（应用化学专业论文）茶多酚的定性定量分析方法及大孔吸附树脂纯化工艺条件优化的研究.pdf

摘要 茶多酚是茶叶中其有生理活性的多酚类物质，具有抗癌沆肿瘤、降压降糖降斑脂、 抗蘩消炎等多静药憨功能，凌寇了箕蒸套羹大医学疆究徐缓。基藏生产瓣茶多酚产燕多 为魍产品，必须经过进一步的分离、纯化，其质量才能满足食品、医药行业的要求。本 实验以药用注射规格茶多酚产晶为目标，建立了茶多酚产品质量评价方法及进行了大孔 蔽辫褥嚣分离、缝亿荼多酚最优工艺条件静初步工作。透过比较没食予鼗、e c 、e g c g 三种标准娼与不同工艺生产的装多酚产品的高效液相图谱进行了定性分析，建立了高效 液相指纹谱对荣多酚产品的定性分析方法；以测定茶多酚含篷的豳家标准分光光魔法为 参照方法，速行了嵩锰酸镩漓定法、篱效滚裙法对茶多酚产照懿悫量分季厅，为两秽灏静 茶多酚定量方法的建立进行了初步探索。离效液相指纹谱定性方法、高锰酸锣滴定及高 效液相定量方法所得的结果具有致性、平行性，均为裁化型p o t 质量最差，样品p o t 2 、 p o t 3 覆量较佳，说瞬了方法静可雩亍槛。本论文还避符了大琵暖瓣楗器分离筑纯茶多酚 的初步工 乍，袋用正交试验建立了h p d 一6 0 0 型大孔吸附树脂作载体，水乙醇你溶剂 分离、纯化茶多酚的最优工艺条件：茶多酚样品溶解方式为水：乙醇= l ：3 ( 体积比) 、洗 脆液乙醇浓度7 0 、洗麟液流速5 m f m i a 。 关键词：茶多鼢；质量评价；犬孔吸附树脂；正交试验；最优纯化工蔑条件 a b s t r a c t t e ap o l y p h e n o l s ( t p ) a r eo n ek i n do fm a t e r i a l sw i t h g r e a tp h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e s ，s u c h a sa n t i c a n c e ro ra n t i t u m o r ，a n t i h y p e r l i p i d e m i aa n da n t i b a c t e r i a lo ra n t i v i r u s ，w h i c hd e c i d e s t h e i rg r e a tv a l u ei nm e d i c a lr e s e a r c h f o rt h em o m e n t ，t h e p r o d u c t so f t e ap o l y p h e n o l sa r e l a r g e l yc r u d e w h i c hm u s tb es e p a r a t e da n dp u r i f i e dt om e e tt h ed e m a n do f f o o do rm e d i c a l i n d u s t r y s o m er e s e a r c h w a sc a r r i e df o rt h e p u r p o s e so f g e t t i n gt e ap o l y p h e n o l s w i t hm e d i c a l i n j e c t i o ns t a n d a r dp u r i t y t h ep u r p o s ea l s oi n v o l v e sv a l u i n gt h eq u a l i t yo f t e ap o l y p h e n o l s a n df i n d i n go p t i m a lp r o c e s st os e p a r a t ea n dp u r i f yt e ap o l y p h e n o l s t h r o u g hc o m p a r i n gt h e c h r o m a t o g r a m so ft h es a m p l e sw i t ht h ec h r o m a t o g r a m so fr e f e r e n c e s ，t e ap o l y p h e n o l si s q u a l i t a t i v e l ya n a l y z e db yh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i d c l l r o m a t o g r a p h yf i n g e r p r i n t s t e a p o l y p h e n o l sa r ea l s oq u a n t i t a t i v e l ya n a l y z e db yt r i t r a m e t r y w i t hk m n 0 4 ，s p e c t r o p h o t o m e t r y a n dh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，w h i c hi st h eb