（海洋生物学专业论文）海洋酵母普鲁兰类酵母aureobasidium+pullulans铁载体的研究.pdf

海洋酵母普鲁兰类酵母( 4 w e 拍a s d 伽p “a ，7 s ) 铁载 体的研究 摘要 从实验室海洋酵母菌种库的3 0 0 多株海洋酵母中利用高氯酸铁检测的方法 筛选得到1 4 株产铁载体的酵母，经过复筛得到一株铁载体产量较高的海洋酵 母菌菌株h n 6 2 ，该菌株分离自中国青岛东风盐场近海表层海水。通过传统的 酵母菌种鉴定及分子生物学鉴定，最终鉴定该株海洋酵母属于普鲁兰类酵母 ( 么“阳d 6 傩础“聊p “刀“肠珊) 。采用单次因子方法对h n 6 2 菌株发酵产铁载体培 养基及培养条件进行优化，得到最适产铁载体的培养基组分是( w v ) ：蔗糖 3 0 ，n h l n 0 3o 3 ，k 2 h p 0 4o 3 ，柠檬酸o 1 ，m g s 0 4o 0 0 8 ，z n s 0 4 o 0 0 0 2 ，1 0 i n ml o m ，蒸馏水配制，初始p h 调至6 2 。最佳培养条件为：在 2 8 和2 0 0 印m 下培养1 2 0 h 。在此最佳条件下培养，删6 2 菌株的铁载体最高 产量可达到1 1 m g m l 。 本文研究发现，产铁载体培养基中加入l 鸟氨酸后铁载体的产量明显增 加，而加入f e ”后，其产量明显减少。并且，从分子水平上检测l 鸟氨酸- n 羟基化酶基因在不同条件下的表达量情况而得到同样的结果。 将h n 6 2 菌株在最佳培养条件下产生的铁载体进行不同的处理；采用牛津 杯法和菌落计数法检测铁载体的抑菌活性，结果显示，铁载体对海洋鳗弧菌 v p 、海洋副溶血弧菌w 二1 和枯草杆菌具有明显的抑菌活性，并且对海洋鳗弧 菌v p 的抑菌圈最大；而对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、梅奇酵母w c y 、黑 曲霉和青霉没有抑菌作用。同时，发现f e 3 + 对铁载体的抑菌作用具有抑制作用。 实验还表明，该铁载体的热稳定性很强，对铁载体进行加热处理后，仍具有同 样的抑菌活性。 利用有机溶剂萃取法提取铁载体粗品，经h p l c 半制备柱纯化，收集目的 峰。利用质谱法对此目的峰进行分析，根据该组分的分子离子峰，与已知结构 的铁载体比对，得到该铁载体的结构组分是异羟肟酸类f u s i g e n 。 关键词：海洋酵母菌；铁载体；发酵条件优化；抑菌；纯化；结构模拟 l v t h es m d i e so ns i d e r o p h o r ep r o d u c e db yt l l em a r i l l ey e a s t 4 扰7 1 p d 6 口s z 西扰，规矽“刀扰励万sh n 6 24 扰陀d d 口s z d z 扰，规矽“z z 扰z 口万sf i 上no z a b s 订a c t o v e r30 0y e a s ts 仃a i n si s o l a t e df r o md i 丘e r e n tm a r i i l ee n 、，的i n e n ：t sw e r es c r e e n e d f o rm e i ra b i l i t ) ，t op r o d u c es i d e r o p h o r e a m o n gm e m ，at o t a lo f14y e a s tg 昀i l l s 、e r e f o u i l dt op r o d u c es i d e r o p h o r e ，a i l d 也ey e a s ts n 面nh n 6 2w b j c hw a si d e m i f i e dt ob e 么扰陀d 6 础f 旃”聊p “刀砧胁力sw a sf b u l l dt op r o d u c eh i g hl e v e lo ft h es i d e r o p h o r e n 坨 o p t i m a lm e d i u mc o m p o n e m sa 1 1 dg r o w mc o n d “i o n sf o rs i d e r o p h o r ep r o d u c t i o nb y s 仃a i l lh n 6 2w e r es t u d i e du s i n g “o n e v 撕a b l e a t - a - t 硫e ，m e t h o d n er e s u l t s s h o 、碍dt 1 1 a tm eo p t i m mm e d i u mc o i n p o n e n t sf o r 也e1 1 i g h e s ts i d e r o p h o r ey i e l db y s n 嘶nh n 6 2w e r es l l c r o s e3 o ( w ，v ) ，n h 4 n 0 30 3 ( w ，v ) ，k 2 h p 0 4o 3 ( w v ) ， c i t r i ca c i d0 1 ( w v ) ，m g s 0 4o 0 0 8 ( w ，v ) ，z n s 0 4o o 0 0 2 0 ，v ) ，1om m l - o m i t l ：1 i n ea 1 1 d 吐l eo p t i i n a lg r o w mc o n d i t i o n s 、e r es h a h n gs p e e d2 0 0r p m ，“t i a l p h6 2 ，t e m p e r a ：t l l e2 8 u n d e rt h e s ec o n d i t i o i l s ，m es i d e r o p h o r ei n l el i q u i d m e d i u mr e a c h e dm el l i g h e s ty i e l d s1 1m g n 儿a r e r12 0 ho ff e n n e n t a t i o n i nt h i ss 缸1 y ，w ef o u n d 虹l a ta d d i t i o no fl - o r n j t b i n ei i lt l l ep r o d u c t i o nm e d i 啪 c o u l de 1 1 l l a i l c et h es i d e r o p h o r ep r o d u c t i o nb yh n 6 2 ，w h e r e a l s 也es u p p l e m e n to f e x c e s sf e 3 + i nt h ep r o d u c t i o nm e d i u mc o u l dd e c r e a s et h es i d e r o p h o r ep r o ( 1 u c t i o n i n t l l em o l e c u l a rl e v e l ，也ee x p r e s s i o no fn l eg e n eo fh y d r o x y l a s ew a sa l s or e p r e s s e di n 也ep r e s e n c eo ff e 3 + ，1 1 1 ee x p r e s s i o no ft l l eg e n ew a ss t i m u l a t e di 1 1 舭p r e s e n c eo f l o m i t m n e w ed e t e c t e da n t i - m i c r o b i a la c t i v i 够o ft h ec m d es i d e r o p h o r ep r o d u c e db ys t r i 王i l l h n 6 2b yt 1 1 eo x f o r d - c u p sa 1 1 dc 0 1 0 n y c o 硼t i n g t h er e s u l t ss h o w e d 吐1 a tt h ec m d e s i d e r o p h o r eh a dc l e a r 砌i b a c t e r i a la c t i v i 够a g a i n s tt 1 1 e 似om a r i n e 越m a lpa _ m o g e i l s ， 口，z g “f ，( 矿“聊a n d p 日，口j i z 口p 聊d b 嘭f c 。岱a n dt h ec o n l i i l o nb a c t e r i u m 丑s “6 f 玎括 h o w e v e r ，t h ec m d es i d e r o p h o r eh a dn oa i l t i m i c r o b i a ja c t i v i t ) ra g a i n s tt 1 1 em o s t c o 瑚m o nb a c t e r i a ，e z f ，s 口“陀姗，t h e 彪6 f c “印f 如把w c yt w o 劬g i 彳嘲罗r a n d 尸p ，z 耙肋淞s p n l er e s u l t sa l s os h o w e dm a tt h eh ea t i 甜s i d e r o p h o r es t i l lh a dt h e s 锄e 枷i b a c 矧a la c t i v i 够a g a i n s t 丑s 甜6 7 泓，形口孵z i 刀口厂纵掰a i l d 形 v p 口，口办口p ，打d l p 疗c 甜s i nn l i ss t l l d y ，t h ec m d es i d e r o p h o r ew a se x t r a c t e d 丘o mt h ec u l t u r es u p e m a t a n t s b yu s i l l go 唱砌cs o l v e n t s ，t h e n ，t ：h ec r u d es i d e r o p h o r ew a sp u r i f i e db yr e v e r s ep h a s e l l i 曲p r e s s u e rl i q u i dc l l r o m a t o 铲a p h y ( r p - h p l c ) ，a n dt h ea i mp