（海洋生物学专业论文）鱼类卵黄蛋白原调理作用的研究.pdf

j1 j 1 s t u d t f 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含未获得【注；翅遗直墓丝盂要 特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位做储签名刘钕签字日期诎年月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项： 1 、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被 查阅和借阅。 2 、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中国学术期刊( 光 盘版) 电子杂志社! 用于出版和编入q 岖l 中国知识资源总库：，授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库。( 保密的学位论文在解密后适 用本授权书) 学位论文作者签名：训铋 j 签字日期：如f 。年月7 日 剔程字：办啦 c 签字日期：_ 卜年厂月c 日 鱼类卵黄蛋白原调理功能类型的研究 鱼类卵黄蛋白原调理作用研究 两裴 硬骨鱼类虽然具有和高等脊椎动物相似的免疫系统，但作为低等脊椎动物， 其特异性免疫机制尚不完善，非特异性免疫占据更为重要的地位。在非特异性免 疫中，吞噬细胞在鱼类抗感染免疫中发挥核心作用。一些能与抗原结合并促进吞 噬细胞吞噬功能的物质称为调理素；通过结合调理素辅助吞噬作用的现象称为调 理化。目前，已经发现的调理素主要有补体活化成分c 3 b 及i g g 类抗体。新近， l i 等人( 2 0 0 8 ；2 0 0 9 ) 的研究表明鱼类卵黄蛋白原( v i t e l l o g e n i n ，v 曲也能发挥调理素 的功能。然而，关于v g 参与调理作用的机理完全不了解。本论文主要目的就是 研究v g 的调理作用类型与机理。 本论文首先利用p e r c o l l 密度梯度离心法从鲈鱼( l a t e o l a b r a xj a p o n i c u s ) 头肾 中分离纯化得到了巨噬细胞，并对其噬菌功能进行了鉴定。通过吞噬实验统计两 个参数吞噬能力衅) 和吞噬指数( p d 来评价巨噬细胞的噬菌水平，发现鲈鱼 头肾巨噬细胞和酵母作用9 0 m i n 时吞噬能力可能达到最大值。然后，用鲈鱼头肾 巨噬细胞吞噬与六线鱼( h e x a g r a m m o so t a k i ov g 孵育过的酵母，结果发现，与对 照相比，经v g 处理的实验组的p a 和p l 都有显著性提高( 胙0 0 5 ) ，说明v g 的调 理素功能不具有种属特异性。利用六线鱼v g 可以促进鲈鱼头肾巨噬细胞吞噬作 用这一系统，接着我们证明了v g 调理功能可被l a v e n d u s t i n ( 蛋白酪氨酸激酶p t k 的特异性抑制剂) 、p p i ( 蛋白酪氨酸激酶f i k 的特异性抑制剂) 和s t a u r o s p o r i n e ( 蛋 白激酶cp k c 抑制剂) 所影响；但不受n o c o d a z o l e ( 微管抑制剂) 和c 3e x o e n z y m e f r h og t p a s e s 抑制剂) 的影响，说明v g 的调理功能可能属于i 型机制。由于巨噬 细胞i 型调理是由巨噬细胞膜表面受体f c y r s 介导，激发吞噬信号传导通路。接 下来，我们进一步验证f c 丫r s 是否参与了v g 的调理。我们用异硫氰酸荧光素 ( f i t c ) 标记的f c y 黜三类受体的单克隆抗体f 吖r j 、f c 丫r n 和f 吖r i i i 与鲈鱼巨 噬细胞孵育，荧光显微镜观察发现这三种单克隆抗体均可以与巨噬细胞结合，表 明巨噬细胞表面存在f 吖刚、f c y r i i 和f c t r i i i 这三种受体。在此基础上，我们 进而用这三种单抗对巨噬细胞表面相应受体进行封闭，检测受体封闭对v g 的调 理功能的影响，结果发现，与对照相比，受体封闭能不同程度地抑制巨噬细胞吞 噬v g 孵育过的酵母，说明v g 可能通过与f c t r i 、f c t r i i 和f c t r l h 这三种受体 鱼类卵黄蛋白原调理功能类型的研究 结合介导调理过程。我们还对蛋白质酪氨酸激酶s k y 和p 1 3 激酶是否参与v g 调 理过程进行了研究。用蛋白质酪氨酸激酶s k y 和p 1 3 激酶各自的特异性抑制剂 p i c e a t a n n o l 和w o r t m a n n i n 对鲈鱼巨噬细胞进行处理，通过r e a l t i m ep c r 的方法检 测v g 调理后炎症因子t n f a 和i l 1p 基因表达量的变化情况，结果发现，与对 照相比，抑制剂处理组的t n f q 和i l 1p 表达量有显著性下降( 砰o 0 5 ) ，说明蛋 白质酪氨酸激酶s k y 和p 1 3 激酶可能参与v g 调理过程的信号传导，影响炎症因 子的产生。 