a s i cr e s e a r c ho fb u i l d i n gt w o k i n do fn e wm e t h o d st o a n a l y z e t e a p o l y p h e n o l sq u a n t i f i v e l y t h ep a r a l l e l i s m a n d c o n s i s t e n c yo f t h ea n a l y s i sd a t as h o w st h ef e a s i b i l i t yo ft h em e t h o d s i nt h i sa r t i c l e ，b a s i c r e s e a r c ho f s e p a r a t ea n dp u r i f yt e ap o l y p h e n o l sb ym a c r o p o r ea d s o r p t i o n r e s i ni sc a r r i e d ，t o o o r t h o g o n a le x p e r i m e n t a l d e s i g n i sa l s o a p p l i e d t od e t e r m i n a t et h e o p t i m a l s e p a r a t i o n p u r i f i c a t i o np r o c e s sc o n d i t i o n s ，w i t h i t p d 一6 0 0 m a c r o p o r ea d s o r p t i o n r e s i na s c a r r i e r , h 2 0 e t h a n o l a ss o l v e n t sa n dt h e o p t i m a lp r o c e s s i sa sf o l l o w s ，t h es o n e n tt o d i s s o l v es a m p l e si sh 2 0 e t h a n o l ，a n dt h er a t i oi s1 ：3 ；t h ec o n c e n t r a t i o no fs o l v e n tu s e df o r e l u t i o ni s7 0 ；t h ev e l o c i t yo fe l u t i o ni s5m l m i n k e y w o r d s ：t e ap o i y p h e n o is ：q u alit ya s s e s s m e n t ：m a o r o p o r ea d s o r p t io nv e sin o r t h o g o n a ie x p e r i m e n t ：o p t i n l a l p u t i f i c a t i o np r o o e s s 登兰鍪鳖塞垄塞墨坌篓查鎏墨查i ! 鍪銎篓鍪鎏釜三茎釜堡堡垒墼登窒 第一章文献综述 一茶多酚讲究迸膝 茶是囊茶树( c a m e l l i as i n e n s i s ，由茶稃) 的缀叶帮芽奉l 成静饮辩h 1 ，它静绦健功 能自然与其化学成分密不可分。 茶酶纯学成分缀复杂，经蓬分离簦定浆己知纯合秘约鸯5 0 0 稀，其中有梳纯合兹有 4 5 0 种以上。构成这些化台物或以无机盐形式存在的基本元素，主鬻有3 0 种，占自然界 存在酶7 2 释元素懿4 1 6 6 ，帮碳、氢、簸、氮、磷、镶、硫、褥、镁、铁、键、镪、 锰、硼、锌、钼、铅、氯、氟、碱、钠、锚、镉、铬、镍、铋、锡、镀、钛、钒茶叶中 静讫学残分，除赣类、瑟转及类l 鬟穆凌、鬣鑫屡三大类锈凄努，冀继位台物都是二级筏 谢产物。三大自然物质在茶叶中的含量，糖类约占茶叶干物重的2 0 2 5 ，蛋白质约占 2 0 3 0 ，l 鬻蘩及类l 蓦豹鹱在茶时孛较多，约荛1 0 。二缀代滚产羧中，多酸类毒2 0 3 5 ，嘌呤碱占3 5 ，其他尚有芳香物质，色索【2 】。 荼中簸突塞懿壤分是装多聚( t e a p o t y p h e n o l s ，t p ) 。遗在十九避纪中咛，久翻就嚣 始了对茶叶中多酚类物质的研究。二十世纪中叶，多酚的提取、分离与鉴定等工作取得 迅速躲避篪。六十年最初，基本攀老擐鞠了荼时中含有大量的挠裁纯活瞧成分茶多酪； 六十年代末至七十年代初，中国农科院茶叶科学院、日本伊藤园中央研究院等国内外科 研枧稳最先扶茶时中分离成功；八卡年代甥期及申期，茶多酚的掇取方法及铡备技术有 了较大的进展，工业化逐步发展起来，茶多酚进入了实用阶段。尤其是最近二、三十年 来，多酚类非为秘天然抗氧化、抗细胞突变的嫩理活性成分，谯医药方面豹应用研究 进展很快。 1 ，1 茶多酚的绣成及，l 茶素的结构 茶多酚是茶叶中一粪含量较离，种类较多的多酚类秘痰，由三卡多种酚类耪震缝成， 按照化学结构的不同，可以分为四类：儿祭素类( c a t e c h i n s ) 、黄烷酮类( f l a v a n o n e s ) 、酚 酸类( p h e n o l i ca c i d s ) 和花酝甙及箕贰元( g l y c o s 猛s a n dt h e i ra g i y c o n so f p l a n tp i g m e n t s ) n 其 中儿茶索是茶多酚的主体，约占茶多酚总量的7 0 。 ，l 茶素静结鞫至少惫括有三个环核，跫2 一苯罄苯劳豫璃蘸黎生物。茶叶中握澈豹j b 茶多辫抟定性定量分辑方法及大孔强鬻树媵缒钝工艺条 孛拭诧的磺究 茶索般有以下几种化合物：儿茶綮( 拄a n s 一2 一 3 ，4 一d i h y d r o x y p h e n y l 3 ，4 d i h y d r o 1 2 h 。b e n z o p y r a n 一3 ，5 ，7 一t r i o l ，又名c a t e c h i n ，简称c ) 、焱j l 茶素( c i s c a t e c h i n ，又名e p i c a t e c h i n ，简称 e c ) 、没食子儿茶素( t r a n s 2 - 【3 ，5 ，7 - t r i h y d r o x y p h e n y l * 3 ，4 一d i h y d r o l 2 h b e n z o p y r a n 一3 ，5 ，7 一 t r i o l ，又名g a l l o c a t e c h i n ，简称g c ) 、寝没食予，l 茶素( c i s g a l l o c a t e c h i n ，又名e p i g a l l o c a t e c h i n ，简称e g c ) 、儿条素没食子酸酌( c a t e c h i n 一3 一g a l l a t e ，简称c g ) 、浅儿茶素没食予酸酯 ( e p i c a t e c h i n 一3 一g a l l a t e ，篱称e c g ) 、没食予l 茶素澄食子酸鼯( g a l l o c a t e c h i n 一3 一g a l l a t e ，篱 称g c g ) 、裳没食子儿茶素没食子酸酯( e p i - g a l l o c a t e c h i n - 3 一g l d l a t e ，简称e g c g ) 。其中含 量较多懿青六萃申，名称、缡襁螽鹜l - l 。 c ，e c ：r 1 = r 2 = h e c g ：r i = h ，鹣- - x x 一奄 g c ，e g c ：r 1 - - - - o h ，r 2 = h 潲：r i - - 溅，& = x 图1 - 1 l 茶索萃申类、结构 f i g u r e1 - 1c a t e g o r i e sa n ds t r u c t u r e so f c a t e c h h l s 1 11 儿茶素的几何异构 ，l 荟素靛c 繇楚瞧穰繇，其结梭不豫苯繇那样袭一个平嚣土，露多戳薄式稳象移在。 由于构成了六元杂环而阻碍了沿键的旋转作用，c 2 与c 3 上的不同的取代熬( h ，一o h ，- 苯 基) 瓣空阗位篷不因，霞秘缀了咒侮劈棱俸。在垂l 中c 2 上鸯- b 耀释一h ，c 3 上鸯一o r 2 和h ，若两个h 在环平面的同一侧，0 r 2 和一b 环在另一侧，即为顺式儿荣素，也称表 l 茶素。著涎令 至苓盔甄平嚣款淄一侧，胡0 t l - 2 n i 。b 巧不在同一测时，鄹为反式j l 茶 素。从茶叶中分离、鉴定的儿茶素多为顺式儿茶素，即表儿茶素，约占几茶索总量的7 0 左右。 1 1 2 儿茶豢的旋光异构 ，0 茶紊懿结橡中c ：帮c ，是两个不对稔族愿予，买毒浚毙洼，英毒4 个( 2 勺旋毙舅 2 鳌妻墼塑星整室墨叁篓互垄墨查整鍪壁塑! ! 整些三堇釜堡些些塑鐾窭 构体。在图1 中，r i = r 2 = h 时是袋儿茶豢，具有左旋光性能，以( ) 表儿茶素表承，其 旋先异构体有( + ) - 袭，0 茶索，( ) - ，茶素帮( + ) 。，l 荼索等。丽舞消旋体( 甸一，k 茶索嵇( 土) 一 表儿茶素都缺乏旋光性能，这是由于( + ) 一和( _ ) - 的旋光性能楣抵消而表现为外消旋。 1 1 3 儿茶素的构毅 儿荼素的掬型是由c 鞲上不对称碳鞭子连接嚣个不同基团静空间取商的不网两决 定的。作为参考标准的化合物是右旋的甘油醛，即( + ) - 甘油醛来 窜比较，右旋甘油醛为 d 构型，所以l 茶素结构中c 环上的c 3 不对称中心若具肖和d ( 十) 甘油鹾构型棚同的 不对称碳原子时，即为d 挺儿茶索。同理，几茶素结构中c 3 具有和l 一( 一) 一甘油醛稳葡的 不对髂碳暇子时即为l 型儿茶素。茶叶中儿茶素多为l 构型，d 构型的儿荼素很少。 根据实验测定可知：l 型，l 茶索均其祷左旋光性能，德多为顺式结构，鄄表，k 祭素。 丽d 型儿装素均舆有右旋光性能，且多为反式结构。这说明茶叶中儿茶素的构型与旋光 性能有着相互对应的关系。所l 三l 为了表示方便，将l 一( ) 一袭l 茶索 l 一( _ ) 一e p i c a t i c h i n 厢符 号l ( 一) - e c 表示，通常简化为l - e c 或( 9 - e c 。