（作物遗传育种专业论文）棉花叶片和纤维蔗糖磷酸合成酶活性变化及其基因的克隆分析.pdf

y9 0 3 9 3 s 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期阔给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论论文和汇编本学术论 文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： 日期： 塞l 出 磁题当 刎：i ! 山东农业大学硕士学位论文 摘要 在丰抗6 号、中棉4 5 和山农棕0 2 三个品种( 系) 发育的花铃期，测 定它们倒一果枝第一果节的叶片和棉纤维中蔗糖含量、可溶性糖含量和蔗 糖磷酸合成酶( s p s ) 活性的变化，利用电子克隆的方法，克隆了s p s 基 因片段，分析s p s 基因m 耐q a 水平上的表达量的变化，并对克隆的s p s 基因编码氨基酸序列进行分析，获得结果如下： 1 三个品种( 系) 的s p s 酶活性的变化在叶片和棉纤维发育过程中 均出现双峰，高峰值出现在开花当天和花后1 8 天，这两个峰值是前者大 于后者，且整体变化均呈现下降趋势。s p s 酶活性在丰抗6 号最高，其次 为中棉4 5 ，山农棕0 2 最低。三个品种( 系) 的可溶性总糖含量、蔗糖含 量表现同样的变化规律。 2 棉花叶片中s p s 酶的活性要比棉纤维中的活性高，这说明s p s 参与合成蔗糖主要发生在叶片中：在棉纤维次生壁沉淀期( 即花后1 8 天) 棉纤维中的s p s 酶活性的提高，这说明s p s 在棉纤维次生壁合成时也起 一定的作用。 3 利用r t - p c r 技术，分析了花铃期棉花叶片和棉纤维s p s 基因片 段在转录水平上的变化，结果表明三个品种( 系) 叶片的s p s 基因的表 达量要高于棉纤维中的表达量，叶片s p s 基因的表达量高，棉纤维的s p s 的表达量低，这说明s p s 基因主要在作为“源”的叶片中起作用。在叶 片和棉纤维中，s p s 基因片段的表达量在转录水平上从高到低依次为： 丰抗6 号、中棉4 5 和山农棕0 2 。 4 利用电子克隆的方法，克隆了棉花s p s 基因片段，共1 0 5 0b p ， 命为电子克隆拼接序列( e c l o 血g ) 。根据拼接的s p s 基因片段，设计引 物，利用p c r 技术，获得s p s 基因片段，经测序共9 8 0 b p ，命为测序片 段( c e x u ) 。电子克隆拼接序列与棉花实际克隆核苷酸序列相似性为8 0 ， 氨基酸序列相似性为7 5 ，c e x u 的氨基酸序列与其他植物温州蜜桔、蚕 豆、马铃薯、车前菊、甜菜、菠菜的s p s 氨基酸序列相似性在6 0 6 8 之间，并且有共同的保守区域，这些高度保守的氨基酸序列可能是s p s 基因的活性位点。 5 生物信息技术分析表明已克隆的s p s 基因片段包含3 2 0 个氨基酸， 棉花叶片和纤维蔗糖磷酸含成酶活性变化及其基因的克隆分析 分子量为3 6 5 2 5 4 ，理论等电点p i 为6 o o ，不稳定指数估算值为5 6 9 3 ，属于 不稳定蛋白类。其中极性氨基酸占5 6 ，疏水氨基酸占4 4 。该基因片段 编码氨基酸的高级结构为混合类型，呈螺旋状的氨基酸残基占2 0 3 8 ，呈 折叠状的氨基酸残基占3 1 7 5 ，呈环状的氨基酸残基占4 7 8 7 。第4 3 和 第1 1 4 位上结合二硫键的可能性最大，预测这两个位点可能对蛋白质高级 结构的形成与稳定有重要作用。预测s p s 酶基因片段编码氨基酸序列有两 个跨膜区域( 第7 2 9 位、第1 3 5 1 5 7 位) ，该酶属跨膜蛋白类，并发生跨膜 运动，故有可能在细胞内和细胞外均起作用。预测该基因片段可能具有水 解酶的功能。 关键词：棉花；蔗糖磷酸合成酶； 电子克隆；酶活性：基因表达 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h e ec u j “v 甜sw e r es t u d j e da b o u tf e n 酏a 1 1 96 ，z 1 1 0 n g m j a n s u o4 5a n d s h 锄o n gb r o w n0 2i n1 e a v e sa n d 助r c sf r o mn o w i l l gt ob o l lo p e l l i n gb y d e t e m l i i l i n gs u c r o s ec o n t e n t ，s o l u b l es u g a rc o m e n ta n d 也ea c t i v i t yo fs u c r o s e p h o s p h a t es y n t h a s e ( s p s ) ，e c l o i n gm ef r a g i n e mo fs p sg e n e ，o b s e i n g r r l r n ae x p r e s s i o no fs p sg e n ef r a g m e n ta