总之，本文首次证明了鱼类v g 诱导的吞噬作用属于i 型调理吞噬作用。经典 的i 型调理吞噬作用主要由l g g 抗体诱导，后来发现c r p 诱导的吞噬作用也属 于i 型调理吞噬作用。这说明v g 和c r p 一样在诱导吞噬方面具有类抗体功能。 关键词：鲈鱼；卵黄蛋白原；巨噬细胞；f c ) , r s ；i 型调理 t ； s t u d yo no p s o n i ca c t i v i t yo f f i s hv i t e l l o g e n i n a b s t r a c t b o n yf i s hh a v ea i m m u n es y s t e ms i m i l a rt ot h a to fh i g h e rv e r t e b r a t e si n c l u d i n g h u m a n s h o w e v e r , a sl o w e rv e r t e b r a t e s ，t h e i rs p e c i f i ci m m u n em e c h a n i s m i sn o t p e r f e c t ，b u tt h e i rn o n - s p e c i f i co ri m m a t ei m m u n i t yi sw e l l d e v e l o p e d a m o n gi n n a t e i m m u n i t yo ff i s hp h a g o c y t e si n c l u d i n gm a c r o p h a g e sp l a ya c e n t r a lr o l ei n a n t i i n f e c t i o ni m m u n i t y s o m em o l e x c u l e sw h i c hc a nb i n da n t i g e nn a dp r o m o t et h e m a c r o p h a g ep h a g o c y t o s i si sc a l l e do p s o n i n ，a n dt h ep r o c e s sb y w h i c ht h eo p s o n i n e n h a n c e sp h a g o c y t o s i si sn a m e do p s o n i z a t i o n t h em a j o ro p s o n i n sf o u n di ns e r u ms o f a ra r ei m m u n o g l o b u l i ng ( i g g ) a n t i b o d i e sa n dc o m p l e m e n tf r a g m e n t sc 3 b r e c e n t l y l ie ta 1 ( 2 0 0 8 ；2 0 0 9 ) h a v ed e m o n s t r a t e dt h a tf i s hv i t e l l o g e n i n ( v i t e l l o g e n i n ，v g ) a l s o h a sa no p s o n i nf u n c t i o ni n v o l v e di ni m m u n er e s p o n s e v gf r o mf i s hh o t a k i ic a na c t a sam u l t i v a l e n tp a r e mr e c o g n i t i o nr e c e p t o rb i n d i n gt os e v e r a lp a m p s ，w h i l e w i t ht h e s p e c i f i cb i n d i n go f t h es u r f a c eo fm a c r o p h a g e s ，n a m e l y , ab r i d g er o l eb e t w e e n p a t h o g e nm o l e c u l e sa n dm a c r o p h a g e s h o w e v e r , t h em e c h a n i s mo f a c f i o nb yw h i c h v gi si n v o l v e di no p s o n i cp h a g o c y t o s i sr e m a i n su n k n o w n t h e m a i no b j e c t i v eo ft h i s s t u d yi st od e m o n s t r a t et h eu n d e r l y i n gm e c h a n i s ms t y l