷的自然选择中得以生存，而且能生存在化 l 江苏大学硕士学位论文 学组成极为复杂、环境条件非常特殊的海水中，其关键是得益于其独特的代谢 途径和代谢产物。这些代谢产物不仅可以作为工业原料或者食品添加剂，而且 还发现它们对一些疾病具有特殊疗效，因而受到人们的重视。 藻胆蛋白存在于蓝藻( c y a n o p h y c e a e ) 、红藻( r h o d o p h y c e a e ) 、隐藻 ( c r y p t o p h y c e a e ) 和一些少数甲藻( p y r r o p h y c e a e ) 中，它是一种古老的蛋白质，在 大约3 5 亿年前原始海洋出现蓝藻时就有了这种蛋白。在叶绿素出现以前，藻胆 蛋白是主要的捕光色素蛋白。在长期的生物进化中，这种蛋白质并没有消失， 反而在一些藻类中大量存在。最新的研究表明组成藻胆蛋白的氨基酸发生了一 些特异性修饰，如在所有已测定的藻胆蛋白中，其亚基的7 2 位均修饰为y n 甲酰天冬酰胺残基，这是经蛋白质转译后修饰产生的，而且不论是原核藻类还 是真核藻类的藻胆蛋白均有这种现象存在( k l o t za ve t a l ，1 9 9 0 ) ，经过深入分析 发现这种特异性修饰是对蛋白质提供一种保护机制，使之免遭蛋白酶的水解 ( k l o t za v ，1 9 9 3 ) ，这些现象表明藻胆蛋白具有一种特殊的功能，因此藻胆蛋白 作为荧光标记物以及作为药物的研究已经引起人们的高度重视。 1 2 1 藻胆蛋白的发现 1 8 8 3 年e n g e l m a n 研究丝状蓝藻o s c i l l a t o r i a 在入射光下的光合放氧时发现 用5 7 0 - - 6 3 0 n m 之间的光照射藻体，其放氧效率与利用叶绿素吸光区域的照射时 的相同，在当时人们认为叶绿素是唯一的光合色素。直到半个世纪以后， e m e r s o n 和l e w i s 在研究单细胞蓝藻c h r o o c o c c u ss p 时对e n g e l m a n 的实验结果 给予了定量的解释。他们通过测定每吸收一个光子量所释放出的0 2 量，发现用 5 7 0 6 3 0 n m 波长范围的光照射所产生的光合量子产额几乎达到叶绿素的最大光 合量子产额，而这个波长范围内正是藻胆蛋白的吸光区域，至此藻胆蛋白在藻 细胞中作为光合作用捕光色素系统的理论才被人们普遍接受。 1 9 6 6 年g a n t t 等在研究紫球藻叶绿体的结构时意外地发现了在类囊体膜上 规则地排列着一些小颗粒，其直径为3 0 - 4 0 r i m ，颗粒间的距离为4 0 n m - 5 0 n m 。 进一步研究发现这些颗粒主要是由藻蓝蛋白和藻红蛋白组成的，电镜观察其形 状为“盘状”，而且在不同的藻类中，其形状与组成有差异( g a n t te & c o n t i s f ，1 9 6 6 ) 。以后g a n t t 和c o n t i 将此颗粒命名为藻胆体( p h y c o b i l i s o m e ) 。现已广 泛认为藻胆体是红藻和蓝藻中藻胆蛋白存在的基本形式和功能单位。 