基因操作的工具酶.ppt

第七章基因操作工具酶,2,内容,3,一.基因工程工具酶的概念,在DNA分子水平的操作中，依赖于一些重要的酶，如限制性核酸内切酶、连接酶等，作为工具对DNA进行切割和拼接，这些酶统称为基因工程工具酶,4,基因工程必需的两个工具酶,5,限制性内切酶与DNA连接酶,细菌细胞内特异性降解外源核酸分子的核酸酶，其作用特点是：特异性降解异源DNA分子(甲基化修饰差异)I类限制酶随机切割双链DNA分子，II类限制酶识别、切割特殊的回文(对称)序列来源不同、具有相同粘性末端DNA片段在DNA连接酶的作用下可准确连接形成重组DNA分子通常使用来自T4噬菌体DNA连接酶,6,常用的工具酶,7,二.限制性核酸内切酶,定义发现限制修饰系统分类命名特性*影响酶切反应的条件,8,限制性内切核酸酶（RestrictionEndonuclease）是指能识别双链DNA分子内部特异位点并在识别位点或附近水解磷酸二酯键的一类内切核酸酶，简称为限制酶（RestrictionEnzyme）,1.定义,一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断目前已发现的限制酶有200多种,9,限制性核酸内切酶的作用,简单的说:能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）,10,2.发现,大肠杆菌中发现，如能切割降解噬菌体DNA而限制外源DNA因切点在外源DNA内部，故叫内切酶,如果在细菌中没有发现ER，现代分子生物学和重组DNA就不可能发展起来,11,20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌体只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”1962年，WArber提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，这类酶称为限制性核酸内切酶,限制酶概念提出的背景,12,分布：作用特点：结果：,主要在微生物中,专一性:一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子多样性:限制酶有200多种,产生黏性末端或平末端,分子剪刀限制性内切酶,13,3.限制修饰系统,为什么此酶不切割宿主细胞自身DNA呢？,因为几乎所有的限制性内切核酸酶都要和能识别而且甲基化相同DNA位点的甲基化酶共同作用这两个酶：限制性内切核酸酶和甲基化酶一起称为限制修饰系统。宿主细胞中甲基化的DNA位点被保护起来，不会被限制性核酸内切酶消化,14,限制性核酸内切酶EcoRI及修饰的甲基化酶MEcoRI的限制与修饰作用,15,4.分类,根据结构和功能的特异性，即其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，可将已发现的内切核酸酶分为三类：即I型、II型、III型酶I型和III型酶在同一蛋白酶分子中兼有甲基化酶及限制性内切核酸酶活性，又因其识别位点与切割位点不固定，所以价值不大II型酶切割DNA片断活性和甲基化作用是分开的，且核酸内切作用又具有序列特异性，在基因克隆中广泛使用通常所用的限制性内切核酸酶是指II型的,16,17,5.命名,采用Smith和Athens提议的方案，根据限制性内切核酸酶来源和菌株进行命名用来源细菌的英文缩写斜体符号命名它的第一个字母大写，来源细菌属名的第1个字母第二、三字母小写，来源细菌种名的头2个字母第四个字母代表菌株最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号,18,前3个字母来自产生菌流感噬血菌的拉丁名“H”来自属名Haemopbilus的第一个字母“in”来自种名influenzae的前两个字母“d”来自菌株名Rd的d“III”说明是该菌株中发现的第三种限制性核酸内切酶,HindIII为例,Hind代表从流感噬血杆菌（Haemophilusinfluenzac）d株中分离到的第3个限制酶,19,名属种株序来源称名名名号菌株EcoREcoREscherichiacoliRHindHindHaemophilusinfluenzaedHindHindHaemophilusinfluenzaedHpaHpa/Haemophilusparainfluenzaea,20,6.特性*,一般分子量为60kd，单链多肽，最适pH为68NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用对热不稳定，通常贮存于20环境。为避免反复冻溶使酶失活，商品酶均含有50甘油，使用时添加相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度,21,能在DNA上相同的位置切割用于基因分析及表达的众多技术的基础通常是由4-6个碱基对组成的具有回纹序列的DNA片段，在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键,每一种酶都有各自特异识别位点,22,最常用的限制性核酸内切酶,23,不同酶识别的碱基数目也不同，一般为4、5或6个碱基对识别序列碱基对越多，则这种酶在DNA上出现的频率越低不同生物其碱基含量不同，酶识别位点的分布及频率也不同,识别序列的频率=1/4NSau3A(4bp)：1/44=256bpEcoRI、PstI(6bp)：1/46=4096NotI(8bp)：1/48=65536（rarecutters）仅是理论推测,24,大多数限制酶是错位切割双链DNA，产生5或3粘性末端,5粘性末端,25,很多限制酶不能精确地在2个对称轴部位切割，而在识别序列2条链对应位上错位切割，切割产物有些形成5-突出的粘性末端,另一些为3-突出的粘性末端这些粘性末端的任何一侧都能和另一末端互补配对，使任何含有该识别序列的DNA分子都能和另一个含相同识别序列的DNA分子容易地连接成新的重组分子,26,限制内切酶,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做黏性末端,27,部分限制酶沿识别序列内的对称轴上切割DNA双链，产生平末端,5-CCCGGG-33-GGGCCC-5,5-CCCGGG-33-GGGCCC-5,平末端,Sma,28,不同限制性内切酶切割的三种结果,a.