eb yw h i c hv g a c t sa so p s o n i n f i r s t ，s e ab a s s ( l a t e o l a b r a xj a p o n i c u s ) h e a dk i d n e ym a c r o p h a g e sw e r ei s o l a t e db y d i s c o n t i n u o u sg r a d i e n tc e n t r i g u g a t i o n t ou s ep e r c o l ld e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o n a n dt h e i rp h a g o c y t i cf u n c t i o nw e r ei d e n t i f i e db yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e t h e np h a g o c y t o s i sa s s a y sw e r ep e r f o r m e da n dt w op a r a m e t e r sp h a g o c y t i ca b i l i t y a ) a n dp h a g o c y t i ci n d e x ( p i ) w e r eu s e dt ot e s tt h ee f f e c t so fv go np h a g o c y t o s i st od r a w ak i n e t i cc u r v em a c r o p h a g e si n g e s t i n gy e a s tp a r t i c l ei nd i f f e r e n tt i m e t h e ni n c u b a t i n g s e ab a s sh e a dk i d n e ym a c r o p h a g e sw i t hh e x a g r a m m o so t a k i iv gc o a t e dy e a s t ， c o m p a r e d w i t ht h e y e a s t sp r e i n c u b a t e d w i t hb s aa n dp b sa l o n e ，t h o s e p r e i n c u b a t e dw i t hv g w e r er e a d i l yp h a g o c y t o s e db yt h em a c r o p h a g e s t h ep aa n dp i v a l u e so ft h em a c r o p h a g e sp h a g o c y t o s i n gv g t r e a t e dy e a s tw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a nt h o s eo fc e l l sp h a g o c y t o s i n gb s a - t r e a t e da n du n t r e a t e dm i c r o b e s ( 矿0 0 5 ) t h e s ed e n o t e dt h a th o t a k i iv gw a sa b l e t o p r o m o t et h e s e ab a s sm a c r o p h a g e 1 1 1 鱼类卵黄蛋白原调理功能类型的研究 p h a g o c y t o s i sa n dt h eo p s o n i nf u n c t i o no fv gd o e sn o th a v eas p e c i e ss p e c i f i c n e x t , t h eo p s o n i nm e c h a n i s mo fv gi ss t u d i e d t h i se x p e r i m e n tc o n f i r m e dt h a tv go p s o n i c f u n c t i o nc a nb ea f f e c t e d b yl a v e n d u s t i n ( p r o t e i nt y r o s i n e k i n a s ep t ks p e c i f i c i n h i b i t o r ) ，p p1 ( p r o t e i nt y r o s i n ek i n a s ep t ks p e c i f i ci n h i b i t o r ) ，s t a u r o s p o r i n e ( p r o t e i n k i n a s ecp k ci n h i b i t o r ) ；b u