（遗传学专业论文）黄孢原毛平革菌peroxiredoxin基因克隆和表达.pdf

四川大擘项士学住论文p e r o x i r e d o x i n 基因的克睦和表达 表格目录 表1 逆转录合成c d n a 反应体系1 4 表2 p c p r x i 与其他物种的氨基酸和核甘酸相似性分析一2 9表3 重组p c p r x 1 抗氧化活性分析 3 8 表4p c p r x i c d n a 片段的密码子偏爱性分析4 2 表5哺乳动物的peroxiredoxia家族一一醒 。 图形目录 图1p m d1 8 - t 载体的物理图谱5 图2p e t - 3 0 a ( + ) 原核表达载体 图3pcprx1cdna的克隆和在大肠杆菌的表达技术路线图26 图4只chrysospodum总rna琼脂糖电泳26 图55 ，- r a c e 产物的分析一2 7 图6y - r a c e 产物的分析” 图7 p c p r x 全长e d n a 及其推导蛋白质序列勰 图8 p c p r x 1 与其它同源序列比较一 图9 邻接法分析p c p r x 与其它物种进化关系一 3 i 图1 0p c p r x 氨基酸序列的亲水性和疏水性分析一3 2 图1 1 pcprx蛋白质跨膜结构预测一一33 圈1 2p c p r x 蛋白的三维结构预测j 4 图1 3r t - p c r 分析p c p r x 基因表达差异一 3 s 图“重组p e t p r x 质粒检测一 3 5 图1 5 重组质粒p e t p r x 在ec o l i b l 2 1 中的表达分析 3 图1 6 pe撇表达产物可溶性分析一一37 图1 7 重组p c p r x 非还原性s d s p a g e 分析3 7 图18重组pcprx1抗氧化活性分析。一38 图1 9 金属催化氧化质粒d n a 切割保护性分析法 一 3 9 图加实验所用引物与模板的匹配方式一4 i 四川大学硪士学位论文p e r o x i r e d o x i n 基因的克隆和表达 图2 1r a c e 原理和方法s 5 图2 2s u 【c i p c r 和l a - p c r 的原理m 5 8 圈2 3 c r t c 法原理二一驰 圈2 4capselect技术原理。砸 图2 5crace原j|e6l 图2 6 s m a r t - r a c e 技术合成全长c d n a 原理。6 2 图2 7p e r a x i r e d o x i n 催化机制 图2 8p e r o x i r e d o x i n 结构图6 7 - v i - 四川大擘硕士擘住 譬文 p e r o x i r e d o x i n 基因的克睦和表达 黄孢原毛平革菌p e r o x i r e d o x i n 基因的克隆和 表达 ， 农达 ， 专业遗传学 姓名：姜权指导教师：张义正教授 摘要 硫氧还蛋白过氧化物酶( p e r o x i r c d o x i n ，简称p r x ) 是一类新发现的抗氧 化酶，广泛存在于原核和真核生物体内真菌在有氧代谢过程中，抗氧化酶 在除去氧自由基保和护生物体中发挥重要的作用。以黄孢原毛平革菌 ( p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m ) 3 d 培养物制备的总r n a 为模板，利用快速末 端扩增( r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s 。r a c e ) 技术得到其5 端和3 端序 列，并拼接获得该基因的全长c d n a 序列，命名为p c p r x ( n c b i 收录号为 a y 7 8 7 7 5 1 ) 该c d n a 全：长为9 3 2b p ，5 - 非翻译区( 5 胛r ) 含6 1 b p ，3 - 非翻译 区( 3 ；- u t r ) 含2 6 8b p ，其中o r f 含6 0 3 b p ，编码2 0 0 个氨基酸残基。预测该蛋白 分子量为2 2 ik d a ，等电点为4 8 。p c p r x 的一级结构分析表明，该基因与其 他真菌中的同种基因的同源性为6 0 ，与非真菌的同种基因也显示出较高的 同源性，如与人的同源性为6 0 ，与拟南芥的同源性为4 0 。利用s w i s s p o r t 网站预测出该蛋白的三维结构。 利用r t p c r 技术分析该基因在2 d 和3 d 只c h r y s o s p o r i u m 的培养物中的表 达差异，结果显示该基因在进入次生代谢后，表达量明显增加。将该基因的 开放阅读框连接到p e t 一3 0 表达载体中，在大肠杆菌中表达，获得了该基因的 重组蛋白。经n i 柱纯化的蛋白，在金属催化氧化系统中，具有保护超螺旋质 粒不被氧自由基降解的能力。同时该重组蛋白在f e r r i t h i o c y a n a t e 体系中 有清除地o ：的能力纯化的蛋白在还原剂二硫苏糖醇的作用下发生解离。经 非还原性s d s p a g e 分析，该蛋白存在二聚体。