类似在酯裂儿茶索中，l - ( 一) * 表没食子儿 萘索漫食子酸酯 l - ( ) 一e p i g a l l o c a t e c h i ng a l l a t e ，鄯胃篱凭辩l - e g c g 或( 一) 一e c , - c g 簿。 ，2 茶多鼯的生理活像 12 。1 抗氯化性 抗氧化剂是一种重要的食品添加剂，它主要用于阻止绒延缓油脂的自劝氧化，还可 用于防止食品困载化两馒营养损失、褐变、褪色等。抗氧化剂广泛的应用于食品工业。 食鼎业目前主要使用入工合成的抗氧化剂b h a ( 丁基弪蘩茴香醚) 、b h t ( - - 丁基羟基甲 苯) 和p o ( 没食子酸页酯) 。丽7 0 年代以来，人们不断发现所用的合成抗氧化剂有一定的 毒性，这程食品行业中弓l 怒了对仡学合成涤加剂的安全髓越来越大的关注，发展煮全性 高的天然食品添加荆己是世界性的课题。而许多椴物中含荫的天然抗氧化成份，其毒性 远远低予人工合成的抗氧讫帮。开发稠掰天然撬筏诧裁疆成为巍今食蠡科学发袋豹趋 势。近年来，有关天然抗氧化作用的研究较多，但天然抗甄化物质一般因在植物体中含 羹较低，擒取工艺复杂、价格遥意，在实际应焉中还魄较少。茶时中多酚廷纯合物其畜 较强的还原剂，而且茶叶资源丰寓，是一种有着广阔开发前景的天然抗氧化剂。 1 2 ，1 1 抗氧亿佟用 酚类物质具泰较活泼的的羟熬氢，能提供氢质子。丽荣多酚般含商两个以上互为 茶多浆懿定矬定量分掇方法及丈我蹉瓣辑聪缝纯工艺条停恍仡豹磷竞 邻位的羟基，具有很强的供氢能力，因而照一手中理想的抗氧化剂。 c h a k r a b a r t y 等人研究发现觚茶叶中提取的茶多酚对予不饱和浦脂和不完全氢化的 油鼹有着良好的抗氧化作用，和常用的食品抗氧化荆b h a 、b h t 、p g 相比在延长花生 油、亚麻油及氢讫鼹肪的鸯效期方黼更为脊利。 t a n z i a w a 等人从茶鲜叶中提取了抗氧化物质，石并究表明儿茶素对亚油酸具有最大的 抗氧化作用，使用浓度可为b h a 瓣5 0 。 l e em i n h s i u n g 等人分别用乙醇、丙酮、乙醚、正己烷从绿茶中萃取抗氧化物质， 褥率分剐为2 89 、6 5 、l4 耱2 4 。乙醇、嚣醺的萃取物对大豆涵鸯臻显浆藐氧讫牲。 乙醇的萃取物还对花生油、玉米油、棕榈油、猪油有着明照的抗氧化作用。 陈瑞锋等霜绿茶嗣备茶革宁 e g c g e g c e c 。 a h m a d 等研究了茶多酚对某些皮肤促瘤剂和n o 合成酶关系的影响。n o 合成酶可 诱导形式的升调节和n o 的合成增加在许多病理情况下发生，与炎症反应有关。在 s e n c a k 小鼠中外用皮肤促瘤剂( 可产生炎症反应) 对n o 合成酶产生调节作用。佛波 型促瘤剂( 如t p a ，m e z ) 比非佛波型促瘤剂( 如，二羟基葸酚，n - d o d e c a n e ，苯甲酰过 氧化物，o k a d a i c 酸) 对n o 合成酶有更强的抑制作用。茶多酚有较强的抗氧化活性，预 处理皮肤可完全逆转这种效应。 h u 等研究了外用e g c g 对t p a 诱导的小鼠皮肤癌基因表达的影响。给小鼠皮肤单 用1 0 n m o l t p a 4 h 后o d c 基因、p k c 基因和c m y c 基因的转录水平显著增加，前l h 外用 e g c g ( 1 或5 pm 0 1 ) 呈剂量依赖性抑制了t p a 诱导的上述基因的表达。 绿茶和茶多酚对烟草特异性亚硝基胺n n k 4 一( m e t h y l n i t r o s a m i n o ) 一1 一( 3 - p y r i d y l ) 一l b u t a l o n e 诱导的肺肿瘤发生产生抑制作用。 f l u 等研究了茶对n n k 诱导的小鼠肺癌基因表达的影响。给小鼠腹腔注射1 3 m g k g 体重的n n k ，每天1 次3 d 并给予2 茶水。4 周和8 周后，n n k 处理的小鼠肺组织有高 水平的c r a f ，c m y c ，c h - r a s 癌基因的表达，茶水分别抑制其5 0 ，2 0 并1 15 0 的表达。 日本学者k a r l 等研究了茶多酚对雄性大鼠l ，2 一二甲基肼( d m h ) 诱导的结肠直肠 致癌作用的影响。皮下注射d m h 2 0 m g k g 体重，每周1 次共1 4 周。分成三组：第一组 给自来水；第二组o 1 4 周给自来水，1 5 3 5 周给0l 茶多酚；第三组给01 茶多份。 第3 5 周处死大鼠，无菌分离盲肠内容物并镜下检查细菌数量和结肠直肠肿瘤。发现后两 组肿瘤发生率显著降低，盲肠内容物中产气荚膜梭状芽孢杆菌( 可产生致癌有害物) 数 量下降。 y u 等发现茶多酚在质粒构建转染的人h e p t o m ah e pg 2 细胞中诱导出氯霉素乙酰 转移酶( c a t ) 活性。由于该质粒含有一个抗氧化反应元件( a r e ) 和一个与c a t 报道 基因相连的最小谷胱甘肽硫转移酶y a 启动子，说明茶多酚可通过a r e 刺激p h a s e 口脱 毒酶的转录。