产生5突出粘性末端（cohesiveend):以EcoRI为例：5-GAATTC-35-GPOHAATTC-33-CTTAAG-5EcoRI3-CTTAAOHPG-5b.产生3突出粘性末端:以PstI为例：5-CTGCAG-35-CTGCApOHG-33-GACGTC-5PstI3-GOHpACGTC-5c.产生平末端（bluntend):以NruI为例：5-TCGCGA-35-TCGpOHCGA-33-AGCGCT-5NruI3-AGCOHpGCT-5,29,同尾酶,有些限制酶来源不同、识别序列不同，但可产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶如BamHI和BglII,30,5-GGATCC-33-CCTAGG-5,5-GGATCC-33-CCTAGG-5,5-AGATCT-33-TCTAGA-5,5-AGATCT-33-TCTAGA-5,31,同位酶,同位酶：识别相同的序列但切割位点不一样的限制性核酸内切酶。如SmaI和XmaI同位酶限制性内切核酸酶HpaII和MspI是同位酶，切割同样的DNA序列CCGG，但对这个序列的甲基化状态有不同的限制性反应MspI切割所有状态下的CCGG序列，而HpaII仅切割非甲基化的CCGG序列。这样MspI被用来识别所有的CCGG序列，而HpaII能用来确定是否甲基化,32,同功异源酶,同功异源酶或同裂酶（isoschizomer）:来源不同但能识别和切割同一位点的限制酶,其他：远距离裂解酶：识别位点与切割位置不一致可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的Subset酶：一种酶的识别序列包含于另一些酶的识别序列之中,33,限制性内切核酸酶识别序列具有180。旋转对称的回文结构,如EcoRI的识别序列为5-GAATTC-33-CTTAAG-5,回文结构,34,温度：一般37盐离子浓度：Na，Mg2缓冲体系：具有稳定pH环境的Tris-HCl缓冲体系DTT用于保持酶稳定性和活性反应体积和甘油浓度：商品化的限制性内切核酸酶均加50甘油作为保护剂，一般在-20保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10，否则甘油浓度过高，影响酶切反应,7.影响酶切反应的条件*,35,反应时间：通常为1h；进行大量DNA酶切反应时一般让酶解过夜DNA纯度和结构：DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、RNA等杂质会影响酶切反应的速度和完全程度酶切的底物一般为双链DNA，DNA的甲基化位置会影响酶切反应,36,酶的活性单位,1个活性单位：在适当的反应条件下(包括温度、pH和离子强度等),1h内在50l容积中完全酶解1ug特定DNA底物(通常用DNA)所需要的酶量,37,“星”活性,“星”活性：酶特异性改变或特异性降低而呈现的活性酶在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列，在名称右上角加一个星号(*)表示,如EcoR*：AATT；EcoR：GAATTC只有在相当特殊的条件下,酶活才与发表的结果相符，必须采用规范的实验步骤,坚持应用推荐的反应条件,38,底物位点优势效应,酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同,39,用途,根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途：不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点基因突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析,40,三.DNA连接酶,常用连接酶DNA连接酶的作用及机理DNA连接酶的反应条件DNA片段的连接重组DNA实验的一般程序,41,定义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3羟基和5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来功能：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复制和损伤后的修复中都起关键作用提取：许多原核和真核生物及病毒中,DNA连接酶,42,43,在基因工程中使用的连接酶主要有大肠杆菌连接酶和T4噬菌体DNA连接酶前者需要NAD作为能源；后者以ATP作为辅助因子二者都能连接平末端和黏性末端T4DNA连接酶应用更广泛一些,1.常用连接酶,44,连接酶的作用：在双链DNA中，DNA连接酶能催化具有邻近3-羟基和5-磷酸基的单链形成磷酸二酯键，促使具有互补粘性末端或平末端的载体和供体DNA片段连接，使之成为一个完整的重组DNA分子连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）结果：黏性未端（包括平未端）连接起来,问题,用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键？