（分析化学专业论文）发夹型dna荧光探针设计新方法研究.pdf

t 套 d 、 n e wm e t h o d sf o rt h ed e s i g no f h a i r p i nd n a f l u o r e s c e n tp r o b e s b y z h o u w e n y u b e ( b a o j iu n i v e r s i t yo f a r t sa n ds c i e n c e s ) 2 0 0 8 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e l n a n a l y t i c a lc h e m i s t y i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r a s s o c i a t ep r o f e s s o rl ij i s h a n p r o f e s s o ry a n gr o n g h u a m a y ，2 0 1 1 舢9洲0川3 m，0川9川jly ，玩 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所耿得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 习主玉 日期：如j 年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“、”) 日期：2 0 11 年6 月2 日 f 1 期：2 0 1 1 年6 月2 日 发夹型d n a 荧光探针设计新方法研究 摘要 随着第一台核酸合成仪的诞生和d n a 化学合成、标记技术取得的重大突破， 核酸分子探针的应用得到了飞速发展。由于核酸探针设计简单、稳定性好、易于 合成、信号转导机制灵活，因而被广泛的应用到化学、医学和生物学等领域。至 今，核酸探针已经发展出许多类型，如经典的r n a 探针、c d n a 探针及基因组 d n a 探针等，新型的阴阳探针、t a q m a n 探针、p a d l o c k 探针、核酸识体( a p t a m e r ) 探针、分子信标探针等。自从t y a g i 和k r a m m e r 于1 9 9 6 年发明分子信标探针以 来，发夹型的核酸探针作为一种高选择性和高灵敏性的新型荧光探针得到了广泛 的应用。随着对发夹型核酸探针研究的深入及新型发夹型核酸探针的出现，人们 发现发夹型核酸探针不仅适用于体外蛋白质和核酸的分析，同样也适用于活体分 析。它还可以用于核酸与药物小分子、蛋白质等相互作用的研究，是一种极好的 研究核酸与蛋白质相互作用的工具，也是一种极具发展前景的新型核酸探针。发 夹型核酸探针与传统的核酸探针相比，能很好的分辨单碱基错配，且能用于实时 监测。核酸探针的标记物有生物素、放射性物质和荧光基团等。其中，荧光分子 标记由于对生物分子影响较小、灵敏度高、且分析检测手段简单，成为最常用的 标记物。本论文着眼于发夹型d n a 荧光探针新方法的研究，主要开展以下三个 方面的工作： ( 1 ) 基于时间分辨荧光技术，设计了一种利用铕离子配合物作为荧光基团的 发夹型荧光探针。由于铕离子配合物的荧光寿命长，用于生物样品检测时能有效 消除背景荧光，提高了探针检测的灵敏度。 ( 2 )基于汞离子与d n a 的t 碱基的特异性结合作用和荧光共振能量转移 ( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) ，设计了以t - h 9 2 + t 结构为茎部的 发夹型d n a 荧光探针，并用此d n a 荧光探针实现了生物硫的高灵敏度检测。 ( 3 )基于一些杂环荧光小分子能与d n a 缺失位点中的碱基形成氢键结合的 特性，设计了一种免标记发夹型荧光核酸探针，考察了这种核酸探针的实验条件， 并对其合理性进行了验证。 关键词：发夹型d n a ；核酸探针；荧光共振能量转移；脱碱基位点；时间分辨荧 光 l i 毫 a bs t r a c t w i t ht h eb i r t ho ft h ef i r s tn u c l e i ca c i ds y n t h e s i sa n dd n a c h e m i c a ls y n t h e s i s ， m a r k e r sg e tb r e a kt h r o u g h ，an u c l e i ca c i dm o l e c u l ep r o b eh a v ed e v e l o p e dr a p l d l y b e c