为探讨引起基因表达的上游信号通道，他们还研究了分裂素激活蛋白激酶 ( m a p k s ) ：细胞外信号调节激酶2 ( e r k 2 ) 和c i u nn 端激酶1 ( j - n k l ) 。用不同浓度 7 茶多酚的定性定量分析方法及大孔吸附树脂纯化工艺条件优化的研究 茶多酚处理h e pg 2 细胞后，e r k 2 得到有效激活，j n k l 也得到激活，但程度稍弱。动力 学研究表明j n k l 的激活慢而持久，e r k 2 的激活迅速而短暂。逆转录酶联p c r 发现茶 多酚也增加早中期c j u n 和c f o s 的m r n a 水平。这些结果提示茶多酚可能通过m a p k s 的刺激作为信号通到来激活a r e 依赖性基因。 此外，f i l a 等还发现e g c g 还可直接与某些致癌物( 如亚硝酸盐) 反应，削弱其致 癌效应。 h i r o s e 等用1 z - 甲苯并蒽处理7 周龄雌性鼠建立乳腺癌模型，用1 儿茶素于致癌 物处理的同时或处理后1 周喂饲实验大鼠，大鼠的存活时间显著延长。同样，绿茶儿茶 素抑制氨甲基咪唑吡啶对f 3 4 4 雌性大鼠乳腺癌的诱发作用，提高其存活率。 n i s h i d a 等人研究表明0 15 绿茶几茶素可抑制诱癌物( d e n ) 和促癌物( p b ) 的致 肝癌作用，促癌前病苄的酶变灶数目、总面积显著低于单纯致癌物组，对实验性肝癌形 成的启动和促进阶段均有明显抑制作用。c 3 h n e n c r j 小鼠饮用o 0 5 和0 i e g c g 后其 自发性肝癌发生率降低，每鼠自发性肝肿瘤的平均数目减少。 122 2 降压、降糖、降血脂和抗动脉粥样硬化 血浆脂质与动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e o r s i s ，a s ) 的发生关系密切低密度脂蛋白( l d l ) 可致a s ，而高密度脂蛋白( h d l ) 则起拮抗作用。载脂蛋白缺乏和异常可影响血脂的运 输和代谢，l d l 的氧化修饰可使血管内皮受损，胆固醇沉积于血管壁而发生a s 。流行病 学调查发现食物中天然多酚含量与冠心病发生率有密切关系。茶叶中含有丰富的多酚类 物质，可通过调节血脂代谢、抗凝促纤溶及抑制血小板聚集、影响血液流变学特性等多 种机制从多个环节起抗a s 作用。 原征彦用粗儿茶素以o 5 的数量加入能诱发高血压的m 粉末饲料作为试验组饲喂 雄鼠，1 5 周龄后对照组测量血压升至2 7 9 9 7 k p a 以上，而试验组都在2 66 6 4 k p a 以下， 差异明显。铃木健夫指出，人体肾脏的功能之一是分泌有使血压增高的“血管紧张素i i ” 和有使血压降低的“舒缓激肽”，以保持血压的平衡。促进这两类物质转换的酶是血管转 化酶( a c e ) ，当a c e 活性过强时，血管紧张素i i 增加，血压就上升，而茶儿茶素具有 较强的抑制a c e 的作用。v a l s a sak 等也指出茶儿茶素能通过络合a c e 的金属辅基锌 离子而抑制a c e 的活性，达到降压的目的。e g c 、e g c g 对自然高血压大鼠有降低血压 的作用，试验组血压比对照组低1 4 1 7 。动物实验发现茶儿茶素能降血糖，增加肝 糖元的合成，减少其分解，1 0 m g ( k g d ) 时降糖作用最大，超过这个剂量活性下降。另有 报道【9 茶多酚能降低家兔血压，使大鼠后脂灌注液流出量增加。说明茶多酚能降低外周血 茎兰塑塑星丝重墨坌塑互鎏墨奎! ! 堕堕垫塑塾垡三茎釜堡垡些塑婴塑 管阻力，直接扩张血管。茶多酚还通过促进内皮依赖性松弛因子的形成，松弛血管平滑 肌而起抗高血压作用。 i s j o g a l ( i 等用大鼠研究了绿茶粗儿茶素( 9 0 ) 对其体内和肝内脂肪积累的影响，结 果表明肝内和体内脂肪含量随儿茶素的增加而减少，特别是添加食物中l 儿茶素减少更 明显。另一组试验通过添加0l 儿茶素喂养3 个月，处理和对照组间体重无明显差异， 但处理组体内和肝内的脂肪含量显著减少，几乎达到正常组水平。 另有研究【”1 表明茶多酚能降低血甘油三酯( t g ) 、胆固醇( c h ) 及低密度脂蛋白胆 固醇( l d l c ) ，降低载脂蛋白a p o b l 0 0 和升高a p o a l ，影响l d l 的氧化修饰等。 动脉粥样硬化( a s ) 和血栓的产生与花生四烯酸代谢关系密切。血小板中存在1 2 一 脂氧合酶同过中膜平滑肌运输可产生引起a s 和过敏性疾病的物质1 2 一羟二十碳四烯 酸( 1 2 - - 髓t e ) ，环氧合酶可使花生四烯酸代谢形成凝血恶烷，进而促使血小板凝聚以 致出现血栓。茶多酚等天然多酚化合物可抑制1 2 一脂氧合酶和环氧合酶，改变花生四烯 酸代谢，增加前列腺环素，减少血栓素合成而起抑制血小板聚集、抗凝和促纤溶作用。 动物实验和临床观察发现茶叶能全面降低血液粘度，改善血液高粘状态，防止局部血栓 形成【”1 。 s a g e s 栅等用雄性日本白兔血浆经离心制得实验用血小板，利用e g c g 测定抗凝实 验，结果表明，当e g c g 在浓度为02 m m l 时能够完全抑制胶原引起的血小板凝聚，从 i c 5 0 值来看它的效果与阿斯匹林相当。