e a kw a sc o l l e c t e d t h ea i mp e a kw a sa n a l y z e db yu s i n gt h em a s ss p e c 虮1 m ，a i l da c c o r d i l l gt ot h e m 0 1 e c u l a ri o np e a ko f 也ec o m p o n e n t ，c o m p a r i n gw i t l lt h ef o r e g o n es 仃i j 咖eo ft h e s i d e r o p h o r e ，t h es 缸u c t u r eo ft h es i d e r o p h o r ep r o d u c e db ys t r a i nh n 6 2 、v a s i d e n t i f i e da 1 1 dw a sf o u n dt ob e 如s i g e n 、砌c hb e l o n g st oo n ek 洫do fm e h y d r o x 锄a t e s 1 ( e yw o r d s ：m a r i n ey e a s t s ；s i d e r o p h o r e ；o p t i m a lc o n d i t i o n s ；a t i b a c t e r i a l a c t i v i 锣；p u r i f i c a t i o n ；s t r u c t u r em o d e l v i 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 注；翅遗直甚他盂要挂别直明鲍：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：立一伟猫k 签字日期：五砷年6 月乡日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学 技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网 络向社会公众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) ? 学位论文作者签名王伟甜k 签字日期：三瑚年6 月罗日 i i i 导师签字：( ，炒扒、， 签字日期：7 研年6 月y 毛 海洋酵母普鲁兰类酵母( 爿删d 幻s j 以衄p u j j ，j 鲫s ) 铁载体的研究 第一章绪论弟一早珀。下匕 u 刖吾 几乎所有的生命都需要铁作为营养成分( w i i l l ( e l m a l l l l ，1 9 9 1 ) 。至今研究 的所有微生物，除某些乳酸杆菌外，都需要铁( h a a se ta 1 ，1 9 9 9 ) ，因此，铁 对于几乎所有的生命有机体来说都是一种必需元素，在生物的代谢过程中起着 重要作用。作为细胞色素、铁氧化还原蛋白、固氮酶、核糖核苷酸还原酶等细 胞物质的组成成分( n e i l a l l d se ta 1 ，1 9 8 7 ) ，铁在生物体内参与分子氧的储存和 运输、碳的同化、氮的生物固定和同化、过氧化物的分解、核糖核营酸的还原 以及与电子传递有关的其它重要代谢过程( b a g g 和n e i l a i l d s ，1 9 8 7 ) 。在微生 物的代谢过程中，铁同样是必不可少的。在微生物细胞中，铁是多种酶的辅基 或激活剂，如细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸还原酶及铁硫蛋白酶等 都需要铁作为活性基( 李季伦，张伟心等，1 9 9 3 ) 。高等生物和微生物缺铁时 上述代谢过程均会受到不利的影响。 铁在地壳中的丰度仅次于铝( n e i l a n d se ta 1 ，1 9 8 7 ) ，在所有元素中居第四 位( s t i n t z ie ta j ，2 0 0 0 ) ，占地壳固体矿物组成的4 5 ，尽管如此，生物可 利用的铁浓度却非常低。在原生矿物中，铁主要以结晶态和非结晶态f e 3 + 氧化 物和水化氧化物的形式存在，使得微生物不能直接利用。海洋微生物生活在开 放的海洋中，海洋中铁的总量并不少，但是，在氧化的海水中可溶性铁的浓度 极低，生物可直接利用的铁仅占总量的1 1 0 之左右( 秦延文等，1 9 9 8 ) 。1 9 9 4 年b m l a i l d 等人对北太平洋中部垂直剖面的可溶性铁进行了研究，结果表明在 表面混合层可溶性铁的最高浓度仅为o 3 71 1 1 1 1 0 1 l ( g ，中部和深海( 5 0 0 4 0 0 0 米) 的可溶性铁的平均浓度为0 3 8i l i l l o 他g ( m a n i n 和g o r d o n ，1 9 8 8 ) 。最近 研究结果表明在海洋和近岸的水域中几乎所有的铁都可以被有机配体所络合 ( l e 谢se ta 1 ，1 9 9 5 ) ，而且对铁表现出非常高的亲和力( 1 0 2 5 1 0 5 0 ) 。 因此，铁在生理条件下的溶解度很低，它很难被生物所吸收。