a u s et h en u c l e i ca c i dp r o b ei ss i m p l ei nd e s i g n ，g o o ds t a b i l i t y , e a s ys y n t h e s l s ， s i g n a lm e c h a n i s mf l e x i b l e ，b yw i d e s p r e a da p p l i c a t i o n t oc h e m i s t r y ，m e d i c i n ea n d b i o i o g y ，e t c s of a r ，m a n yt y p e so f n u c l e i ca c i dp r o b eh a sd e v e l o p e d ，s u c ha sc l a s s l c u c l e i ca c i dp r o b ei n c l u d i n gr n ap r o b e ，c d n ap r o b e sa n dg e n o m i cd n a p r o b ee t c ， t h en e w s t y l en u c l e i ca c i dp r o b ei n c l u d i n gy i ny a n gp r o b e ，t a q m a np r o b e ，p a d l o c k p r o b e ，a p t a m e rp r o b e ，m o l e c u l e sb e a c o np r o b e ，e t c s i n c et y a g ia n dk r a m m e ri n v e n tt h em o l e c u l a rb e a c o np r o b ei n 19 9 6 ，h a i r p i n n u c l e i ca c i dp r o b ea sah i g hs e l e c t i v i t ya n dh i g hs e n s i t i v i t yo f n e wf l u o r e s c e n tp r o b e b e e nw i d e l vu s e d a l o n gw i t ht h ef u r t h e rr e s e a r c ho fh a i r p i nn u c l e i ca c i dp r o b ea n d t h ee m e r g e n c eo fn e wt y p e sh a i r p i nn u c l e i ca c i dp r o b e ，p e o p l ef o u n dh a i r p i nn u c i e l c a c i dp r o b en o to n l ya p p l i c a b l ei nt h ea n a l y s i so fp r o t e i na n dn u c l e i c a c i di nv i t r o ，a l s o s u i t a b l ef o rl i v i n ga n a l y s i s i tc a na l s ob eu s e dt oa n a l y tt h ei n t e r a c t i o no fd r u gs m a u m o l e c u l e s ，p r o t e i na n dn u c l e i ca c i d ，i ti s ap o w e r f u lt o o lt or e s e a r c hn u c l e i ca c i da n d p r o t e i ni n t e r a c t i o n ，a l s oi s ak i n do fe x t r e m e l yp r o m i s i n gn e wn u c l e i ca c i dp r o b e c o n t r a c tw i t ht r a d i t i o n a ln u c l e i c a c i dp r o b e ，t h eh a i r p i np r o b ec a nb e u s e di n d e t e c t i n gs i n g l e b a s em i s m a t c ha n dr e a l t i m em o n i t o r i n g t h en u c l e i ca c i dp r o b e m a r k e ri sb i o t i n ，r a d i o a c t i