（遗传学专业论文）人源性上皮细胞的分离鉴定及其向胰岛素分泌细胞诱导的初步研究.pdf

中南大学硕士学位论文中文摘要 摘要 干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞，能够 产生至少一种类型的，高度分化的子代细胞。按照发生学来源，干细 胞可分为胚胎干细胞( e m b r y o n i cs t e mc e l l ，e s c ) 和成体干细胞( a d u l t s t e mc e l l ，a s c ) 。成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分 化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的 细胞。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。在多数情况下，成 体干细胞分化为与其组织来源一致的细胞，但是在某些情况下，成体 干细胞的分化并不遵循这个规律，表现出很强的跨系或跨胚层分化潜 能。 本课题组使用特定的分离培养方法，从人胎盘羊膜上分离得到羊 膜上皮细胞( h u m a na m n i o t i ce p i t h e l i a lc e l l s ，h a e c s ) ，体外进行 h a e c s 原代及传代培养，对体外培养的h a e c s 进行了一系列生物学鉴 定，优化培养体系，建立了具有一定标本量的h a e c s 细胞库。在此基 础上，对h a e c s 向胰岛素分泌细胞体外定向诱导分化的条件进行了摸 索，成功诱导h a e c s 生成胰岛素分泌细胞，并初步探讨了h a e c s 向胰 岛素分泌细胞定向诱导分化的机制。本研究分为两大部分，主要研究 方法和结果如下： 中南大学硕士学位论文中文摘要 第一章人羊膜上皮细胞( h u m a na m n i o t i ce p i t h e l i a lc e l l s ， h a e c s ) 的分离及其干细胞生物学特征的鉴定 目的：分离人羊膜上皮细胞，建立人羊膜上皮细胞库，检测人羊 膜上皮细胞的干细胞生物学特征。 方法：收集人羊膜标本，采用自定义的标准进行分级评定，分i 、 i i 、i i i 级( 具体分级标准见论文第一部分) ；台盼蓝排斥实验检测分 离得到的h a e c s 活细胞百分比，绘制生长曲线评价不同级别羊膜标 本分离得到h a e c s 的细胞数量和细胞活力。对h a e c s 的干细胞生物 学特征进行四个方面的检测：r t - p c r 检测胚胎干细胞全能性基因表 达，细胞免疫荧光检测胚胎干细胞表面标记，碱性磷酸酶( 舢o ) 染 色检测h a e c s 未分化性以及细胞核型普通g 显带检测其培养过程中 染色体的稳定性。 结果：i 、i i 、级羊膜标本所能收获h a e c s 数量不同，以约 l d m 2 面积羊膜而言，i 级羊膜可收获约( 1 1 2 5 3 士2 3 ) x 1 0 7 个细胞； i i 级羊膜标本可收获约( 8 士1 9 ) x 1 0 7 个细胞；i 级羊膜标本可收获 的细胞数量不足1 0 5 个细胞且这些细胞中的大部分都不能正常贴壁。 台盼蓝排斥实验结果显示，i 级羊膜标本活细胞百分比约为8 9 7 - 4 - 2 1 ；i i 级羊膜标本活细胞百分比约为7 7 8 1 士3 4 ；i i i 级羊膜标 本活细胞百分比约为2 1 6 _ - 1 ：4 5 。生长曲线的评价结果显示，细胞 的分裂增殖能力随羊膜标本质量的降低明显减退。建立了一个小型羊 膜细胞库，冻存h a e c s 达近3 0 0 管。 h 中南大学硕士学位论文 中文摘要 h a e c s 细胞表现s s e a 4 强阳性，t r a 1 6 0 和t r a 1 8 1 弱阳性； a k p 染色呈现部分阳性。连续传代三次的h a e c s 全能性相关基因的 表达检测结果显示：o c t 4 、t e r f l 基因在三代h a e c s 中的表达未见 明显差别；t h y 、n a n o g 基因的表达在三代中呈现逐渐加强的趋势； l e f t y 在第二代h a e c s 中表达最强，在另外两代h a e c s 中的表达无 明显差别；s o x 2 基因在三代中的表达呈现下降趋势。染色体g 显带 分析的结果显示，体外经连续传代培养达至少1 0 代的h a e c s 仍保持 了其染色体数目不变和染色体普通g 显带核型正常。 结论：1 人羊膜上皮细胞适合建库，已建立了一个小型的羊膜 细胞库。2 建立了一种行之有效的h a e c s 分离方法及适合h a e c s 体外增殖和扩增的培养体系。3 原代及体外连续传代两代之内的 h a e c s 在细胞生长形态，全能性基因表达，细胞表面标记以及碱性磷 酸酶染色等方面均无明显区别；4 体外连续传代培养的h a e c s 可以 保持其遗传学稳定性。 