p c p r x 基因的克隆和表达为阐 明黄孢原毛平革菌在进入次生代谢阶段如何抵御逆境提供了新的线索。 关键词：黄孢原毛平革菌；硫氧还蛋白过氧化物酶；c d n a 克隆；大肠杆菌： 基因表达 四j 1 1 欠学硕士学位论文 p e r o x i r e d o x i n 基因的克睦和表达 c l o n i n ga n de x p r e s s i o no fap e r o x i r e d o x i ng e n ef r o m p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mi ne s c h e r i c h i ac o l i m a j o r - g e n e t i c s s t u d e n t ：q u a nj i a n g m e n t o r ：p r o f y l z h e n gz h a n g a b s t r a c t p e r o x i r e d o x i n s ( p s ) a r eau b i q u i t o u s f a m i l y o f p e r o x i d a s e sw i l d l y d i s t r i b u t e da m o n g p r o k a r y o t e sa n de u k a l y o t e s a n t i o x i d a me n z y m e si nf u n g ip l a y a ni m p o r t a n tr o l ei np r o t e c t i o na g a i n s tt h eo x y g e nr a d i c a l s g e n e r a t e dd u r i n g a e r o b i cm e t a b o l i s m t h er e s u l t so fc l o n i n ga n df u n c t i o n a lc h a r a c t e r i z a t i o no fa e d n ae n c o d i n gp e r o x i r e d o x i nf r o ma3 - d a yc u l t u r eo ft h ew h i t e r o tf u n g u s p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u md e s i g n e da sp e p r xa l ed e s c r i b e di nt h i st h e s i s t h e f u l l l e n g t hp c p r xe d n a ( 9 3 2b p ) c o n t a i n sa l lo p e nr e a d i n gf r a l l l oo f2 0 0a m i n o a c i dr e s i d u e sw i t ham o l e c u l a rm a s so f2 2 1k d aa n dap io f4 8 t h ed e l u c e d p r i m a r y s t r u c t u r eo fp c p r xp o l y p e p t i d ei np c h r y s o s p o r i u ms h o w sah i g hl e v e lo f s e q u e n c eh o m o l o g yt or e c e n t l y i d e n t i f i e d2 - e y sp e r o x i r e d o x i n s p e p r xa l s o e x h i b i t s a s i g n i f i c a n t l e v e lo f s e q u e n c es i m i l a r i t y t o n o n - f u n g i2 - c y s p e r o x i r e d o x i n si nf u n g i ，p l a n ta n db a c t e r i aw i t h6 0 、4 0 、4 1 ，r e s p e c t i v e l y r t - p e r a n a l y s i sw a sc a r r i e do u tt od e t e r m i n et h er e l a t i v el e v e lv a r i a b i l i t yo f e x p r e s s i o no f p e p r xg e n ei nr c h r y s o s p o r i u ma n dt h e e x p r e s s i o no fp c p r xs l i g h t l y i n c r e a s e di n3 - d a yc u l t u r e t h er e c o m b i n a n tp e p r xp