2 江苏大学硕士学位论文 1 2 2 藻胆蛋白的种类与分子组成 根据组成和吸收光谱的不同，藻胆蛋白一般分为三类；藻蓝蛋白 ( p h y c o c y a n i n ，简称c p c ，吸收光谱在6 1 0 - - 6 4 0 n m ) 、藻红蛋i 刍( p h y e o e r y t h r i n ， 简称p e ，吸收光谱在5 0 0 5 7 0 n m ) 和别藻蓝蛋i 兰t ( a l l o p h y c o e y a n i n ，简称a p c ， 吸收光谱在6 5 0 - 6 7 1 n m ) 。1 9 2 8 年l e m b e r g 首次证明藻胆蛋白是由脱辅基蛋白 和四吡咯结构的色基所组成。脱辅基蛋白主要由a 和1 3 两种亚基组成，两者比 例一般为1 ：l ，在某些藻胆蛋白中还发现丫亚基的存在。现己用氨基酸序列分析 的方法研究了脱辅基蛋白和色基结合的位置，并且发现所有的色基均是与多肽 链中的半胱氨酸残基以硫醚键共价结合，结合方式分别是通过色基的a 环或者 d 环单键相连，也有的色基a 环和d 环同时与脱辅基蛋白相连。半胱氨酸残基 的存在是色素与脱辅基蛋白共价交联的必要条件，但不是充分条件。例如蓝藻 s y n e c h o c o c c u6 3 0 1 的藻蓝蛋白四个半胱氨酸残基中有三个结合着藻蓝素，另一 个处于自由态。在藻胆蛋白中总共发现四种色基，分别为：藻红胆素( p e b ) 、藻 蓝胆素( p c b ) 、藻尿胆素( p u b ) 和p h y c o b i l i v i o l i n ( p x b ) ，这四种藻胆素是同分异 构体，它们的差异表现在双键位置的不同( g l a z e ra n ，1 9 8 1 ) 。藻胆蛋白分子共 价结合的色基数目较多，而且一个分子可以结合种类不同的色基。例如r - 藻红 蛋白共价结合2 5 个藻红胆素，9 个藻尿胆素。蓝藻和红藻中藻胆蛋白的种类、 光谱性质见表1 1 所示。 表1 1 蓝藻和红藻中藻胆蛋白的种类和光谱性质 3 123 藻胆蛋白的基本构建单位及在溶液中的存在形式 藻胆蛋门是一黄寡聚体蛋向，丛木构建单位是和b 两个亚基，业基分子 量在】7 4 0 k d 之；在藻红蛋向巾还存在少量的y 亚摹，它的分子帚议人，约 为3 0 k d ( g l a z e ra n ，1 9 9 4 ) 。每种亚基山脱辅基蛋白和，r 链的凹吡咯结构的色萆 组成，色基通过硫醚键与脱辅基蛋白l 】的半胱氨酸残基交联。其分子结构如剧 1 i 、图l2 所小。 s ? ( 。1 4 j 办拶，巷 斟1i 蕊兴中藻j u 篮自的分，鲜，构 e 一。i 酣12 藻娄中藻埘蚩白的分r 形老站捣 一般来说藻红蛋l 】的。距基和b 亚基髟成聪定的印体，再i j 单体聚什为多 聚体。从红凛和蓝藻中分离的藻胆蚩白是三聚体( 乜隅或? 、聚体( n 0 ) 6 。藻胆蚩自 在溶被t ，的状态什往与藻胆蛋白的引噗、浓度、溶液的p h 和离了强度等明豢 钶天。来自于蓝藻的凛蓝蚩白在接近其等e u a ( p i - 5 55 ) 时以六策体( 邙) 6 为主要 存在形式，而在p h 为68 时则以三聚体为主。而对丁藻红蛋白米蜕，在一个很 宽的范围内均是以很稳定的六聚体( d ) 6 形式存在，其原因可能是7 亚基将两个 = 聚体联在起。 般米说大音【f 分的别藻蓝蛋自足以三聚体的形式存在，然而 江苏大学硕士学位论文 c y a n i d i u m c a l d a r i m 的别藻蓝蛋白分子量却显示它主要是以六聚体的形式存在 ( g l a z e ra n ，1 9 8 1 ) 。