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钝顶节旋藻a r t h r o s p i r a p l a t e n s f a c h b 3 4 1 藻蓝蛋白基因 上游序列功能研究 摘要 在本实验室先前的工作中已经证实,钝顶节旋藻( a r t h r o s p i r ap l a t e n s i s f a c h b 3 4 1 ) 藻蓝蛋白操纵子上游的4 1 9 b p q - r 有6 条启动子序列,本文研究了该上 游序列各启动子中与启动强度有关的因素。我们选择6 条启动子中表达水平较高 的3 条启动子p r o m o t e r3 、p r o m o t e r 4 和p r o m o t e r 6 ,列其0 0 3 号启动子的一1 0 元件和 3 5 元件、4 9 启动子的一1 0 元件及6 号启动子的一3 5 元件进行不同位点多种形式的诱 变处理,流式细胞仪分析g f p 的表达水平检测启动子强度。通过一3 5 元件与- l o 元 件中单碱基的改变对报告基因的表达的影响,分析不同碱基在启动子中所起作用 的主次和强弱。 t a k a r a m u t a n b e s t k i t 用来进行定点突变,结果表明,3 号启动子的一l o 元件 突变后,各突变株g f p 表达量明显上升,达原表达量的2 4 倍;3 号启动予的3 5 元件突变后,g f p 表达量均下降,减少到原表达量的2 - 4 ;而4 号启动子的一1 0 元件与6 号启动子的一3 5 元件突变后,不同突变株的表达量有上升也有下降。实验 证明了一3 5 区与一l o 区在保持启动子功能方面的重要作用,对阐明藻蓝蛋白基因启 动子的作用机理提供了实验数据,并为蓝藻基因工程提供了强有力的启动元件。 启动于是基因表达调控中重要的顺式元件,其结构与功能的研究成为分子生 物学的研究热点之。但目前的启动子研究还存在许多问题,很多启动子上的序 列功能我们到现在为i i 还不完全清楚,特别是国内外有关藻类启动子方面的研究 很少,尚未见到有关藻类启动子研究进展的综述性报道。如果能了解其研究现状, 找出不足,指导未来启动子研究的方向,将会对基因表达调控的研究起到促进作 用。基于此目的,我们整理了一篇综述文章,介绍r 植物基因启动子的研究方法 与概况,重点综述了藻类基因启动子的研究现状,介绍了本实验室对节旋藻藻蓝 蛋白基因启动子的研究情况,并就启动子在基因工程中应用价值进行了讨论。 另外,先前工作证明,将节旋藻f a c h b 3 4 1 品系丁2 5 。c ,光照强度 4 0 9 m 0 1 m - 2 s 。条件f 培养,进行转录分析,结果只有一条启动子,即1 号启动子 参加了转录调控。另外,通过以大肠杆菌d h 5 a 和聚球藻( s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 2 ) 为表达载体分别证明了温度、光强的变化会影响启动子驱动的g f p 报告基 因的表达。为了进一步分析其作用机制,我们在极端温度、光强条件下培养节旋 藻,采用s m a r t r a c e 技术进行转录分析,看特定的条件下该基因的转录特征是否 变化。结果证明在温度分别为1 5 、3 5 ,光强分别为1 0 u a n o l ,i n - 2 s 、 7 0j t m 0 1 m - 2 s 。1 时,藻蓝蛋( 5 1 c p c b 基因的转录起始位点数量、位置不变,仍只有l 号启动子参加转录调控,转录起始位点位于翻译起始位点上游一2 8 5 b p 处。初步分 析在极端温度和光强条件下培养节旋藻,不会引起c p c b 基因转录起始位点的变 化。至于温度、光强对启动子功能的影响机制还有待进一步研究。 关键词:钝顶节旋藻;藻蓝蛋白;定点突变:转录分析 i l s t u d i e so ht h e u p s t r e a ms e q u e n c eo fp h y c o c y a n i nps u b u n i t g e n ef r o ma r t h r o s p i r a p l a t e n s i sf a c h b 3 4 1 a b s t r a c t s i x p r o m o t e r s i n t h e4 1 9b p u p s t r e a ms e q u e n c eo f t h e p h y e o c y a n i nps u b u n i t g e n e o f a r t h r o s p i r ap l a t e n s i sf a c h b 3 4 1w e r ec l o n e di n0 1 1 1p r e v i o u sw o r k i nt h i ss t u d y , s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i si su s e df o ri n d u c i n gm a n i f o l dm u t a t i o n si n l0a n d 。