n a m i l ( i 等也证实这一结果，并证实e c 、e g c 、e g c g 均具有较强的抗血凝作用。 福真弓等利用w i s t a r 系雄性自鼠饲喂高脂胆固醇饲料，利用添加e g c g 观察实验， 结果表明，e g c g 具有很强的抑制血浆及肝脏中胆固醇含量上升的作用，具有促进脂类 及胆汁酸从粪便中排出的效果。 y a m a g u c h i 等【1 0 l 对小鼠饲喂致动脉粥样硬化的食物( 如1 5 胆固醇，o5 胆酸，5 亚油酸) 饲喂1 4 周得高脂血症和肝及主动脉中高脂积累的小鼠，通过饮用水中按5 0 ，1 0 0 ， 2 0 0 m ( b d ) 给以绿茶提取物，结果表明，实验开始6 周后处理组体内血清胆固醇减少， 而且血脂过氧化物的增加随绿茶提取物的用量增加收到显著抑制。 肃伟祥等利用茶多酚对饮食性高脂大鼠的降血脂作用研究表明茶多酚对肝脏和血清 中胆固醇有显著的抑制作用，当茶多酚浓度为0 1 6 时对甘油三酯也有较强的抑制作用。 楼福庆通过实验和临床研究表明，以多酚类物质为主的化学物质具有抗凝，促进纤 溶，阻止血小板粘附和沉积，减少主动脉壁中胆固醇含量等作用，因此可预防动脉粥样 硬化。 垄兰墼塑塞垡塞墨坌塑垄鲨墨查! ! 堡堕塑! ! 丝些三茎墨竺垡些塑竺壅 程秀娟等给大鼠为茶黄烷醇o 1 4 0 2 9 d ，共7 5 d ，结果表明，给药组与高胆固醇所致 的动脉硬化模型组相比，茶多烷醇可使动物的血总脂、胆固醇和磷脂含量明显降低，前 口脂蛋白电泳值降低，血小板最大聚集波明显降低，观察到动脉硬化范围减少，厚度变 薄，心肌血管阻塞程度减轻。 122 3 抗菌、消炎、抗病毒 茶叶中的e g c 和e g c g 对伤寒杆菌，副伤寒杆菌，黄色溶血性葡萄球菌、金黄色链 球和痢疾等病原细菌具有明显的抑制作用，宋善瑾等采用杯碟法，茶多酚( 9 0 ) 对福氏 痢疾杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、副伤寒杆菌、大肠杆菌进行抗菌活 性测定，结果表明茶多酚抗菌活性比黄芩索强，抗菌谱也比黄芩索广。 s h i m a m u r a 研究表明茶儿茶素能够抑制霍乱毒素，霍乱血溶素，溶血弧菌( b r i o p a r a h a r e m o l u t i c a s ) 溶血素以及金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r 0 1 1 s ) 一毒素的活性， 还可抑制流感a 型和b 型病毒的感染，建议用于临床。 a l a n 等进一步用e c 、e g c 、e c g 、- | = _ c 、g c 、e g c g 等6 种单一成份对a t c c l 3 1 2 4 型株系产气性荧膜梭菌( c l o s t f i d i u m p e r i f i n g e n s ) 和a t c c 9 6 8 9 型困难梭菌( c d i f f i c i l e ) 的抑菌效应，结果表明，5 m g e c g 或e g c g 均能有效抑制困难梭菌的生长，但其他4 种 则无效，5 m g e c g 或e g c g 能强烈抑制产气性荧膜梭菌生长，除( 一) e g c 无效外，+ c 、 ( 一) e c 和g c 抑制效果中等。 茶儿茶素能抑制细菌葡萄糖基转移酶，减少葡萄糖的生成量，影响变形链球菌的生 长。而且随着浓度的上升，对变形性链球菌的生长抑制越明显。变形性链球菌是主要的 致龋菌，s u c h i y a 研究发现茶儿茶素可以降低龋齿的蚀斑，对牙齿有保护作用。 茶儿茶素有抗炎效应。y a n g 等研究表明绿茶儿茶素e g c g 能降低紫外线辐射造成的 皮肤炎症和白细胞的渗出。肿瘤坏死因子( n 吓一n ) 在炎症中起了重要作用。n f k b 为一种对氧敏感的核转录因子，控制着多种基因包括n 旺一a 基因的表达，茶儿茶素能 降低脂多糖诱导的n 师一d 含量，同时可抑制r a w 2 6 4 7 细胞的n 旧一nm r n a 的表达 和n f k b 活性使n 师一a 基因表达降低而达到的。c h a r t 等认为在慢性炎症中，细胞因 子诱导产生n o ，e g c g 能抑制脂多糖( l p s ) 诱导的小鼠腹膜炎细胞产生的亚硝酸盐。 另有报道，茶儿茶素能抑制诱导型n o 合成酶基因的表达和酶活性，提示可能是其抗炎 机制之一。 茶多酚不仅对细菌有较强的杀菌抑菌作用，而且对某些病毒有抑制作用。o n o k 等研 究表明e c g 和e g c g 对人体免疫缺陷病毒( 艾滋病毒，m v 一1 ) 逆转录酶具有强烈的 茶多酚的定性定量分析方法及大孔吸附树脂纯化工艺条件优化的研究 抑制作用。而在筛选抗h i v 的药物中发现e g c g 的抑制作用比治疗h i v 的首选药a z t 的三磷酸化合物a z t t p 还要强。动力学研究表明，e g c g 是m v 逆转录酶底物d t t p 的 非竞争性抑制剂，是模板( r a ) 、( d t ) 1 2 一1 8 的混合型抑制剂【1 1 1 。 1 2 2 4 抗衰老 王志远等用绿茶中的茶多酚和e g c g 处理小鼠后，发现可以抑制皮肤线粒体中脂氧 合酶和脂质过氧化作用，起着抗衰老的效应。