（神经生物学专业论文）褪黑素对海马ca1神经元外向延迟整流钾电流的作用及其机制.pdf

a c s f a a a d d m s o 5 h t 5 h t p i k i a t e a t t x t r d t p o h v e g f 缩略词表 a r t i f i c a lc e r e b r o s p i n a lf l u i d a r o m a t i ea m i n oa c i dd e c a r b o x y l a s e d i m e t h y l s u l f o x i d e 5 一b y d r o x y t r y p t a m i n e 5 - h y d r o x y t r y p t o p h a n o u t w a r d d e l a y e d r e c t i f i e r p o t a s s i u m o u t w a r dt r a n s i e n tr e c t i f i e r p o t a s s i u m t e t r a e t h y l a m m o n i u m t e t r o d o t o x i n t r y p t o p h a n t r y p t o p h a nh y d r o x y l a s e v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r 人工脑脊液 芳香族氨基酸脱羧酶 二甲基亚砜 五羟色胺 五羟色胺酸 延迟外向整流钾电流 瞬态外向整流钾电流 四乙基胺 河豚毒素 色氨酸 色氨酸羟化酶 血管内皮生长因子 中文摘要 褪黑素对海马c a l 神经元延迟外向整流钾电流的作用及其机制分析 褪黑素( m e l a t o n i n ) 是一种主要由脑内松果体合成和分泌的神经激素， 离体和在体实验均已证实褪黑素具有强大的神经保护作用，主要机制在于其 清除自由基和抗氧化功能。钾离子通道对于维持细胞膜兴奋性和神经元阳j 的 信息传递有着重要的作用。然而，近年来研究发现，延迟外向整流钾离子通 道( i k ) 活性增加参与了脑缺血后神经元的死亡过程。而其特异性通道阻断剂 具有神经保护作用。海马是中枢神经系统记忆和认知形成和巩固的重要结构， 同时也是缺血缺氧极易累及的脑区。己有的电生理学实验已经表明，褪黑素 可以调节海马神经元的兴奋性和突触可塑性。然而，褪黑素是否能调节海马 神经元i k 尚未见报道。因此，本实验采用脑片全细胞膜片钳记录技术，观察 了褪黑素对出生后1 4 1 8 天s d 大鼠海马c a l 锥体神经元i k 的作用，并分析 了其可能的机制。结果显示： ( 1 ) 为了研究褪黑素对i k 的作用，我们将细胞膜电位钳制于一5 0 m v ， 在一1 1 0 m v 的前置脉冲电压之后插入一段时间为5 0 m s ，幅度为5 0 m v 的中 间电压，使i a 完全失活，然后使膜电位去极化至l j + 6 0 m v 记录到i k ，在此基础 之上，我们观察了褪黑素对i k 的作用，发现褪黑素可以剂量依赖地抑制i k ， 其半数抑制剂量( i c 5 0 ) 为3 7 5 m m ( n = 8 ) 。从褪黑素对i k 作用的时程曲线可 以看到，褪黑素发生作用较迅速且具有可逆性，一般在绍药后1 分钟内起效， 在冲洗后6 分钟恢复到给药前水平。 2 ) 为了研究褪黑素对i k 激活和失活的电压依赖性的影响，我们绘制 了i k 的正态化的电导( 或电流) 与膜电位的关系曲线，用b o l t z m a n 公式拟合后 发现，给予褪黑素前后i k 的半激活电压( v h ) 分别为1 1 6 1 5m v 和9 6 1 2m v ，两者相比无显著性差异。相反，i k 的半失活电压( v h ) 分别为- - 5 2 8 1 1m v 和“1 0 1 4m v ( p o 0 5 ，n = 6 ) 。该结果提示褪黑素不影响i k 的电压依赖性激活却使i k 的失活向超极化方向偏移。 ( 3 ) 为了研究褪黑素的作用是否与其细胞膜特异性受体有关，我们分别 观察了m t l m t 2 受体阻断 u - - l u z i n d o l e 和m t 3 受体阻断剂- - p r a z o s i n 对褪 黑素抑制效应的影响。结果显示，4 0 ，1 0 0 ，2 5 0um 的l u z i n d o l e 可以剂量 依赖性的抑制i k 且不能减弱2 5 m m 的褪黑素对i k 的抑制效应。而p r a z o s i n 在1 0 0 和3 0 0um 的剂量下既不影响正常i k 的幅度，也不能减弱2 ，5 r a m 的褪 黑素对i k 的抑制效应。