n dd o i n gb i o i n f b m a t i c sa i l a l y s i s t h er e s u l t sa r ea sf 0 1 l o w s ： 1 t h ea c t i 、哇t yo fs p s ，s o l u b l e s u g a rc o n t e n ta n ds u c r o s ec o n t e n t a p p e a r e dd o u b l ep e a k so nb l o o r n i n gd a ya n d18d a y sp o s ta i l 恤e s i s ( d p a )i n l e a v e sa n df i b r e s ；也ef l r s tp e a l 【s u r p a s s e dt 1 1 es e c o n dp e a ka n di td e c r e a s e da s aw h 0 1 e 1 kv a l u eo fs p sa c t i 、r i t yw a s 吐l eh i 曲e s ti nf e n g k a n g6 ，s e c o n di n z h o n g m i a 工l s u o4 5 ，a n d 血i r di ns h a n n o n gb r o w n0 2 a n ds i m _ u l t a n e o u s l y s o l u b l es u g a rc o m e n ta n ds u c r o s ec o t e mh a dt l l es a m ec h 柚g e s 2 s p sa c t i v i t yw a sh j g h c ri nl e a ft h a i li n 舳r e ，w h i c hw a ss h o w e dt h a t s p s 、a sm a i n l yc o n c e m e dw i t hs u c r o s e s y n 血s i si nl e a fs p sa c t i v i t yi nc o t t o n 舶r e 、糯i n c r e a s e dd u r i n g 舶e rs e c o i l d a r yw a l ld e p o s i t i o n ，a 1 1 dm i ss h e wt h a t s p sp l a y e da i i n p o n a n tr 0 1 ed u 血gf i b e rs e c o n d a r yw a l ld e p o s i t i o n 3 i m p c ra n a l y s i so fs p sg e n e 丘a g m e n ts h o w e d m a ts p sg e n c e x p r e s s i o no f 也et h r e ec u l t i v a r s t m i l s c r i p t i o n a l1 e v e i 、v a s1 1 i g h e ri nl e a f t l l a ni i l 肋r ed u r i n gc o t t o n 曲r ed e v e l o p m e n t a n dt 1 1 i si n c l u d e dt h a ts p sg e n e e x p r e s s i o nm a i l yr e a c t e di ns o 砒s el e a v e s i nl e a fa 1 1 d 丘b r es p se x p r e s s i o n 啪sm eh i 曲e s ti i lf e 然a i l g6 ，s e c o n di 1 1z h o n g m i a n s u 04 5 ，吐l i r di ns h 黜o n g b r o w n 0 2 4 s p sg e n c 疔a g m e n tw a sn a n l e de - c l o n i n gs e q u e n c ea n d 啪s1 0 5 0b pb y e c l o n i n gt e c h n i q u e w ec e x us e q u e n c e舶me x p 鲥m e n tw a s9 8 0 b p t h r o u 曲d e s i g n i l l gp r i m e ra c c o r m n gt oe c l o n i n gs e q u e n c e t h e r ew a s8 0 i d e n t 时o fn u c l e i ca c i ds e q u e n c ea n d7 5 i d e n t 畸o f 锄i n oa c i ds e q u e n c e s b e t w e e ne - c l o i l i n gs e q u e n c ea n dc e x us e q u e n c e t h eh o m o l o g yw a s6 0 一6 8 锄o n gc e x