tn o tb yn o c o d a z o l e ( m i c r o t u b u l ei n h i b i t o r ) ，c 3 e x o e n z y m e ( r h og t p a s e si n h i b i t o r ) t h e r e f o r e ，w es p e c u l a t e d t h a tt h eo p s o n i n f u n c t i o no fv gm a yb et y p e im e c h a n i s m a st y p eim e c h a n i s mf u n c t i o n sb yc e l l s u r f a c er e c e p t o r sf c 丫黜，s t i m u l a t i n gp h a g o c y t o s i ss i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y t h e e x p e r i m e n t s f u r t h e rv 嘶母t h ef c 7 r sa j ei n v o l v e di n t h ev go p s o n i cp r o c e s s f l u o r e s e e i ni s o t h i o c y a n a t e ( f i t c ) - l a b e l e df c t r sm o n o c l o n a la n t i b o d y s ，r e s p e c t i v e l y f q , r i ，f e y r i ia n df c y r l l l ，w e r ei n c u b a t e dw i t hm a c r o p h a g e s i ti sf o u n dt h a tf e a r s m o n o c l o n f la n t i b o d y si sa b l et ob i n ds e ab a s sm a e r o p h a g e s ，i n d i c a t i n gt h a tt h es u r f a c e o fm a e r o p h a g e sh a sr e c e p t o r sf q , r i ，f c t r i ia n df c t r i i i t h e nt h e s et h r e ek i n d so f m o n o c l o n a la n t i b o d yw e r eu s e dt ob l o c kt h em a c r o p h a g ec e l ls u r f a c er e c e p t o r , t h r o u g hp h a g o c y t o s i sa s s a y si ti sf o u n dt h a tc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l ，t h eb l o c k e d r e c e p t o r sc a n i n h i b i tm a c r o p h a g e si n g e s tv gc o a t e dy e a s tt ov a r y i n gd e g r e e s ， i n d i c a t i n gf c r r i ，f c t r i ia n df c t r i i ia r ei n v o l v e di nv go p s o n i z a t i o n i na d d i t i o n , t h et h e s i so ft h ep r o t e i nt y r o s i n ek i n a s es k y , a n dp 1 3 - k i n a s ei si n v o l v e di nv g o p s o n i z a t i o np r o c e s sw e r es t u d i e d t h es e ab a s sm a c r o p h a g e sw e r et r e a t e dw i t h p r o t e i nt y r o s i n e k i n a s e s k y a n dp 1 3 - k i n a s e s p e c i f i ci n h i b i t o r s ，r e s p e c t i v e l y p i c e a t a n n o la n dw o r t m a n n i n , a f t e ro p s o n i cp h a g o c y t o s i sa s s a y sr e a l t i m ep c r w a s d o n et od e t e c ti n f l a m m