该结果提示褪黑素对i k 的抑制效应与其特异性细胞膜 受体无关。 ( 4 ) 因为褪黑素在高浓度时也可以激活5 - - h t 受体，那么其对i n 的抑 制是否与5 - - h t 受体有关昵? 我们观察了广谱的5 - - h t 受体激动剂5 - - h t 在1 0 ，i 0 0 ，5 0 0um 时对i k 的作用，发现该作用剂量的5 - - h t 不能模拟褪 黑素对k 的抑制效应，也不能减弱褪黑素对i k 的抑制。该结果间接提示褪黑 素对i k 的作用不是通过激活5 一h t 受体完成的。 ( 5 ) 为了研究褪黑素对i k 的作用是否与其清除自由基的作用有关，我 们观察了羟自由基的前体h 2 0 2 对i k 的作用，发现h 2 0 2 能快速、剂量依赖地 抑制i k ，给予l m m 和4 r a m 的h 2 0 2 5 分钟后，i k 的幅度分别为给药前i k 幅度 的8 6 5 4 5 和4 4 2 3 4 ，与对照组相比，p 5 - h t 。如前所述，这些化合物都含有吲哚这一基本结构， 所不同的是吲哚上的侧链的极性不同而造成了脂溶性的不同。它们对i k 抑制 效应的差别恰恰反应了与这些化合物本身的脂溶性有很大的关联。为此，我 们设想，把脂溶性最小的5 - - h t 导入细胞内，也可能出现对i k 的抑制效应。 结果显示，电极内给予2 5 m m 的5 一h t 可以迅速抑制i k ，在给药后5 分钟， i k 的幅度降低为刚形成封接时幅度的5 7 7 5 2 4 ，同对照组的9 4 3 1 o 相比，p 0 0 0 t 。该结果提示褪黑素对1 k 的作用可能与其吲哚结构有关， 且发生作用的部位可能在细胞内部。 综上所述， 褪黑素可以快速、可逆且剂量依赖地抑制海马c a l 神经元 i k 。褪黑素对i k 的抑制与其细胞膜受体及清除自由基功能无关，很可能是通 过其吲哚结构来完成的，且作用发生在细胞内。我们的结果提示对i k 的抑制 可能是褪黑素神经保护作用的一条新的途径。 关键词：海马延迟外向整流钾电流褪黑素吲哚五羟色胺 英文摘要 e f f e c to fm e l a t o n i no no u t w a r dd e l a y e dr e c t i f i e rp o t a s s i u mc u r r e n t si n h i p p o c a m p a l c a in e u r o n sa n dt h em e c h a n i s m s m e l a t o n i n 一a c e t y l - 5 m e t h o x y t r y p t a m i n e ) ，t h em a j o re n d o c r i n ep r o d u c to f t h ep i n e a lg l a n d ，h a sb e e nd e m o n s t r a t e dt oh a v es i g n i f i c a n tn e u r o p r o t e c t i o n i t s n e u r o p r o t e c t i o ni sm a i n l ya t t r i b u t e dt oi t sa n t i o x i d a n ta n df r e er a d i c a l - s c a v e n g i n g a b i l i t i e s v o l t a g e g a t e dp o t a s s i u mc u r r e n t sp a r t i c i p a t ei nt h er e g u l a t i o no f n e u r o n a l e x c i t a b i l i t y , a c t i v i t y , a n ds y n a p t i cp l a s t i c i t y r e c e n t l y ，m u c ho ft h ea c c u m u l a t e d d a t ah a si n d i c a t e dt h a to u t w a r dp o t a s s i u mc u r r e n t s ，e s p e c i a l l yo u t w a r dd e l a y e d p o t a s s i u mc u r r e n t ( i k ) ，a r ei n v o l v e di nn e u r o n a lc e l ld e a t ha n dp o t a s