v es u b s t a n c e sa n df l u o r e s c e n c eg r o u p ，e t c a m o n gt h e m ，t h e f l u o r e s c e n ts i g n a li sl e s si n f l u e n c eo fb i o l o g i c a lm o l e c u l e s ，h i g hs e n s i t i v i t y a n d s i m p l e b e c o m et h em o s tc o m m o n l ym a r k e r s t h i s p a p e rf o c u s o nh a i r p i nt y p eo t d n af l u o r e s c e n c ep r o b en e wm e t h o dr e s e a r c h ，m a i n l yi nt h ef o l l o w i n gt h r e e a r e a s ： b a s e do nr o o m t e m p e r a t u r ep h o s p h o r e s c e n c e ，d e s i g n e dah a i r p i np r o b e w h i c h u s i n ge u 3 + i o nc o m p l e x e sa sf l u o r e s c e n c eg r o u p d u et ot h ee u 3 十i o nc o m p l e x e s 。h a v e a1 0 n gl u m i n e s c e n c el i f e t i m e ，w h e nu s e di nb i o l o g i c a ls a m p l e sc a n e f f e c t i v e l yr e d u c e t h eb a c k g r o u n d ，i m p r o v e st h es e n s i t i v i t y 。 b a s e do nm e r c u r yi o nc o m p e t i t i v el i g a t i o na n df l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r ( f r e t ) ，d e s i g n e dah a i r p i np r o b ew h i c hu s e dt h e s t r u c t u r eo ft h 9 2 + - tf o r s t e m a n di ti su s e dt od e t e c t i o nb i o l o g i c a ls u l f u rw i t hh i g hs e n s i t i v i t y b a s e do ns o m eh e t e r o c y c l i cf l u o r e s c e n c es m a l lm o l e c u l e s c a ni n s e ti na b a s i cs i t e ， d e s i g n e dal a b e l f r e eh a i r p i n f l u o r e s c e n c en u c l e i ca c i dp r o b e ，a n di n v e s t i g a t e d i i i 一 ， 硕士学位论文 目录 学位论文原创性声明和版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t i i i 第1 章绪论1 1 1 荧光核酸探针1 1 1 1 t a q m a n 探针1 1 1 2 阴阳探针2 1 1 3 相邻探针3 1 1 4 核酸适体荧光探针3 1 2 发夹型核酸探针4 1 2 1b r e a kl i g h t 探针5 1 2 2l u x 探针5 1 2 3 分子信标6 1 3 本论文的选题依据及研究内容1 1 第2 章基于e u 3 + 长寿命的发夹型荧光核酸探针设计1 3 2 1 引言1 3 2 2 实验部分1 3 2 2 1 主要仪器和试剂一1 3 2 2 2d n a 杂交分析1 4 2 2 3 荧光寿命的测量1 4 2 2 4 荧光量子产率的确定1 5 2 3 结果和讨论1 5 2 3 1 铕离子配体的结构和光谱特性1 5 2 3 2 探针的设计和特性1 7 2 3 3 稳态荧光检测d n a 杂交2 0 2 3 4 细胞介质中的核酸检测。