藻胆体的空间结构使其成为理想的光能转换器，其光能的 传递效率可达9 0 以上。在藻类中其光能传递顺序为：藻红蛋白一藻蓝蛋白一 异藻蓝蛋白一叶绿素一光合作用中心。 1 2 4 藻胆蛋白在藻体细胞内的生理作用 一般认为在蓝藻和红藻中，藻胆蛋白除了有在光合作用中作为捕光色素系 统进行吸收和传递能量的功能外，还可以作为细胞中的储存蛋白。其理由为： ( 1 ) 在氮源充足的环境中生长的细胞，如果转入缺氮培养基中，在短时期内生 长速度不变；然而生长在有限氮源环境中的细胞，一旦转入缺氮培养基中细胞 的生长完全停止；( 2 ) 分别生长在氮源充足和氮源不足两种培养基中的细胞， 尽管前者的生物量高于后者，但当用5 4 5 n m 的闪光照射藻体时，两类细胞的 p s i i 有相同的电转化；( 3 ) 用5 0 的甘油处理细胞，会阻断藻胆蛋白与反应中 心间的能量转移，因此此类细胞中的藻胆蛋白受激后会产生自身的荧光。然而 没有经过5 0 甘油处理的藻细胞内的部分藻胆蛋白受激后也能产生自身的荧光 ( w y m a nme t a l ，1 9 8 6 ) ：( 4 ) 用时间分辨荧光光谱进行研究，发现蓝藻 s y n e c h o c o c c u ss p 细胞内非能量偶联的藻红蛋白的荧光寿命明显高于偶联的藻红 蛋白，进一步研究发现在含氮丰富的培养基中细胞内非能量偶联的藻红蛋白占 藻红蛋白总量的1 2 ，是氮源不足的培养基中非能量偶联藻红蛋白的3 4 倍； ( 5 ) 在钝顶螺旋藻( s p i r u l i n ap l a t e n s i s ) 中，当培养基氮源不足时，c 藻蓝蛋白 含量下降，同时伴随着细胞内蛋白水解酶活性的增强( b o u s s i b as & r i c h m o n d a e ，1 9 8 0 ) 。从进化的观点看藻胆蛋白作为储存蛋白对藻类在自然界中的生存 竞争相当有利。 1 3 藻胆蛋白应用研究 由于藻胆蛋白种类多、荧光强、量子产量高，易于同生物素、抗体等一些 蛋白质结合，因而用特定的交联剂可将其与生物素，亲和素和各种单克隆抗体 结合起来制成荧光探针，用于免疫检测，荧光显微技术，流式细胞荧光测定， 临床诊断及生物工程技术。因此藻胆蛋白作为荧光探针越来越受到重视，同时 江苏大学硕士学位论文 还发现藻胆蛋白具有一些独特的疗效，因此藻胆蛋白广泛应用于医学诊断、临 床医学等。国外的许多公司相继投资开发藻胆蛋白，产品售价十分可观( 见表 1 2 ) 。目前国内已在使用这些产品，但全部依赖进口，所以这类高技术产品的开 发利用就显得尤为重要。 表1 2 藻胆蛋白纯品的售价囊 根据s i g m a 公司1 9 9 8 年的目录 1 3 1 用作食品和化妆品的添加剂 藻胆蛋白中的必需氨基酸组成比例十分理想，是一种优良的营养保健成 分。它可以被用来制造高档护肤化妆品，低纯度的藻蓝蛋白用作食品添加剂不 仅可以避免化学合成食品添加剂对人体的伤害，而且它特有的蓝色可以和藻红 蛋白以不同的比例混合，达到其他天然和人工合成染料所不能达到的着色效 果。 1 3 2 用作药物 藻蓝蛋白还具有提高人体免疫力，促进动物血细胞再生功能。曾繁节等人 研究表明藻蓝蛋白可以刺激淋巴细胞的增殖反应，提高机体的免疫力( 曾繁节 等，1 9 9 2 ) 。