n a k a n o 等利用w i s t e r 大鼠实验结果与之相 似，认为儿茶素可使细胞色素氧化酶活性提高，因此在年龄较老的动物体内线粒体活性 可以维持较高水平，这样对预防衰老有调控效应。y a n g 用茶多酚抗衰老实验表明，该类 化合物可增强肝脏中还原谷酰甘肽过氧化酶和超氧化物歧化酶的活性，降低肝脏和血清 中脂质过氧化物酶活性并延迟脂褐脂的形成。人们服用v c 、v e 等抗氧化活性的化合物可 以具有增强抵抗力，延缓衰老的作用，据室内研究表明，2 0 p p m e g c g 的抗氧性明显优于 2 0 0 p p m v e 和5 0 p p m b h a ，且与、k 、v e 有增效效应。一旦将茶多酚在机体内的抗氧效果 得到进一步证实，其作为抗衰老药物为时不远了。 1 22 5 其他作用 茶儿茶素具有抑制口臭的效果，宇井美树等研究表明，添加1 0 m g 几茶素对甲基硫 醇消臭率达6 2 ，l m g 儿茶素消臭率也可达4 5 ，而l m g 叶绿酸铜钠只能消臭8 ，且 几种儿茶素消臭效果e g c g e g c e c g e c 。茶多酚还具有护齿、固齿、坚齿的效果。 茶多酚具有抗过敏功效，s u g i y a m a 等利用e c 、e g c 、e c g 、e g c g 对化合物4 8 8 0 诱导大鼠肥大细胞组胺释放的抑制作用，结果表明，o 1 o 1 5 m g m l 的e g c 和e g c g 能 强烈抑制组胺的释放作用。6 0 抑制浓度的e c g 、e g c 、e g c g 比目前常用的抗过敏药 t r a n i l a s t 的抑制效果分别强2 倍、8 倍和l o 倍。m a t s u o 等也发现茶儿茶素能抑制大鼠腹 膜渗出细胞释放的白三烯和组胺，e o c g e c g e g c ，这些结果提示茶几茶素可能参与 抗过敏反应。 a u c a m p 等研究表明茶儿茶素因抑制黄嘌呤氧化酶减少尿酸形成，可用于治疗痛风； y o n e d a 等研究表明绿茶儿茶素的清除自由基作用可降低癫痫大鼠的感觉运动皮层中氧化 产物的增加，同时可增加过氧化培养中s o d 的活性，提示可预防癫痫；m a t s u o k a 报道了 茶儿茶素能改善小鼠脑缺血再灌注后自由基引发的学习记忆功能和保护培养的新生小鼠 脑细胞兔受葡萄糖氧化酶诱导死亡；儿茶素还能中止自由基氧化链，提高机体酶活力， 对抗辐射作用“1 。茶多酚还能作用沉淀生物碱和重金属盐中毒的抗解剂。 茶多酚的定性定量分析方法及大孔吸附树脂纯化工艺条件优化的研究 1 3 茶多酚的提取制备工艺研究 1 31 溶剂萃取法 溶剂萃取法的原理是茶多酚易溶于或可溶于水、乙醇、乙醚、正丁醇、乙酸乙酯等 溶剂，利用此点将茶多酚从茶叶中提取出来。其大致工艺流程如图1 2 ： 浸提浓缩 茶叶卜浸提液+ 浓缩液 醚相卜色素 水相 水相一 水相 溶剂回收 茶多酚一酯相 氯仿相 咖啡因 水相 图1 - 2 溶剂萃取法工艺流程 f i g u r e1 - 2p r o c c s so f s o l v e n t e x t r a c t i o n 自六十年代初日本学者探明茶叶中含有大量的抗氧化活性成份一茶多酚以来各国学 者就对该法作了深入研究。至八十年代初期及中期，该法工艺已有了较大发展，并进入 工业化生产阶段。葛宜掌等曾综述过六十年代至八十年代有机溶剂提取茶多酚的工艺【l ， 见表卜l ： 虽然该法工艺较成熟，生产量大，设备要求低，己进入工业化生产阶段。但该法存 在着严重不足，其缺点在于：工序多，工艺复杂，大量使用了包括氯仿有毒试剂在内的 有机溶剂，影响产品安全性；溶剂回收能耗大，成本高，且易造成环境污染；茶多酚受 热时易发生氧化、聚合、缩合等反应，影响其抗氧化活性，并且有效成份含量和提取率 低，仅能获得粗产品，若需较高纯度的茶多酚，还需经过精制。为此，近十多年来，不 少研究工作者对此法又作了许多研究工作，以进一步改进、完善该法，尽可能用简单、 有效的方法提取茶多酚。 张克钦等l 。1 先用甲醇萃取茶粉，萃取液减压蒸馏，回收甲醇，粗提取物溶于水，用 正己烷萃取，正己烷层回收溶剂，弃去残渣。水层再加入氯仿萃取，氯仿层回收溶剂， 弃去残渣。水层再用非极性溶剂萃取，有机层回收溶剂获得提取物。 茶多酚的定性定量分析方法及大孔吸附树脂纯化工艺条件优化的研究 h a r a ，m a s a h i k o 等1 1 5 j 将l k g 茶叶先用l o l 9 0 热水浸提1 h ，再将8 3 l 提取液浓缩至 l l ，n ；0 n z 1 l 丙酮，离心分离，再用1 l 乙酸乙酯萃取，冷冻干燥，得到9 7 9 茶多酚， 纯度6 0 。 表1 1 溶剂萃取法工艺 t 抽l e1 1p r o c e s so f s o l v e n t e x t r a c t i o n 编号开发年份开发者工艺方法主要原料 李新生等【1 6 1 将2 0 9 粉末状绿茶和1 4 0 m 1 8 5 乙醇溶液，加热回流，搅拌6 h 。抽滤， 所得滤渣同法用8 5 乙醇再提取2 次。三次滤液合并，蒸除乙醇，用等量氯仿洗蒸馏液 两次，水层用二倍的乙酸乙酯萃取两次。