2 1 2 4 小结：一2 3 第3 章基于金属配位作用的生物硫发夹型荧光核酸探针设计2 4 3 1 引言2 4 3 2 实验部分2 5 3 2 1 试剂和仪器2 5 v t 发夹型d n a 荧光探针设计新方法研究 3 2 2 光谱测量2 5 3 3 结果与讨论2 6 3 3 1 实验原理2 6 3 3 2 金属离子与p 2 的作用2 8 3 3 3 实验条件优化2 8 3 3 4 灵敏度检测3 0 3 3 5 选择性检测3 0 3 4 小结3 2 第4 章基于缺失位点的发夹型荧光核酸探针设计3 3 4 1 引言3 3 4 2 实验部分3 4 4 2 1 主要仪器和试剂3 4 4 2 2 光谱测量3 4 4 3 结果与讨论3 5 4 3 1 实验原理3 5 4 3 2 实验可行性研究一3 6 4 3 3 温度影响3 9 4 4 小结3 9 结论4 0 参考文献41 附录攻读学位期间所发表的学术论文目录5 0 致 谢51 v i 硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 荧光核酸探针 自1 9 5 3 年w a t s o n 与c r i c k 提出了d n a 双螺旋结构模型以来，以d n a 、r n a 等作为研究对象的基因组学成为分子生物学的重要研究领域。对于d n a 、r n a 的研究，人们做了大量的工作，从而建立了大量的技术和方法，其中核酸分子探 针技术成为最常用的方法之一。随着化学合成核酸方法的不断成熟、人类基因组 计划推动基因信息不断丰富及软件设计能力的不断提高，核酸分子探针利用核酸 杂交的可设计性以及高特异性，成为分子生物学最常用的技术之一，得到越来越 多的研究和应用。它可以利用化学发光、拉曼、电流及荧光等信号，传递信息。 其中由于荧光信号具有分析检测手段简单、灵敏度高且对生物分子影响较小等优 势，成为最常用的信号转导方法。荧光核酸探针可用于检测蛋白质，核酸片段， 生物小分子和无机离子。它的原理一般有两种：( 1 ) 基于荧光共振能量转移 ( f r e t ) ，在探针的两端分别标记荧光基团和猝灭基团，由于探针与目标物结合 情况不同而导致荧光基团与猝灭基团之间的距离改变，发生或阻断荧光共振能量 转移，从而引起荧光信号的变化；( 2 ) 基于荧光偏振原理，探针上只标记荧光基 团，当探针与目标物作用后，荧光偏振发生改变，从而实现对目标物的检测。下 面介绍几种常见的核酸荧光探针。 1 1 1t a q m a n 探针 t a q m a n 探针是一条两端分别标记荧光基团和猝灭基团的单链d n a ，它是最 早出现的基于荧光共振能量转移原理的核酸荧光探针【l 2 】，t a q m a n 探针的核心是 利用t a q 酶的37 _ 5 外切核酸酶活性，切断探针，使荧光基团与猝灭基团远离， 荧光信号增强。如图1 1 所示，在靶序列的存在下进行延伸反应时，探针被t a q 酶的5 外切酶活性切断，荧光基团远离猝灭基团，发出荧光。一分子产物的生成 伴随着一分子荧光信号的产生，因此，t a q m a n 探针检测的是累积荧光信号。 t a q m a n 探针提高了聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 过程 的定量精度，使得实时检测p c r 过程第一次得以实现，耐热聚合酶的应用又大幅 度降低了样品受污染的可能性。t a q m a n 探针已经在科研和医学诊断广泛应用。 同时，t a q m a n 探针也存在着不足，首先，它的长度限制了荧光共振能量转移效 率，使得荧光背景较高；其次，探针是线性序列构型，区别单碱基突变时，容易 出现假信号；第三，由于需要采用酶的外切活性，因此定量时也会受酶性能的影 响。 发夹型d n a 荧光探针设计新方法研究 t a q m a n 探针 3 ，篓兰坠l5 ， 3 ，詈! ! 暑! - 已兰刍詈詈烹鼍釜翌二一5 ， 5 习户置暑；3 3 5 5 1 f ；3 图1 1t a q m a n 探针原理图【1 】 1 1 2 阴阳探针 阴阳探针是利用核酸链之间的竞争性杂交实现对目标链的分析检测【3 j ，于 2 0 0 2 年由厦门大学李庆阁等首次报道。它由两条互补的d n a 链组成，其中一条 末端标记荧光报告基团，另一条末端标记荧光猝灭基团，且两条链的长短不一样， 其中一条d n a 链比另一条d n a 链长大约5 个碱基。没有目标链存在时，两条 d n a 探针互补，荧光基团与猝灭基团之间的距离被拉近，发生荧光共振能量转移， 荧光被猝灭；加入目标链后，目标链与多出5 个碱基的d n a 链杂交，形成更稳 定的杂交体，此时荧光基团与猝灭基团之间的距离被拉大，荧光共振能量转移被 阻断，荧光信号增强。