3 5 b o x e so f p r o m o t e r3 ,一1 0b o xo f p r o m o t e r4 ,a n d 一3 5b o xo f p r o m o t e r 6 ,r e s p e c t i v e l y t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fr e p o r tg e n e 咖m e a s u r e db yf l o wc y t o m e t r yi su s e da st h e i n d i c a t o ro f s t a r t u pi n t e n s i t yo f t h em u t a n t s , r e s u l t ss h o wt h a tt h ee f f e c t so fs i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i si nd i f f e r e n tp r o m o t e r s a r eq u i t ed i s s i m i l a r :m u t a n t sf r o m 一1 0b o xo f p r o m o t e r3l e a dt oo b v i o u sr i s eo f g f p l e v e l si na l lc a s e s ,m u t a n t sf r o m 一3 5b o xo f p r o m o t e r3d e c l i n es h a r p l y ,a n di n 10b o x o fp r o m o t e r4a n d 一3 5b o xo fp r o m o t e r6 ,t h ee x p r e s s i o nl e v e l so fs o m eo ft h e i r m u t a n t sr i s e ,w h i l es o m ed e c l i n ea f t e rm u t a g e n e s i s t h e r eh a sb e e nn od e t a i l e d a n a l y s i so ft h eu p s t r e a ms e q u e n c eo fp h y c o c y a n i ni nb l u e g r e e na l g a eb e f o r e t h i s w o r km a yp r o v i d es o m ed a t af o rc l a r i f y i n gt h ep r i n c i p l eo f t h ep r o m o t e r so f c p c b ,a n d s o m ep o w e r f u lp r o m o t e r so b t a i n e di nt h ep r e s e n ts t u d ym a yo f f e ru s e f u lt o o l sf o r g e n e t i cm a n i p u l a t i o ni nb l u e g r e e na l g a ea n do t h e ro r g a n i s m s a sp r o m o t e r sa r ee s s e n t i a lc i s a c t i n ge l e m e n t si ng e n ee x p r e s s i o n , t h e i rs t r u c t u r e a n df u n c t i o nb e c o m eo n eo ft h eh o ts p o to fm o l e c u l a rb i o l o g y b u tt h e r ea r em a n y p r o b l e m so n t h ea c t u a lp r o m o t e rr e s e a r c h t h ef u n c t i o n so f m a n yp r o m o t e rs e q u e n c e s a r eu n k n o w n ,e s p e c i a l l yt h o s eo nt h ep r o m o t e r si na l g a e t h e r eh a sb e e nn og e n e r a l r e p o r to nt h er e s e a r c he v o l u t i o na b o u ta l g a ep r o m o t e r sb e f o r e i ti su s e f u lt h a tf i n d i n g o u tt h ei n s u f f i c i e n c ya n da s c e r t a i n i n gt h ed i r e c t i o nf o rt h ep r o m o t e rr e s e a r c hi nt h e f u t u r e i tw i l lp r o m o t et h er e s e a r c ho nr e g u l a t i o no fg e n ee x p r e s s i o n t h i sp a p e r s k e