r o t e i nw a se x p r e s s e da sa h i s l i d i n ef u s i o np r o t e i ni ne s c h e r i c h i ac o l ia n dp u r i f i e dw i t hh i - c o l n m l lt h e p u r i f i e dp r o t e i nw a ss h o w nt oh a v eap r o t e c t i v ee f f e c ta g a i n s tp l a s m i dd n a c l e a v a g eb yr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s m e a n w h i l e ，p c p r xp r o t e i nd i s p l a y e da b i l i t y t or e m o v eh 2 0 2i nf e r r i t h i o c y a n a t es y s t e m t h ep c p r xe x i s t e da sd i n m l e r su n d e r n o n r e d u c i n gc o n d i t i o n sa n dd i s s o c i a t e di n t om o n o m e ri nt h ep r e s e n c eo fd t r a l la b o v er e s u l t sa r el i k e l yt op r o v i d ec l u eo nt h ep h y s i o l o g i c a li m p o r t a n c eo ft h e 2 - c y sp r xf u ra d a p t i o nt od i v e r s es t r e s s e s k e y w o r d s ：p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m ；p e r o x i r e d o x i n ；e d n ac l o n i n g ； e s c h e r i c h i ac o i l ；g e n ee x p r e s s i o n 2 - 四川大学项士学位论文p e r o x i r e d o x i n 基因的克隆和袭达 1 引言 目前，作为木质素降解的模式生物黄孢原毛平革菌( p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m ) 的基因组的序列测定已基本完成【捌。同人类基因组计划一 样，对只c h r y s o s p o r i u m 基因组的阐述成为了一个极具挑战性的工作【6 2 5 1 。 早期的生理学研究表明，只c h r y s o s p o r i u m 在低氮培养基中培养时，在 4 8 7 2 h 期间耗尽氮源，进入木质纤维素降解的次生代谢状态【埘。黄孢原毛平 革菌能够在高氧和碳氮受限的次生代谢期间启动其木质素降解系统，该降解 系统包含锰过氧化物酶( m n p ) 、木质素过氧化物酶( l i p ) 及多种氧化酶可 降解木质素，其降解系统的启动可能还有其它基因参与。 生命的演化经历了从无氧到有氧的过程。在有氧的条件下，生物的代谢 反应中会普遍产生活性氧族( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) ，包括过氧化 氢、羟基自由基和超氧阴离子等汹1 活性氧族可以破坏生物大分子如生物的 脂膜、核酸和蛋白质等，产生严重的生物效应，诸如谷胱甘肽的耗竭、脂质过 氧化、蛋白质和核酸的氧化等闭。这些活性的氧化物在机体的大量堆积可导 致细胞、组织的死亡。生物在进化过程中发展形成了各种抗氧化系统，以抵 抗这些活性氧族的破坏作用。细胞内的抗氧化剂包括维生素e 、c 和a 、类胡 萝h 素、内源性酶类。在生理条件下，细胞有多种内源性酶类，如过氧化氢酶、 超氧化物吱化酶和谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶以及 p e r o x i r e d o x i n ( p r x ) 。 p e r o x i m d o x i n ( p r x ) 作为一种新的硫醇特异性抗氧化蛋白，最近几年受到 日益广泛的关注，该蛋白也被称为硫氧还蛋白过氧化物酶，烷基氧还c 2 2 蛋 白等名称。作为近年来研究的热点，其催化活性和蛋白序列与其它抗氧化剂 完全不同，它在清除活性氧族中具有重要作用。事实上，这类蛋白在生物体 中广泛存在，1 9 9 4 年第一个被发现的该家族蛋白是来源于酵母的2 5 k d 蛋白 质，最初被命名为巯基特异性抗氧化酶。随后证实该蛋白广泛存在于原核和 真核生物体内。 虽然该蛋自主要定位在胞质，但是p r x s 也被发现存在于线粒体，叶绿体 和过氧化物酶体中【惦埘。