r - 藻红蛋白可以和胰岛素抗体产生特异的免疫反应( 曾繁节等， 1 9 8 6 ) ，这表明r 藻红蛋白的构象或结构的某些部位与胰岛素有一定程度的相 似，因而也许会对糖尿病有一定的疗效。 藻蓝蛋白能够刺激肌体免疫系统产生免疫球蛋白，同时还能保持或促进正 常的细胞功能，防止肿瘤如癌症的发生或抑制恶性肿瘤的生长和复发，具有抗 肿瘤或抗癌的功效。临床研究显示，向病人体内引入的藻蓝蛋白能选择性地破 坏癌细胞，对正常细胞没有破坏作用。上述方法在治疗胸腺癌、血癌及鼠的肿 瘤等己取得成功；能够缓解药物和重金属对肾脏的毒害。 6 江苏大学硕士学位论文 藻蓝蛋白能显著提高淋巴细胞的活性，具有极强的抗癌作用，尤其是对肝 癌细胞。藻胆蛋白光敏剂也可应用在肿瘤光动力治疗中，光动力治疗肿瘤细胞 是近年来发展起来的一种新的方法。其原理是利用一些荧光量子产额高的光敏 剂注射体内，肿瘤细胞与其亲和性高于正常细胞，因而驻留在肿瘤细胞中。当 用强光照射后，光敏剂吸收光子跃迁至激发状态，处于激发状态的光敏剂再将 能量传至周围的氧分子产生单线态氧。单线态氧是细胞的强毒性剂，因而杀伤 肿瘤细胞，而对正常组织的损伤极小。因而国内外不少肿瘤医疗中心己对多种 肿瘤采用这种方法进行治疗，效果明显，因而日益受到人们重视。有研究表明 藻胆蛋白结合激光辐照，可以有效地杀伤肿瘤细胞，低浓度的藻红蛋白分别对 人口腔8 1 1 3 癌细胞和小鼠s 1 8 0 癌细胞的杀伤率高达7 5 和7 6 。临床试验藻 蓝蛋白铜激光对大肠癌细胞株有很强的杀伤效应。中国海洋研究所王广策研究 员承担的“藻胆蛋白光敏治疗癌症药物的研制”课题，获得科技部二十一世纪中 心“创新药物品种研究新药博士基金”资助。他们用藻红蛋白作为光敏剂， 用氩离子激光辐照，发现体外培养的人口腔8 1 1 3 癌细胞和小鼠s 1 8 0 瘤细胞与 对照组相比，存活率分别只有2 5 和2 4 。这些均表明不论是藻红蛋白还是藻 蓝蛋白都有可能成为有效的光敏剂。 1 3 3 用作制造荧光探针的原料 藻胆蛋白荧光探针的研制起始于8 0 年代初，最先研制者是美国c a l i f o m i a 大学的g l a z e r 等( g l a z e ra n & s t r y e r l ，1 9 8 4 ) 。他使用双功能试剂s p d p 交联藻 红蛋白和a v i d i n 、i g g 、a 蛋白等发现藻红蛋白与其它分子交联后，荧光量子产 量和发射光谱均未发生改变，而且藻胆蛋白荧光检测的灵敏度极高，用1 0 - 1 5 9 藻红蛋白的荧光就很方便的检测出。藻胆蛋白的荧光强度是相同浓度荧光素的 1 5 倍。如果用细胞流式仪检测，细胞表面只要结合1 0 0 0 个藻红蛋白就可以测 出。藻胆蛋白荧光探针克服了人工合成荧光素的许多缺点。例如荧光素的制备 及提纯都比较困难，在复杂的反应中要使用有毒的硫光气液体，而且有无法控 制的支反应，其质量和纯度均难以保证；其次荧光素价格昂贵而且长期保存后 同蛋白质结合的能力减弱甚至消失。 