a t o r yc y t o k i n e st n f 吨a n di l lpg e n ee x p r e s s i o nc h a n g e s i t i sd e n o t e dt h a tc o m p a r e dw i t ht h e c o n t r o lt r e a t m e n tg r o u p ，t n f 一仅a n di l - lp e x p r e s s i o no ft h ei n h i b i t o rt r e a t m e n tg r o u p sw e r es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d ( p o 0 5 ) t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ep r o t e i nt y r o s i n ek i n a s es k ya n dp 1 3 - k i n a s em a yb e i n v o l v e di nt h ep r o c e s so fv go p s o n i z a t i o ns i g n a lt r a n s d u c t i o n ，a f f e c t i n gp r o d u c t i o n o fi n f l a m m a t o r yc y t o k i n e s i ns u m m a r y , t h ep r e s e n ts t u d yb yi nv i t r oe x p e r i m e n t sd e m o n s t r a t e sf o rt h ef i r s t t i m et h a to p s o n i nf u n c t i o no ff i s hv gi sc o n s i s t e n tw i t ht h et y p eio p s o n i z a t i o n a st h e t y p elo p s o n i cp h a g o c y t o s i si sm e d i a t e db yi g ga n dc r p ( c r e a c t i v ep r o t e i n ) c a na l s o l v 鱼类卵黄蛋白原调理功能类型的研究 p l a ya st y p eip h a g o e y t o s i so p s o n i n s oi t a l s ob o l s t e r st h en o t i o nt h a tv ga n dc r p b o t hf u n c t i o nl i k ea n t i b o d y k e y w o r d s ：s e ab a s s ；v i t e l l o g e n i n ；m a c r o p h a g e ；f c t r s ；t y p eio p s o n i z a t i o n v 鱼类卵黄蛋白原调理功能类型的研究 鱼类卵黄蛋白原调理功能类型的研究 目录 第一章文献综述l l 前言1l 目茜l 1 1 鱼类吞噬细胞简介1 1 2 吞噬细胞杀菌机理2 2 吞噬调理作用研究进展5 2 1 吞噬调理的发现5 2 2 两种类型调理作用5 3 研究内容和技术路线1 2 第二章鲈鱼( 1 a t e o l s b r a x5 a p o n i c u s ) 巨噬细胞的分离及其吞噬动 力学1 5 1 前言1 5 2 材料与方法1 5 2 1 试验材料15 2 2 酵母的培养1 6 2 3f i t c 标记酵母16 2 4 巨噬细胞的分离1 7 2 5 巨噬细胞噬菌鉴定和吞噬动力学1 9 3 结果2 0 3 1 鲈鱼头肾巨噬细胞的分离j 2 0 3 2 巨噬细胞吞噬动力学2 l 4 讨论2 3 第三章卵黄蛋白原的调理作用2 5 1 前言2 5 v l l 鱼类卵黄蛋白原调理功能类型的研究 2 材料与方法2 6 2 1 试验材料2 6 2 2 酵母的培养、f i t c 标记酵母和巨噬细胞的分离同第二章2 7 2 3 六线鱼卵黄蛋白原对鲈鱼巨噬细胞的吞噬调理。2 7 2 4l a v e n d u s t i n 抑制巨噬细胞p t k 实验2 8 2 5p p l 抑制巨噬细胞p t k 实验2 9 2 6s t a u r o s p o r i n e 抑制巨噬细胞p k c 实验。2 9 2 7n o c o d a z o l e 抑制巨噬细胞m i c r o t u b u l e s 实验3 0 2 8c 3e x o e n z y m e 抑制巨噬细胞r h o 实验3 l 2 9 鲈鱼巨噬细胞上受体f c y r s 的鉴定3 l 2 1 0 受体f 啦s 的单克隆抗体对卵黄蛋白原调理功能的影响3 2 2 1 l 两种抑制剂对卵黄蛋白原调理作用的影响3 4 3 结果3 8 3 1 六线鱼卵黄蛋白原对鲈鱼巨噬细胞的调理。