p r x s 在细胞中有很高的表达量，该蛋白在大肠杆菌 中是i o 种最为丰富的蛋白之一1 5 】；在红细胞中该蛋自居于第2 或第3 的表 四州大擘硕士荦拉论文 p e r o x i r e d o x i n 基因的克隆和表达 达量【1 q ；在其他哺乳动物细胞的可溶性蛋白中占了0 1 - 0 8 1 8 1 许多生物 体含有不止1 种p 的异构体，在哺乳动物中至少已经发现6 种p r x 。最近， p 被发现在细胞中具有一些其他重要的作用，包括调节细胞因子诱导的过 氧化氢水平，过氧化氢的含量将引发信号级联反应，这些反应将导致产生细 胞分裂，分化和细胞凋亡( m1 1 1 2 1 3 1 。 该家族所有蛋白均在n 端具有保守的c y s 残基，有的成员在c 端还具有 保守的c y s 。根据其保守c y s 的数目不同，可以分为2 个亚家族，即1 - c y sp r x 和2 c y sp r x 前者仅在5 0 位左右上有一个高度保守的半胱氨酸残基，后者 则在5 0 位和1 7 0 位左右上分别有一个高度保守的半胱氨酸残基。本实验室 的江明锋博士在用抑制消减杂交( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，s s h 3 和基因芯片( m i c r o a r r a y ) 技术研究了黄孢原毛平革菌( p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m ) 在低氮培养基中培养4 8 h 和7 2 1 1 的基因表达谱时，得到了一批 2 d 和3 d 表达有差异的基因片段。其中编号为s s h 3 6 2 的片段通过同源比对， 发现它是编码p e r o x i r e d o x i n s 基因。 在本研究中，我们利用r a c e 技术获得黄孢原毛平革菌p e r o x i r e d o x i n 蛋 白的全长c d n a ( 命名为p c p r x 1 ) ，在大肠秆菌中表达得到该基因的重组蛋 白，体外酶活性检测分析表明，该酶具有过氧化物酶的活性。p c p r x 基因的 克隆和表达为阐明黄孢原毛平革菌在进入次生代谢阶段如何抵御逆境提供 了新的线索。 四川大学项士擘位论文 p e r o x i r e d o x i n 基因的克隆和表达 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌种和质粒 p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u r ab k m f - 1 7 6 7 为本实验室保存 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l f ) 菌株d h 5 a ：s u p e 4 az a l a c u l 9 6 ( f s o l a c z a m l 5 ) h s d r l 7 r e c a le n d a g y r a 9 6t h i - 1r e a 1 和x l l - b l u e ：s u p e a 4h s d r l 7 r e c a le n d a lg y r a 4 6t h r 1r e i a ll a c f p r o a b + l a c ll a c z am 1 5 t n l o ( t e t ) ，为 本实验室保存，用于d n a 片段的克隆。 大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，本实验室保存。基因型为f ，o m p t , h s d s s ( r s m s 3 ， g a l ( l c l 8 5 7 ，i n d l ，s a m 7 , l f i n 5 ，l a c u v 5 一t t g e n e l ) ，d c m ( d e 3 ) ； 研究中所用质粒载体p m d l 8 - t 是一种高效克隆p c r 产物( t ac l o n i n g ) 的专用载体，用于克隆p c r 扩增得到的产物，购自大连宝生物公司。其物理 图谱见图1 。 图1p m d1 8 - t 载体的物理图谱 f i g 1 p h y s i c a l m a p o f p m d l 8 t v e c t o r t - c l o n i n g s i t e p e t - 3 0 a ( + ) ：k a m ，大肠杆菌表达载体，本实验室保存载体的物理图 谱参见图2 。 