u 锄i n 0a c i ds e q u e n c e sa n do t l l e rp l a l l t s 锄i n oa c i ds e q u e n c e s ， s u c aa sm a l l d 耐no r a i l g e ，h o r s e b e a l l ，p o t a t o ，s u g a r b e e t ，c h r y s a l l t h e m u ma 1 1 d 3 棉花叶片和纤维蔗糖磷酸合成酶活性变化及其基因的克隆分析 s p i n a c h ，a n dm e yh a dc o 咖o nc o n s e r v e dd o m a i 工1 1 h sh i 曲i yc o n s e n ，e d a m i n oa c i ds e q u e n c e sm a yb ef h ea c t i v i l _ ) ，s i t eo fs p sg e n e 5 b yi n f b n a t i c sa 1 1 a l y s i ss p s 鲫e 丘a g m e mw a sc o m p o s e do f3 2 0 锄i n oa c i d sa 1 1 di t sm o l e c u l a rw e i g h tw a s3 6 5 2 5 4 ，a n di t sp 1w a s6 0 0 ，a 1 1 di t s i n s t a b l ei n d e x 邯5 6 9 3 ，w l l i c h 愠sb e l o n g e dt oi 1 1 s 切b l ep m t e i n f i f t ys i x p e r c e mo f 砌n oa c i d sw e r ep o l a ra m i n oa c i d s ，a n df o r c yf o u rp e r c e n to f a m i n oa c i d sw e r eh y d r o p h o b i c 锄i n oa c i d s t 1 1 i sa d v a n c e ds t n l c n 聆e n c o d e d b y 姗m oa c i d sw a sb e l o n g e dt om i x e ds 仉l c t 【l r e ，w i l i c h2 0 3 8p e r c e ma m 缸o a c i dr e s i d u e sw a sa h e l i xr e g i o n s ，31 7 5p e r c e n ta m i oa c i dr c s i d u e si sp - s h e e t r e g i o n s ，4 7 8 7p e r c e n ta m i n oa c i dr e s i d u e si s1 0 0 pr e g i o n s d i s u l f i d eb o n d i n g s t a t e w a s t e m l y i i k e l y t ob ea tn o4 3a 1 1 d n 0 1 1 4 ，w h i c h w c r cp r e d i c 把d t ob e i m p o n a n tt of b m a t i o na n ds t a b i l i z a t i o no fp r o t 血n o7 2 9a n dn o1 3 5 1 5 7 w e r et h e 廿a n s m e m b r a n ed o m a i 工1 a n dc o t t o ns p sh a dt r a n s m e m b r a n ea c t i o n w l l i c hc o u l da c t 洫a n do u to fc e l l a n dw ep r e d i c t e d 也a tm i sg e n e 缸g r n e m c o u l dh a v e 坨劬c t i o no f h y d r o l y t i ce n z y m e k e y w o r d s ： c o “o n ；s u c m s ep h o s p h a t es y n t h a s e ( s p s ) ； e - c l o i g ； e n 珂m ea c i t i v i t ) r ；g e ee x p n s s i o 4 山东农业大学硕士学位论文 符号说明 b p c t a b d a a d e p c d n a d n t p e d t a e s t o r f p c r p v p r n a r t - p c r s d s s p s s s t r i s u d p u d p g b a s e p a i r c e 可l - e m y i a m m o n i 啪b r o m i d e d a ya f t e ra 1 1 t h e s i s d i e 1 y lp y r o c a r b o n a t e d e