t c h e st h er e s e a r c ht a c t i c sm a dg e n e r a ls i t u a t i o no fp l a n tp r o m o t e r s ,w i t hs p e c i a l e m p h a s i so nt h a t i na l g a e i ta l s or e v i e w st h ei n v e s t i g a t i o n so nt h ep r o m o t e r so f p h y c o c y a n i n1 3s u b u n i te n c o d i n gg e n eo fb l u e g r e e na l g aa r t h r o s p i r a p l a t e n s 括i no u r l a b o r a t o r y , a n dp r o p o s e st h ep o s s i b i l i t i e so fa p p l i c a t i o no fa l g a lp r o m o t e rr e s e a r c hi n g e n e t i ce n g i n e e r i n g w h e na r t h r o s p i r a p l a t e n s i sf a c h b 3 4 1w a sc u l t u r e da t2 5 。c ,4 0 9 m o lm 一2s - 1l i g h t i n t e n s i t y , o n l yo n ep r o m o t e rt h a tw a st h en u m b e r1 t o o kp a r ti nt h et r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n t h ec h a n g eo ft e m p e r a t u r ea n dl i g h ti n t e n s i t yw i l la f f e c tt h ee x p r e s s i o no f r e p o r tg e n eg o , d r i v e nb yp r o m o t e l i n t h i s s t u d y , t r a n s c r i p t i o n a lp a t t e r n o f c p h y c o c y a n i ng e n e u n d e rd i f f e r e n tc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n si sd e t e r m i n e d b y s m a r t r a c et e c h n o l o g y r e s u l t ss h o wt h a tt h en u m b e ra n dp o s i t i o no f t h et r a n s c r i p t i o n s t a r ts i t eo f p h y c o c y a n i nps u b u n i tg e n ea r ei n v a r i a b l eu n d e rn e i t h e r1 5 。co r2 5 c ,n o r 10 9 m o lm _ 2s - 1o r4 0 n o lm 一2s - 1l i g h ti n t e n s i t y t h et r a n s c r i p t i o ns t a r ts i t egi s l o c a t e da t 一2 8 5 b pu p s t r e a mo ft h es t a r tc o d o n i ti si l l u m i n a t e dt h a tt h ec h a n g e so f c u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sw i l ln o ta f f e c tt h et r a n s c r i p t i o ns t a r ts i t eo fp h y c o c y a n i nb s u b u n i tg e n e f u r t h e rr e s e a r c hi sn e e d e dt oc o n f i r mt h em e c h a n i s mt h a tt e m p e r a t u r e a n d l i g h ti n t e n s i t ya f f e c tt h ef u n c t i o no f p r o m o t e r s k e yw o r d s :a r t h r o s p i r ap l a t e n s 缸f a c h b 3 4 1 ,e - p h y e o c y a n i n ,t r a n s c r i p t i o n a l a n a l 3 ,s i s 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导f 进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含未获得 i 洼;塑塑查墓丝益要壁型壹塑的! 