四川大擘硕士学位论文 p e r o x i r e d o x i n 基因的克隆和表达 图2p e t 3 0 a ( + ) 原核表达载体 f i g 2p h y s i c a lm a po f p e t - 3 0a ( + ) e x p r e s sv e c t o r 2 1 2 主要试剂和酶类 总r n a 抽提试剂盒( t r i z o i r - t o t a lr n a i s o l a t i o nr e a g c n 0 为g i b c o b r l 公司产品；s m a r t t mr a c ec d n a a m p l i f i c a t i o nk i t ( c l o n t e c h ) ，逆转录试剂 盒y r 4d n a 连接酶为m b i 公司产品( r e v e r t a i d t mhm i n u sf i r s ts t r a n dc d n a s y n t h e s i sk i t ) ：e c o ri 和h i n d l i i 限制性内切酶，l at a qd n a 聚合酶、 p m d l 8 tv e c t o r 载体，牛小肠碱性磷酸酶( c i p ) ，t 4 d n a 连接酶，为t a k a r a 公司产品。s d s 、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、t e m e d 购自美国s i g m a 公司。 其它试剂均为国产分析纯。 2 1 3 引物序列 2 1 3 1r a c e 引物 按试剂盒操作手册提供的引物由上海联合生物有限公司合成其序列如下： 四，叶走擘硕士擘位论文p e r o x i r e d o x i n 基因的克隆和表达 1 ) s m a r ta o l i g o n u d e o f i d e 5 - - a a g c a g t g g t a t c a a c g c a g a g t a c g c g g g - 3 _ 2 ) 3 - c d s p r i m e r a ( 3 c d s ) 1 5 - a a g c a g t g g t a t c a a c g c a g a g t a cc 0 3 0 vn ( n = a c ，g , o r t ；v = a g , o r c ) 4 。 3 ) 5 - c d sp r i m e rs - c d s ) “ 5 - 0 3 2 5v n ( 2 7 b p )， ( 3 0 b p ) ( s t o p ) ( n = a c ，g ，o r t v = a 函o rc ) + 4 ) l o n g p r i m e r 5 - - c t a a t a c g a c t c a c t a t a g g g c a a g c a g t g g t a t c a a c g c a g a g t - 3 ( 4 5 b p ) j7。 5 ) s h o r t p r i m e r 5 - c t a a t a c g a c t c a c t a t a g g g c - - 3 ( 2 2 b p ) 回n e s t e du n i v e r s a lp r i m e ra 州u p ) 5 a a g c a g t g g t a t c a a c g c a g a g t - 3 ( 2 3 b p ) ， q 2 1 3 2 特异性引物 ：。 ，4 。5 扩增f p d 基因片段( 9 0 7 b p ) 用引物： 7 印以f 5 - c g l c g t c c t c c g 砑甜g d 3 l 、 g l m l r ：5 - a c r c g r r g t c g l a c c a g ( 认g 3 3 r a c e 引物 。“ p 3 ：5 j 玎g g t c g c r c a g g t c c a g a a g c c - 3 。 5 r a c e 引物 一 p 1 ：5 g g t g g a a a c a c c g a g a a c g a c a g 3 p 2 ：5 - t c g t r g a a g g c g a g a 触r c r c g g 3 扩增p e r o x k c d o x i no f f 引物 p 4 ：5 c c g g a a t t c a t g g t c g c t c a g g t c c a g a a g c c - 3 ( e c o ris i t e u n d e r l i n e d ) ，。+ + p 5 ：5 。c g t c g c a a g c t t c t a c t g g g c a t t g g t g t r g a c a g - 3 ( h i n d s i t e 一7 四川大擘硕士学住论文 p e r o x i r e d o x i n 基因的克窿和表达 岫d c 曲c 田 2 1 4 常用缓冲溶液和培养基的配制 2 1 4 1 黄孢原毛平革菌的培养基 完全培养基( c m ，1 0 0 0 m l ) ： 主要用于p c a r y s o s p o r 妇n 的常规培养和形成分生孢子田2 6 j 其主要成分 四川大擘硕士擘住论文p e r o x i r e d o x i n 基因的克隆和表达 k i r k 低氮培养基( 加水至1 0 0 0m l ) 葡萄糖( 1 0 ) l o o m l n a a c 缓冲液( 2 