相比之下藻胆蛋白荧光探针具有以下优点： 7 江苏大学硕士学位论文 ( 1 ) 藻胆蛋白以溶液或固态保存都很稳定，在p h 4 1 1 之间光谱无明显变 化； ( 2 ) 色基多，对光的吸收能力强，荧光量子产额高： ( 3 ) 荧光位于橙红光区( 5 5 0 7 0 0 n m ) ，背景荧光干扰少； ( 4 ) 斯托克位移大，普通的荧光素一般小于3 0 n m ，而藻胆蛋白则高达 8 0 n m 或更高； ( 5 ) 它的等电点在4 7 5 3 之间，因此在生理溶液中带负电荷，而细胞表 面通常也是带负电荷的，所以非特异性吸附的可能性极小： ( 6 ) 天然生物大分子不猝灭其荧光： ( 7 ) 藻胆蛋白表面具有许多的活性基团如s h 基，- n h 2 等，因此交联方 便； ( 8 ) 藻胆蛋白是亲水性的，而且在溶液状态下十分稳定，与抗体共价结合 并不影响它的光谱特性，同时有保持了抗体的免疫特征。 正是由于藻胆蛋白的这些优点，目前藻胆蛋白己被广泛地用作荧光探针并 已有产品出售。表1 3 为部分商品探针价格。 表1 3 藻胆蛋i 兰t - b i o t i n 或- a v i d i n 探针售价鬻 。引自s i g m a 公司1 9 9 0 年产品目录 藻胆蛋白荧光探针研制的关键表现在以下两个方面。一是利用经济简单的 方法得到高纯度的藻胆蛋白：二是探索简易可靠的蛋白质交链技术。蛋白质与 抗体的交联主要有两种方法：一是直接与抗体共价交联，制成荧光探针；另一 种间接与抗体结合，即利用抗原与抗体的特异性结合反应，制备非共价的藻胆 蛋白荧光探针。因此藻胆蛋白荧光探针可以分为两类：一类是专一性的藻胆蛋 白荧光探针，另一类是非专一性的藻胆蛋白荧光探针。前一种藻胆蛋白与某一 种专一性的单抗共价结合，这种单抗一般为某种常见多发性的检测性的单抗， 例如检测乙肝的单抗等，可以用于这类疾病的检测诊断：后一种藻胆蛋白荧光 8 江苏大学硕士学位论文 探针是非专一性的，可以对两种或多种疾病进行检测诊断。例如用藻胆蛋白标 记抗兔抗体，以兔的某种抗体作为夹心，就可以对多种兔的抗原进行检测。目 前国外公司出售的藻胆蛋白荧光探针主要是在藻胆蛋白上标记生物素而且这些 产品均有专利保护。 藻蓝蛋白探针代替酶标、放射性同位素以及荧光素标记等显示出巨大的优 越性，在医学诊断、动植物检疫、免疫学、细胞生物学和分子生物学等方面有 着极其广泛的应用，尤其是在细胞表面抗原的研究方面。藻胆蛋白种类多，分 子间的共价交联物存在着能量传递，因而可以对细胞表面进行多色分析。表1 4 为部分生物素标记了的藻胆蛋白产品的价格和专利号。 表1 4 生物素标记了的藻胆蛋白产品 1 3 4 藻胆蛋白其它方面的作用 研究表明在抗肿瘤药物中添加藻蓝蛋白时可用以治疗溃疡；藻蓝蛋白能够 促进末端供血和骨髓的造血功能；藻蓝蛋白还能够选择性地富集病灶能用于动 态粥样硬化或癌症，如皮肤癌、乳腺的动态治疗，最近己获得美国食品医药局 ( f d a ) 的批准：试验证明藻蓝蛋白能够减轻盐酸苯肼和辐射对小鼠的外周血中 自、红细胞和骨髓的损伤，降低贫血程度，促进c f u - e ( c 0 1 0 n ) f o r m i n gu n i t - e r y m r o i a ) 和b f u - e ( b u r s tf o r m i n gu n i t - e r y t h r o i d ) 的形成；食品中铁的可利用性与 藻蓝蛋白的化学性质也有很大关系：藻蓝蛋白从4 4 0 n t o 处开始有较强的可见光 吸收波长，并从5 5 0 h m 处开始有强烈的发射波长一直延伸到红光区，而且由于 藻蓝蛋白能把捕获的光能高效、直接传给叶绿素，所以其在光合作用的原初理 论方面具有重要的研究价值。 