蒸除乙酸乙酯，真空干燥得3 5 9 黄绿色固体， 提取率1 75 ，纯度7 5 。 袁珂f ”将茶叶研碎加入i o 倍量7 5 7 , 醇冷浸提取两次，每次2 4 h 。抽滤，合并提取 液，于5 0 6 04 c 真空薄膜浓缩，浓缩液中加入一定量去离子水搅拌以除去叶绿素及油脂 类，冰箱中放置过夜，将上清液转移出，继续真空浓缩至体积减半，再乙酸乙酯少量多 次萃取后，减压回收溶剂后真空干燥得到成品。 熊何建等【”1 将茶叶用8 0 乙醇水溶液在5 06 c 恒温浸提两次，每次3 0 m i n ，真空浓缩 浸提液，采用独特的t 3 5 2 复合物溶液脱色、乙酸乙酯提纯、柠檬酸水溶液洗脱咖啡因的 董兰塑塑塞丝塞量坌堑查堕墨查塾坚堕塑! ! 丝垡三茎墨堡些些塑竺塑 工艺操作，克服了传统工艺中利用有毒化学试剂分离纯化茶多酚的缺点。减压浓缩回收 乙酸乙酯，真空低温干燥，茶多酚得率1 3 0 0 ，纯度9 64 2 ，其中e g c g 含量明显提 高，咖啡因含量则显著降低。 。 近几年来，鉴于诸多提取工艺均为单成份单独提取，其余均作为废物未加以利用， 又有不少研究工作者提出了茶叶中有效成份综合提取工艺，以利工业化生产。吴明光等i ”1 采用溶剂分步萃取法( 多阶式分步提取) 相继提取出咖啡因、儿茶素、叶绿素。用稀甲 醇水溶液将茶叶粉末浸泡并充分搅拌，提取液在旋转蒸发浓缩器中减压浓缩，蒸去甲醇， 残留液用二氯甲烷萃取并浓缩成糖浆状，然后硅胶柱层析并用丙酮一二氯甲烷洗脱，洗 脱液减压浓缩至干，再升华精制得到咖啡因。上述二氯甲烷萃取后的水溶液用乙酸乙酯 萃取并浓缩至于，加适量水加热溶解后，用s e p h a d e sl h - 2 0 吸附，然后用一定浓度的丙 酮水溶液洗脱，洗脱液减压浓缩，回收溶剂，冷却，过滤，真空减压干燥，得到儿茶素 混合物。而经甲醇水溶液提取后的茶叶残渣，用氯仿浸泡提取，过滤，滤液加入5 0 甲 醇水溶液，分离甲醇水溶液，氯仿层溶液浓缩至干，加入乙醚一石油醚充分搅拌溶解提 取，提取液浓缩，冷却过滤，干燥得到叶绿素。 汪东风等【2 叫则采用溶剂多阶式分布提取法，研究了在提取茶多酚和咖啡因后的废液 中再提取茶多糖，大大降低了各成分的提取成本，同时提高了各成分的纯度。 姜爱莉等【2 1 1 同样采用溶剂分步萃取法，取乙醇、氯仿、乙酸乙酯作为萃取剂，制得 荼多酚、咖啡碱，脂多糖及茶氨酸。 132 离子沉淀法 热水过滤金属离子 茶叶卜浸提液+ 滤液卜 埕提沉淀 水相 溶剂 茶多酚i 一有机相 回收 滤液( 含咖啡因) 酸 沉淀- 溶液 图1 - 3 离子沉淀法工艺流程 f i g u r e1 - 3p r o c e s so f i r o n sp r e c i p i t a t i o n 1 4 礼 一一茎兰墼堕星堡塞鲎坌堑查鲨墨查墨堕塑堕丝些王篓墨壁垡些箜墅塞 该法豹原联楚萘多酚在定的介质中，与菜些无机蓠子形成沉淀富集荼多酚，经转 溶群瘸畜枧溶裁攀取。工艺濂程翔匿l 一3 。 该法减少了有机溶剂尤藏是氯仿有毒物质的使用鬃，简化了工蕊，缩短了生产周期， 降低了能耗，生产成本减少。 最麓该法搜璃重金嚣褒予( 热p b ”、c u 2 一) 与j l 茶豢澎或滠淀，囊予耋金鬟襄予毒 性较大影响产懿质量，逐步被毒性较小、廉价易得的c 矿、m 9 2 + 、a i 针、z n 2 + 等沉淀剂所 取代。 葛宣掌等 描l 罄评述了表1 - 2 中的三静方法，指出方法l 中使用p b 、c u 等有毒攫金属 表1 - 2 离子沉淀法工艺 t a b l e1 - 2p r o c e s so f i r o n sp r e c i p i t a t i o n 编鸶秀发年傍秀发者工艺方法茶多黔含量( 产箍注装 碱式盐作沉淀荆，给产品的蜜全性带来影响，且沉淀剂的价格比较踊贵，缺乏嫩命力。 方法2 中用c a ( o h ) ：作沉淀剂，虽然沉淀剂价格低廉，但属碱性，灏茶多酚在碱性介质 中缀易氧纯威溅类物震，c a ( o h ) ：不是囊惑翡沉淀赛l 。方法3 中趸秃簿、豢债荔褥熬莲釜 离子c a ”、m g 孙、a 1 3 + 、z n 2 + 为沉淀荆，在酸性或中性条件下提取荣多酚，茶彩酚无氧 化损失，因而较有前途。 葛宣掌等还雷次采髑a i c h 沉淀法攫取茶多酚：于绿茶末中，翻入6 绩鬃龅1 0 0 沸水搅拌浸掇3 0 r a i n 。过滤后的提取液加入适量的a l c l 3 ，用1 m o t l n a h c 0 3 调p h 至 茶多酚沉淀完全后离心分离。沉淀用4 6 m o l f l 盐酸转溶后用等体积的乙酸乙酯萃取， 激缩聪溶剂后经真空干燥，即制得近白色的粗晶体茶多鼢。 葛宣掌等1 还营摄遵菇黉子c a 2 、m 9 2 一、b 矿、f 矿+ 、z f + 、a 1 3 + 滋淀法挺取茶多羧， 结果表明在相同口h 时6 种离子对茶多鼢的沉淀率大小顺序为a 1 ”z n 2 + f e ”m 9 2 + b a 2 + c a ”。文誊还研究了沉淀剂提取茶移酚的最佳p h 值，讨论了调节p h 值用的碱性 溶液蹲提取率豹影璃。 133 柱分离法 由于有机溶剂萃取法和离子沉淀法各自的缺点，研究工