奎拦丑窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贞献均己在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学雠文储鹳:啷楠签字慨吁月扩日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完令了解学校有关保留、使用学位论文的规定,有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名:嚏辛1 3 | i 氧 签字吼叼年g 月占同 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 通讯地址: 导师签字: 吩 签字日期艺叛夕年月护日 电话 邮编 钝顶节旋藻a r t h r o s p i r a p l a t e n s i $ f a c h b 3 4 1 藻蓝蛋白摹因上游序列功能研究 1 文献综述和立项依据 1 1 蓝藻藻蓝蛋白基因分子生物学研究 1 1 1 蓝藻简介 蓝藻是类光合原核生物,是藻类中最古老、最原始的门类,在地球上出现 已有3 0 多亿年,是海洋中重要的原初生产者之一。其细胞壁与细菌类同,无细胞 核及双层膜结构的细胞器,染色体d n a 裸露,因此又名蓝细菌( c y a n o b a c t e r i a ) , 但它们的光合系统类似于真核藻类和高等植物,含叶绿素a ( 无叶绿素b ) 和藻胆 色素,具有光系统i 和光系统i i ,能迸行光解水放氧的高等植物类型的光合作用, 因此又称蓝绿藻( b l u eg r e e na l g a e ) 。蓝藻分子遗传学研究始于上世纪八十年代, 这一时期属于开拓阶段,主要是建立基因转移体系,筛选突变株,单个基因的克 隆和表达分析。进入九十年代,其研究则开始着眼于基因调控途径或网络的解析, 生物钟和异型胞分化研究是这方面研究的两个重要例子。九十年代后期,随着若 干蓝藻基因组序列分析的完成预示着蓝藻分子生物学研究进入基因组时代( 孔任 秋等,2 0 0 1 ) 。 单细胞蓝藻集胞藻p c c 6 8 0 3 与聚球藻w h 8 1 0 2 的基因组序列相继公布,丝状 固氮蓝藻鱼腥藻( a n a b a e n as p ) 和点形念珠藻( n o s t o c p u n c t i f o r m e ) a t c c 2 9 1 3 3 , 也己完成基因组测序。其中集胞藻的基因组数据公布较早,对蓝藻分子遗传学研 究起了重要作用。截止到2 0 0 4 年1 1 月1 日,在蓝藻基因组数据库中共有1 0 种蓝藻 的全部基因组信息( h t t p :w w w k a z u s a o r j p c y a n o c y a n o h t m l ) 。 由于蓝藻特有的生物学特征和特殊的进化地位,是研究光合作用的理想的实 验系统,从分子水平了解光合作用的机制一直是蓝藻分子遗传学的重点。自1 9 8 0 年从鱼腥藻( a n a b a e n av a r i a b i l i s ) 中克隆至j j i f h l 基因,至今克隆的各种功能基 因1 3 0 种以上,其中7 0 以上与光合作用有关( 秦松等,1 9 9 3 ) 。 钝顶节旋藻a r t h r o s p i r a p l a t e n s i sf a c h b 3 4 1 濠蓝蛋白摹因上游序列功能研究 1 1 2 节旋藻简介 节旋藻( a r t h r o s p i r a ) 是一种主要生长在热带、亚热带地区的淡水或盐碱湖 中的多细胞丝状蓝藻( b l u eg r e e na l g a e ) ,起源于约3 5 亿年前,是地球上最早进行 光合作用的生物之一。节旋藻在分类上属原核生物,蓝藻门( c y a n o p h y t a ) ,段 殖藻日( h o r m o g o n a l e s ) ,颤藻科( o s c i l l a t o r i a c e a e ) ,节旋藻属。目前己知这个 属在全世界有3 5 个种,多数为淡水种,有4 个种分布在海洋中。 在过去很长一段时间里,节旋藻被归类于与其形态相似的螺旋藻属 ( s p i r u l i n a ) ,为该属的一个亚属;直至近一、二十年,随着电镜技术的发展和 分子生物学方法的应用,节旋藻与螺旋藻之间在亚显微结构和遗传本质上的巨大 差异逐渐为人们所认识,节旋藻和螺旋藻是分立的两个属的观点才被蓝藻分类学 家所普遍接受。 节旋藻的基础研究及应用研究是目前蓝藻生物学的热点之一( 张学成, 1 9 9 9 ) 。作为一种非常重要的经济蓝藻,其日益受到关注的原因在于本身所具有 的营养价值和医疗功能。节旋藻蕴涵丰富的蛋白质、维生素、不饱和脂肪酸、多 糖和有益于人体健康的微量元素,营养均衡,安全无毒。节旋藻还有许多医疗功 能,如提高人体免疫力,抵抗辐射损伤,降低血糖,血脂,抗病毒等。在世界范 围内,钝项节旋藻( a r t h r o s p i r a p l a t e n s i sf a c h b 3 4 1 ) 等品系被大规模养殖,并 被用做功能食品和蛋白源。