人源化单克隆抗体PPT课件.ppt

人源化单克隆抗体的研究进展和应用,09生物技术,单克隆抗体在理论和实践上的应用成为解决生物学和医学等许多重大问题的重要手段。但是，上述应用的单抗属于鼠源性，鼠源性单抗应用于人类的临床应用结果反映出了单克隆抗体药物存在的一些问题:(1)鼠源性单抗容易容易产生人抗鼠抗体(HAMA),在体内作为异源蛋白被清除掉，从而削弱其治疗的有效性。(2)鼠源性单抗在人体内生物活性降低，不能有效地激活人体的生物效应。,研究背景,因此，人们一直致力于人源性抗体的研究。,人源化治疗性单克隆抗体的研究进展,构建的基本思路,鼠抗体人源化就是通过基因改造，使其和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导HAMA（人抗鼠抗体）反应。遵守两个原则首先，要保持抗体的亲和力和特异性；其次，要降低或消除抗体的免疫原性。,.,以分子生物学技术提取、扩增编码人抗体的DNA，构建质粒，建立组合抗体文库，再利用供者文库建立针对某一特定抗原的子文库。以该技术制备的抗体片段(Fab)是人源抗体，具有建库简单、抗体表达稳定等特点。迄今已有多种抗体产生。可以预见，该技术具有良好的发展和应用前景。,解决方案：,（1）用人脾细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交；,（2）用EB病毒转化人的B淋巴细胞；,（3）用基因工程法制备嵌合抗体等。,效果不强,（4）最新方法：抗体库筛选技术和转基因鼠技术,.,单克隆抗体的发展史,第一代：鼠源性单抗,药物特异性很强，副作用大，现在已经渐渐退出市场。不过由于其代谢比较快，目前在放射性元素标记的单克隆抗体药物中使用。,第二代：人鼠嵌合性单抗,进行人源化改造，使其人源化程度达到70%左右。,第三代：CDR移植抗体和SDR移植抗体,人源化程度达到95%左右，大大降低了毒副作用。,第四代：全人源化单抗,2002年，的世界首个药物阿达木单抗上市。人源化及全人源单克隆抗体由于副作用小，在体内停留时间长，更有利于治疗。,.,人源化程度,.,1.嵌合抗体（Chimericantibody),用人源基因代替鼠源单抗的恒定区，即该单抗由鼠的可变区和人的恒定区组成的嵌合抗体。,由于嵌合抗体可变区（V）约占整个抗体的30%，鼠源性抗体V区中的框架区（FR)仍残留一定的免疫原性，可诱导HAMA反应。,灵长目源抗体也是一类嵌合抗体，通过免疫短尾猿猴产生。由于其抗体的可变区与人可变区无差异，不至于发生抗体反应。,缺点,解决方案,鼠源抗体,嵌合抗体,.,2019/12/12,2.CDR移植抗体（CDRgraftedantibody),真正意义上的抗体人源化。抗体中除了3个互补决定区（CDR）是鼠源的外，其余全部是人源结构，人源化程度可达到95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性。,不足,有时异基因的CDR人源化抗体可能引起抗个体基因型反应。,改良方案,进行SDR移植改良,嵌合抗体,人源化抗体,3个CDR,.,3.SDR移植抗体(SDRgraftedantibody),在CDR移植抗体的基础上，将异源抗体中与抗原结合密切相关的SDR等少数残基移植到人抗体相应位置上，进一步降低了抗体的异源性。通过这种方法，使人源化的抗体潜在的免疫原性降至最低。,.,4.全人单克隆抗体（Fullyhumaneantibody),它是将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性。,4.1.抗体库筛选技术,4.1.1.噬菌体表面展示技术,鼠源抗体,完全人源化抗体,.,基本原理和程序,噬菌体抗体库,人免疫细胞基因组,PCR技术扩增,整套的抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因,噬菌体DNA中有抗体基因外壳表面有抗体分子的表达,克隆并以融合蛋白的形式表达,基因重组,噬菌体重组DNA,构建,利用抗原-抗体特异性,筛选所需抗体并进行克隆扩增,获得可溶性抗体片段,表达,.,2019/12/12,局限性,1.在噬菌体展示过程中涉及细菌转化、噬菌体包装、展示跨膜分泌，这就大大限制了所建库的容量和分子的多样性。目前，常用的噬菌体展示文库容量在109。2.不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需要外加选择压力。