微生物在长 期的进化过程中获得了用以难溶性铁的活化、吸收和运输的特殊机制( b a g g 和n e i l a i l d s ，1 9 8 7 ) ，以保证可溶性铁的有效吸收。微生物铁载体( s i d e r o p h o r e ) 海洋酵母普鲁兰类酵母( 月删d 幻s j 以脚倒“勘s ) 铁载体的研究 就是生长在低铁环境中的细菌和真菌合成的一类具有高度专一性的低分子量 的铁螯合剂，它的生物合成受细胞内铁浓度的调节( s t i n _ t z ie ta i ，2 0 0 0 ；m 础e e ta 1 ，1 9 8 4 ) 。在缺铁的条件下，大多数真菌包括酵母至少分泌一种类型的铁 载体来利用环境中的铁。微生物在分泌铁载体的过程中同时合成铁载体相应的 膜受体蛋白，这样在质膜上结合铁载体，然后把铁载体吸收到细胞内，提供微 生物本身对铁营养的需求( h o r e ，1 9 9 3 ) 。许多真菌还能够表达可以利用其它 微生物生产的铁载体的递体，从而扩大它们的铁源范围。 1 铁载体的概念 “铁载体”来源于希腊语“铁的运载工具 。铁载体是微生物适应低铁环境 而合成的一类低分子量( 5 0 0 1 0 0 0 d a ) 、螯合铁离子的配位体( w i 出1 m a i l l l ， 1 9 9 1 ) 。大多数的细菌和真菌都产生铁载体( n e u b a u e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。当然也有 一些例外，尤其是厌氧细菌和一些酵母，如酵母属( s a c c h a r o m y c e s ) ( l e s u i s s e 和l a b b e ，1 9 9 4 ；n e i l a l l d s ，1 9 9 5 ) 不能产生铁载体；但是，酿酒酵母能够利用 外源的铁载体( l e s u i s s ee ta 1 ，1 9 9 8 ) 。海洋微生物如浮游植物( 而c ke ta 1 ， 1 9 8 3 ) 和蓝细菌( m m s 咖n g 和v a l lb a a l e n ，1 9 7 9 ) 也有报道产生铁载体。n e i l a i l d s ( 1 9 8 1 ) 将铁载体的特性归纳如下：( 1 ) 相对分子质量很小( 5 0 0 1 0 0 0 d a ) ， 也有文献报道 1 5 0 0 d a ；( 2 ) 它们对高铁离子具有高度特异性，高亲和力，结 合常数在1 0 2 5 1 0 5 2 之间，可以从宿主体内铁结合蛋白上摄取铁；( 3 ) 其生物合 成受溶液中铁浓度的调节。 大约6 0 年前科学家们已经开始对这方面进行了研究，除极个别菌株外， 几乎所有的好氧和兼性厌氧微生物都能够大量合成微生物铁载体( h o r e ， 1 9 9 3 ) 。随着大多数好氧和兼性厌氧微生物都能合成至少一种铁载体的现象的 发现，人们对铁载体的研究兴趣日益增强。 2 铁载体的分类 大多数的铁载体分为两类：儿茶酚类( c a t e c h o l a t e ) 和异羟肟酸类 ( h y d r o x a m a t e ) ( 如图1 1 ，j a l a le ta 1 ，1 9 8 4 ) ，均可与f e 3 + 结合形成六齿型结构。 但是，也发现铁载体包含其他一些功能基团，如羟酸、羧酸和2 羟基苯唑啉等 2 海洋酵母普鲁兰类酵母( 彳伽n 6 a s j 以埘p 以j “鲫s ) 铁载体的研究 ( h i d e r ，1 9 8 4 ) 。细菌能产生多种铁载体( h i d e r ，1 9 8 4 ) ，而大多真菌只产生 异羟肟酸类铁载体( l e o n g ，1 9 8 6 ) 。也有一些例外，结合菌纲产生聚羧酸锌类 铁载体r h j z o f - e m ( 1 h e k e n 和w i i l k e l m a l l n ，1 9 9 2 ) 。也有报道说，在缺铁环境 下，酚盐类化合物也分别在褐腐菌( 尸d s “口p 肠c p 咒胁) 、粘褶菌( g f d g d p 矗川甜m 舭z 6 e 口聊) ( e l l i s o ne ta 1 ，1 9 9 1 ；m a u c h u c ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 和白色假丝酵母( 劬玎疣出 口舾f c 绷s ) ( i s m a i le ta l l ，1 9 8 5 ) 中产生。铁载体根据它们结合铁的形式命名， 它们去铁化的形式有时称作去铁铁载体( d e f e r r i s i d e r o p h o r eo r d e s f e r r i s i d e r o d h o r e ) ，但叫法并不统一，通常两种形式都叫做铁载体。至今， 已有2 0 0 多种铁载体被发现和定性研究( j o 锄l ac 砌n s h a we ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 图1 1 是两类铁载体的基本结构和每一类相应的代表性铁载体结构： 图1 1 铁载体基本结构及其示例 f i g 1 - 1t h e s 1 口n 且c t i l r ea n de x a m p l e so fs i d e r o p h o r e s 异羟肟酸盐都包含一个n 6 羟基化鸟氨酸( n 6 - h y d r o x y o r i l i t h i n e ) 功能团， 大多数的铁载体都含有三个羟基，通过肽键或酯键连接形成八面体复合体。