我国的节旋藻养殖开始于二十世纪七十年代,目前己 成为我国最大的微藻产业( z h a n g ,1 9 9 8 ) 。 1 1 3 藻蓝蛋白基因 1 1 3 1 藻蓝蛋白( c p c ) 藻胆蛋白是存在于蓝藻、红藻、隐藻中的一类光合作用捕光色素蛋白,可吸 收光能并传递到光反应中心( h ue t a l ,1 9 9 9 ) 。藻胆蛋白具有特殊的光谱吸收性 质,根据这些光谱性质,藻胆蛋白又可分为藻红蛋白( p h y c o e r y t h r i n ,p e ) 、藻 红蓝蛋白( p h y c o e r y t h r o c y a n i n ,p e c ) 、藻蓝蛋白( p h y c o c y a n i n ,p c ) 和别藻蓝 蛋白( a l l o p h y c o c y a n i n ,a p c ) 。p e 、a p c 在藻细胞的类囊体膜上,组成高度有 序的超分子结构一藻胆体,作为光合作用的捕光色素系统,将捕获的光能传递给 2 钝顶节旋藻d r t h r o s p i r a p l a t e n s i $ f a c h b 3 4 1 藻蓝蛋白幕因t 游序列功能研究 光系统i i ,传递方向为p e p c a p c c l la ( r o w a n ,1 9 8 9 ;z i l i n s k a se ta l ,1 9 8 6 ) 。 在钝顶节旋藻( a r t h r o s p i r ap l a t e n s i s ) 中,藻胆体主要由c 藻蓝蛋白、别藻蓝蛋 白和连结蛋白所组成( 王广策等,1 9 9 6 ) 。 藻蓝蛋白作为一种非常重要的藻胆蛋白,除用于光合作用研究外,还具有很 高的开发利用价值。可以作为天然的色素,用于食品、化妆品、染料等工业。可 制作成荧光探针,用于癌细胞表面抗原的检测,及蛋白质、核酸等生物大分子的 分析等。具有重要的医疗保健和药用价值。能促进动物血细胞再生,提高淋巴细 胞活性,提高机体免疫功能,消炎,防治癌症,溃疡等疾病( s c h w a r t se t a l ,1 9 8 6 ) 。 藻蓝蛋白还是一种抗氧化剂,具有预防泌尿系统结石的功能,对肾细胞具有保护 作用( f a r o o q e ta l ,2 0 0 4 ) 。可诱导人白血病细胞株k 5 6 2 的凋亡( s u b h a s h i n ie t a l , 2 0 0 4 ) 。对自由基有清除作用( b h a t e l a l ,2 0 0 0 ) ,对放射伤有治疗作用( k a r p o v 甜可,2 0 0 0 ) 。 藻蓝蛋白由亚基、b 亚基以及发色团构成。一般认为,在藻胆体内,p c 以 ( q d ) 3 和( p ) 6 存在,聚集态越高,其捕获和传递光能的能力越强( g l a z e r , e a ,1 9 8 4 ) 。1 9 8 6 年c o n l e y 等( 1 9 8 8 ) 提出藻蓝蛋白的a 亚基基因总是位于b 亚 基基因的下游,且亚基和b 亚基以顺反子的形式转录,以保证细胞中这两种亚基 的数量接近1 :1 。这些亚基不仅在转录单元中的排列方式非常保守,而且氨基酸 组成也很保守,特别是某些重要的功能区段,但两亚基之间的问隔区的长度及序 列具有较大的变异性。 以下为钝顶节旋藻f a c h b 3 4 1 藻蓝蛋白操纵子结构示意图( 刘金姐,2 0 0 3 ) 。 图1 1 钝项节旋藻f a c h b 3 4 1 藻蓝蛋白操纵子结构示意图 u p s :c p c b 基因上游序列;i g s :藻蓝蛋白b 亚基和n 亚基基因间隔区序列 f i g u r e 1 1t h es t r u c t u r eo f t h ec p c o p e r o no f ap l a t e n s i sf a c h b 3 4 1 , u p b :u p s t r e a ms e q u e n c eo f c r bg e n e ;i g s :p h y e n c y a n i ni n t e r g e n e t i es p a c e rr e g i o n ; 1 1 3 2 藻蓝蛋白上游调控序列的研究 钝项节旋藻a r t h r o s p w a p l a t e n s i sf a c h b 3 4 1 藻蓝蛋白基因上游序列功能研究 1 9 9 4 年c a s e y 等研究证明,在夫列藻f r e m y e g a d i p l o s i p h o n 的c p c b 2 a 2 操纵子 中,一7 以3 7 的序列对c p c b 2 a 2 的表达是必需的,7 + 2 5 的区域是红光诱导的 作用区,1 6 2 1 2 2 , 口一3 7 + 2 5 的两段序列是调控蛋白的两个结合位点,来自红 光和绿光下生长的细胞粗提物蛋白都可与第一个位点结合,只有来自红光下生长 的细胞抽提物才能与后一个位点反应,这说明该位点对互补色适应是很重要的。 在c p c b l a l 的转录位点下游可形成两个茎环结构,可能具有衰减子功能( m a z e le t a l ,1 9 8 8 ) ;憎鲥基因参与c p c b l a l 基因的表达调控,对其有抑制作用( k a h ne t a l , 1 9 9 7 ) 。 