第二章人羊膜上皮细胞( h u m a n a m n i o t i ce p i t h e l i a lc e l l s ， h e a c s ) 向胰岛素分泌细胞诱导分化的初步研究 目的：研究尼克酰氨联合细胞因子n 2 的培养体系对人羊膜上皮 细胞向胰岛素分泌细胞定向诱导分化的影响。 方法：体外扩增一代的h a e c s 接种至琼脂粉铺皿的细胞培养皿 中，采用如下诱导体系：1 ) l o w - d m e m + e g f2 ) l o w - d m e m + n 2 + 尼克酰氨+ e g f 。r t - p c r 检测诱导后细胞i n s u l i n ，g l u c a g o n ，p d x l ， i i l 中南大学硕士学位论文 中文摘要 n k x 6 1 ，n g n 3 等胰腺a ，1 3 细胞发育相关基因的表达；流式细胞术分 析细胞表面标记p d x l 的表达；细胞免疫荧光检测胰岛素分泌细胞表 面i n s u l i n ，n e s t i n 和g l u c a g o n 标记的表达；葡萄糖刺激的胰岛素释放 实验检测诱导后细胞对葡萄糖的应激性。为优化诱导体系，使用半定 量r t - p c r 检测不同诱导时间点的h a e c s 细胞胰腺相关基因的表达， 如i n s u l i n ，g l u c a g o n ，p d x l ，n k x 6 1 ，n g n 3 等；r t - p c r 检测细胞外 黏附因子e c a d h e r i n 基因表达情况。 结果：诱导后的h a e c s 表达p d x l ，n k x 6 1 ，i n s u l i n ，p a x 6 ，i s l l ，n g n 3 等胰腺q ，p 细胞相关基因，弱表达g l u c a g o n 基因。诱导第三天h a e c s 开始表达p d x l ，表达率约为2 1 1 - 4 - 3 4 ；诱导1 4 天后的h a e c s 细胞表面i n s u l i n 标记表达可达1 3 6 4 士1 6 ；h a e c s 经诱导后形成 的类胰岛细胞团样细胞具有生物学功能，能对不同浓度的葡萄糖刺激 产生反应，在1 6 5 m m 浓度葡萄糖刺激下，其胰岛素释放量平均可达 5 9 4 3 4 - 6 0v u m l 。 对不同诱导时间点的h a e c s 基因表达分析结果显示：i n s u l i n 基因 和g l u c a g o n 基因具有不同的表达趋势。i n s u l i n 基因表达在第一周的时 候上调，随后下降；g l u c a g o n 基因在诱导前3 天未见表达，诱导第4 天时可以检测到表达，第l o 天出现表达高峰，随后表达下调。p d x l ， n k x 6 1 等这些1 3 细胞分化和胰岛素转录的重要转录因子的表达趋势与 i n s u l i n 的表达趋势相一致；n g n 3 基因表达处于一个相对稳定状态。 没经诱导的h a e c s 和诱导8 天时的h a e c s 均表达e c a d h e r i n 基因； 但诱导1 4 天后的h a e c s 未见e c a d h e r i n 基因的表达。 结论：h a e c s 细胞可以在体外被定向诱导分化形成胰岛素分泌 细胞。 关键词：人羊膜上皮细胞，生物学特征，胰岛素分泌细胞，诱导分化 i v 中南大学硕士学位论文中文摘要 课题创新性：1 ) 首次采用d n a s ei 联合胰蛋白酶消化分离人羊 膜上皮细胞；2 ) 建立了初具规模的人羊膜上皮细胞库；3 ) 首次分析 了人羊膜上皮细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞过程中基因表达时程 差异，为进一步提高诱导分化的效率提供更好的基础；4 ) 首次对人羊 膜上皮细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的诱导机制进行了初步探讨。 v 中南大学硕士学位论文英文摘要 a b s t r a c t c h a p t e r1t h ei s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fh u m a n a m n i o t i ce p i t h e l i a lc e l l s o b j e c f i v e s ：w ea i m e dt op u r i f yt h eh a e c si s o l a t e df r o mh u m a n a m n i o na n dt oi d e n t i f yt h es t e mc e l lr e l a t e dc h a r a c t e r i s t i c so ft h e ms ot h a t w ec o u l de s t a b l i s hac e l lb a n kf o rf u r t h e rs t u d i e s m e t h o d s ：w ed e f i n e dh u m a na m n i o n sa sc l a s si 、i i 、i i id e p e n d i n g o nt h et