0 0 m m o l l , p h 4 5 ) 1 0 0 m l 硫胺素( 1 0 0r a g l )1 0 m l 酒石酸铵( 8 0g ，l ) 2 5 m l 微量元素溶液6 0 m l b a s a li i i 液成分( 加水至1 0 0 0m l ) ： k h 2 p 0 4 m 薛0 4 7 1 1 2 0 c a c l 2 微量元素溶液( 加水至1 0 0 0 m l ) - m g s 0 4 7 h 2 0 m n s 0 4 n a c l c o c l 2 z n s o t c u s 0 4 a 1 k ( s o , h 1 2 h 2 0 h 3 8 0 3 n a m 0 0 4 2 h 2 0 氮三乙酸 2 1 4 2 大肠杆菌培养基 1 ) l b ：皤养基( 1 0 0 0 m l ) 2 2 1 胰蛋白胨l o g 酵母粉 5 9 2 ) l m 培养基( 1 0 0 0 l m l ) 瞄i 2 0 0 9 5 0 9 1 0 9 3 0 9 0 5g 1 0 9 0 1g 0 1g 0 1g 1 0 m g 1 0 m g 1 0 m g 1 5g n a c i l o g 用l m o l l n a o h 调至p h 7 5 9 四川大荦硕士擘位论文 p e r o x i r e d o x i n 基因的克隆和表达 胰蛋白胨 酵母粉 1 0 9 5 9 用1m o l l n a o h 调至p h 7 5 3 ) s o b $ + + o o o o m l ) l m 胰蛋白胨 酵母粉 * 1 0 0 x m 9 2 + 2 0 9 5 9 1 0 m l n a c i m g s 0 4 n a a k c l 0 5 s g 2 4 6 9 0 5 8 9 0 3 8 9 用1m o l l n a o h 调至p h 7 0 * l o o x m 9 2 + ( 1 0 0 0 m l ) m g c l 2 6 h 2 02 0 3 3 9m g s 0 4 7h 2 0 2 4 6 5 9 4 ) s o c 培养基嘲：s o b + 2 0 m m o l f l 葡萄糖 2 1 4 3 溶液和缓冲液 2 2 1 溶液i 1 葡萄糖，5 0m m o l l e d t a ( p h 8 0 ) ，2 5m m o l l t r i s h c l ( p h 8 0 ) 溶液 0 2m o l l n a o h ，1 s d s 溶液m 3m o l 几k a e ( p h 4 8 ) t b 缓冲液 2 5 0 m m o f l k a ，5 5 m m o l l m n c l 2 ，1 5 m m o l l c a c l 2 ，1 2 5 m m o l l k - m e s p a 6 7 t e 缓冲液 1 0m m o l l t r i sp h 8 0 ，1m m o l l e d t a p h 8 0 磷酸缓冲液( p h 7 0 s ) 0 2 m o l ln a i l z p 仉8 5 h e , ：0 2 1 几n a , j - i p o , 9 1 5 i n l ： p h 计标定至p h 7 8 聚丙烯酰胺母液 3 0 丙烯酰胺。0 8 亚甲双丙烯酰胺 t r h - c i $ d s , ( p h 8 8 ) 。叙 - 1 0 四川大擘硕士学位论文 p e r o x i r e d o x i n 基因的克隆和表达 在3 0 0 m l h 2 0 中溶解9 1 9 t r i s r 喊( 1 5 t o o l l ) ，用l m o f l h c i 调至p h 8 8 ， 补加h z o 至体积5 0 0 m l 再加入2 9 s d s ，于4 c 保存1 个月 t r a - c i s d s , ( p h 6 8 ) ，4 x 。 在4 0 n 1 _ l h 2 0 中溶解6 0 5 9 t r i s 碱( 0 5 t o o l l ) ，用1 m o l 几h a 调至p h 6 8 ， 补加h 2 0 至体积1 0 0 m l 。再加入o 4 9s d s ，于4 保存1 个月 s d s 电泳缓冲液。5 t r i s 碱( 0 1 2 5 m o i d 1 5 1 9 甘氨酸( 0 9 6 m o l l )7 2 0 9 s d s 5 o g 加去离子蒸馏水至1 0 0 0 m i ，使用前稀释至1 s d s 电泳缓冲液 s d s 样品缓冲液。2 x 4 t r i s - c 1 s d s 。p h 6 8 2 5 m l 甘油 2 0 ( w v ) 2 0 m l d t t 3 1 9 溴酚蓝i m g 加去离子蒸馏水至1 0 0 m l 并混匀等量分装成l m l 并于7 0 贮存 染色液 甲醇5 0 ( v v ) 考马斯亮蓝r - 2 5 00 0 5 ( v v ) 乙酸1 0 ( v v ) h 2 04 0 ( v v ) 用去离子蒸馏水配制 脱色液 乙酸5 ( v v ) 。 