基于藻蓝蛋白具有以上重要的生理功能，因此有关藻蓝蛋白的制备早己引 起科学界和工业界有关人士的高度关注。 9 江苏大学硕士学位论文 1 4 本课题研究的意义和主要内容 1 4 1 选题的意义 被誉为“微型绿色功能性营养宝库的钝顶螺旋藻( s p i r u l i m ap l a t e n s i s ) 是目前具有开发前途的绿色功能性食品新资源。钝顶螺旋藻是我国目前开发利 用的重点藻种，据报道它的蛋白质含量占干重的6 2 7 0 ，每l h m 2 养殖面积 产蛋白质3 9 4 5 t ( 相对大豆只有1 4 t ) 。联合国粮农组织( f a 0 ) 已将其列入 2 l 世纪人类食品资源开发计划，并认为是人类未来最理想的食品。 由于螺旋藻是一种生长快，又具有食用价值和饵料价值的高效蛋白源，故 我国对螺旋藻的开发利用很重视，并以研究螺旋藻的大规模生产与应用为主， 形成的多种药食产品也已遍布市场。但是目前国内对螺旋藻的开发和利用主要 集中于对藻粉的初级加工，而忽视了对其中的活性物质藻胆蛋白的生产研究。 尽管有不少人试图将藻胆蛋白基因转入微生物中以实现藻胆蛋白的大规模 生产，但由于各种各样的原因，用转基因方法生产藻胆蛋白还有很长的一段路 要走，目前从藻类中提取分离藻胆蛋白仍是获得藻胆蛋白的主要途径。 藻胆蛋白作为藻类中的一种重要生理活性物质，随着人们对其认识的逐步 深入，它的价值也正逐步为人们所认识。藻胆蛋白的大规模开发利用已成为当 前研究的热点，但是昂贵的价格成为制约其开发利用的瓶颈，因而如何在提取 分离纯化技术上取得进步，低成本高效益地获得具有商业应用价值，尤其是高 纯度的藻胆蛋白己显得极为迫切。我国在该领域的研究起步较晚，应加大研究 力度，尤其应加快有关分离纯化技术的研究，这样才能促进我国深层次开发和 利用螺旋藻，尽快赶上国外对藻类食品、药物发展的趋势，造福于人类。 1 4 2 本课题主要的研究内容 ( 1 ) 超临界c 0 2 预处理对钝螺旋藻干粉的影响 以钝顶螺旋藻为原料，采用超临界c 0 2 萃取技术进行脱脂处理。用常规方 法测定超临界c 0 2 萃取前后钝顶螺旋藻中蛋白质和藻蓝蛋白的含量；用反复冻 融的提取方法研究超临界c 0 2 处理对藻蓝蛋白的提取效率的影响。对超临界 c 0 2 萃取所得螺旋藻油的成分进行初步分析。 1 0 江苏大学硕士学位论文 ( 2 ) 常规方法提取藻蓝蛋白的试验研究 目前，用于天然产物有效成分提取的方法有很多种，作者以超临界c 0 2 处 理过的藻粉为原料，对文献中报道的适合于藻蓝蛋白提取的常用方法反复 冻融法和溶胀进行试验研究，并对反复冻融法进行详细的正交试验研究，得出 最优提取条件。 ( 3 ) 超声辅助提取藻蓝蛋白的试验研究 首先，以超临界c 0 2 处理过的藻粉为原料，对超声辅助提取藻蓝蛋白的可 行性进行研究；然后通过单因素试验，结合实际情况和产品本身的要求，确定 超声提取的主要因素和参数，进行正交试验，得出超声辅助提取的最佳工艺条 件。 ( 4 ) 藻蓝蛋白的纯化及其性状的测定 以藻蓝蛋白粗提液为原料，详细研究盐析、柱层析及超滤三种纯化方法对 藻蓝蛋白粗提液纯化的效果。得到硫酸铵盐析；葡聚糖凝胶、离子交换、羟基 磷灰石柱层析；超滤法纯化藻蓝蛋白的条件。并制备适合不同级别要求的藻蓝 蛋白。