3 8 3 2l a v e n d u s t i n 抑制巨噬细胞p t k 实验3 9 3 3p p i 抑制巨噬细胞p t k 实验4 1 3 4s t a u r o s p o r i n e 抑制巨噬细胞p k c 实验4 3 3 5 不同浓度n o c o d a z o l e 抑制巨噬细胞m i c r o t u b u l e s 实验。4 5 3 6 不同浓度c 3e x o e n z y m e 抑制巨噬细胞r h o 实验4 6 3 7 巨噬细胞上受体f c 丫r s 的鉴定。4 7 3 8 受体f 吖r 的单克隆抗体对卵黄蛋白原调理功能的影响一4 8 3 9 两种抑制剂对卵黄蛋白原调理作用的影响5 0 4 讨论5 3 结论5 6 参考文献5 7 致谢“”一一- - 一- 6 7 作者简介丫6 9 鱼类卵黄蛋白原调理功能类型的研究 发表的学术论文一一一7 0 缩略语7 1 i x 鱼类卵黄蛋白原调理功能类型的研究 硬骨鱼类大约起源于4 亿年前，具有和高等脊椎动物相似的免疫系统。在解 剖学上，鱼类淋巴组织包括甲状腺、头肾、胰腺、肠道淋巴组织。淡水鱼和海水 鱼在免疫系统发育顺序上存在不同，前者胸腺最早发育，而后者肾脏最早发育。 像其他脊椎动物一样，鱼类免疫系统也由先天免疫和特异性免疫2 部分组成。但 是，作为低等脊椎动物，鱼类特异性免疫机制尚不完善，非特异性免疫占据重要 地位。鱼类执行非特异性免疫的组分主要包括吞噬细胞、天然杀伤细胞、补体和 抗菌分子。其中，吞噬细胞在鱼类抗感染免疫中发挥核心作用。当病原微生物进 入鱼体后，血液中颗粒细胞和单核细胞能够破坏存在于循环系统中的微生物，并 且在器官和组织中具有吞噬活性的细胞能够摄取和降解微生物及其产物，还能够 被微生物的有害产物激活并产生更多更有效的抗微生物因子。 1 1 鱼类吞噬细胞简介 鱼类吞噬细胞( p h a g o c y t e s ) 主要包括巨噬细胞( m a c r o p h a g e s ) 和粒细胞 ( g r a n u l o c y t e s ) 。它们可以快速运动到发炎部位，抵抗入侵病原。吞噬细胞基本功 能是识别病原并限制感染病原的扩散和生长。吞噬细胞广泛分布于鱼体内，保证 鱼类能有效监视入侵的病原，并将其快速吞噬。 巨噬细胞可以从不同组织分离，包括血液、淋巴器官( 特别是肾脏) 和腹膜腔。 鱼类肾脏分为头肾、中肾和后肾三部分。肾脏在成鱼头肾已失去排泄功能，保留 了造血和内分泌的功能，而成为造血器官和免疫器官f l a n g ee ta 1 ，1 9 8 6 ) ，在免疫 反应中具有重要作用( k a a t t a r ia n di r w i n ，1 9 8 5 ) 。鱼类的头肾内含丰富的单核巨噬 细胞。硬骨鱼类头肾散布在靠近鱼体围心腔的致密窦状隙中，由网状基质上皮细 胞支撑，具有类似哺乳动物中枢免疫器官和外周免疫器官的双重功能，同时还相 当于哺乳动物的骨髓，在不依赖抗原刺激时头肾可以产生红细胞和b 淋巴细胞 等效应细胞，是免疫细胞的发源地( m e s e g u e re ta 1 ，1 9 9 5 ) 。在受到抗原刺激后， 头肾和后肾造血实质细胞出现增生，形成抗体产生细胞，这表明头肾是硬骨鱼类 重要的抗体产生器官，相当于哺乳动物的淋巴结。通过密度梯度离心可以把巨噬 细胞和淋巴细胞、母细胞分开，因为巨噬细胞大且具颗粒( s e c o m b e se ta 1 ，1 9 9 0 ) 。 鱼类卵黄蛋白原调理功能类型的研究 目前，已有人从不同鱼的头肾中分离得到巨噬细胞。b e t o u l l e 等( 2 0 0 0 ) 利用 3 4 1 5 1 ( v ：v ) p e r c o l l 密度梯度离心法从虹鳟鱼头肾中分离得到了巨噬细胞。 j o e r i n k 等( 2 0 0 6 ) 利用5 1 p c r c o l l 密度梯度离心法从鲤鱼头肾中分离得到巨噬细 胞。 巨噬细胞吞噬细胞细胞膜可以包裹细菌等颗粒状物质并将其吞入胞内加以 清，这种现象称为吞噬或吞噬作用。吞噬有三个主要属性：( 1 ) 吞噬大颗粒，直 径至少在0 5 微米；( 2 ) 该过程是由质膜受体与颗粒表面的特异配体结合；( 3 ) 配体 受体复合物触发膜肌动蛋白为基础的细胞骨架局部重组，提供吞噬颗粒的动力。 吞噬作用可以分成三个阶段：细菌等病原附着( a t t a c h m e n t ) 至l j 吞噬细胞表面、内吞 ( i n g e s t i o n ) 并形成吞噬体( p h a g o s o m e ) 以及病原在吞噬体内降解。病原附着到吞噬 细胞膜上是吞噬作用的先决条件，这是一个相对被动的过程。鱼类吞噬细胞有能 力辨别病原，表明有细胞表面受体参与其中。业已证明罗非鱼巨噬细胞有凝集素 样受体( s a g g e r se ta 1 ，1 9 8 9 ) 。把罗非鱼巨噬细胞先与岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、 甘露糖、甲基甘露糖苷和乙酰氨基葡糖培养，吞噬作用被显著抑制。