s i u mc h a n n e l b l o c k e r sc a np r e v e n ts u c ha ni s c h e m i cn e u r o n a lc e l ld e a t h i ti sw e l lk n o w nt h a t h i p p o c a m p u si se s s e n t i a lf o rm e m o r yf o r m a t i o na n dc o g n i t i o n ，a n dt h a ti t i sa l s o h i 曲l yv u l n e r a b l et oi s c h e m i eb r a i ni a j u r ya n dm a n yo t h e rp a t h o l o g i c a li n s u l t s p r e v i o u se l e c t r o p h y s i o l o g i c a le x p e r i m e n t sh a v er e v e a l e dt h a tm e l a t o n i nm o d u l a t e s h i p p o c a m p a ln e u r o n a le x c i t a b i l i t ya n dp l a s t i c i t y h o w e v e r ，w h e t h e rm e l a t o n i nh a s a n ye f f e c to np o t a s s i u mc u r r e n t si nh i p p o c a m p u si s s t i l lu n k n o w n t h e r e f o r e ，i n t h e p r e s e n ts t u d y , w eo b s e r v e dt h e e f f e c to fm e l a t o n i no n 1 k r e c o r d e d b y w h o l e c e l lp a t c hc l a m pi nc a ln e u r o n si nh l p p o c a m p a lb r a i ns l i c e so fs dr a t s a g e d14 - - 1 8d a y s b e s i d e s ，t h em e c h a n i s m sm e d i a t i n gt h i se f f e c tw e r ea n a l y z e d t h er e s u l t sw e r es h o w e da sf o l l o w s ： ( 1 ) t oo b s e r v et h ee f f e c to fm e l a t o n i no ni x ，w ec l a m p e dm e m b r a n e p o t e n t i a l sa t 5 0m v a f t e rap r e p u l s eo f 1 1 0 m yf o l l o w e db ya5 0d i si n t e r p u l s e o f 一5 0 m v ，t h em e m b r a n ep o t e n t i a lw a sd e p o l a r i z e dt o + 6 0 m vt oe v o k e i k m e l a t o n i n d o s e d e p e n d e n t l y i n h i b i t e d i n w i t ht h e h a l f - m a x i m a l i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n ( 1 c 5 0 ) o f 3 7 5m m t h et i m ec o u r s eo ft h ee f f e c to fm e l a t o n i na tt h e c o n c e n t r a t i o no f2 5m ms h o w e dt h a tt h ei n h i b i t i o nh a dar a p i do n s e ta n dw a s r e a d i l y r e v e r s i b l e t h ei n h i b i t i o nw a so b s e r v e dw i t h i n 1m i na f t e rm e l a t o n i n a p