目 前异羟肟酸型铁载体己经被认可的有四个家族： 1 ) 玫红酵母酸( r h o d o t o m l i ca u c i d ) 主要在担子菌酵母中发现，是结构最简单 的一类，只含有两个羟基，形成f e 2 ( r h o d o t o m l i ca c i d ) 3 复合物； 2 ) 粪生素( c o p r o g e n s ) 在植物病原菌荚膜组织胞浆菌( 丑c 印s “z 口m m ) ，皮炎 芽生菌( 丑沈册口f 打砌s ) 中发现，它含有两个反式链孢氨酸( t i 觚s 血s a r j n j n e ) 8 l 傩知 讧严 海洋酵母普鲁兰类酵母( 月删d 蚰s j 出瑚p “j u 鲫s ) 铁载体的研究 部分，通过肽键头头连接形成一个哌嗪二酮( d 汰e t o p i p e r a z i n e ) 单位； 3 ) 高铁色素( f e 玎i c l l r o m e s ) 在病原菌小孢子菌属( m z c ，d 印d ，“ms p p ) ，发癣 菌属( 乃f c 办印协仞刀s p p ) ，曲霉属( 么印口恻刀姗s p p ) 中发现，包括铁色素 ( f _ e r r i c l l r o m e ) ，铁色素a ( f i e 玎i c h r o m e a ) ，铁菌素( f i e r r i c r o c i l l ) 等； 4 ) 镰孢氨酸、萎蔫酸( f u s a d n i n e s ) 在动物病原真菌镰孢菌( 霉) 属( 凡岱口r f “聊 s p p ) ，拟青霉属( 尸口p c 洳缈嚣s p p ) ，曲霉属( 么印p 呼盯螂s p p ) 中发现，其 前体是梭原素( f u s i g e n ) ，有三个顺式链孢氨酸( c i s 向s a r i i l i n c ) ，通过酯键连 接( j a l a l ，1 9 9 l ；h h a a s ，2 0 0 3 ) ，各家族结构示例如图1 2 所示： 丫锨f 点 一 口鲫一嚣c 。删 淞删 。太 ，f： 铂 图1 2 真菌异羟肟酸类铁载体结构 勋一幽绡竹埒 f i g 1 - 2s n c t u r e so fm g a lh y d r o x 锄a t es i d e r o p h o r e s 除了上述四个家族之外，还有其它的非异羟肟酸盐也有报道。如聚羧酸盐 ( p 0 1 y c a r b o x y l a t e s ) ，从稻根霉属( 尺办拓印淞m f c m 印d ，螂v a l 砌忍叩。匆白，m 西) 分离到一种叫做根瘤铁素( r h i z o f e m ) ，含有柠檬酸的聚羧酸盐。 3 真菌异羟肟酸类铁载体的结构 所有已定性的真菌铁载体都是异羟肟酸类的，但是聚羧酸锌类( r 1 1 i z o f e 玎i n ) 是例外( 图1 - 3 ) ，此类型的铁载体包含两分子柠檬酸，通过两个酰胺键连接成1 ， 4 l - a 卿级6 溯 图1 1l 真菌异羟肟酸类铁载体的生物合成途径 f i g 1 1 lt h eb i o s y n t h e t i cp a t h w a yf o rh y d r o x 锄a t es i d e r o p h o r e si n 胁g i 1 5 |；|；丫 海洋酵母普鲁兰类酵母( 一啪d 妇s j 以埘p “，u a 力s ) 铁载体的研究 p c pd 删a 衲 f r nt h ep d i r 岣r w h 6 如 f i p c p d 鲫a m 图卜1 2 非核糖体肽多结构域酶催化肽键形成的过程 f i g 1 12t h ep r o c e s so fc a t a l y s i so fp 印t i d eb o n df o n i l a t i o nb y n o n r i b o s o m a lp e p t i d es y n t h e t a s e s ( n r p s ) 6 铁载体介导的铁离子运输 铁载体介导的铁离子运输是耗能的( m a t z a n k ee ta 1 ，1 9 8 8 ) 。在微生物中， 铁一铁载体的识别和运输对特定的铁载体和立体结构通常都是专一的 ( w i n k e l m a n n 和h u s c h k a ，1 9 8 7 ) 。这些取决于金属铁离子的配位几何结构和金 属中心周围的n 酰基基团( w i n k e l m 籼，1 9 9 2 ) 。在深红酵母中，f e 2 ( r a ) 3 的 吸收受金属中心的配位作用和配位体邻近的功能性基团的影响( m n l l e re ta 1 ， 1 9 8 5 b ) 。大多数微生物具有一个以上的运输系统，能够利用多个铁载体。