r a n s p a r e n c ea n dc l e a n l i n e s so ft h ea r n n i o n s t r y p a n - b l u es t a i n i n g w a su s e df o rd e t e c t i n gt h er a t i oo fl i v i n gc e l l s t h eg r o w t hc u r v ew a s d r a w nf o rj u d g i n gt h ec h a r a c t e r i s t i c so fc e l l si s o l a t e df r o md i f f e r e n t p l a c e n t a so fd i f f e r e n tc l a s s e s r t - p c r , i m m u n o c y t o f l u o r e s c e n t a la n a l y s i s a n da k pd y e i n gw e r eu s e dr e s p e c t i v e l yf o ri d e n t i f y i n gt h es t e mc e l l c h a r a c t e r i s t i c so fh a e c s t h ec e l ls a m p l e so fd i f f e r e n tp a s s a g e sw e r e c o l l e c t e da n dt h e ns e m i q u a n t i t yr t - p c rw a sp e r f o r m e dt oe x a m i n et h e p l u r i p o t e n c y - r e l a t e dg e n e se x p r e s s i o n ，s u c ha so c t 一4 ，n a n o g ，t e r f1 ， t h y 1 ，l e f t y a ，a n dr e x - 1 i m m u n o c y t o f l u o r e s c e n t a la n a l y s i sw a s t a k e nt ot e s tt h ee x p r e s s i o no f s t e mc e l lr e l a t e dm a r k e r s ，s u c ha st r a - 61 + ， t r a 8 0 + ，s s e a 1 + ，s s e a 3 + a n ds s e a 4 + a k pd y e i n gw a sp e r f o r m e d t od e t e c tt h ea k p p o s i t i v ec e l l s c h r o m o s o m eg i e m s ab a n da n a l y s i sw a s u n d e r t a k e nt oe v a l u a t et h e g e n e t i cs t a b i l i t y o fh a e c sc u l t u r e d c o n t i n u o u s l yi nv i t r of o r10p a s s a g e s v i 中南大学硕士学位论文英文摘要 r e s u l t s ：1 w eh a v ec o l l e c t e d6 2a m n i o ns a m p l e s ，a n de s t a b l i s h e da 也墟e e l lb a n kw i t hf r o z e ne e l lt ot h ea m o u n to f3 0 0t u b e s 2 a m n i o no f c l a s sii st h em o s ta b u n d a n tw i t hah a e c s y i e l do f ( 1 1 2 5 3 + 2 3 ) x 1 0 7 c e l l s d m 2 3 t r y p a n b l u es t a i n i n gs h o w e dt h a tt h er a t i oo fl i v i n gc e l l s w a sm o r et h a n7 5 4 a l m o s ta l lo ft h et o t i p o t e n tg e n e se x p r e s s e di n e a c hp a s s a g eo fh a e c s t h y1 g e n ee x p r e s s i o nu p r e g u l a t e di np 0 ，p1 ， p 2g r a d u a l l y ；l e f t y a ，s o x 2 ，o c t - 4a n dt e r f1 g e n es h o w e dt h es a m e l e v e l sa m o n g3p a s s a g e s 5 