k a l l a 等( 1 9 8 5 ) 曾报道藻蓝蛋白的两个亚基是共转录的,p 亚基在q 亚基前面。 并证明在聚球藻p c c 6 3 0 1 中,两拷贝的藻蓝蛋白基因都能进行转录。s a w a k i 等 ( 1 9 9 8 ) 报道,在聚球藻p c c 7 9 4 2 中有两拷贝的藻蓝蛋白基因c p c b l a l 和 c p c b 2 a 2 ,它们的上游非编码区分别长4 2 8 b p 与2 8 6 b p ,序列与p c c 6 3 0 1 完全相同, 但只有c p c b 2 a 2 有一条1 3 k b 的转录物,有一个启动子。在p c c 6 3 0 1 中,c p c b l a l 有两条转录物,分别为1 4k b 和1 3 k b ,两条转录物分别有自己的启动子,并且 发现启动子表现出昼夜节律性,在黄昏时表现最高活性,在凌晨表现最低活性。 1 1 - 3 | 3 藻蓝蛋白突变体研究 在眉藻( c a l o t h r i x ) p c c 7 6 0 1 中有三个不同的操纵子,互补色适应仅需其中 的两个操纵子。在绿光下操纵子i 组成型表达,红光下操纵子l 、i i 一起表达,操 纵子1 1 1 仅在硫元素缺乏时表达( m a z e le ta l ,1 9 8 6 ;c o n l e ye ta l ,1 9 8 8 ) 。该3 聚 体的a 和b 亚基是否来源于同一个操纵子尚不太清楚。有实验证明不同来源的亚 基完全可以组合为有正常功能的藻胆蛋白分子。例如p l a n k 等( 1 9 9 5 ) 发现藻蓝 蛋白8 亚基缺失突变株集胞藻p c c 6 8 0 34 r 中c p c b 基因突变,不能产生b 亚基, 但如果在该突变株引入外源的b 亚基基因并使表达,则可以在细胞中产生正常的 藻蓝蛋白。 n a k a j i m a 等( 1 9 9 8 ;2 0 0 1 ) 在集胞藻p c c 6 7 1 4 中发现一藻蓝蛋白缺乏突变株 系( p d 一1 ) ,序列测定结果和n o r t h e r nb l o t 结果分析都显示野生型c p c 操纵子的组 成顺序为;c p c b ,c p c a ,c p c c i ,c p c c 2 和c p c d ,而该株系藻蓝蛋白启动子效率 仅为野生型的1 6 1 1 0 ,经分析发现在其c p c b 基因起始密码子上游2 5 9 碱基,即一1 0 区域下游3 碱基处的“c ”突变为“r 。 4 钝顶节旋藻a r t h r o s p i r a p l a t e n s i sf a c h b 3 41 藻蓝蛋白摹西j :游序列功能研究 在聚球藻( s y n e c h o c o c c u ss p ,p c c 6 3 0 1 ) 中,存在有两个拷贝的藻蓝蛋白基 因,两个基因间隔2 5k b 其两株突变体的藻胆蛋白的结构发生了变化,连接蛋 白杆状物较原来短。基因图谱分析表明其中l 株突变体a n l l 2 完全缺失了基因间 隔区并且只含有1 个拷贝的藻蓝蛋白;而在另外1 株突变体a n l 3 5 中没有发现遗传 结构上的变化。通l - j 2 r t h e r n 杂交和引物延伸实验进一步分析表明a n l l 2 中丢失 了3 7k b 的d , m r n a ,j l t m r n a 位于基因间隔区上,而只是生成了重要的1 3 和1 4 k b 的m r n a 。这些转录物是各转录单位的融合产物,包括左侧藻蓝蛋白启动子区 域转录单位的5 端和右侧藻蓝蛋白启动子区域转录单位的3 端( k a l l a , 1 9 8 9 ) 。 1 1 3 3 环境因子对藻蓝蛋白表达的影响 光是影响藻蓝蛋白表达的重要因素。在蓝藻中存在互补色适应现象 ( c o m p l e m e n t a r yc h r o m a t i ca d a p t a t i o n ) ,即某些藻类对生长环境中光质的改变在 藻胆蛋白的组成上所作的适应性的变化。如某些藻类在绿光下有利于藻红蛋白的 合成,而在红光下有利于藻蓝蛋白的合成。一般认为只有当蓝藻含有p e 时才可 能有此现象。b a b u 等( 1 9 9 1 ) 认为节旋藻中不存在互补色适应现象,但在不同 的光质下藻胆蛋白的含量是有差异的。张爱琴等( 1 9 8 9 ) 发现,在绿光下节旋藻 藻胆蛋白的含量明显低于其他色光和自光。在低光强( 高于光补偿点) 下,藻胆 蛋白的合成增加,这是对光限制的一种适应行为,通过藻胆蛋白数量的增加来保 证光合作用的进行。当然,黑暗和弱光( 低于光补偿点) 不利于合成。g a m i e r 等 ( 1 9 9 4 ) 发现,在高光强下,极大节旋藻中p c 含量下降,一条3 3 k d 的连接肽消 失,而另有三条非连接多肽却出现了,它们对高光强具有依赖性。 除光照外,适合的温度,高浓度的c 0 2 ,丰富的营养等均有利于藻蓝蛋白的 合成,反之,则不利于其合成。藻胆蛋白,特别是藻蓝蛋白,是藻细胞中主要的 蛋白储存库。在环境条件合适时大量合成,而当环境条件缺乏时则被分解,提供 合成生存必需蛋白质需要的材料,当藻胆蛋白被分解后,藻细胞的颜色变浅,这 种现象被称为漂白现象。