大西洋鲑巨 噬细胞具有葡聚糖受体，可以识别酵母和真菌( e n g s t a dr ee ta 1 ，1 9 9 4 ) 。病原颗粒 内吞是一个主动过程，表现为吞x ( e n g u l f m e n t ) 或包裹( e n f o l d m e n t ) 。吞入时，吞 噬细胞伪足伸长，包围异源颗粒并融合，把形成的吞噬体拖入细胞内；在包裹时， 吞噬细胞各伪足数次环绕并包围病原颗粒，最后融合形成吞噬体。吞入和包裹都 需要细胞骨架蛋白如肌动蛋白主动参与。因此，与可致使细胞内肌动蛋白失活的 肉瘤杆菌毒素共育，就可以阻止吞噬细胞的吞噬作用( k o d a m ae ta 1 ，1 9 9 4 ) 。c a 2 + 也为吞噬作用必需，无c a 2 + 时吞噬作用就会受阻( l e i r 0e ta 1 ，1 9 9 5 ) 。另外，温度、 培养时间以及病原颗粒和吞噬细胞之比，都会影响吞噬作用。病原被内吞后，细 胞内胞质颗粒和囊泡环绕吞噬体并与之融合，把内含物释放到病原颗粒四周腔隙 内。胞质颗粒和囊泡含有各种水解酶如蛋白酶、核酸酶、磷酸酶、酯酶和脂肪酶 以及抗菌肽，可以分解杀灭病原( n o r m a ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。吞噬细胞颗粒内含物也可 以释放到细胞外，杀灭病原。 1 2 吞噬细胞杀菌机理 吞噬细胞可以杀灭病原，其机制可广义地分为氧依赖型和非氧依赖型两种 ( s e c o m b e se ta 1 ，1 9 9 2 ) 。许多情况下病原是微生物，鱼类吞噬细胞的杀灭作用是 2 鱼类卵黄蛋白原调理功能类型的研究 一个细胞内事件，过程相对迅速。不过，胞外杀灭作用也显然会发生，例如虹鳟 巨噬细胞对蠕虫的杀灭。 1 2 1 氧依赖型吞噬 吞噬细胞吞噬病原时，氧吸收增加，而这一过程和线粒体呼吸无关，也就是 代谢抑制剂不能阻止氧吸收增加。例如，虹鳟头肾吞噬细胞用酵母聚糖刺激后， 氧耗约为1 2n m o lo d m i r d l 0 7 细胞，而静止细胞的氧耗为1 3n m o l0 2 m i r d l 0 7 细 胞( n a g e l k e r k ee ta 1 ，1 9 9 0 ) ，这就是所谓呼吸爆发，呼吸爆发结果产生对细菌和寄 生虫有毒的氧自由基和氮自由基。 1 2 1 1 氧自由基 鱼类吞噬细胞呼吸爆发过程中产生氧自由基，如0 2 。和h 2 0 2 。呼吸爆发主要 反应是在n a d p h 氧化酶催化下氧分子发生一个电子还原成为0 2 。哺乳类 n a d p h 氧化酶是一种存在于细胞质膜上的多酶复合体，主要由低能细胞色素b 和一种色素蛋白组成，并通过还原态n a d p h 起电子传递链作用。n a d p h 由磷 酸己糖旁路产生，这一过程具有葡萄糖依赖性。有证据表明，虹鳟吞噬细胞中存 在n a d p h 氧化酶，也存在葡萄糖依赖性0 2 。生成作用，说明相似情形也出现在 鱼类( s e c o m b e se ta 1 ，19 9 2 ) 。清除剂抑制剂研究表明：鱼类巨噬细胞产生的0 2 。 对鱼类病原毒性不大，但所产生的h 2 0 2 及其衍生物就像无细胞体系中的h 2 0 2 是强杀菌剂一样，有很强毒性。某些细菌可以通过抑制氧自由基产生而逃脱吞噬 细胞的吞噬，例如爱德华氏细菌n u f 2 5 1 能够抑制牙鲆巨噬细胞产生氧自由基， 避免被氧自由基伤害而在巨噬细胞内生存下来( k e i k oe ta 1 ，2 0 0 9 ) 。 如同吞噬作用一样，对病原调理可促使氧自由基产生增加。因此，经正常血 清或加热灭活抗血清调理的细菌，都能促进氧自由基产生；经抗体和补体同时调 理的细菌诱导产生氧自由基能力最强。同样，吞噬细胞和病原之比会影响氧自由 基产生，就大西洋鲑中性粒细胞和杀鲑气单胞菌而言，最佳比例为1 ：5 0 到 1 ：1 0 0 ( l a m a se ta 1 ，1 9 9 4 ) 。活细菌通常比死细菌刺激性强，但是，吞噬细胞和病 原比过大会抑制氧自由基产生。菌株的相对毒性和温度也能影响氧自由基产生。 1 2 1 2 氮自由基 越来越多证据表明鱼类能产生活性氮自由基，如一氧化氮( n o ) 。对n o 认识 主要来自对神经系统的研究。在神经系统中，n o 是细胞间和细胞内信使。n o 鱼类卵黄蛋白原调理功能类型的研究 由精氨酸在n o 合酶作用下合成；n o 合酶水解末端碳产生瓜氨酸和n o 。组织 化学研究表明：n o 合酶存在于大西洋鲑( o s t h o l me ta 1 ，19 9 4 ) 和虹鳟( s c h o b e re t a 1 ，1 9 9 3 ) 中枢神经系统和脑内。在哺乳类，有2 种n o 合酶：组成型n o 合酶和 诱导型n o 合酶。吞噬细胞尤其是巨噬细胞经细胞因子诱导后，可以表达诱导型 n o 合酶。n o 合酶的表达对某些病原的杀灭至关重要，虽然n o 本身不足以启 动脂质过氧化等有害反应。