o x 州b o s en u c l e i ca c i d d e o x y n u c l e o s i d en j p h o s p b a t e e t l y l e n e d i 锄i n e t e 仃aa c e t i ca c i d e 1 印r e s s e ds e q u e n c et a g s o p e nr e a m n g 丘锄e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p 0 1 ) w i l l y l p y r r o i i d o n e i u b o n u c l e a s e r e v e r s e 仃a n s c r i o t i o np c r s o d i u md o d e c y ls u l ：6 l t e s u c r o s ep h o s p h a t es y n 也a s e s u c r o s es y n t h a s e 啊s - h y d r o x y i n e t 1 y l - a j n i n o m e t l l a n e u r i d i n ed i p h o s p h a t e 埘d i n e d i p h o s p h a t eg l u c o s e 碱基对 十六烷基三甲基溴化氨 开花后天数 焦炭酸二乙酯 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷酸三磷酸 乙二胺四乙酸 表达序列标签 开放阅读框 聚合酶链反应 聚乙烯吡咯烷酮 核糖核苷酸 反转录p c r 十二烷基磺酸钠 蔗糖磷酸合成酶 蔗糖合成酶 三( 羟甲基) 氨基甲烷 尿苷二磷酸 尿苷二磷酸葡萄糖 棉花叶片和纤维蔗糖磷酸台成酶活性变化及其基因的克隆分析 1 引言 棉花是世界性的重要经济作物，在我国国民经济中占有重要地位。我 国是世界上最大的棉生产国和消费国。棉花纤维是世界上最重要的纺织原 料之一，是第一大产大然纤维的作物，具有重要的经济价值。为了提高棉 纤维的品质和产量，各国的科研人员利用不同的材料对棉纤维的发育机制 从分子水平上进行了广泛的研究。棉花的产量和质量是棉花产业的两个关 键因素。如何提高强“源”强“库”，使作为“源”的叶片产生更多的碳 水化合物以供“库”即棉铃的利用，同时棉铃也能充分利用“源”叶提供 的碳水化合物，是解决棉花高产优质的重要途径。 1 1 蔗糖磷酸合成酶( s p s ) 的研究进展 1 1 1 蔗糖磷酸合成酶的生物学特性 蔗糖磷酸合成酶( s u c r o s e p h o s p h a t es y n m a s e ，s p s ) 在1 9 5 5 年由l e l o i r 首次在小麦胚芽中测到：1 9 5 9 年在萌发的小麦和1 9 6 9 年在水稻种子也发 现其存在( h a w k e r ，1 9 7 1 ) 。1 9 9 0 年代初在菠菜和玉米中纯化了s p s ，由 分子量1 1 7 k d 1 3 8 k d 的亚基构成，为二聚体或四聚体，存在于细胞质中。 随着研究材料范围扩大和深入，人们发现光合组织( 主要是叶片) 和非光 合组织( 果实、贮藏块根、块茎等) 中都广泛存在着s p s 。l u 衄等认为 c 4 植物中s p s 几乎主要分布在叶肉细胞，而维管束鞘细胞中的s p s 活力 是叶中的5 3 5 ( l u 皿等，1 9 9 7 ) 。而c 3 植物由于其维管束鞘不如c 4 植物的发达，且不含叶绿体，其周围的叶肉细胞排列疏松，所以s p s 全 部分布在叶肉细胞内。 蔗糖磷酸合成酶( e c 2 4 1 1 4 ) 是一种可溶性酶，活性最适p h 值约 为7 0 ，是一种低丰度蛋白( 不到可溶性蛋白的0 1 ) ，且不稳定。催化 如下可逆反应： u d p g + 觚c t o s e - 6 - p h o s p h a t e 卜- u d p + s u c r o s e - 6 - p h o s p h a t c s p s 是以u d p g 为供体，以6 磷酸果糖( f 6 p ) 为受体的糖转移酶， 合成6 一磷酸蔗糖( g 6 p ) 。6 磷酸蔗糖在磷酸蔗糖磷酸化酶( s p p ) 的作 6 山东农业大学硕士学位论文 用下脱磷酸，并水解形成蔗糖和磷酸根离子。一般将s p s s p a s e 系统作为 蔗糖台成的主要途径，在此途径中s p s 是关键的限速酶；而s p s 和s p p 又是以复合体的形式存在于植物体内，所以s p s 催化蔗糖生成在事实上 是不可逆的( h u b e r 等，1 9 9 6 ) 。s p s 的活性受到很多因素的影响，包括 温度、水分、无机盐、品种以及其它酶等。 1 1 2s p s 调节光合产物在蔗糖代谢中的作用 蔗糖是高等植物光合作用的主要产物，是碳运输的主要形式，也是 “库”代谢的主要基质( f a r r a r 等，2 0 0 0 ) 。蔗糖的合成是在细胞质内进 行的。