最后以纯度为试剂级的藻蓝蛋白为试验对象，用电泳和排阻色谱两种方 法测定该种钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分子量；对样品进行紫外和红外扫描，为 藻蓝蛋白鉴定提供更丰富的依据。 ( 5 ) 藻蓝蛋白稳定性测定 由于藻蓝蛋白是一种色素蛋白，是一种很好的着色剂，低纯度的藻蓝蛋白 常用于食品和化妆品的着色，作者用测定色素稳定性的方法对藻蓝蛋白在不同 条件下的稳定性进行初步研究，旨在为藻蓝蛋白的应用和贮藏提供理论依据。 江苏大学硕士学位论文 第二章超临界c 0 2 对钝顶螺旋藻干粉预处理的试验研究 2 1 前言 钝顶螺旋藻干粉中含有部分油脂类物质，在这些油脂类物质中又以不饱和 脂肪酸居多。油脂类物质的存在在一定程度上增加了藻蓝蛋白提取和纯化的困 难：而且螺旋藻中的油脂类物质是一种具有保健功能的物质，所以这使得在提 取藻蓝蛋白之前除去原料中的油脂类物质的操作显得很有必要。分离去除油脂 类物质的传统方法主要有压榨法和有机溶剂萃取法，压榨法出油率低，除油不 完全，适合含油量较高的物质的脱脂；而有机溶剂萃取法虽然除油效果好，但 不可避免会使产品中有有机溶剂的残留，而且对环境造成污染，超临界c 0 2 萃 取技术是近几年来新兴的一项高效、绿色、环保的新技术，尤其适合油脂类非 极性物质的萃取，其处理量较大，除油彻底，而且不会对原料中的有效成分造 成任何破坏。 本研究应用超临界c 0 2 萃取技术对钝顶螺旋藻干粉进行脱脂；并分别用微 量凯式定氮法和分光光度法对超临界c 0 2 处理前后藻粉中的总蛋白和藻蓝蛋白 的含量进行测定；用反复冻融提取法比较超临界c 0 2 处理前后藻蓝蛋白提取效 率的变化情况；最后用气相色谱法对所得到的螺旋藻萃取物进行了初步分析。 2 2 钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白得率和纯度测定方法的建立 藻蓝蛋白易溶解于水中，在水中的浓度分布均匀，故藻蓝蛋白含量和纯度 的测定一般采用比色法。 根据物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方 法，称为分光光度法( s p e c t r o p h o t o m e t r y ) 。将待测物( 如核酸、蛋白质) 配 制成一定浓度的溶液后，移至相应波长的分光光度计中，即可从测定的消光值 换算出待测物质的含量。此法测定时所需的样品量较少，但往往能够产生比较 高的消光值，而且操作简单，反应迅速、灵敏，结果也较准确，因此广泛应用 于蛋白质的含量测定等方面。根据朗伯一比耳( l a m b e r t b e e r ) 定律，一定浓度 1 2 江苏大学硕士学位论文 的物质与其在某一波长处的吸光值成正比关系。在一定条件下，一束单色光通 过吸收介质的溶液后，因吸收介质吸收部分光能，引起该束光的强度降低。吸 收介质的厚度和吸光物质的浓度与光降低的程度成正比。用公式表示： c = a k l( 2 1 ) 式中a 一吸光值；卜常数；c 一溶液浓度；卜光程。 在蓝藻和红藻中，其粗提液中往往含有两种以上的藻胆蛋白，已知钝顶螺 旋藻中含有藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白两种藻胆蛋白，它们在可见光区分别有自己 的特征吸收峰，所以在测