不过，n o 可以形成更强的过氧化、硝化和亚硝化基 团，如o h 、n 0 2 、n 2 0 3 和n 0 2 + 。另外，n o 能和铁反应，形成亚硝酰血红素复 合物；能和氧自由基反应，形成过氧化亚硝酸盐o n o o 。大量研究表明，鱼类 也具有诱导型n o 合酶( n o r m a ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 虹鳟( t i e h u ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 、鲤鱼( s a e i je ta 1 ，2 0 0 0 ) 和猫鲨( j e n n i f e re ta 1 ，2 0 0 6 ) 的诱导型n o 合酶全长基因已经被克隆出来。鲤鱼吞噬细胞被血内鞭毛虫刺激 后，就表达诱导型n o 合酶( s a e i je ta 1 ，2 0 0 0 ) 。病毒可以诱导虹鳟诱导型n o 合 酶基因表达( 面e h u ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 。鲇鱼腹腔内注射活爱德华氏细菌后，在其头肾检 测到n o 合酶( s c h o o re ta 1 ，1 9 9 4 ) 。同样，l p s 能够诱导金鱼诱导型n o 合酶表达。 在金鱼中，巨噬细胞系和原代培养的肾巨噬细胞与l p s 或含巨噬细胞活化因子 培养液共育后，都能分泌n o 。含巨噬细胞活化因子培养液和l p s 可以协同作用， 诱导n o 产生( n e u m a n ne ta 1 。19 9 5 ) 。这些结果显示诱导型n o 合酶表达和n o 产 生之间存在联系。添加精氨酸类似物( 单甲基精氨酸或氨基胍) 到金鱼巨噬细胞培 养物中，可以抑制n o 产生，说明鱼类n o 产生具有精氨酸代谢依赖性。转铁蛋 白似乎也可以诱导鱼类巨噬细胞产生n o ( s t a f f o r d 几，e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。有证据表明， 鱼类吞噬细胞产生的n o 具有一定杀菌活性。活化的鲇鱼巨噬细胞可以部分杀灭 气单胞菌，并且其杀菌活性能被产生n o 的抑制剂n 6 m m l a 部分抑n ( y me ta 1 ， 1 9 9 7 ) 。 1 2 2 非氧依赖型吞噬 目前，对鱼类吞噬细胞非氧依赖型杀菌机制所知甚少。已知鱼类吞噬细胞含 有各种酶类，它们和吞噬体融合后，可能发挥杀菌作用。已经明确知道鱼类吞噬 细胞具有溶菌酶，它能够杀灭一些鱼类病原，并可以分泌到细胞外行使杀菌作用 ( d a u t i g n ye ta 1 ，1 9 9 1 ) 。一些阳离子蛋白也有杀灭鱼类病原的功能，例如抗菌肽 h e p c i d i n 等。鱼类还存在抗病毒活性蛋白，如抗粘液病毒活性的蛋白m x ( l a r s e n 4 鱼类卵黄蛋白原调理功能类型的研究 e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。大西洋鲑m x l 能够抵抗感染性胰腺坏死病毒感染；牙鲆m x 能够抵 抗杆状病毒感染。另外，细胞因子如肿瘤坏死因子也可能具有无氧杀菌功能。肿 瘤坏死因子已经被证明存在于鱼类吞噬细胞i 内( j a n ge ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 2 吞噬调理作用研究进展 2 1 吞噬调理的发现 一些能与抗原结合并促进吞噬细胞吞噬功能的物质称为调理素( o p s o n i n ) ：通 过结合调理素辅助吞噬作用的现象称为调理化( o p s o n i z a t i o n ) 。目前，发现的调理 素主要有i g g 类抗体及补体活化成分c 3 b ，纤维连接蛋i 兰t ( f i b r o n e c t i n ) 亦有较弱 的调理作用。经具有溶血活性正常血清调理的病原与巨噬细胞和中性粒细胞的黏 附以及随后的内吞作用都大为增加，而加热失活的正常血清的调理作用大为减弱 ( m a t s u y a m a e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。把调理的病原和鱼c 3 抗血清共育，则调理作用消失。 另外，纯化的哺乳类补体成分对病原也具有调理作用( j o h n s o ne ta 1 ，1 9 8 4 ) 。这些 都表明补体是重要调理因子。通过经典和替代途径激活补体，都可以有效发挥调 理作用。有研究证明，用补体或者加热的免疫血清对a s a l m o n 耙i d a 调理能促进 吞噬作用，然而加热的正常血清并无此功能( l a m a se ta 1 ，1 9 9 4 ) 。抗体也能提高抗 菌活性和吞噬能力，用抗体对绵羊红血细胞的调理，结果提高了大菱鲆巨噬细胞 的吞噬能力( f i g u e r a se ta 1 ，1 9 9 7 ) 。另外，虹鳟鱼巨噬细胞在特异性抗体存在时对 a s