甲醇 1 6 5 ( v v ) h 2 07 8 5 ( v v ) 固定液 甲醇5 0 9 6 ( v v ) 乙酸1 0 ( v v ) 四川大学硕士学位论文 p e r o x i r e d o x i n 基因的克隆和袭达 h 2 04 0 ( v v ) 于室温可保存1 个月 注：所有电泳所需的溶液及缓冲液均用重蒸去离子水配制 洗脱缓冲液组成 b a l a n c e b u f f e r ：5 0 m m o l l p b s 、0 5 m o l l n a c l 、1 0 m m o l l 咪唑、1 0 甘油、 p h 7 4 w a s hb u f f e r ：5 0m m o l lp b s 、0 5m o l l n a c l 、5 0m m o l l 咪唑、1 0 甘油、 p h 7 4 e l u t i o nb u f f e r ：5 0m m o l l p b s 、0 5m o l l n a d 、2 5 0m m o l l 咪唑、1 0 甘油、 p h 7 4 2 1 5 主要仪器设备 p t c - 2 0 0 “p c r 仪，美国耵公司。 紫外分光光度计，低温高速离心机5 8 0 4 r ，常温高速离心机5 4 1 5 d ，德 国e p p e n d o r f 公司。 b i o - r a d 凝胶成像装置和m i n i p r o t e a n l le 1 e c t r o p h o r e s i su n i t s ，电 转化仪c a p a c i t a n c ee x t e n d e rp l u s ，美国b i o - r a d 公司产品。 - 8 0 低温冰箱，日本三洋公司。 2 2 实验方法 以下的各种d n a 操作技术，除特别注明出处外，均采用本实验室已经规范 化的研究方法【冽。 2 2 1p c h r y s o s p o r i u m 的培养 。 只c h r y s o s p o r i u m 的常规培养：采用c m 平板或斜面，3 t c 培养约5 d 左 右，在平板或斜面上形成大量的分生孢子后，用0 1 的t w e e n 2 0 溶液将孢子 从平板上洗下，涡旋分散，玻璃纤维丝过滤，4 , 0 0 0 r p m 离心5 r a i n ，用无菌水 洗涤1 2 次，重新悬浮孢子，将浓度调节到a 6 酊1 5 ，每次均配制新鲜孢子 四州走擘项士学位论文 p e r o x i r e d o x i n 基因的克隆和表达 悬液嘲 只c h r y s o s p o r i u m 在低氮培养基上的培养：在3 0 m l 的k i r k 低氮培养基中， 分别接种3 m l 孢子悬液，3 9 c 静置充氧培养，设置3 个平行样，在培养后第 4 8 h 和7 2 h ，过滤收集菌体用于提取细胞总r n a l 2 6 1 2 2 2 总r n a 的提取 黄孢原毛平革菌4 8 h 和7 2 h 的总r n a 用卢圣栋介绍的力法提取【l l o 简要 步骤如下：称取3 9 菌丝体用1 的p b s o 1 5 9n a 2 h p 0 4 ，0 2 9k h z p 0 4 ，8 9n a c i ， o 2 9k c i 溶于1 0 0 0 m l 去离子水中) 冲洗，用滤纸吸干多余水分后转入1 个 5 0 m l 的玻璃匀浆器中，加入2 4 m l 的变性液( 5 5 9 异硫氰酸胍溶于6 6 m l 的 c s b 缓冲液中，c s b ：1 0 5 0 7 9 柠檬酸溶于6 0 m l h 2 0 ，用1 nn a o h 调p h 4 0 ， 加矩s d s 和1 9 的b 一巯基乙醇) 后迅速研磨3 r a i n ，全部成分转入5 0 m l 的 离心管中，加入2 4m l 的2m o l ln a a c ( p h4 o ) 和2 4 m l 的酚：氯仿；异戊 醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，颠倒混匀后涡旋处理2 r a i n ，冰浴2 0 r a i n 后4 1 2 ，0 0 0 9 离 心2 0r a i n ，将上清液转入另一离心管中同样的条件再离心一次。上清液转入 另一离心管中，加入等体积的异丙醇2 0 c 冰箱放置l h ，4 1 2 0 0 0 9 离心2 0 m i n ，弃上清。沉淀中加入1 0 m l 的变性液，6 5 处理5 r a i n ，加入1 0 m l 的 氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 涡旋处理1 5 s ，冰浴2 0m i n 后4 c1 2 ，0 0 0 9 离心2 0m i n ， 上清液转入另一离心管中，加入等体积的异丙醇冰浴3 0 r a i n ，4 c1 3 ，0 0 0 9 离 心2 0 m i n ，弃上清，7 5 的乙醇洗2 次，离心干燥后h 2 0 溶解。8 0 ( 2 低温保 存。 总r n a 的质量用紫外分光光度计和甲醛变性胶琼脂糖电泳检测。