i m m u n o c y t o f l u o r e s c e n ta n a l y s i ss h o w e dt h a t m o s to fh a e c sw e r es s e a 4 + ，p a r to ft h e mw e r ep o s i t i v ew e a k l yt o t r a 一1 6 0 ，t r a 1 81 6 a k pd y e i n gs u g g e s t e dt h a ta k p + c e l l se x i s t e d i np o ，p l ，p 2h a e c s 7 c h r o m o s o m eg i e m s ab a n da n a l y s i ss h o w e dt h e c h r o m o s o m e sm a i n t a i n e dn o r m a l ，e v e nc u l t u r e df o r10p a s s a g e s c o n c l u s i o n s ：1 w ee s t a b l i s h e dam i n i a t u r el u 垣c e l lb a n kf o r f u r t h e rs t u d i e s 2 t h e r ea r en oo b v i o u s b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c d i f f e r e n c e sa m o n gp 0 ，p1 ，p 2h a e c s v 中南大学硕士学位论文 英文摘要 c h a p t e r2t h ed i f f e r e n t i a t i o no fh u m a na m n i o t i ce p i t h e l i a l c e l l st oi n s u l i n s e c r e t i n gc e l l s o b j e c t i v e s ：t oi n v e s t i g a t et h ei n d u c t i o nd i f f e r e n t i a t i o nf r o mh a e c s i n t o i n s u l i n s e c r e t i n gc e l l sb yu s i n gc u l t u r em e d i u ms u p p l i e dw i t h n i c o t i n a - m i d ea n dc y t o k i n en 2 m e t h o d s ：p1h a e c sw a ss e e d e di nc e l ld i s hc o a t e dw i t ha g a r p o w d e r r t - p c rw a sp e r f o r m e dt ot e s t i n gt h ee x p r e s s i o no fp a n c r e a t i c d e v e l o p m e n t - r e l a t e dg e n e ss u c h a si n s u l i n ，g l u c a g o n ，p d xl ，n k x 6 1a n d n g r o f l o wc y t o m e t r y w a su s e dt od e t e c tt h ep d x1 + c e l l i m m u n o f l u o r e s c e n c ew a sp e r f o r m e dt ot e s tp - c e l ls p e c i f i cm a r k e ri n s u l i n g l u c o s e s t i m u l a t e di n s u l i nr e l e a s ee x p e r i m e n tw a st a k e nt ot e s tt h e r e a c t i o na b i l i t yo fi n d u c e dh a e c s s e m i q u a n t i t yr t - p c rw a su s e dt o e v a l u a t e t h e c h r o n o l o g i c a lg e n ee x p r e s s i o nc h a n g e sd u r i n ga 14 一d a y i n d u c t i v ec o u r s e ，s u c ha sp d xl ，n g n 3 ，p a x 6 ，n k x 6 1 ，i n s u l i na n dg l u c a g o n r t - p c rw a s p e r f o r m e d t od e t e c tt h e e x p r e s s i o n o fa d h e s i o n f a c t o r - r e l a t e dg e