与其它荧光核酸探针相比，阴阳探针的标记成本低、原理 和设计简单，在p c r 定量分析中有很大的应用前景，其原理如图1 2 所示。 + p r o b e t a r g e t 图1 2 阴阳探针的原理图【3 1 2 + 尸 硕士学位论文 1 1 3 相邻探针 相邻探针，又称作双杂交探针。它由两条带标记的单链d n a 组成，两条单 链d n a 都标记荧光基团，其中一条d n a 链的荧光基团标于5 端，另一条标在3 端。其工作原理如图1 3 所示，当目标物存在时，由于两种单链d n a 探针与目标 物的序列配对且相邻，所以与靶序列杂交，两探针中的荧光基团被拉近，两荧光 基团之间发生荧光共振能量转移。能量转移效率可以通过检测两荧光基团的荧光 强度比值获得，信号强度与目标物的量成正比。 r o c h e 公司利用相邻探针原理开发了一种定量p c r 技术l i g h t c y c l e r 。该探 针系统包括两条能与同一模板相邻杂交的探针序列，且在这两条不同探针上分别 标记荧光基团和猝灭基团，杂交时标记在两探针上的荧光分子和猝灭分子被拉近， 从而发生荧光共振能量转移，荧光被猝灭。荧光猝灭的程度与起始模板的量成反 比，由此进行p c r 的定量分析。该方法的猝灭效率高，但由于两条探针均结合于 模板上，因此影响扩增效率。而且两条探针序列比较长，合成成本相对比较高。 相邻探针原理除被应用到d n a 序列分析上，t s u j i 等还利用相邻探针方法对活体 细胞内m r n a 进行了分析。他们将两条带不同荧光团的相邻探针，设计为与被测 m r n a 片段互补且相邻，显微注射到活体细胞后，两探针与目标m r n a 发生杂交， 发生荧光共振能量转移。然后，根据两种荧光团的荧光比值，算出活体细胞中的 m r n a 含量。相邻探针技术在应用中也存在一些不足之处：( 1 ) 因为是线性探针， 在检测单碱基错配时，容易产生假信号；( 2 ) 它是针对二级结构复杂的区域设计 探针，因此容易产生二聚体，背景信号高。 1 1 4 核酸适体荧光探针 图1 3 相邻探针的原理图【4 1 核酸适体又称为核酸适配子，英文名a p t a m e r 。根据1 9 9 8 年9 月全国生命科 学技术名词审定委员会的定义，核酸适体是指能与蛋白质或有机化合物等配体特 异性、高效结合的d n a 或r n a 片段。从定义中可知，核酸适体的研究对象不仅 包括蛋白质大分子，还包括其他有机小分子。它是通过s e l e x 技术( s y s t e m a t i c 发夹型d n a 荧光探针设计新方法研究 e v o l u t i o no fl i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t ) 筛选出来的，目前已经筛选到了一 大批能与氨基酸、蛋白、多肽等特异性结合的核酸适体。这些适体与目标物的亲 和力高，有些甚至强于天然配体。 目前，核酸适体在生物小分子及蛋白质分子检测等方面得到了广泛的应用。 f r e d r i k s s o n 等利用核酸适体探针发展了一种高灵敏度的蛋白质分析方法【5 】。他们 设计了两个核酸适体探针，这两个探针的一部分与血小板源生长因子 ( p l a t e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r ，p d g f ) 结合，另一部分互补。当核酸适体探针结合 到p d g f 上时，两条核酸适体序列相互靠近，提高了其尾部杂交的几率和稳定性。 然后利用已连接的探针，用t a q m a n 探针实时荧光p c r 定量检测。这种方法具有 非常高的特异性和高灵敏性，可用于检测痕量蛋白质的存在。此外，如图1 4 所 示，l i 【6 】等设计了一种分子开关核酸适体荧光探针，f d n a 上设计一段a t p 的核 酸适体序列，另一段与q d n a 互补，没有a t p 存在时，f d n a 和q d n a 杂交， 探针形成双链结构，荧光基团与熄灭基团被拉近，荧光信号很低。当a t p 存在时， f d n a 与a t p 结合，q d n a 被释放出来，荧光增强。 5 。糍鬯m - 譬袋e m - 2 fq 图1 4 核酸识体荧光探针在a t p 检测中的应用 6 1 1 2 发夹型核酸探针 d n a 的一级结构为多聚脱氧核苷酸链，它是通过脱氧核苷酸的5 磷酸基与 另一分子脱氧核苷酸的3 羟基( c 3 o h ) 通过磷酸二酯键连接而成。d n a 的二 级结构为碱基互补形成的双螺旋结构。d n a 变性是指在加热等理化因素的作用 下，d n a 分子互补碱基对间的氢键断裂，双螺旋结合打开，变成单链。