在具有光合作用的功能叶的细胞质中，利用a t p 和n a d p h 和一 系列的酶将c 0 2 转化为蔗糖，然后通过共质体或质外体在韧皮部装载进入 筛管进行长距离运输，运输到接近“库”细胞时，蔗糖通过伴胞膜上的蔗 糖载体进入筛管伴胞复合体在韧皮部卸出，然后直接进入或在一系列酶 的作用下降解后再进入“库”细胞。降解的蔗糖在s p s 作用下将其重新 合成蔗糖，分别供转运、贮藏和代谢。近十年来，在鉴定影响光合作用两 大同化产物蔗糖和淀粉分配的关键步骤上人们已做了很多工作，蔗糖在细 胞质中的合成途径已经研究清楚( 图1 ) 。蔗糖也是许多果实中糖积累的 主要形式，是果实品质形成的重要因子。此外，它还是细胞代谢的调节因 子，可能通过影响基因表达发挥作用( j a n g 等，1 9 9 4 ) ，s p s 在蔗糖代谢 中起着重要的作用。 1 1 2 1s p s 影响“源”强和“库”强 h u b e r 曾指出s p s 活力越高，蔗糖积累得越多( h u b e r ，1 9 8 3 ) 。s p s 活性的高低代表了旗叶光合产物转化为蔗糖的能力( 李永庚等，2 0 0 1 ) 。 在甘蔗中( 世界上7 0 的糖来自甘蔗) ，茎中蔗糖的含量依赖于s p s 的活 力( z l 】u 等，1 9 9 7 ) 。尽管菜豆等叶片在伸展期间，s p s 活性出现周期性 变化，但h u b e r 等人指出这是由植物体内生物钟机制调节所致，它并不影 响s p s 的正常活力( h u b e r 等，1 9 8 5 ) 。 1 1 2 2s p s 调节光合产物在蔗糖和淀粉的分配 在光合细胞中，光合固定的碳最终转变为蔗糖和淀粉。在高等植物中 碳水化合物的主要运输形式是蔗糖，而淀粉在叶绿体内积累是碳水化合物 棉花时片和纤维蔗糖磷酸合成酶活性变化及其基因的克隆分析 图1 蔗糖在细胞质中的合成 f i g 1s u c m s es y n t l l e s i si nc y t 0 s o 的暂时贮存形式。h u b e r 曾指出s p s 活性与淀粉积累呈现负相关，而与蔗 糖形成呈正比关系，s p s 的活力大小直接影响光合产物在淀粉与蔗糖之间 的分配( h u b e r ，1 9 8 3 ) 。h u b e r 还指出s p s 对光合产物在蔗糖和淀粉的分 配中起关键的调控作用( h u b e r 等，1 9 9 6 ) 。王宁宁等人在研究苦参碱对 小麦旗叶中s p s 活性的调节时发现，短期内苦参碱在促进s p s 活性的同 时，也表现出提高蔗糖含量和降低淀粉的积累，这进一步表明s p s 对c 0 2 同化产物在蔗糖和淀粉之间的分配起重要作用( 王宁宁等，2 0 0 0 ) 。 1 1 2 3s p s 是合成蔗糖的关键酶之一 d o e h l e n 对大豆研究均表明，s p s 是影响大豆叶片中蔗糖合成的关键 酶( d o e l l l e r t ，1 9 8 3 ) ，而李永庚等人也发现磷酸蔗糖合成酶在小麦旗叶光 合产物向蔗糖的转化过程中也起着关键性的调节作用( 李永庚等，2 0 0 1 ) 。 小麦籽粒产量主要来源于光合产物，源的供应能力实际上就是源器官光合 产物的供应能力或光合产物生成总量。光合碳循环生成的磷酸丙糖主要有 两种流向：在叶绿体中形成淀粉贮存或在液泡中合成蔗糖。蔗糖是植物体 内碳水化合物运输的主要形式，所以在叶片液泡中的磷酸丙糖尽快转化为 山东农业大学硕士学位论文 蔗糖，并运输至籽粒中，才有利于光合产物屉终形成籽粒产量。在这个过 程中，磷酸蔗糖合成酶是其中可能的调节位点之一( h a r b r o n 等，1 9 8 l ； h u b e r 等，1 9 8 2 ) 。进而h a i b r o n 等人指出s p s 可能是蔗糖合成途径中的 一个重要控制点，它的活性反映蔗糖生物合成途径的能力( h a r b 1 等， 1 9 8 1 ) 。 1 1 2 4s p s 可提高瓜果的品质 s p s 在蔗糖积累型“库”组织中具有重要作用。许多果实成熟过程中 蔗糖积累与s p s 活性的升高密切相关。s p s 参与控制蔗糖长途运输与 “库”组织蔗糖代谢。网纹甜瓜果实蔗糖积累与s p s 活性上升相关( l i i l g l e 等，1 9 8 7 ：m c c 0 1 l 啪等，1 9 8 8 ：s c h a f r e r 等，1 9 8 7 ；l e s t e r 等，2 0 0 1 ； h u b b a r d 等，1 9 8 9 ) 。h u b b a r d 等人发现，在网纹甜瓜果实发育过程中，s p s 酶活性从7 斗m o l 一( f w ) - h 1 增加到3 2 岬o i 一( f w ) _ h ，蔗糖积累能 力不同的甜瓜( 基因型不同) s p s 酶活性各不相同( h u b b a r d 等，1 9 8 9 ) 。 l e s t e r 等人将高蔗糖积累型和低蔗糖积累型的两个网纹甜瓜品种分别在春 秋季栽培，发现不管是在春季还是在秋季，在花后5 到2 5 天内，两个品 种的s p s 活性较低，没有或几乎没有蔗糖积累( l e s t e r 等，2 0 0 1 ) 。