,2.DNA连接酶的作用及机制,45,DNA连接酶的作用过程,分3步：连接酶与辅助因子ATP或NAD形成酶-AMP复合物AMP作用于DNA缺口的5-末端磷酸基团缺口3-OH对活跃的磷原子作亲核攻击，形成新的磷酸二酯键，封闭切口,46,47,连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15以下，然而保持连接酶活性的最佳反应温度却是37但在该温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷，所以连接反应一般采用16过夜,3.DNA连接酶的反应条件,48,DNA浓度：外源片段浓度比载体DNA浓度高5-10倍由于平末端的连接效率比粘性末端要低得多，故在平末端连接反应中，T4DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要求较高防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体时间：过夜最好,49,4.DNA片段的连接,1）粘性末端DNA片段的连接2）平末端DNA片段的连接,50,1）粘性末端DNA片段的连接,51,直接用T4DNA连接酶连接：效率不高，较少采用同聚物加尾连接平末端DNA片段：先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA连接酶进行连接用衔接物连接平末端DNA分子：目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切位点，经酶切后产生特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA连接,2)平末端DNA片段的连接,52,应用互补同聚物加尾法连接DNA片段,53,用衔接物分子连接平末端的DNA片段,衔接物：指用化学方法合成的一段由若干个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段,54,5.重组DNA实验的一般程序,选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶（如EcoRI）作位点特异的切割，形成全长的具粘性末端的线性DNA分子再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化混合，加入DNA连接酶。由于具有相同的（如EcoRI）粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经DNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNA分子,55,由噬菌体编码催化单链DNA或RNA连接主要用途：是对RNA进行3末端标记,T4RNA连接酶,56,四.DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶IK1enow片段T4DNA聚合酶TaqDNA聚合酶逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶RNA聚合酶,57,具有3种酶活性53DNA聚合酶活性53DNA外切酶活性35DNA外切酶活性用途：DNA缺口平移中标记DNA探针,1.大肠杆菌DNA聚合酶I,以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到双链DNA分子的3-OH端而合成新的DNA,58,用蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶I后小片段：53DNA外切酶活性大片段：53DNA聚合酶活性35DNA外切酶活性大片段称为Klenow大片段酶,2.Klenow片段,59,E.coliDNA聚合酶I和Klenow片段,5到3DNA聚合酶活性,3到5DNA外切酶活性,5到3DNA外切酶活性,5到3DNA外切酶活性,蛋白酶处理,DNA聚合酶I全酶,Klenow片段酶,60,用途,Klenow片段广泛用于各种克隆实验补齐双链DNA的3末端；如补平经限制酶消化的DNA所形成的3凹端双链DNA3末端的标记；标记DNA片段的末端等在cDNA合成中，第二链的合成DNA序列分析3-端的末端标记随机引物标记核酸探针,61,3.T4DNA聚合酶,来源：从T4噬菌体感染的E.coli中分离得到具53聚合酶活性和35外切酶活性,62,TaqDNA聚合酶是从栖热水生菌(Thermusaquaticus)中分离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶，最适温度75-80需要Mg2+(10mmolL)，在低浓度Mn2+(2mmol/L)中有低活性，Ca2+使其完全失活，一价阳离子高至0.1moIL对活性无影响，而最适浓度NaCl为40mmol/L，KCl为60mmol/L最适pH7.8(Tris-HCl)，与大肠杆菌DNA聚合酶相比，其最大特性是耐高温和无核酸酶活性自1976年从Thermusaquaticus菌中分离纯化后，直至1985年PCR概念形成，才将此酶应用于PCR技术的建立和完善。对基因克隆、测序、突变研究和检测诊断等方面发挥巨大作用,4.TaqDNA聚合酶,63,5.逆转录酶,一种有效的转录RNA成为DNA的酶，即以RNA链为模板，以带3-OH末端的DNA片段为引物，沿53方向合成DNA链产物DNA又称cDNA，即互补DNA逆转录酶又称RNA依赖的DNA聚合酶（RNA-dependentDNApolymerase），存在于肿瘤病毒中主要用途：转录mRNA成为cDNA制备基因片段,64,种类：AMV-逆转录酶Mo-MLV-逆转录酶,53聚合酶活性（+）35外切酶活性（-）,65,催化RNA体外合成反应依赖DNA的RNA聚合酶不依赖DNA的RNA聚合酶,6.RNA聚合酶,66,五.DNA和RNA的修饰酶,核酸酶碱性磷酸酶磷酸激酶末端脱氧核苷酸转移酶甲基化酶,67,以核酸为底物的水解酶按底物专一性分：RNase、DNase、非专一性核酸酶按作用位点分：内切或外切酶（许多兼有内外切活性）5-核酸酶或3-核酸酶常用：BAL31核酸酶、核酸酶S1、绿豆核酸酶、RNaseA、RNaseT1、DNase、外切核酸酶、噬菌体外切核酸酶等,1.核酸酶,68,核酸酶的分类,69,1）核酸酶SI,功能：降解ssDNA或ssRNA形成5-磷酸末端的单或寡核苷酸片段应用：分析DNA：RNA杂交体结构。通过降解成熟mRNA与放射性标记基因组、DNA的杂交体确定内含子部位切除DNA片段上的单链末端，形成平末端切开cDNA合成过程中形成的发夹环在限制酶位点上产生小缺失,70,核酸外切酶III核酸外切酶VIIDNA酶IRNA酶A(牛胰)RNA酶TIRNA酶H,其他常见核酸酶,71,2.碱性磷酸酶,功能：催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5端磷酸基团,从DNA