例如， 双孢菇( 彳g 甜f c 螂6 站p d ，螂) 对铁色素和萎蔫酸有不同的运输系统( e n g w i l m o t e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 现己提出了真菌中四种铁载体介导的f e ”的吸收机制( v a i ld e rh e l m 和 1 6 海洋酵母普鲁兰类酵母( 彳删n 蚰s j 甜衄p 口u j 彻s ) 铁载体的研究 w i n k e l m 锄，1 9 9 4 ) 。在门通道机制中( w i n k e l m a i l i l ，1 9 9 0 ；v a l ld e rh e l m 和 w i n k e l i l l a n i l ，1 9 9 4 ) ，整个f e 3 + 一铁载体复合物被运输通过细胞膜。在细胞内， f e 3 + 从配位体上释放下来，然后，空铁载体被分泌到细胞外。 阮i c a b 机制是在细胞膜上，f e ”从细胞外的铁载体运输到细胞内的配位体 上( m n l l e re ta 1 ，1 9 8 5 a ) ，细胞外的铁载体不进入细胞。 在水解性机制中( v a l ld e rh e l m 和w i n k e l m a n n ，1 9 9 4 ) ，完整的f e ”铁载体 复合物被运输到细胞内，同时在细胞内发生还原和降解反应。f e 3 + 还原成f e 2 + ， 三乙酰镰孢氨酸c ( t r i a c e t y l 如s 撕i l i n ec ) 的酯键通过专一的酯化酶被打开，形 成单体镰孢氨酸( 如s a r i l l i n e ) ，然后被分泌出去。 在还原性机制中( v a i ld e rh e l m 和w i n k e l m a n n ，1 9 9 4 ) ，f e 3 + 铁载体不被运 入细胞内，而是在细胞膜上发生还原作用，然后f e 2 + 被吸收。 对真菌铁载体吸收机制的了解要远远少于细菌，大多研究是在啤酒酵母菌 ( 勋c c 办口m 聊粥嚣卯彤v 妇f 以p ) 中进行的，尽管啤酒酵母不能产生铁载体，但是 它可以利用很多真菌和细菌产生的外源性铁载体( l e s u i s s ee ta 1 ，1 9 9 8 ) ，在其 中已发现大量与铁载体介导的铁离子转运有关的蛋白质。 7 铁载体转运系统的调节 铁载体的产生通过铁依赖性机制进行调节( a ne ta 1 ，1 9 9 7 a ) 。真菌铁载 体转运体系调节的研究主要在玉米黑粉菌和啤酒酵母菌中进行的。玉米黑粉菌 产生铁色素( f e 而c h r o m e ) 和铁色素a ( f e 币c h r o m e a ) ( a ne ta 1 ，1 9 9 7 a ，b ) 。 至今，在玉米黑粉菌中，有三个基因已被确定与铁载体的生物合成有关，它们 分别是s 以，s 耽和“，弧j 。s 矗拼是l 一鸟氨酸- n 5 氧化酶的编码基因( m e ie ta 1 ， 1 9 9 3 ) 。j 沈是一个肽键合成酶的编码基因。“厂觚j 编码铁载体合成中一个转录 调节子( u r b s l 蛋白) ( v o i s 砌e ta i ，1 9 9 3 ；a ne ta 1 ，1 9 9 7 b ) 。u r b s l 是s 冠，的 一个转录调节子( a ne ta 1 ，1 9 9 7 b ) ，其调节作用受细胞的f e ”浓度影响。有证 据表明，当f e 3 + 充足时，u r b s l 直接作用子s 刎的启动子而抑制其合成( a ne ta 1 ， 1 9 9 7 a ) 。根据环境中和细胞内的f e ”浓度，缈夙州三调节s 肋的表达( l a ne ta 1 ， 2 0 0 1 ) ，但是，还没有证明它影响铁载体的运输系统( l e o n g e ta j ，1 9 9 5 ) 。 在其它真菌中也发现类似的基因和蛋白质。在链孢霉( 肫”加印d ，口c 阳9 ，口) 1 7 海洋酵母普鲁兰类酵母( 彳删0 6 a s f 以瑚p ，“j a 仃s ) 铁载体的研究 中，s r e 蛋白是铁代谢途径的正调节子，同时是控制铁载体合成的负调节子 ( z h o u 和m a r z l u f ，1 9 9 9 ) 。在构巢曲霉( 彳印p 曙f l i f 螂，z 胁肠嬲) 中，当f e 3 + 供应 充足时，s i 冱a 蛋白是铁载体合成的抑制子，而且，它还调节f e ”铁载体的吸 收系统( h a a se ta 】，1 9 9 9 ；0 b e r e g g e re ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在链孢霉和构巢曲霉中发 现，当分别缺少s i 也和s i 汪a 时，将会对铁载体的合成产生不完全抑制作用， 这表明，还有其它因素影响铁载体合成的调节( h a a se ta 1 ，1 9 9 9 ；z h o u 和 m a r z l u f ，1 9 9 9 ) 。在黄青霉( 凡，2 纪棚甜聊c 办缈p 秽，z 甜优) 中，j 阳p 基因与链孢霉 中s 陀基因和玉米黑粉菌中“r 如j 基因具有同源性，表明s 理p 具有相似的作用 ( h a a se t2 l 1 ，1 9 9 7 ) 。 在啤酒酵母中，基因彳删，脚”口剧啊) ，尉几删2 ) 和e b j 口剐w ) 编码 的蛋白都作用于f e ”铁载体复合物运载入细胞的过程中( h e y m 锄e ta 1 ，1 9 9 9 ； h e m a n n e ta 1 ，2 0 0 0 a ，b ；y 蛐e ta 1 ，2 0 0 0 a ，b ) 。