d n a 复 性是指在适当条件下变性的d n a ，重新恢复天然的双螺旋构象的现象，d n a 复 硕士学位论文 性过程被称为退火。杂交是指来源不同的核酸变性后，在一起复性，通过碱基互 补配对，形成杂化双链。热变性的d n a 单链，在复性时，自身局部碱基互补结 合，或与某些区域有互补序列的异源d n a 单链杂交，形成“发夹型”结构。下面 介绍几种常见的发夹型d n a 荧光探针，着重介绍分子信标。 1 2 1b r e a k1 i g h t 探针 b r e a kl i g h t 探针，是一种基于分子信标原理发展来的发夹型分子探针，于2 0 0 0 年由b i g g i n s 等【_ 7 】首先报道。该探针的茎部比分子信标长，所以稳定性更好，有利 于核酸酶或其他药物分子与d n a 双链结合。如图1 5 所示，在分子信标的茎部上 设计一个核酸酶或者其他药物分子的识别位点，再引入4 个无关碱基，常态下， 探针呈发夹结构，无荧光信号。当存在核酸酶或其他药物分子时，核酸酶或其他 药物分子能识别探针茎部的识别位点，发夹型结构被破坏，荧光基团和熄灭基团 分离，荧光恢复。根据荧光信号的变化，可实时检测核酸酶或其他药物分子。如 m a k s i m e n k o t 8 】等利用b r e a kl i g h t 探针实时监测碱基损伤修复过程，当d n a 损伤 碱基被切除时，荧光基团和熄灭基团的距离增大，荧光增强，通过荧光信号的变 化，监测碱基损伤修复过程。 讲峨 c h 悯驴 芒葺 图1 5b r e a kl i g h t 探针实时检测d n a 切割的原理图m 1 2 2l u x 探针 l u x ( 1 i g h tu p o ne x t e n t i o n ) 探针由n a z a r e n k o 等在2 0 0 2 年首先报道【9 】，用于 定量p c r 分析。l u x 探针呈发夹型结构，它的产物扩增端标记有荧光基团。如 图1 6 所示，没有扩增时，探针呈发夹型结构，发夹茎部的碱基猝灭了荧光基团 的荧光；在扩增时，l u x 探针与模板杂交，并沿着模板延伸，其发夹结构打开， 荧光基团的荧光恢复，且增强了1 0 倍以上。l u x 探针只需标记一端，所以成本 较低、标记简单，同时它的响应速度也很快。这些优势使得该探针具有很强的竞 争力【9 , 1 0 】。由于l u x 探针是直接利用碱基来猝灭荧光基团的荧光，所以荧光基团 的选择受到了一定的限制，且对发夹结构的茎部序列有一定的设计要求。这些缺 陷限制了l u x 探针的发展。 5 n v 隆 肛甘鲁什：*拿= = 卅1 ：| f唧：制，z ：卅 q 发夹型d n a 荧光探针设计新方法研究 h ar p l np r i m e r ： ! 壤； 、吣眈西矽吨l 幺沙弋一 一 ! i ? 。 图1 6l u x 探针的工作原理图9 1 1 2 3 分子信标 分子信标是一种新型的可特异性识别核酸序列的荧光探针，于1 9 9 6 年由 t y a g i 和k r a m e r 等【1 1 1 首次报道。这种荧光探针与核酸靶分子杂交后，其构象发生 变化，导致荧光报告基团与其猝灭基团远离，从而荧光信号发生改变。分子信标 具有操作简单、灵敏度高、特异性强、本底荧光低以及可进行实时检测等优点， 在近几年得到了快速发展，并成功应用于实时定量p c r 分析、蛋白质的检测、活 体细胞中m r n a 的检测、基因突变的快速分析及生物芯片研究等，且其应用领域 仍在不断拓展。下面简单概述分子信标的结构、原理、特点及其应用。 分子信标由三部分组成：( 1 ) 环部，一般是长度为1 5 3 0 个碱基序列，它与 目标分子特异性结合，是分子信标的识别部分；( 2 ) 茎部，一般是长度为5 8 个 碱基的互补序列，茎部与杂交后的环部双链结构之间的热力学平衡关系，使分子 信标的杂交特异性明显高于常规的线状探针；( 3 ) 荧光基团和猝灭基团，荧光基 团一般连接在信标分子的57 端；猝灭基团连接在3 端。常用的荧光基团和猝灭基 团一般是一些有机染料分子，如荧光基团德克萨斯红( t e x a s r e d ) 、荧光素 ( f l u o r e s e i n ) 、低聚唆吩衍生物【12 1 、聚对苯 炔( p o l y ( p h e n y l e n ee t h y n y l e n e ) ，p p e ) 【1 3 1 4 j 等，常用的猝灭基团有4 ( 4 二甲基氨基偶氮苯基) 苯甲酸( d a b c y l ) 等。近年来， 也有学者用纳米金颗粒作为猝灭剂来代替d a b c y l 1 5 】。研究者通过调节金纳米粒 子的形状、大小和组成来得到不同的猝灭剂，实验发现，金纳米粒子与d a b c y l 相比，可以提高分子信标的灵敏度和特异性。