只有 到了花后3 0 天，s p s 的活性高，这时两个品种才有了蔗糖积累，可见在 甜瓜果实碳水化合物代谢中，s p s 对蔗糖积累发挥重要作用( h u b e r 等， 1 9 8 2 ) 。 甜菜、猕猴桃、柑桔、番茄( 蔗糖积累型) 、甘蔗、网纹甜瓜蔗糖水 平的提高与s p s 活性的提高相关联( f i e w 等，1 9 8 7 ：m a c r a e 等，1 9 9 2 ； k o m a t s u 等，1 9 9 9 ；d a l i 等，1 9 9 2 ；l i n g l e ，1 9 9 9 ；l i n g l e 等，1 9 8 7 ) 。 m i r o n 和s c h a 疵r 报道，成熟期的普通番茄果实中蔗糖含量不超过 1 5 m m 0 1 g 。1 ( f w ) ，其s p s 活性在整个果实的发育过程中都很低；而蔗糖 积累型番茄成熟期果实中蔗糖含量约为1 1 8 m m o l g “( f w ) ，其s p s 活性 在果实发育末期约为前期的8 倍( m i r o n 等，1 9 9 i ) 。 1 1 2 5s p s 参与细胞分化与纤维细胞壁合成 m i c h e l l e 等认为s p s 在纤维沉淀细胞合成时起重要作用。对棉花胚珠 进行组织培养，其中只供给葡萄糖进行生长，隔一段时间进行s p s 活性 和蔗糖含量的测定，发现棉纤维中含有合成的蔗糖。在棉花纤维由初级细 棉花叶片和纤维蔗糖磷酸台成酶活性变化及其基因的克隆分析 胞到次级细胞发育过程中，田间栽培棉纤维花后2 4 天s p s 酶活性是花后 1 2 天的5 倍，而培养的胚珠是4 8 倍；不论是田间栽培棉纤维还是培养的 胚珠，在s p s 活性提高的同时纤维素合成的速率也快速提高。在进入次 极细胞壁发育过程后，s p s 的活性也是一直增高( m i c h e l l e 等，2 0 0 1 ) 。 i i a i 直c r 等将菠菜来源的s p s 基因转入陆地棉柯字棉31 2 中，发现叶片和 棉纤维内的s p s 活性均较非转基因的有所提高，而且s p s 活性的提高使 纤维次级细胞壁沉淀量增加，棉纤维的质量和产量有所提高；子一代和子 二代与亲本相比较，叶片和棉纤维中分别表现出s p s 活性提高了3 3 倍和 2 - 3 倍，这说明导入s p s 基因在棉花内起了积极有效的作用( h a i d e r 等， 2 0 0 0 a ；h a i 9 1 e r 等，2 0 0 0 b ；h a i 讲e r 等，2 0 0 0 c ) 。 1 1 3s p s 酶活性调控 生物体内s p s 的活性有多种调控方式。( 1 ) 蛋白酶水平上的调控： 在菠菜叶片的发育过程中s p s 活性的调控紧随s p s 酶蛋白水平的上升 ( w j l k e r 和h u b e r ，1 9 8 9 ) 。这是由于光合作用直接产物增多的诱导? 还是 由于蔗糖合成需求的诱导所引起的酶蛋白水平的提高? 目前尚未清除。但 有一点可以肯定的是，s p s 酶蛋白水平的上升使蔗糖合成的最大潜在能力 增强，这与叶片在发育过程中逐渐增强的光合作用能力相一致。( 2 ) 粗调 控：即通过s p s 的磷酸化和脱磷酸化调节酶的活性。s p s 是植物中可被光 信号改变磷酸化状态从而改变活性的几种酶之一。在黑暗中s p s 被磷酸 化而失活，在光照条件下s p s 脱磷酸化恢复活性。但目前还不知道光是 怎么改变细胞质中酶的磷酸化状态的，体内的s p s 有过少个丝氨酸残基 可被磷酸化? ( 3 ) 细调控：即通过别构因子来调节s p s 的活性。g 。6 p 和p i 都可以在两个水平上对s p s 的活性进行调节。当g 6 p 丰富时，抑 制s p s 激酶活性，s p s 的丝氨酸残基去磷酸化而具有较高的活性，或g 一6 p 结合在s p s 的特定位置上直接催化它；当g 6 p 减少而p i 浓度高时，抑 制s p s 磷酸酯酶活性，维持s p s 的磷酸化状态而具有低的酶活性，或p i 结合在s p s 的特定位置上直接抑制它。g 6 p 稍微升高和p i 很少的降低 相偶联就能使体内的s p s 活性产生很大的影响( h u b e r 等，1 9 9 2 ；h u b e r 等，1 9 9 6 ) 。 l o 山东农业大学硕士学位论文 1 1 4s p s 基因的克隆及遗传转化植株的表现 目前国外研究者已经成功地将s p s 基因从玉米( w j 玎e l l 等，1 9 9 1 ) 、 菠菜( 砌e i n 等，1 9 9 3 ) 、甜菜( h e s s e 等，1 9 9 5 ) 、柑桔( k o m a t s u 等，1 9 9 6 ) 、 苹果( a t k i i l s o n 等，1 9 9 7 ) 、甘蔗( s u g i h a n o 等，1 9 9 7 ) 、水稻( v m d e z 等，1 9 9 6 ) 等作物中克隆出来。 w o r r e l l 等在番茄中首次成功表达了玉米的s p s 基因，发现转基因植 株叶片中s p s 活性显著升高，而且不受昼夜节律的调节( w j r r e l l 等，1 9 9 1 ) 。 