n ee - c a d h e r i n r e s u l t s ：1 r t - p c rr e s u l t ss h o w e dt h a tp d x l ，n k x 6 1 ，i n s u l i n ，p a x 6 ， i s l l ，n g n 3w e r ee x p r e s s e di nh a e c sa f t e r i n d u c t i o n 2 p d x l + c e l l n u m b e ra m o u n t e dt o21 1o 社3 4 a f t e r3d a y si n d u c t i o n 3 i n s u l i n + c e l l s n u m b e ra c h i e v e d13 6 4 0 硅1 6 a f t e r2w e e k s g t h ea v e r a g ei n s u l i n r e l e a s eo fh a e c sr e a c h e da b o u t5 9 4 3 + 6 0v u m 1 5 t h e g e n e 中南大学硕士学位论文英文摘要 c h r o n o l o g i c a le x p r e s s i o na n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fi n s u l i n g e n e w a sf i r s t u p - r e g u l a t e d i nt h ef i r s tw e e ka n d s u b s e q u e n t l y d o w n - r e g u l a t e d ，w h i l et h eg l u c a g o n g e n ee x p r e s s i o ns h o w e dd o w n r e g u l a t i o na f t e rt h ec r e s t - t i m ea td a y10 e x p r e s s i o nt e n d e n c yo fp d xl ， n k x 6 1g e n ew a ss i m i l a rt ot h a to fi n s u l i ng e n e n g n 3w e r es t e a d y l y e x p r e s s e di na l lo ft h es a m p l e s 6 e - c a d h e r i ng e n ee x p r e s s e di nh a e c s i n d u c e df o r8d a y s ，b u tn o te x p r e s s e di nh a e c si n d u c e df o r14d a y s c o n c l u s i o n s ：h a e c sc o u l db ed i f f e r e n t i a t e di n t oi n s u l i n s e c r e t i n g c e l l si nv i t r ob y u s i n gt h e i n d u c t i o ns y s t e m k e yw o r d s ：h u m a na m n i o t i c e p i t h e l i a lc e l l s ，c e l lb a n k , b i o l o g yc h a r a c t e r i s t i c s ，i n s u l i n - s e c r e t i n gc e l l s ，i n d u c i n gd i f f e r e n t i a t i o n i x 中南大学硕士学位论文 中英文对照表 专业名词缩写中英文对照表 缩写 全称中译名称 h a e c sh u m a na m n i o t i ce p i t h e l i a lc e l l s 人羊膜上皮细胞 a k p a l k a l i n ep h o s p h a t a s e 碱性磷酸酶 e d n a c o m p l e m e n t a r yd n a互补d n a d n a s ei d e o x y r i b o n u c l e a s ei脱氧核糖核酸酶i d m s o d i m a t h y ls u l f o x i d e二甲亚砜 e g f e p i t h e l i a lg r o w t hf a c t o r 表皮生长因子 f b sf e t a lb o v i n es e r u m 胎牛血清 f i t cf l u o r e s e e i ni s o t h i o c y a n a t e 异硫氰酸荧光素 h e s c sh u m a n e m b r y o n i cs t e mc e l l人胚胎干细胞 l - g l - g l u t a m i n e左旋谷氨酰胺 m r n a