p l i c a t i o na n dc o m p l e t e l yr e v e r s e dw i t h i n6m i n a f t e rw a s h i n g ( 2 ) t oe x a m i n et h ee f f e c to fm e l a t o n i no nt h es t e a d y s t a t ea c t i v a t i o na n d i n a c t i v a t i o no fi x ，n o r m a l i z e dc o n d u c t a n c eo rc u r r e n t a m p l i t u d e so fi kw e r ep l o t t e d a saf u n c t i o no fm e m b r a n ep o t e n t i a l ，t h e nt h e r e s u l t i n gc u r v e sw e r ef i t t e db y b o l t z m a n n e q u a t i o n s t h ev a l u e so f v hw e r e1 1 ，6 1 。5m va n d9 6 1 2m v i nt h ea b s e n c ea n dp r e s e n c eo f m e l a t o n i n ，r e s p e c t i v e l y t h e r ew a sn os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c eb e t w e e nt h e m w h i l e t h ev a l u e so fv hw e r e 一5 2 8 1 1m v a n d 一 6 1 0 1 4m v i nt h ea b s e n c ea n dp r e s e n c eo fm e l a t o n i n ，r e s p e c t i v e l y ( p 5 - h tt h e s ei n d i c a t e dt h a t t h ed i f f e r e n c eo fe f f e c t so fa b o v ec h e m i c a l sw a sr e l a t e dt ot h e i rd i f f e r e n tl i p o p h i l i c s o l u b i l i t y i t i sr e a s o n a b l et o p r o p o s et h a t 5 - h t ，w h i c hh a st h el e a s tl i p o p h i l i c s o l u b i l i t ya m o n gt h ea b o v ec h e m i c a l s ，c o u l dp r o d u c et h ei n h i b i t o r ye f f e c to ni ki f i tw a si n t r o d u c e di n t ot h ec e i l s w ef u r t h e ro b s e r v e dm ee f f e c to f5 - h ta f t e ri tw a s i n c l u d e di n t ot h e p i p e t t e s o l u t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e l a t i v ec u r r e n t a m p l i t u d ew a s5 7 7 2 4 a t5m i na f t e rt h ea p p l i c a t i o no f2 5m m o f5 - h t ( p o 0 0 1 ，c o m p a r e d w i t ht h ec o n t r o l g r o u p s ) t h e r e s u l t si n d i c a t et h a tt h e m e l a t o n i n i n d u c e di ki n h i b i t i o ni sr e l a t e dt oi t s s p e c i f i ci n d o l es t r u c t u r ea n dt h i s e f f e c ti sa ni n t r a c e l l u l a ro n e t a k e n t o g e t h e r , o u rr e s u l t ss h o wt h a tm e l a t o n i nc a nr a p i d l y , r e v e r s i b l y , a n d d o s e 。