有实验证明，这些基因的表 达依赖于环境中铁的浓度，而且这些基因受铁依赖型转录子a r l p 的调控( y u n e ta 1 ，2 0 0 0 b ) 。但是，19 8 9 年，h u s c h k a 和w i n k e l m 锄发现，链孢霉在铁充足 和铁缺乏的环境下，膜受体蛋白的表达没有区别，这表明铁载体运输体系是组 成型的而不是铁诱导型的( m e i 和l e o n g ，1 9 9 4 ) 。 8 真菌铁载体的产生 大多真菌能产生一种以上的铁载体。一种微生物产生的铁载体的多样性可 能被限制在一个特定的结构家族，但是，大量研究表明真菌合成的铁载体属于 不同的结构家族。比如：长枝木霉( 乃f c 办d 沈，聊口，d 删6 阳幽缸r 甜聊) 和假康宁木 霉( z 矽p “面勋，z f 删f ) 同时产生三类结构家族的铁载体( m l k e e ta 1 ，1 9 9 1 ) 。 粉红色镰刀菌( 凡f s 口，f “朋加j p 甜聊) 在初期生长期产生萎蔫酸，而在衰老期萎蔫 酸被丙二酸色素( m a l o l l i c h r o m e ) 代替，丙二酸色素是这个物种独特的一种铁 色素型铁载体( e m e r y ，1 9 8 0 ) 。 研究表明，铁载体的鉴定可以作为真菌生物分类学的一个重要特征 ( c h a r l a n ge ta 1 ，1 9 8 1 ) 。铁载体与分类学之间的关系在细菌中已被发现。分 枝菌素是分枝菌( 坳6 口c f p ，砌) 产生的铁载体，其产生的类型和分类学之间 有明显联系( s n o w ，1 9 7 0 ) 。真菌产生的铁载体和分类学之间的关系是很有限 1 8 海洋酵母普鲁兰类酵母( 月删曲a s j 以脚删u 舢s ) 铁载体的研究 的。最近报道的杂担孢子菌类( h e t e r o b a l s i d i o m y c e t o u s ) 酵母，红酵母属 ( r 办d 面幻，“肠) ，红冬孢酵母属( 尺办d 如印o ，f 坊“，z ) 和白冬孢酵母属 ( 三p “c o 印d ，f 坊“聊) 都产生红酵母酸( a t k j ne ta 1 ，1 9 7 0 ；d e m l 和0 b e 刑i n 心e r ， 1 9 8 1 ) 。黑粉菌目( u s t i l a g i n a l e s ) 及与其有亲缘关系的粉座菌属( 研印办f d 肠) ， 原虫菌属( 尸阳幻聊y c 钌) 和7 了，彪灯甜f 口属的分类学研究发现粉座菌属，原虫菌属， 乃耽，f 乜，蛔和寄生性黑粉菌目都产生铁色素型铁载体，而腐生的黑粉菌目产生红 酵母酸( d e m l ，1 9 8 5 ；d e m l 和o b e n i n l ( 1 e r ，1 9 8 1 ；d e m le ta 1 ，1 9 8 4 ) 。对紫 罗兰分枝杆菌( m v f d 肠c p “m ) 的重新分类，从黑粉菌属到微葡萄状菌属 ( m i c r o b o t r y l 】m ) ，部分是基于这些种产生的红酵母酸( d e m l 和o b e 州i n “e r ， 1 9 8 2 a ，b ；p r i l l i n g e re ta 1 ，1 9 9 1 ：、协山y ，1 9 8 7 ，1 9 9 4 ) 。 9 铁载体的潜在应用 9 1 医学方面 铁载体已用于治疗像b 地中海贫血的铁过量和铝过量的症状( d a y 和 a c k r i l l ，1 9 9 3 ；f a a 和c r i s p o i l i ，1 9 9 9 ) 。所用的复合物主要是去铁敏b ，简称 d f o ( d e s f e 币o x a m i n eb ) ，但是，使用时存在一些问题和副作用( d e x t e re ta 1 ， 1 9 9 9 ；k o n t o 曲i o r 曲e s ，1 9 9 5 ；m a r t e ue ta 1 ，1 9 9 9 ) ，所以有人想利用天然产生 的铁载体( b e r g e r o ne ta 1 ，1 9 9 4 ；p e t e r s o ne ta 1 ，1 9 7 6 ) 和人工合成的铁载体 类似物( d e x t e re ta 1 ，1 9 9 9 ；h e r s h k oe ta 1 ，1 9 9 8 ；m a n e ue ta 1 ，1 9 9 9 ) 作为 治疗f e 和a 1 过量的口服d f 0 的有效替代物，从而来治疗这些疾病。已研究的有 真菌异羟肟酸类铁载体红酵母酸，它可以作为药物，利用动物进行试验发现口 服红酵母酸没有明显的治疗效果( b e r g e r o ne ta 1 ，1 9 9 4 ) ，但是，在5 个地中海 贫血症病人的静脉注射试验中有一定疗效，它对f e 的代谢水平类似于d f o ，但 是，它同时能提高z n 的代谢，并且对治疗部位有毒性作用( g r a d ye ta 1 ，1 9 7 9 ) 。 