m e s s e n g e rr n a信使r n a n i en i c o t i n a m i d e 尼克酰氨 n e a an o n - e s s e n t i a la m i n oa c i d 非必需氨基酸 o d o p t i c a ld e n s i t y光密度 p b s p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e磷酸盐缓冲液 p 1 p a s s a g el第l 代( 依此类推) p e p h y c o e r y t h r i n 藻红蛋白 r t - p c rr e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 逆转录聚合酶链式反应 x l l 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 储签名：扯眺堕年尘月蛳 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名： 导师签每避日期：必五月。 中南大学硕士学位论文技术路线 技术路线 一分一一堍一一本二鞘一一标二足一 中南大学硕士学位论文日舌 上- ! 鱼 刖昂 发育生物学过程的本质是受精卵的基因型按着一定的时间和空间的逐步表 达：由于胚胎细胞中不同基因被激活，转录出不同的m r _ n a ，继而产生不同的特 异性结构和功能蛋白，完成细胞分化、增殖和形态发生，最后塑造成一个具有一 定结构和功能的器官。 胰腺的整个发育过程是一个涉及多基因、多环节、多途径的网络调控过程。 形态发生是形成胚胎外部形态和内部构型的全过程通称，是发育生物学研究的一 个重要组成部分。w e s s e l l s 等在啮齿类动物早期胚胎实验研究中分别对胰腺早 期发育的情况做了详尽的描述【h2 1 ：胰腺发育起源于内胚层，在2 0 2 5 体节之间， 间充质包被于肠背侧，胰背芽也开始形成，腹芽的发生大约在第3 0 体节期，其发 育过程与背芽完全相同，只是时间上有所延后。人的胰腺主要包括胰腺内分泌腺 和胰腺外分泌腺两大部分，胰腺外分泌腺主要是一些胰导管和腺泡组织，经典的 胰腺内分泌腺中存在4 种具有不同功能的细胞，即：a ，b ，6 和p p 。分别分泌 ： 胰高血糖素，胰岛素，生长抑素和胰多肽。最近的研究表明，胰腺内分泌细胞中 还存在一种表达g h r e l i n 的细胞。g h r e l i n 是近年从大鼠胃组织中首先发现的一 种调节肽【3 】，为g h s r 的内源性配体，具有促进g h 释放的作用。细胞在发 育生物学，细胞形态学等方面不同于上述任何一种细胞，故被认为是一种独立的 胰岛细胞类型。胰腺内分泌腺中1 3 细胞在数量上最多，约占成年胰岛细胞的7 5 。只有1 3 细胞具有分泌胰岛素的功能，对于体内葡萄糖浓度的调节起关键作用。 糖尿病是由于体内胰岛素的相对或绝对缺乏引起的一种疾病，目前主要分 为两种类型：1 型糖尿病和2 型糖尿病【5 】o1 型糖尿病又称胰岛素依赖型糖尿病， 通常是由于体内b 细胞功能受损而导致胰岛素分泌障碍，引起体内胰岛素绝对缺 乏从而导致血糖持续升高，出现糖尿病【4 ，5 1 。1 型糖尿病属于器官特异性自身免疫 性疾病，患者由于免疫系统的异常产生了可以破坏人体内分泌胰岛素的胰岛细 胞，导致胰岛素下降、血糖升高而发病。据流行病学调查，我国糖尿病患者约 4 0 0 0 万，居世界第二位，其中1 型糖尿病患者约占5 ，其也占糖尿病患者的5 1 0 。1 型糖尿病是依赖胰岛素治疗的，也就是说患者从发病开始就需使用胰 岛素治疗，并且终身使用。 2 中南大学硕士学位论文 在1 9 2 1 年胰岛素发现以前，没有较好的方法来降低糖尿病患者的血糖，患 者多在发病后不久死于糖尿病的各种并发症。随着胰岛素的发现和应用于临床， l 型糖尿病患者同样可以享受几乎同正常人一样的健康和寿命。但是，对于胰岛 素的终身依赖，却同时又让许多患者苦不堪言，因此，迫切需要更为理想的治疗方 法让l 型糖尿病患者们摆脱对胰岛素终身依赖的痛苦。 随着医学的发展，器官移植问世，这在很大程度上改变了i 型糖尿病患者的生 活，通过器官移植，可以摆脱对胰岛素的依赖，然而，能供移植的器官毕竟数量有 限：并且器官移植所需的手术费用也常常让入望而却步；再者，移植的器官往往 会引起较强的免疫排斥，这也是困扰医生和患者的一大难题。2 0 0 0 年1 0 月，加拿 大科学家采用成人胰岛细胞移植治疗糖尿病获得成功( e d m o n t o n 方案i s , s ) ，7 例1 型糖尿病患者经手术后随访一年，均完全停用胰岛素治疗。第1 8 届国际糖尿病联 盟年会报道，截止2 0 0 3 年e d m o n t o n 协作小组共实施了4 7 例胰岛移植，均获得良 好疗效。在2 0 0 6 年7 月举行的世界器官移植大会上，世界权威移植专家预测：今 后3 年，治疗糖尿病的外科方法中，9 0 将是成人胰岛细胞移植。胰岛移植是治 疗胰岛素依赖性糖尿病的另一种有效方法【6 7 9 1 ，有实验资料证明：胰岛移植不仅 能够调节糖代谢的紊乱，而且能够有效地防止或逆转糖尿病的微血管病变i l o j 。 