d e p e n d e n t l y i n h i b i t i k o f h i p p o c a m p a l c a l p y r a m i d a l n e u r o n s m e l a t o n i n i n d u c e di ki n h i b i t i o nw a sn o tv i aa c t i v a t i o no fi t so w nm e m b r a n e r e c e p t o r so ri t s f r e e r a d i c a l s c a v e n g i n ga b i l i t yb u tv i at h ea c t i o n so fi t si n d o l e s t r u c t u r ew i t ht h ei n t r a c e l l u l a rd o m a i n so f p o t a s s i u mc h a n n e l s o u r r e s u l t ss u g g e s t t h a tt h ei n h i b i t i o no f i ki sp o s s i b l yr e l a t e dt ot h en e u r o p r o t e c t i o no fm e l a t o n i n k e yw o r d s ：o u t w a r dd e l a y e dr e c t i f i e rp o t a s s i u mc u r r e n t ，h i p p o c a m p u s ，p a t c h c l a m p ，m e l a t o n i n ，i n d o l e ，5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e 7 引言 褪黑素( m e l a t o n i n ) 是由脑内的松果腺( p i n e a lg l a n d ) 分泌的一种神经 激素，在生物节律中枢一下丘脑视交叉上核( s c n ) 的调节下，其合成表现 出明显的昼夜节律性，即白天合成下降，夜晚大幅度上升。合成的褪黑素随 血液运输到机体的其它器官组织，通过与其特异性受体结合进而调节这些器 官的功能。目前认为褪黑素受体可以分为m t l 、m t 2 、m t 3 三型，它们均为 具有七次跨膜结构的g 蛋白偶联受体【1 1 。免疫组织化学检测结果显示褪黑素 受体广泛分布于中枢神经系统，如垂体，下丘脑，海马，大n , u 4 , 脑皮层等 部位【2 。通过与受体结合，褪黑素可以调节c a m p 3 , 4 ，【c a ”】【5 ，6 】， c g m p 4 ，7 】，d i a c y l g l y c e r o l 8 】，蛋白激酶c 9 ，花生四烯酸 1 0 等细胞内信号分 子的水平，进而发挥了多种多样的生理学功能，比如调节2 4 小时生物节律， 对季节变换作出适应性反应 2 】，增强免疫器官的功能 1 1 1 3 】，调节细胞生长 繁殖 1 4 】，通过调节突触前神经递质如乙酰胆碱、肾上腺素、多巴胺、5 一h t 的释放而影响突触传递的效率【1 5 1 8 等。此外，由于褪黑素具有极高的脂溶 性，它可以进入细胞内直接与一些胞浆信号分子作用，比如它可以作为 c a 2 + c a m 的拮抗剂直接影响胞内钙信号转导 1 9 ，2 0 】和一氧化氮合酶( n o s ) 的活性【2 1 ，调节微管蛋白的解聚和聚合 2 2 】。最近研究发现褪黑素也可以与 核内受体结合通过调节基因转录活性而发挥长时程效应 2 3 1 。除松果腺外，其 它器官和组织如，视网膜 2 4 1 、h a r d w e i a n 腺 2 5 】、骨髓 2 6 ，2 7 、及胃肠道 2 8 也可以合成少量的褪黑素，不同的是，这些部位合成的褪黑素通常不进入血 液循环而只在局部发挥作用。 离体和在体研究均已证实褪黑素具有强大的神经保护作用 2 9 3 2 1 。比如， 它可以减小缺血后脑梗塞的体积 3 3 ，减轻海人藻酸 3 4 】和n m d a 3 5 1 诱导的 兴奋毒效应导致的神经元死亡，抑制m p t p 诱导的黑质多巴胺能神经元死亡 3 6 3 9 ，缓减b 淀粉样蛋白的致神经元凋亡作用4 0 ，4 1 等。