还有学者用碱基本身【l6 。、超分子【l 7 】 以及铜离子鳌合物【l8 】等作为猝灭剂，取得了很好的检测效果。 分子信标的原理如图1 7 所示，在没有分析物存在下，分子信标呈发夹型结 构，茎部通过碱基互补配对形成，使荧光分子与猝灭分子靠近( 约为7 1 0n m ) ，一 定的激发光照射时即可发生荧光共振能量转移( f l u o r e s e e n e er e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r ，f r e t ) ，荧光基团受到光照激发而产生的荧光被猝灭基团吸收，并以热 6 ， 一 努，_ ：，攀吖 一 ， 一 _ m t 硕士学位论文 量的形式散发，荧光背景极低。当有目标物存在时，目标物与分子信标环部的寡 核苷酸序列发生特异性结合，形成比分子信标的发夹型结构更稳定的形式，使茎 部碱基互补部分打开，从而使得荧光基团与猝灭基团分开，空间距离增大，在相 同的激发光照射下，不发生荧光共振能量转移，荧光增强。分子信标就是通过这 种荧光信号的转换机制实现对目标物定性和定量分析。 飞 1 o 图1 7 分子信标的原理图1 由分子信标的工作原理可以看出，荧光的强度受荧光基团与猝灭基团之间距 离的影响。另外，温度和p h 也会影响分子信标稳定性。因此，茎部和环部的序 列设计是进行分子信标研究和应用的关键所在。这种设计不仅决定了其构象，使 杂交后猝灭基团与荧光基团之间的距离达到足够大，而且决定了其合适的使用温 度。就序列长度来看，为了保证分子信标的灵敏度和热力学稳定性，在其茎干区 设计的碱基数目一般为其环区的一半。序列过长，发夹结构过于稳定，其灵敏度 下降，容易给出假阴性结果；过短，则稳定性下降，容易出现假阳性结果。就序 列碱基来说，也应该是茎部稳定状态适当，而环部则应该避免出现任何可能的二 级结构，否则分子信标茎环结构将受到影响。 由于其独特的结构，使得分子信标具有以下四大方面的特点：( 1 ) 特异性强。 如果靶分子中一个碱基与探针不匹配，这两者之间的杂交就会受到影响，分子信 标构象的改变就会变的困难，荧光信号的恢复不太明显，因此，与线性核酸探针 相比，分子信标具有更大的灵活性和更高的特异性；( 2 ) 灵敏度高。在没有目标分 析物存在时，由于碱基互补作用，荧光基团与猝灭基团靠的很近，因此，背景信 号很低；( 3 ) 操作简单。在没有与目标物结合时，不发荧光，所以在实验过程中就 省略了洗涤步骤；( 4 ) 可对核酸进行实时定量测定。 近年来，人们不断优化和改进分子信标的设计，构建了许多新型的分子信标， 使分子信标的应用范围得到很大的拓展。下面是分子信标应用的几个领域。 ( a ) 用于核酸检测分析 核酸检测最常规的方法是固相杂交，它在杂交后还需要进行分离，然后才能 检测。随着分子信标的发现，人们把分子信标应用到核酸检测体系中，这种方法 7 发夹型d n a 荧光探针设计新方法研究 免了分离过程，如果用紫外灯或荧光仪来检测，还可以避免中间操作环节对反 体系的污染。 p c r 是一种在试管内的d n a 扩增技术，整个过程可分为三个步骤：变性。 用高温( 9 0 以上) 加热，使模板的双螺旋结构解链成单链。退火。把温度 至2 5 6 5 ，使引物与模板中单链的d n a 局部杂交。延伸。在7 0 7 4 时， d n t p 和t a q 聚合酶的存在下，沿着单链d n a 模板，以引物为起点，进行d n a 成链的延伸反应。上述三个过程为一个循环，每个循环都以上个循环生成的产 作为模板。分子信标和目标d n a 作用后会引起荧光信号的恢复，因此，分子 标非常适合对p c r 整个过程中d n a 的增长情况实时监测，这也是分子信标的 典应用。与需要凝胶电泳法提供分析信号的传统p c r 技术相比，分子信标更快 方便，同时分子信标可以进行液相杂交、闭管操作，可有效消除核酸交叉污染， 具有实时、高灵敏度、高特异性的特点。t y a g i 等【1 1 】将分子信标加入至p c r 扩增 管内，利用荧光光谱仪，来检测反应体系的中荧光强度的变化，实验中，荧光强 度与溶液中模板分子的量有关，成正比关系。k o n g 等【2 0 】设计了一种集合分子信 标发夹结构和t a q m a n 探针降解作用的新型均相荧光检测探针t a q m a n 分子信标 ( t a q m a nm b ) 探针，这种探针可以很好的检测p c r 均相反应，与p c r 仪联用， 还可以用于靶基因的定量检测。此外，分子信标技术还实现了d n a 切割和d n a 连接过程的监测。w a n g 等【2 1 】把分子信标应用到核酸结扎的实时监测中，相对于 变性凝胶电泳与放射自显影技术，该方法简单、快速且可以准确的描述d n a 连 接酶的活动。