但是，胰岛移植治疗糖尿病仍然需要解决两大难题：( 1 ) 胰岛供体缺乏国 际胰岛移植登记处公布至u 2 0 0 0 年全球仅开展了4 9 3 例成人胰岛移植，根本无法满 足众多糖尿病患者的需求。在我国，由于长期的计划生育政策，导致了能够符合 要求的供者更加缺少，移植手术所用的供体又有相当大的部分取材来源不符合伦 理要求。( 2 ) 免疫排斥常常导致移植失败，同时免疫抑制剂有严重的副作用， 移植的患者往往因为较为昂贵的医疗开支而放弃治疗。胰岛移植技术的发展，在 我国更加凸现了上述两个问题的尖锐和严重。现存的问题又将限制胰岛移植治疗 在我国的快速发展，使我们在此领域逐渐丧失国际竞争力。因此迫切需要一套符 合中国糖尿病人群特点的胰岛移植方案。 目前，干细胞技术正迅速发展，干细胞的研究已取得两个重大的技术突破， 一是人类胚胎干细胞在体外培养成功，另外一个重大突破就是成体干细胞的横向 分化。成体干细胞在一定的微环境的作用下，可以横向分化为需要的细胞和组织， 从而起到极其有效的治疗作用。有研究表明，骨髓间充质细胞【1 1 1 、成脂肪细胞1 1 2 】、 3 中南大学硕士学位论文前言 脐血干细胞及羊膜上皮细胞( h u m a na m n i o t i ce p i t h e l i a lc e l l ，h a e c s ) 1 4 】可以分 化为胰岛样细胞，体外培养证实可以分泌胰岛素。上述细胞可能成为胰岛移植细 胞来源的良好材料，研究一旦取得进展，不仅可以解决供体细胞数量问题，还可 以通过自体移植的方法，绕过免疫排斥的障碍。 h a e c s 具有自身独特的优势，可成为胰岛移植的良好细胞来源。羊膜是覆 盖在羊膜腔内表面的一层薄膜，由羊膜上皮细胞、基底膜、实质层、纤维母细胞 层、海绵层5 层结构组成。h a e c s 起源于原始上胚层( 发育为上中下三个胚层) ， 推测其可能具有分化的多能性。最近研究表明，h a e c s 确实具有干细胞的特性， 表达多能性标记基因“o c t - 4 和“n a n o g ，在不同生长因子的调节下可以分化 成肝细胞、心肌细胞、神经细胞和胰岛细胞【1 5 , 1 6 1 。h a e c s 取材于分娩后的胎盘， 来源丰富、容易获得，不引起任何伦理及法律争议；每个废弃胎盘羊膜中可提取 接近1 0 9 数量级的h a e c s ，通过扩增达到1 0 数量级，细胞数量接近移植的要 求：h a e c s 没有端粒酶活性，没有在体内无限制生长而成为肿瘤的危险；h a e c s 培养过程中不需要动物血清、动物细胞的支持培养，免受动物源性疾病因素的污 染；h a e c s 在体外培养过程中始终不表达m h ci i 抗原，而m h ci 类抗原表达 很弱【1 1 丌。i f ny 可诱导如单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞上调表达m h ci 、 m h c i i 抗原，而s a k u r a g a w a 等【l8 】研究发现h a e c s 在i f n l , 的刺激下培养3 天， 两类抗原表达并没有升高。以上的特点表明h a e c s 是细胞替代治疗良好的材料 来源，经过诱导分化或基因修饰后移植给患者，可对一些疾病患者进行细胞替代 治疗，目前h a e c s 已应用于溶酶体蓄积病、神经细胞退行性病变以及眼科疾病 的治疗【1 9 2 2 】。 本研究中，我们共收集了6 2 份羊膜标本( 其中3 份标本在分离h a e c s 培养 后发现真菌污染而丢弃，l 份发现细菌污染而丢弃，其余按本部分2 1 所述分级 标准进行分级：1 2 份为i i i 级羊膜标本，不用于实验与建立羊膜细胞库，其余4 8 份羊膜标本( i 级羊膜2 1 份，级羊膜2 7 份) 用于建立羊膜细胞库与后续实验 使用) ，分离h a e c s 进行体外原代和传代培养，通过一系列检测手段分析h a e c s 细胞生物学特征，确定h a e c s 细胞是具有干细胞特征的一类细胞，建立了具一 定规模的羊膜细胞库，冻存羊膜细胞数量达到近3 0 0 管之多；在此基础上，我们 采用尼克酰氨联合细胞因子n 2 的诱导体系体外诱导h a e c s 向胰岛素分泌细胞 4 中南大学硕士学位论文前言 定向分化，检测了诱导后的h a e c s 胰岛素分泌细胞相关特征，并初步分析了 h a e c s 体外定向诱导分化为胰岛素分泌细胞的机制，为进一步的临床实践提供 了有力的理论支持。 5 中南大学硕士学位论文 第一章 第一章人羊膜上皮细胞( h u m a na m n io tice pit h ei iaic ei i h a e c ) 的分离及其干细胞生物学特征的鉴定 人羊膜上皮细胞( h u m a na m n i o t i ce p i t h e l i a lc e l l s ，h a e c s ) 是位于人胎盘上 呈多边形紧密排列的一层细胞。从胚胎发育角度看，h a e c s 的起源与最初形成 三胚层的初级上胚层相同，推测其可能具有分化为全身各种组织细胞的潜能。