电泳 装置用清洁剂清洗后用流水冲洗，i n a o h 浸泡过夜，d e p c 处理过的h 2 0 水彻底冲洗后用无水乙醇清洗干燥。 2 3 3r t p c r 2 3 3 1 第一链c d n a 的合成 以抽提的总r n a 为模板，以0 1 i g od t 为反转录引物，按照p r o m e g a 公司 逆转录试剂盒操作手册进行c d n a 第一链的合成，反应体系为2 0 | ll ，具体试 四川大学硕士学位论文p e r o x i r e d o x i n 基因的克隆和表达 剂成份见表l ，反转录条件为4 2 ( 2 ，6 0m i n = 9 5 c ，5r a i n ；5 ，5m i n ， 一2 0 保存。 表1 逆转录合成e d n a 反应体系 t a b l e l r e v e r s e t r a n s c r i p t i o nr e a c t i o ns y s t e m o f c d n as y n t h e s i s 2 3 3 2 p c r 反应 取适量第一链e d n a 产物为模板，以p 4 、p 3 为引物进行p c r 扩增。反应 体积为1 0 0 i ll ，l o x p c r 缓冲液1 0 pl ，1 咖o l l 的各种d n t p 混合液5 pl ， 2 5 m m o l lm g c l ：1 0i ll ，上下游引物各5 0 p m o l e ，上述逆转录产物5ul ，t a q 酶2 5 ul ，加水至1 0 0 l ll ，混匀后，短暂离心，用石蜡油封住液面。p c r 反 应参数设置为：9 4 0 c3m i n 、9 4 3 0s 、6 9 。c3 0s 、7 2 。c6 0s ，3 0 个循环， 最后7 2 。c5 m i n 。p c r 反应结束后，取1 0i il 进行1 琼脂糖凝胶电泳，以检 查扩增结果 四川太擘硕士学位论文p e r o x i r e d o x i n 基因的克隆和表达 整个系统的r t - p c r 反应则以只c h r y s o s p r o i u m 的三磷酸甘油醛脱氢酶 基因( g p d ) 引物扩增出预期大小盅d n a 条带作为正对照。 2 2 4r a c e p c r 克隆全长c d n a 2 2 4 l 第一链c d n a 的合成 用c l o n t e c hs m a r tp c rs y n t h e s i sk i t 合成和扩增c d n a ，实际操作按 试剂盒说明书进行。主要步骤为：0 0 5 肛g 总r n a 在c d n a 合成引物( c d s p r i m e r ) 和s m a r t i i 寡聚核苷酸引物存在下，7 0 温育2 m i n 后，冰上骤冷 2 m i n ；然后在终体积为l o pl 的反应体系中，加入5 第一链反应缓冲液( 2 5 0 m o l lt r i s h c i ，p h 8 3 ，5 0 m m o l lk c l ：3 0 1 1 m o l lm g c l 2 ) 2hl 、d t t ( 2 0 岫o l l ) li ll 、d n t p ( 1 0m m o l l ) ll il ，4 2 温育l h 合成第一链c d n a 。7 0 下终止反应l o m i n 。 2 2 4 2r a c e 技术获得全长p c p r x 1c d n a 1 ) r a c e 引物设计 根据已知序列，引物按照s m a r tr a c e 试剂盒的要求“2 3 2 8n t 、5 0 7 0 g c 比例、t m 6 5 ”设计一系列r a c e 引物。所设计的引物均由北京 赛百胜公司合成使用浓度均为1 0 | lt o o l l 。引物序列参见p 7 2 ) $ - r a c e 按照试剂盒的操作流程，首先进行反转录反应，制备5 r a c e - r e a d y c d n a 。随后，采用通用引物混合物u p m ( 此时作为上游引物) 和p 1 进行首 轮p c r 扩增循环条件为：9 4 03m i n ：9 4 3 0s ，7 2 2m i n ，5 个 循环：9 4 3 0s ，7 0 3 0s ，7 2 2m i n ，5 个循环：9 4 3 0s ，6 8 3 0s ，7 2 2m i n ，1 5 个循环。扩增结束后，用t e ( p h8 0 ) 将其 稀释5 0 倍，进行第2 次扩增，即用巢式通用引物n u p 和巢式引物p 2 作巢 式p c r 扩增。循环条件为：9 4 5m i n ：9 4 3 0s ，6 9 03 0s ，7 2 2 m i n ，1 7 个循环。2 次扩增结束后，用1 琼脂糖凝胶电泳回收，克隆至 p m d l 8 - t 载体，转化大肠杆菌d h 5 ，菌落在含有氨苄青霉素的琼脂平板上生 长1 6h 。菌落p c r 筛选阳性克隆，质粒提取，双酶切鉴定插入片段。选择阳 四川大学硕士学位论文p e r o x i r e d o x i n 基园的克隆和表达 性克隆做测序分析。 3 ) 3 - r a c e 按照