t a n 等【2 2 】利用分子信标对核酸内切酶对双链d n a 的断裂实时监测， 这种方法可以对d n a 的裂解实时监控，且能方便地表征限制性内切酶的活动和 裂解反应动力学。 除了实时定量p c r 外，分子信标技术也为粘性末端的分析提供了一种全新的 手段。分子信标的荧光在分子间粘性末端的杂交过程中会减弱，通过荧光信号的 变化，能实现对粘性末端d n a 的实时定量分析，且能实时观测涉及粘性末端配 对的生物物理过程，如d n a 末端连接和d n a 自组装等。超速离心、凝胶电泳、 电镜和原子力显微镜等传统的粘性末端配对分析方法会引起粘性末端配对反应的 平衡移动，而且需要对产物进行分离等，操作较繁琐。因此，基于特殊设计的分 子信标的实时检测方法成为高灵敏分析粘性末端配对的一种简便工具。 分子信标还可以用于检测活体内核酸的动态反应。m r n a 的运动、分布及降 解是遗传控制中非常重要的因素，因此，人们对m r n a 的研究越来越关注。目前， 在分子生物学上大多采用反转录p c r ( r e v e r s e dt r a n s c r i p tp c r ，r t - p c r ) 法来检 测m r n a ，其基本步骤包括：( 1 ) 从组织中提取m r n a ；( 2 ) m r n a 逆转录为相应 的c d n a ；( 3 ) 通过设计合适的引物进行p c r 扩增；( 4 ) 对扩增的d n a ，用凝胶 电泳进行定性或半定量分析。整个步骤繁杂冗长，p c r 过程中还容易产生非特异 8 硕士学位论文 性扩增。已固定的或经过预处理的细胞中特定的m r n a 虽可以利用原位杂交技术 来检测，然而固定的细胞中的m r n a 和活体细胞中的m r n a 的状态不同，预处 理或固定化的过程使我们对m r n a 合成的过程以及其在细胞中的运动不能真正 了解。因此，对活体细胞中m r n a 的运动实时监测显得尤为重要。通常是通过注 射或转导在体外合成的r n a 荧光探针，但这种方法要求探针与m r n a 杂交能引 起荧光信号的变化，而且还需洗掉未杂交的探针。而这一步骤在活体检测中很难 实现，所以常规的荧光探针不能适用于活体细胞中m r n a 的检测。分子信标技术 的发展，很好的解决了这个难题，它操作简单、检测过程无须除去未杂交的探针， 为m r n a 的检测提供了一个很好的手段，因此，被广泛的应用到的m r n a 检测 中。g e w i r t z 等【2 3 l 用分子信标实时监测活细胞内d n a r n a 的杂交；m a t s u o 等2 4 1 利用分子信标技术研究了碱性成长纤维细胞生长因子( b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t h f a c t o r ，b f g f ) 的代谢过程。但由于分子信标的主体是d n a 链，在活体检测中容 易被细胞内的防御性外切酶体系所降解，造成假阳性信号，于是人们又对分子信 标不断改进，发现通过一定修饰后的分子信标，能克服这个的缺点，可靠的用于 活体内的d n a 研究。如t a n 等设计的锁定分子信标( l n a ) 【2 5 1 ，就能有效地抵抗 核酸酶的降解，成功的用于活体分析；b r a t u 等【2 6 】利用氧化甲基基团取代分子信 标中每个核苷酸在核糖上的h + ，使分子信标不被核酸酶降解；s a n t a n g e l o 等【2 7 】 设计双分子信标，降低了分子信标应用于活细胞时的假阳性率；n i t i n 等【2 8 】在分 子信标的一端连接反式激活蛋白( t r a n s a c t i v a t o r , 仉盯) 肽分子信标技术用于三 磷酸腺苷( a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e ，a t p ) 等重要生物分子的检测，使分子信标同 时具有主动进入细胞、杂交及发射荧光的特点；m h l a n g a 等【2 9 】设计了5 端连接 t r n a 且其骨架上含有2 o 甲基核糖核苷的分子信标。表1 1 归纳了几种改进分 子信标的性能。 表1 1 几种改进型分子信标的性能 ( b ) 用于蛋白质检测分析 d n a 与蛋白质之间的相互作用控制着许多重要生理过程。因此，d n a 与蛋 白质之间相互作用的研究成为现代生物学中一个富有挑战的课题。在此之前，人 们做了大量的工作，建立了如凝胶阻滞分析、d n a 印迹法、交联技术、亲和色谱、 x 射线晶体衍射、圆二色谱、荧光光谱等技术，得到了如结合位点、蛋白质结合 9 发夹型d n a 荧光探针设计新方法研究 d n a 总的构象及位点结构的影