目前认为褪黑素 神经保护的主要机制在于其强大的清除自由基和抗氧化功能。研究发现，褪 黑素不仅可以通过调节基因转录活性增加具有抗氧化功能的酶蛋白如，超氧 化物歧化酶和谷光甘肽过氧化物还原酶的合成【4 2 ，4 3 】，而且还具有直接的自 由基清除功能，它对多种自由基都有清除能力，以对羟自由基的清除为例， 它可以结合两个羟自由基分子 4 4 】，然后经尿液排出体外。最近的研究发现褪 黑素的神经保护作用可能与其调节抗凋亡蛋白与致凋亡蛋白的平衡和增强神 经元损伤后n d a 修复因子的表达有关【4 5 ，4 6 】，但详细的机制有待于进一步阐 明。以上研究提示褪黑素神经保护效应机制是多方面的。 钭离子通道对于维持细胞膜兴奋性和神经元问的信息传递有着重要的作 用4 7 1 。然而，越来越多的研究发现它同时也参与了细胞损伤过程。以往研究 较多的是a t p 敏感性钾通道( n a t p ) ，缺氧时k a t p 开放，引起细胞膜超极化， 对神经元具有保护作用 4 8 。近年来研究认为，电压门控钾离子通道也参与了 神经元的死亡过程。研究发现，在离体模拟缺血缺氧条件下所导致的离体培养 的皮层神经元死亡的早期，细胞外钾离子浓度显著升高，同时电压依赖性钾 电流幅度增高，6 小时后i k 增加了6 l 4 9 ，5 0 。此外，在c 2 一c e r a m i d e 诱导 的原代皮层细胞凋亡模型中，发现在用c 2 - - c e r a m i d e 处理后6 小时后，i k 的 幅度增加了3 8 4 9 】。进一步的研究发现，延迟外向整流钾电流t i k ) 而非瞬态 外向钾电流( i a ) 介导了体外缺血缺氧导致的迟发性神经元死亡过程：增加细 胞外钾离子的浓度或使用i k 通道阻断剂t e a 可减轻神经元的死亡，而i 。的 阻断剂4 - a p , 钙离子依赖性钾通道阻断剂c h a r y b o d o t o x i n 以及k t p 阻断剂 t o l b u t a m i d e 却没有明显的作用 4 9 】。同时，在体研究也发现，短暂性全脑缺 血再灌后1 4 小时，海马c a l 细胞的i k 增加了3 0 ，随后才是海马c a l 细胞 的大量死1 2 1 5 1 】，而t e a 可以减轻缺血后神经元的损伤程度 5 2 1 。此外，我 们实验室以往的研究结果也显示，一些具有神经保护的肽类如血管内皮生 长因子( v e g f ) 也可以通过抑制i k 5 3 】以及增强k v 】2 通道蛋白的磷酸化 5 4 1 而减轻缺血导致的神经元死亡。 众所周知，海马是中枢神经系统记忆和认知形成和巩固的重要结构f 5 5 1 ， 同时也是缺血缺氧后极易累及的脑区 5 6 ，5 7 】。已有的电生理学实验表明，褪 黑素可以调节海马神经元的兴奋性和突触可塑一i 生 5 8 6 0 1 。然而，褪黑素是否 能调节海马神经元i k 却不清楚。因此，本实验采用脑片全细胞记录技术，观 察了褪黑素对大鼠海马c a l 锥体神经元i k 的作用，在此基础上，我们进一步 分析了其可能的机制。 ( 一) 溶液的配制 材料与方法 1 人工脑脊液配制 人工脑脊液( a c s f ) 分为两部分：成份h n a c i1 3 0 ，k c l5 ，m g s 0 4 2 ，c a c l 22 ，g l u c o s e1 0 ，s u c r o s e l 0 ( m m ) ；成份i i ：n a h 2 p 0 41 2 5 ，n a h c 0 3 2 6 ( m m ) ，渗透压为3 2 1m o s m 。成分i 与成分1 1 分别配成2 0 倍浓缩液( 不可混 合，否则产生浑浊) ，置一2 0 0 c 低温保存。实验前取出融化，分别稀释，然后 混合定容到1 0 0 0m l 。 2 电极内液配制 电极内液成份：k g l u c o n a t e1 4 5 ，m g s 0 4 7 h 2 02 ，c a c l 20 1 ，e g t al ， a t p k 22 ，g t e n a 3o 1 ，h e p e s1 0 ( m m ) 。p h 值用k o h 调至7 2 ，渗透压为3 0 6 m o s m 。 ( 二) 脑片制备 脑片的制备按常规方法进行。制备标本前先做好以下准备工作：将盛有 脑脊液的烧杯埋入碎冰中，持续通混合气( 9 5 0 2 + 5 c 0 2 ) 。将切脑片的刀 片在酒精中浸泡，以除去其表面的油污，然后安装在切片机上。待脑脊液冷 却3 0r a i n 后( 温度约4o c ) ，将雄性1 4 1 8 天的s p r a g u ed a w l e y 大鼠( 复旦动物 房) 用水合氯醛( 4 0 0 m g k g ，i p ) 腹腔麻醉。