m i c a i i e f 等发现，正义导入玉米s p s 基因的番茄植株叶片的s p s 活性在各 种处理中均显著提高，叶片分配向蔗糖的碳同化物提高了5 0 ；开花时间 提前，总的花序数也增多；在环境中c 0 2 量相同的情况下，转基因植株比 对照的果实个数增加1 5 倍；果实成熟期提前，总干重提高3 2 只是产 量没有显著增加( m i c a l l e f 等，1 9 9 5 ) 。 c h a r l e s 等人将玉米的s p s 基因转到烟草中，发现烟草提前开花，并 且开花数目比野生型的烟草多。尽管叶片中蔗糖与淀粉的比值明显增高， 但这些变化并不是因为叶片中碳吸收和输出的改变。幼叶和老叶中的s p s 活力超量表达，是野生型的1 0 倍。而功能叶仅是野生型的2 3 倍。他们 指出，蔗糖合成和碳吸收能力的提高，特别是在老叶中的提高，有助于整 个植株的生长和发育，提高开花数目( c h a r l e s 等，2 0 0 3 ) 。 h a i 9 1 e r 等将菠菜来源的s p s 基因导入陆地棉柯字棉3 1 2 中，发现转 s p s 基因的棉花能超量表达s p s 活性。即使在夜间1 5 温度的低温胁迫 下，叶片和棉纤维的s p s 的活性均比非转基因的高。转s p s 基因棉花比 非转基因对照每株棉铃数增加了1 8 ，单籽纤维重量增加了2 5 ，纤维 成熟度提高了7 ，纤维长度增加了1 0 ，纤维细度提高了8 ，即转s p s 基因的植株在低温中可以稳定或提高棉纤维质量。由于转s p s 基因的棉 纤维与亲本c 3 1 2 的棉纤维直径在1 6 5 ，1 7 o 微米之间，大体相同，细度的 增加可能是由于纤维壁厚度增加，故预测s p s 基因是一种有利纤维细度 增加的基因。h a i g l c r 等还发现s p s 在叶片中的超量表达能提高光合效率 对寒冷夜晚的耐受能力，在第二天温暖的白天里其光合速率能与一直处在 温暖生长的植物的光台速率保持一样，而未转基因的棉花经过1 5 夜晚 棉花叶片和纤维蔗糖磷酸合成酶活性变化及其基因的克隆分析 之后，在温暖的白天光合速率表现降低。实验得出s p s 主要调节光合细 胞和贮藏器官中蔗糖的合成( h a i 9 1 e r 等，2 0 0 0 a ；h a i 9 1 e r 等，2 0 0 0 b ；h a i g l e r 等，2 0 0 0 c ) 。 1 2电了克隆基因的研究进展 电子克隆( i ns i l i c oc l o i l i n g ) 是近年来伴随着基因组计划和e s t 计划 发展起来的基因克隆新方法( g i l l 等，2 0 0 0 ) 。电子克隆出现，为研究者 获得整个编码区或者可变剪接体、寻找全长基因并发现新基因提供了方 便、迅捷的方法，同时加速基因结构和功能研究的进程，推动比较基因组 学和基因进化的发展( 李鑫等，2 0 0 4 ) 。 1 2 1 电子克隆的原理 电子克隆又叫电子杂交( e i e c 们n i ch y b r i d i z a t i o n ) ，其基本原理同染色 体步移是相似的，所不同的只是用e s t 数据库代替文库，且主要用于全 长c d n a 克隆。e s t 是长达2 0 0 b p 3 0 0 b p 的c d n a 片段，世界各国的实验 室将分离得到的e s t 输入一个公开的公共数据库中。如果有了某个c d n a 的一个e s t 后，可输入e s t 数据库中去搜索同这个e s t 有一段共同序列 的另一个e s t ，然后把这两个e s t 装配成较长的e s t ，经过多次拼接延 伸，最后有可能得到一个全长c d n a 序列或部分c d n a 序列。此时可根 据这个c d n a 序列设计引物，在合适的c d n a 文库中作p c r ，或直接做 r 孓p c r 扩增出真正的全长c d n a 或部分c d n a 序列，之后序列测序，把 这个c d n a 序列或其氨基酸序列与其他植物同一基因的全长或部分c d n a 序列或相应的氨基酸序列进行比对，看是否具有较高的相似性和同源性， 初步确定该植物的基因被克隆出来。i m p c r 、n o n l l e m 杂交或荧光定量 p c r 等方法进行验证和鉴定基因的表达。当然，在数据库中搜索和拼接 e s t 等是借助电脑和有关的软件进行操作，所以称之为电子克隆。 山东农业大学硕士学位论文 1 2 2电子克隆的优缺点 值得注意的是d b e s t 中的e s t 数据不够精确，精确度最高为9 7 。 这也就意味着我们所获得的模拟序列，仅是一种假象序列，是作实验前的 一种参考，但与传统的采用克隆原位杂交方法筛选c d n a 文库或是利用基 因特异引物进行c d n a 末端快速扩增即r a c e 方法相比，起到了节省时 间、节约经费、事半功倍的效果。随着基因组计划的进展以及e s t 数据 的迅速扩增，没有被e s t 项目检测过的基因将会越来越少，因此在克隆 基因全长c d n a 之前，很有必要采用电子克隆技术先行模拟c d n a 全长 应是必不可少的策略，以指导下一步实验的进行( 于浩等，2 0 0 3 ) 。 有时难以获得完整的5 端序列，这是电子克隆中遇到的最主要问题， 在以基因组序列为基础的电子克隆尤其难以确定。