n ,p ,s ,f e ,c 的缺乏均可引起漂白现象,n 和s 引起 的漂白现象与p 缺乏引起的有所不同,表明不同的生理过程参与其中。m a r q u e z 等( 1 9 9 5 ) 发现在高浓度溶解氧( 1 2 5 m m o l l ) ,藻蓝蛋白含量减少。m a r q u e z 等( 1 9 9 5 ) 和c h e n 等( 1 9 9 6 ) 均认为兼养培养有利于钝顶节旋藻中色素含量的 增加。 钝顶节旋藻d r t h r o s p i r a p l a t e n s t sf a c h b 3 4 1 藻蓝蛋白肇因上游序列功能研究 1 2 启动子结构功能研究的主要手段 启动子( p r o m o t e r ) 是基因调控中普遍存在的顺式作用元件,是r n a 聚合 酶能够识别并与之结合而起始基因转录的一段d n a 序列,通常位于基因5 端上 游。它能决定转录的方向和效率,以及r n a 聚合酶类型,并引导r n a 聚合酶 与模板的正确结合。启动子是基因表达调控的重要元件,它与r n a 聚合酶及其 他反式作用因子的相互作用是通过基因转录实施基因调控转录的关键( 路静等, 2 0 0 4 ) 。 1 2 l 原核与真核生物启动子特点 一般说来,原核启动子的核心区域一般在转录起始位点上游2 0 0 b p 至下游 l o o b p 的范围内。对于大肠杆菌启动子,与启动功能有密切关系而且结构保守的 因子有:转录起始位点( t s s ) 、1 0 区序列、3 5 区序列以及一1 0 区和一3 5 区序列的 间隔距离。t s s 组成通常以嘌呤碱基( a 或g ) ,在t s si - 游大约3 5 b p 和l o b p 处有 两个共同的顺序,称为3 5 序列( t t g a c a ) 和1 0 序列( t a t a a t ) ,它们分别是 r n a 聚合酶的识别和结合位点。原核生物中1 0 区同一3 5 区之间间隔区域的序列组 成并不重要,但两者距离的大小对适应r n a 聚合酶的几何构象却很重要。强启 动子一般为( 1 7 士1 ) b p ,当间距小于1 5b p 或大于2 0 b p 时都会降低启动子的活性 ( 杜耀华等,2 0 0 5 ) 。 通过对多种真核生物启动子的分析发现,真核生物基因启动子的典型核心结 构( c o r ep r o m o t e r ) 大约在转录起点- 4 p + 5 0b p 之间( c a r e ye ta l ,2 0 0 0 ) ,存在 多个顺式元件。在2 扣一3 5b p 处含有t a t ab o x ,t a t ab o x 保守序列为 t c a c t a t a t a t a g ”,一般被认为参与决定转录的方向,并在依赖于r n a 聚合 酶i i 和n 1 的启动子内起作用( j o s h i ,1 9 8 7 ;李一醌等,1 9 9 8 ) 。t a t a b o x 是绝大 多数植物启动子正确启动转录所必需的,不含t a t a b o x 的基因的精确转录受起 始子( i n i t i a t o r s , i n r ) 介导。i n r 元件一致序列为p y p y n t a p y p y 。i n r 在功能 上与t a t ab o x 类似,能指导转录起始前复合物的装配、决定转录起始位点并调 节上游激活蛋白的活性。但不同的是h l r 元件往往与转录起点重叠( c a r e y e l a l , 2 0 0 0 ) 。,7 吐一7 8b d 处有c a a tb o x ,- 8 0 一1 1 0b p 区含有g cb o x ,他们是r n a 6 钝顶节旋藻, , i r t h r o s p i r a p l a t e n s i sf a c h b 3 4 1 藻蓝蛋白基因上游序列功能研究 聚合酶i i 结合的位点( 吴乃虎,2 0 0 1 ; 保守序列称为上游启动子元件( u p e ) , 张晓春等,2 0 0 4 ) ,这些t a t a 区上游的 协同作用确保转录精确而有效地起始。 随着基因表达调控研究的进行,对启动子结构功能的研究越来越受到普遍重 视,发展了许多方法。目前,研究启动子功能的方法主要有定点突变技术、报告 基因表达分析、转录位点分析、以及酵母双杂交技术、r n a 干涉技术等。 1 2 2 定点突变技术 定点突变( s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ) 技术是研究调控序列结构和功能的重 要手段,一般是利用转座子插入突变、限制性酶切除去某一特定启动子元件,或 者是p c r 方法去掉或改变某一特定序列,通过突变后报告基因的表达情况确定特 定序列的功能。该方法比使用化学因素、自然因素导致突变的方法具有突变率高、 简单易行、重复性好的特点。目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定 点突变、p c r 介导的定点突变及盒式突变。不同方法的原理不同,共同之处在于 高效产生目的突变的同时,防止错误突变的产生。 1 2 2 1 寡核苷酸引物介导的定点突变 其原理是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物,在聚合酶的作用下启动 d n a 分子进行复制。