最 近的研究表明，在不同生长因子的调节下，h a e c s 可以分化成肝细胞、心肌细 胞、神经胶质细胞、神经元细胞和胰岛细胞1 5 , 1 6 l 。目前已经有研究者将h a e c s 应用于溶酶体蓄积病、神经细胞退行性病变以及眼科疾病的治疗【1 9 - 2 2 1 。h a e c s 容易获得，不引起任何伦理争议，每个废弃胎盘羊膜中至少可以提取接近1 0 9 数 量级的h a e c s ，通过扩增可达到1 0 1 1 数量级。这为今后羊膜上皮细胞大量应用 于临床实践提供了充足的细胞来源。 但是对于人羊膜上皮细胞的分离方法和培养条件及其干细胞相关生物学特 征的鉴定，目前尚无统一定论。本章的研究完善了人羊膜上皮细胞的分离方法和 体外培养条件；我们检测了体外培养h a e c s 的一系列干细胞相关生物学特征： 通过r t - p c r 检测h a e c s 中全能性基因的表达情况，通过细胞免疫荧光检测干 细胞相关细胞表面标记的表达情况，通过碱性磷酸酶( 触o ) 染色检测h a e c s 的细胞原始性，通过染色体普通g 显带分析检测体外传代培养的h a e c s 的遗传 学稳定性。我们确定了h a e c s 细胞体外培养方法，并收集大量羊膜标本，已初 步建立了具有一定细胞库存量的羊膜细胞库，为进一步的诱导分化提供了具有稳 定遗传学特征的h a e c s 细胞来源以及有力的理论支持。 ( 一) 人羊膜上皮细胞的分离 1 材料与方法 1 1 材料与试剂 1 1 1 细胞生物学试剂 l o w - d m e m ：美国g i b e c o 公司； 6 中南大学硕士学位论文第一章 e g f ：美国r & ds y s t e m s 公司； 左旋谷胺酰胺( l g ) ：美国g i b e c o 公司： 非必需氨基酸：美国g i b e e o 公司； 丙酮酸钠：美国g i b e c o 公司； 胰蛋白酶( o 0 5 t r y p s i n e d t a ) ：美国g i b e c o 公司。 1 1 2 主要仪器 高速台式离心机：德国e p p e n d o r f 公司； 隔水式电热恒温培养箱：上海市跃进医疗器械一厂； 超净工作台：中国a i r t e c h 水浴箱：美国p o l y s t a t 公司； 倒置相差显微镜：日本o l y m p u s ； c 0 2 培养箱：美国f o r m as c i e n t i f i c 。 1 1 3 标本来源 标本来源：羊膜来自湖南省妇幼顺产产妇的胎盘，经产妇本人知情同意后用 于研究( 已签署知情同意书) 。 1 2 方法 1 2 1 人羊膜上皮细胞的分离培养 1 2 1 1 人羊膜上皮细胞的原代培养 1 2 1 1 1 采集的羊膜标本清洗 采集的羊膜标本首先进行清洗。标本瓶外表面用7 5 乙醇擦拭后，在操作 台中小心打开，用止血钳夹出羊膜( 注意不要碰到瓶口及其他物品) ，放入注入 生理盐水的皿盖中，使用0 9 的生理盐水在1 0 c m 玻璃细胞培养皿中小心清洗 掉膜上血渍及杂质等，视羊膜具体情况确定清洗次数；清洗干净后，用手术剪将 羊膜剪成适当大小，以备消化。 1 2 1 1 2 分两次进行羊膜消化 第一次消化：细胞培养皿中进行，各皿注入一定量胰蛋白酶( 0 0 5 t r y p s i n e d t a ) ；将剪好的羊膜块放a n n 中，用镊子小心展平以保证羊膜完全被 消化液浸泡；盖上皿盖，置于3 7 c ，5 c 0 2 培养箱中消化1 5 - - 3 0 m i n ( 消化过 程中注意观察羊膜状态，当细胞开始变圆，细胞间缝隙开始变大时立即停止消化， 7 中南大学硕士学位论文 第一章 以防止消化过度对细胞造成伤害) ：将培养皿拿出培养箱，在超净台中打开皿盖， 用镊子夹住羊膜，轻轻漂洗羊膜，使上膜上的杂质等洗入消化液中，吸弃消化液； 第二次消化：紧接第一次消化在原细胞培养皿中进行，各皿在吸弃旧消化液 之后重新注入一定量新消化液( 胰蛋白酶( 0 0 5 t r y p s i n - e d t a ) + d n a s e 2 5 ( 使 用浓度0 5 m g r n l ) ) ；将羊膜重新展平；盖上皿盖，置于3 7 c ，5 c 0 2 培养箱中 再消化1 5 - - 3 0 m i n ( 消化过程中注意观察羊膜状态，当细胞变圆，细胞间缝隙变 大甚至有细胞开始从羊膜上脱落下来悬浮于消化液中时立即停止消化，以防止消 化过度对细胞造成伤害) ；将培养皿拿出培养箱，在超净台中打开皿盖，用镊子 夹住羊膜，在消化液中漂洗羊膜，可小幅甩动以尽量使羊膜上的干细胞全部洗脱 下来( 在此过程中注意暂停漂洗不时镜检以便及时终止消化，防止因消化过度损 伤细胞) ，当细胞基本全部洗脱时，立即终止消化。 1 2 1 1 3 终止消化 加入与消化液等量的d m e m + 1 0 f b s 液终止消化( 以冲洗羊膜的方式加 入) 。 1 2 1 1 4 羊膜上皮细胞收集 用移液枪收集细胞悬液至5 0 m l 离心管中，离心，1 5 0 0 - - 2 0 0 0 r p t r d m i n 离心 5 m i n 收集细胞。 1 2 1 1 5 羊膜上皮细胞原代培养 细胞悬液离心后，