对于通过基因组结构预 测获得的基因有时候难以确定其表达的时期，这给r t - p c r 验证带来困难， 一般可以根据其功能预测或查找相关的文献资料确定该基因的表达时期， 也可以同时测定各个时期和不同组织的表达谱来加阻判断( 吴士良等， 2 0 0 5 ) 。 与传统的基因克隆方法相比，电子克隆主要有以下优点：1 ) 速度快。 包括同源性比较、序列拼接组装等工作在计算机上完成，只需i m p c r 序 列验证即可。2 ) 投入低。电子克隆只需能够上网的计算机和p c r 仪等仪 器即可进行，实验成本较低。3 ) 技术要求低。实验室工作只涉及到r n a 抽提、反转录、p c r 扩增等分子生物学的基本实验，研究人员很容易掌握。 4 ) 针对性强。拟克隆基因的生物学功能大都比较明确，一旦获得即可直 接应用转基因技术进行作物品种改良( 黄骥等，2 0 0 2 ) 。 1 2 3电子克隆在克隆植物基因中的应用 随着水稻、玉米等基因组的测序发展，已有关于水稻( 黄骥等，2 0 0 2 ； 林慧贤等，2 0 0 l ：徐吉臣等，2 0 0 4 ；钮旭光等，2 0 0 5 ) 的电子克隆报道。 罗明等在研究棉花纤维细胞发育过程中胞质骨架的形成和作用机理 时，根据植物l i m ( 一种含锌的蛋白质) 结构域基因同源性对棉花e s t 片段进行筛选。利用g e n b a n k 中提供的l i m 结构域蛋白序列，通过n c b i 棉花叶片和纤维蔗糖磷酸合成酶活性变化及其基凶的克隆分析 的p r o t e i n c o n s e n ，a t i o n d o m a i n 程序比较获得相对保守区域。以此保守序 列为探针用b l a s l n 程序对g e n b a n k 的棉花e s t 数据库进行电子信息杂 交筛选，以期获得与探针序列同源的棉花e s t 片段。选取同源性较高的 e s t 片段，通过d n a s t a r 的s e q m a l l 程序将e s t 片段归纳为几个e s t 重叠群。并对重叠群进行整合和延长。根据最终整合序列和可能的o i ， 设计引物进行p c r 扩增，以徐州1 4 24 d p a 胚珠( 含纤维) 的c d n a 为 模板，进行c d n a 片段扩增，回收目标片段并测序，得到与预期长度吻合 的p c r 扩增产物，其序列与整合序列比较一致。该棉花u m 结构域基因 g e i l b a i l k 登录号为a f 4 4 31 17 ，取名g 1 1 l i m l ，长8 4 8b p ，包含一个5 7 0 b p 的开放阅读框，推导的氨基酸序列( 1 8 9 个氨基酸) 与拟南芥、烟草和向 日葵的l i m 结构域蛋白有极高的同源性，在5 4 8 9 9 之间。n 端区域 和两个l i m 结构域保守性很高，l i m 间区序列的保守性却较低，c 端区 域的保守性更低。以棉花i 腺r r l 基因作为内参，进行r 1 二p c r 分析，结 果发现，g 1 1 l i m l 基因在棉花的根、下胚轴、叶、花药、徐州1 4 24 d p a 的胚珠( 含纤维) 、1 2 d p a 和1 8 d p a 的纤维中，以及海岛棉1 8 d p a 纤维 和中棉1 2 d p a 纤维中也有表达。并且在花药和纤维，特别是1 8 d p a ( 海 岛棉和陆地棉) 的纤维中表达量相对较高。说明g l l l i m l 基因在棉花各组 织中均有表达，但不同组织的表达水平却有较大的差异，在棉花纤维发育 过程中有较强的表达，进一步证明g 1 1 l i m l 基因与纤维发育有密切的关 系。( 罗明等，2 0 0 3 ) 。 刘庆坡等采用基于e s t 序列的电子克隆方法得到了一段长1 6 1 1 b 口的 线粒体丝氨酸羟甲基转移酶基因。首先从水稻盐胁迫诱导表达e s t 数据 库( h t t p ：n ”n c b i n l i l l n i h g o v ，u i l i l i b ) 中下载e s t 序列并在曙光3 0 0 0 大型计算机上用软件p h r a p 进行序列拼接和校对，获得6 0 个e s t 重叠群 ( c o 嘶g ) ；从中挑选出感兴趣的、主要由a c c e s s i o l l l 分别为b f 4 3 0 5 2 6 、 b f 4 3 0 6 5 1 和b f 4 3 0 7 5 7 这3 条e s t 序列支持的大片断c d n a 序列，即 c o m i 9 4 6 ，序列长1 6 1 1 b p 。将c o n t i 9 4 6 通过b l a s t 搜索h t g s 数据库， 找到一个同源性很高的基因组d n 序列o s b a 0 0 5 7 g 0 7 克隆。用软件 f g d 忸s h 对该d n a 序列中与目标c d n a 片断高度匹配的区域进行基因 预测，分析该克隆中的联配区域得到一个包含1 4 个外显子和1 3 个内含子 山东农业大学硕士学位论文 的基因。将推测的外显子拼接成c d n a 序列，用0 r ff i n d e r 程序分析其 o r f 编码4 9 8 个氨基酸，用此蛋白序列搜索s w i s s p r