待麻醉适度后，迅速断头、剪 开颅骨取出全脑，置于备好的脑脊液中静置2r a i n 。将冷却后的脑取出放在预 先冷却过的冰台上，用刀片将左右脑从中间切丌，用玻璃分针游离海马，然 后轻轻将其取出。需要注意的是，动作一定要迅速，以免海马组织在空气中 长时间暴露。然后，用刀片去除海马的头尾两端，形成平行的两个截面，粘 在切片机载物台上，加入上述4o c 脑脊液，持续通气，开振动切片机( l e i c a v t l 0 0 0 m ，德国) ，设置震动频率为最大，速度最慢，脑片厚度为4 0 0p , m ，使 刀片轻轻滑过脑片而减少对神经元的损伤。然后选取形态较好，厚度较均匀 的脑片移入3 0 。c 已通混合气的人工脑脊液中，孵育1 h 以上备用。 ( 三) 微电极拉制 微电极选用长度8c m ；j 径1 5m m 的硬质玻璃毛坯管( g c 1 7 ，中科院科 1 0 达公司，上海) 。采用微电极拉制仪( p b 一7 ，n a r i s h i g e ，日本) ，两步拉制， 第一步为粗拉，将玻璃管尖端直径拉成2 0 0 4 0 0p _ m ，然后再拉一次，使玻璃 管在中段熔断成两根电极，断开处直径约为1 2u m 左右。需要注意的是，新 买的电极应先在酸液中浸泡过夜以除去玻璃管内部的杂质，然后先用自来水 冲洗，再用双蒸水浸泡并进一步冲洗，最后置于烘箱中烘干。而且每次实验 都用当天拉制的新微电极，每根微电极只用一次，以保证成功封接。 ( 四) 全细胞记录 为能够精确记录海马c a l 区域的锥体细胞的电活动，我们建立了可视脑 片膜片钳记录方法。具体操作如下； 1 脑片固定 用吸管小心将已孵育好的脑片放入记录槽内，用毛笔将脑片位置调整适 当，用铂框呢绒小网将脑片压好。人工脑脊液持续灌流( 室温，通混合气) ， 灌流速度3 4m l m i n ，以保证脑片有足够的氧供。 2 电极充灌和加压 用连有细塑料管的注射器将电极内液充入，轻弹电极排除气泡，然后将 其固定在膜片钳放大器的探头上。用注射器给电极适量正压，将电极放入标 本浴槽，测量电极阻抗，一般为3 5m r 2 。 3 细胞选取和定位 将正置显微镜低倍镜的镜头浸入灌流液中，选准所要记录脑片的位置， 然后换成高倍镜。将高倍镜头浸入液体，适当调节焦距就可通过c c d 摄象机 在t v 监视器屏幕上看到放大的细胞图象。为使细胞图象更清晰，用红外光代 替普通光，其d i c ( d i f f e r e n t i a li n t e r f e r e n c ec o n t r a c t ) 图象在黑白t v 监视器屏 幕上会更有立体感。而且通过d i c 不但能看清脑片表面的细胞，而且还能看清 脑片表面下一定深度不同聚焦平面的细胞，从而能选取状态更好的细胞进行 记录a 锥体细胞的判断标准为细胞胞体呈锥体形，且有明显的顶端树突。状 态好的细胞表面光滑，形体饱满，轮廓分明，折光性好。 4 千兆欧封接 封接方法与h a m i l l 等所用的相似 6 1 】，膜片钳放大器处于电压钳状态。将 充有正压的微电极放入灌流槽，可先在低倍镜下把电极尖端放在正中，再在 显微镜的监视下使电极尖端接近脑片表面。然后换成高倍镜，使电极尖端置 于高倍镜正中，并调节电极与镜头直到能同时看到脑片表面与电极尖端。此 时可在监视器帮助下，继续调节电极与镜头，使电极尖端逐渐接近所选的细 胞。此时，可明显看到电极内的诈压在电极尖端将脑片组织吹开，直到将所 选细胞表面吹光滑，并看到在细胞膜表面吹开一凹陷，放开f 压，再给以小 的负压，吸数秒钟，同时观察阻抗，此时会发现微电极阻抗在逐渐增加，直 至电极尖端与细胞表面形成l g q 以上的封接阻抗，表明封接成功。 5 i k 的全细胞记录 封接成功后，将膜片钳放大器由电压钳状态转换成电流钳状态，以记录 膜电位和动作电位。未吸破前膜片钳放大器仪表上的数值应为0m v 左右。然 后给以突然的吸力( 1 0 - 1 0 0c m h 2 0 ) ，此时如果放大器仪表上的电压值由0 m v 左右突然变成静息电位值，则表明细胞膜已吸破而形成全细胞方式。实验选 取静息电位在5 5m v 以上的神经元，稳定3 到5 分钟后开始进行数据采样记录， 用连续叠加电流刺激细胞直至动作电位出现。动作电位幅值大于8 0m v ，并出 现串发放，表明细胞状态良好。然后转到电压钳方式，保持电位在5 0 m v ， 记录延迟外向整流钾电流。为了记录到单纯的i k ，在细胞外液中常规加入1 l a m 的t e t r o d o t o x i n ( t t x ) 以阻断钠离子电流，2 0 0 m 的c d c l 2 以阻断钙离子电流。 在每次实验中，待汜录稳定后，再作进一步的实验处理。电压