3.噬菌体展示文库无法进行有效的体外突变和重组进而限制了文库中分子遗传的多样性。4.因为噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以一些对细胞有毒性的分子（如生物毒素分子)很难得到有效表达和展示。,4.1.2.核糖体展示技术,基本原理和程序,人免疫细胞基因组,EDTA,体外转录、翻译、偶联,mRNA-核糖体-蛋白质三聚体,核糖体展示的蛋白文库,构建,基因型和表型联系,利用抗原-抗体特异性,筛选所需抗体复合体,EDTA解离,获得特异mRNA,RT-PCR,RT-PCR,特异抗体DNA子文库,获得特异性的、高亲和力的抗体,表达,.,2019/12/12,传统的筛选技术具有本身难以克服的缺陷，主要表现在构建文库和筛选时都涉及细胞转染、噬菌体包装、跨膜分泌和蛋白质降解等诸多方面的问题，文库容量及其分子多样性在某种程度上受到很大的限制，降低了文库筛选效率。核糖体展示技术由于在体外无细胞翻译体系中进行，用mRNA的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，不受细胞转化效率的限制。它大大的提高了文库容量和筛选通量（1012-1014）而且能够增加表达的蛋白质的溶解度。,优势,4.2.转基因小鼠,通过基因敲除技术，使小鼠自身的基因失活，并导入新基因，创造出携带人抗体重轻基因簇的转基因小鼠。这种人抗体基因小鼠所携带的人DNA片段具有完善的功能，可以有效地进行同型转换和亲和力成熟。任何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力的人抗体。,案例：,日本麒麟公司用基因工程技术，使小鼠携带完整的人14号染色体，该染色体包含全部人抗体产生基因。,但迄今尚无该技术生产的制品问世。,.,4.3.微胞杂交干细胞技术,日本学者Ishida等首先提出,技术要点：首先将抗G418的人成纤维细胞与小鼠的A9细胞融合，通过筛选，得到抗G418的小鼠A9细胞，再运用PCR或原位荧光杂交方法筛选，先筛选出的细胞用秋水仙素处理48h，然后用细胞松弛素B处理并高速离心，分离出含2号、14号、22号染色体的小鼠。,人源抗体在这种转基因小鼠的产量还比较低。,.,4.4.其他方法,XTL生物制药公司使用一种类似于人骨髓移植的方法，用放射线破坏动物骨髓，然后注入人抗体生成细胞。该公司已用此法生产出一种全人单抗。,.,2019/12/12,近年来,人源化抗体和人抗体的出现为临床应用带来了新的希望,当前正处于临床研究的多种抗体中,嵌合抗体和人源化抗体所占比例大于70%。目前的人源化抗体,主要用于肿瘤、自身免疫性疾病和心血管疾病的治疗以及抗移植排斥反应和抗病毒感染等方面。,人源化抗体的临床应用,2019/12/12,1.在肿瘤治疗方面的应用:单抗药物抗肿瘤能有效地降低传统肿瘤药物治疗的不良反应。如2005年我国开发出癌症治疗药重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体(商品名：泰欣生)。泰欣生联合放疗治疗鼻咽癌的完全缓解率比单纯放疗的患者提高30%以上。2.在器官移植中的应用:近年来,利用抗体药物作为实体器官移植的诱导治疗逐渐增加。如1986年批准进入美国市场的治疗性抗体类药物抗CD3单抗即被用于肾、心脏、肝脏移植排斥的逆转。3.在心血管疾病方面的应用：美国FDA于1994年批准了第一个人-鼠嵌合Fab抗体的上市，该抗体现已被广泛应用于多种心血管疾病治疗,主要用于预防冠状动脉成形术后的再狭窄。,2019/12/12,4.在自身免疫性疾病方面的应用:现有的研究表明,抗体对类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣、多发性硬化、硬皮病、溃疡性结肠炎等疗效较好。5.在抗病毒感染方面的应用：近年来研究表明,在HBV、HCV、HIV等病毒感染性疾病中,人源化抗体显示了较好的应用前景。如：商品名为SynagisTM的抗呼吸道病毒感染的抗体在美国已经上市,为人源化的基因工程抗体。,.,应用单克隆抗体后的患者症状改善率,.,总结,到目前为止，至少有35个完全人类的单抗已经进入临床的治疗实验阶段。这些单抗的靶抗原都是临床癌症、自身免疫疾病或炎症疾病和传染病中的主要抗原。例如EGFR、CTLA-4和CD4等。在治疗一些异种移植、骨质疏松症等疾病已有显著的效果。抗体人源化以及完全人源化抗体的制备已