d f o 和其它异羟肟酸类铁载体还被用于治疗其它疾病，包括癌症、疟疾和 其它传染性疾病及锕金属中毒( f a a 和c r i s p o n i ，1 9 9 9 ；l o y e v s k ye ta i ：，1 9 9 3 ； s t m d l i n g ，1 9 9 8 ；w e i n b e r g ，1 9 9 9 ) 。d f o 已被用于治疗急性成淋巴细胞白血病 ( e s t r o ve ta 1 ，1 9 8 7 ) ，其它几种铁载体也发现有抗癌活性( v e r g i l ee ta 1 ，2 0 0 0 ) ， 例如，f r e d e r i c k 等( 1 9 8 1 a ) 发现由变紫色表球菌( 印f c c 甜聊p “仞“，伽c p ，2 j ) 1 9 海洋酵母普鲁兰类酵母( 肋”曲a s j 以埘p 以j “j 甜s ) 铁载体的研究 产生的真菌铁载体t r i o m i c i n 能够抑制小鼠肿瘤，从而延长其存活时间。治疗传 染病方面，研究主要集中在探索铁载体吸收系统，利用铁载体药物复合体将药 物运送到微生物细胞中( l u 和m i l l e r ，1 9 9 9 ；v e r g l l ee ta 1 ，2 0 0 0 ) 。这种方法 的一个优点是将药物结合于特定铁载体，它可以选择性地作用于利用该铁载体 的微生物( r 锄u r c h y 和m i l l e r ，1 9 9 6 ) 。锕系元素具有放射性，是潜在的致癌 物。己经发现许多铁载体及其类似物能够增强锕系元素的排泄，目前正在探索 铁载体在锕系元素排泄中的可能性应用( k a t ze ta 1 ，1 9 8 6 ；s t r a d l i n g ，1 9 9 4 ， 1 9 9 8 ：x ue ta 1 ，1 9 9 5 ；d u r b i ne ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 尽管铁载体己被研究用于医疗方面，但是，其研究主要集中于细菌铁载体， 尤其是去铁敏b 及其类似物，如羟基吡啶酮类化合物( h y d r o x y p 河d i n o n e s ) 。对 真菌铁载体的可能性应用研究较少。 9 2 鱼病的控制 既然对于几乎所有的生物而言，铁是一种必不可少的元素，那么细菌也不 例外。比如大西洋鲑鱼的致病菌杀鲑气单胞菌杀鲑亚种( 么p 加聊d 咒伽s 口砌d 船f c f 砌 s 1 i b s p s 口砌d 甩f c f 如) 进化了非常完善的机制来对抗宿主的防御机制( e l l i s ，1 9 9 9 ) 。 铁离子对细菌的毒力和细菌间的相互作用很重要，1 9 9 9 年等人研究了荧光 假单胞菌a h 2 菌株在富铁和限铁条件下的抑菌活性。在限铁条件下培养的菌株 过滤除菌的上清液对鳗弧菌的生长起到抑制作用，而富铁条件下培养的则没有 抑菌活性，而且，a h 2 菌株限铁培养上清液的抑菌活性与c a s 反应的强烈程度 相一致，表明上清液中存在铁载体。以上结果说明铁载体可能是其众多活性因 子中的一种成分。海洋鳗弧菌是鱼类弧菌病发病的主要病原菌，是目前研究较 多、了解较清楚的海洋细菌，是潜在的人类致病菌，同时也是水产养殖动物的 条件致病菌( a n g u i a l l o b e l l r a i lr e ta 1 ，1 9 9 8 ) ，可以利用产铁载体的有益菌来抑 制鳗弧菌的生长，从而控制因鳗弧菌引起的鱼病，这对于我国渔业、养殖业具 有潜在的应用价值。 9 3 环境修复 环境中的金属污染物浓度和种类在不断增加，污染源包括汽车尾气、制造 业、污水污泥的应用和采矿业( l e d i n 和p e d e r s e n ，1 9 9 6 ；g r a y ，1 9 9 8 ) 。人造 2 0 海洋酵母普鲁兰类酵母( 彳阳咖酊以凹训，- ，伽s ) 铁载体的研究 铜系元素镎和钚广泛应用于环境中、核武器的生产和试验中，核电站及核燃料 回收厂建造过程中( g o p a l a i le ta 1 ，1 9 9 2 ；g o p a l a ne ta 1 ，1 9 9 3 ) ，所有这些都 构成了潜在的巨大的环境危机。 铁载体能够非常有效地溶解锕系元素( b r a j n a r de ta 1 ，1 9 9 2 ) ，并且能够与 四价的锕系元素形成稳定的化合物，铁载体还能影响其它金属如铜、锌、钙和 铅在土壤中的运动性( 1 屺m e re ta 1 ，1 9 9 9 ；n e u b a u e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。产铁载体 的微生物在土壤中的数量很多，环境中的铁载体影响金属和放射性核素的形 成、生物利用度及其寿命的长短( v o ng u n t e n 和b e n e s ，1 9 9 5 ；心a e m e re ta 1 ， 1 9 9 9 ；r u g g i e r oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 和污水的有效治理。铁载体复合物能够用于金属 回收工程或污水处理厂的生物修复，包括放射性污水的处理( g o p a l a ne ta 1 ， 1 9 9 3 ：h e m l e me ta 1 ，1 9 9 9 ：j o h ne ta 1 ，