主要的过程( 见图1 2 ) :将待突变基因克隆到突变载体上; 制备含突变基因的单链模板;引物与模板退火5 端磷酸化的突变寡核苷酸引 物,与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的d n a ,合成突变链: 在d n a 聚合酶的催化下,引物以单链d n a 为模板合成全长的互补链,而后由连 接酶封闭缺口,产生闭环的异源双链的d n a 分子:转化和初步筛选异源双链 d n a 分子转化大肠杆菌后,产生野生型、突变型的同源双链d n a 分子。可以用 限制性酶切法、斑点杂交法和生物学法来初步筛选突变的基因:对突变体基因 进行序列分析。 钝顶节旋藻d r t h r o s p i r a p l a t e n s i s f a c h b 3 4 1 藻蓝蛋白摹因上游序列功能研究 l l i n s e r t lc l o n ei n s e r t i n t oy e c t o r 2is o l a t ed s d n a i n ed 眦t n r e n d m u t a g e n t t co l l g o l sh t l& 墨i 擘墨矗絮v 。a d i s e l e c tm u t a t s 图1 2 寡核苷酸诱导的定位突变方法的示意图 f i g u r e1 2s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h es i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s 其优点是保真度t t p c r 突变法高,经过改进后使该方法突变成功率大大提 高,缺点是操作过程环节复杂、周期长,而且在克隆待突变基因时会受到限制性 酶切位点的限制。 1 2 2 2p c r 介导的定点突变法及其改进大引物突变法 p c r 反应的出现推动了定点突变的发展,以p c r 为介导的定点突变为基因 修饰、改造提供了另一条途径。如通过改变引物中的某些碱基而改变基因序列, 钝项节旋藻a r t h r o s p i r a p l a t e n s i s f a c h b 3 4 1 藻蓝蛋白摹因上游序列功能研究 达到有目的改造蛋白质结构、研究蛋白质的结构和功能之间的关系的目的。还可 以在所设计的引物5 端加入合适的限制性内切酶位点,为p c r 扩增产物后续的克 隆提供方便。 经典p c r 介导的定点突变法,需要4 种扩增引物,进行3 次p c r 反应( 见图1 3 ) 。 头两次p c r 反应中,应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引 物,扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链d n a 片段,去除未参入的多余引物 之后,这两条双链d n a 片段经变性和退火可以形成具有3 凹末端的异源双链分 子,在t a q d n a 聚合酶的作用下,产生含重叠序列的双链d n a 分子。这种d n a 分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三次p c r 扩增,便产生突变体d n a 。 t a r g e td n a ;= = = = = 鼍- - - = - - a - - ! - a - 一5 j 3 。_ 、一 l p r :。p r ,。a ,1 i 竺 i 竺 p r h blp c r l p c r p r i i 。c y 一”:= = := 炎亨f :;芝:= 了 l 巨三固 弘一 ! :三连i 一了 f 了= 楚兰一f m p 0 蛳哪跎 ;i i 芝= = 欠= = = = 坐; ;墨荽:班h ;= = = = = 忽= = = 芋 图1 3p c r 突变示意图 p i g u r e1 3s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h ep c rm u t a g e n e s i s 大引物突变法是以第1 次p c r 扩增产物作为第2 次p c r 扩增的大引物,整个过 9 钝项节旋藻a r t h r o s p l r a p l a t e n s i s f a c h b 3 4 1 藻蓝蛋白摹囡上游序列功能研究 程只需3 种扩增引物进行2 次p c r 反应,可获得突变体d n a 。 其优点是操作较简单,突变的成功率可达1 0 0 。但它亦有两个缺点:后 续工作较复杂,p c r 扩增产物通常需要连接到载体分子上,然后才能对突变的基 因进行转录、转译等方面的研究; t a q d n a 聚合酶的保真性偏低;因此,p c r 方法产生的d n a 片段要经过核苷酸序列测定,方可确证有无发生其它突变。 】2 2 3 盒式突变 盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段,取代野生 型基因中的相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的,当它们
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