（生物物理学专业论文）50hz工频磁场对成纤维细胞微丝骨架装配的影响.pdf

摘要 目前各种电器的应用使人们暴露在极低频磁场中的强度和时间与日俱增，极低 频磁场与肿瘤发生的关系及机制成为环境健康研究工作中最主要的挑战之一。肿瘤 细胞最显著的特征是增殖失控及细胞迁移性改变，而细胞的这些行为都与生长因子 受体及细胞骨架的信号通路相关。最近的研究结果表明0 4m t ，5 0h z 交流磁场诱 导了细胞表面及离体的表皮生长因子受体( e g f r ) 的聚簇。e g f r 与f a c t i n 紧密 相连，磁场可能通过影响e g f r 的信号通路影响到f a e t i n 的信号通路。 本文以中国仓鼠肺成纤维细胞( c h l 细胞) 和人羊膜成纤维细胞( f l 细胞) 为研究对象，用免疫荧光标记、w e s t e m - b l o t t i n g 、光谱法、激光共聚焦显微镜、扫 描电镜、原子力显微镜( a f m ) 等实验方法研究了工频弱磁场辐照对c h l 细胞和 f l 细胞微丝骨架的影响，并进一步探讨了这种影响可能的机制。 实验结果：( 1 ) 免疫荧光标记实验发现0 4m t 工频磁场辐照c h l 细胞3 0r a i n 引起细胞中平行排列的微丝应力纤维变少，扫描电镜发现磁场辐照后c h l 细胞变 得更为扁平，w e s t e r n - b l o t t i n g 检测到细胞内与去垢剂不可溶的细胞骨架相连的 e g f r 增多。( 2 ) 0 2m t 工频磁场辐照f l 细胞3 0m i n 后导致细胞内部微丝应力纤 维减少，诱导细胞周边出现致密微丝外周带并伸出丝状伪足，且停止辐照2 小时后 微丝形态恢复；伪足消失。激光共聚焦显微镜逐层扫描观测到0 2m t 磁场辐照使 细胞微丝骨架平均高度降低。扫描电镜图像显示磁场辐照使f l 细胞更为扁平，有 足状伪足出现。磁场辐照后细胞骨架中去垢剂不可溶部分的肌动蛋白和e g f r 含量 升高。( 3 ) a f m 观察到肌动蛋白的体外装配未受磁场影响，但装配效率下降。分 别用a - t o c o p h e r o l 清除胞内自由基，p d l 5 3 0 3 j 抑制e g f r 的磷酸化，或乙二醇一 双一( 2 一氨基乙基) 四乙酸( e g l a ) 螯合胞外钙离子时都无法完全抑制磁场对f l 细 胞微丝形态的影响，但p d l 5 3 0 3 5 和e g t a 的联合作用明显抑制了磁场对f l 细胞 微丝形念的影响。 本文的实验结果表明：极低频磁场能影响细胞微丝骨架的装配和细胞内e g f r 的表达，对不同的细胞有不同的磁场强度依赖性效应。磁场影响细胞微丝形态可能 主要与磁场降低微丝装配效率，磁场诱导e g f r 聚集及磁场引起胞外钙内流有关。 关键词：工频磁场，成纤维细胞，微丝骨架，表皮生长因子受体 2 0 0 4 年国家教育部留学回国人员基金资助 a d s n 。a c t t h e e x p o s u r es t r e n g t h a n dt h et i m et h a t p e o p l e h a v eb e e ne x p o s e dt o e l e c t r o m a g n e t i cf i e l d s ( m f ) a r ei n c r e a s i n gs t e a d i l yi nn o w a d a y s t h er e l a t i o n s h i p b e t w e e ne x t r e m e l yl o wf r e q u e n c ym a g n e t i cf i e l d sa n dt u m o r so c c u r r e n c e si so n eo ft h e m o s tc o n c e r n e di s s u e st ot h ep r e s e n te n v i r o n m e n t a la n dh e a l t hi n v e s t i g a t i o n s t u m o r c e l l su s u a l l yb e h a v ea b n o r m a lp r o l i f e r a t i o na n dc e l lm i g r a t i o n 1 1 l e p r o p e r t i e sa r e d i r e c t l yl i n k e dt ot h es i g n e dt r a n s d u c t i o np a t h w a y so fg r o w t hf a c t o r sa n dt h a to fc e l l c y t o s k e l e t o n p r e v i o u sr e s u l t ss h o w e dt h a te p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o rn i g f r ) c l u s t e r e di nv i t r oa n dv i v oi n d u c e db ye x p o s u r ei n0 4 m tp o w e r f r e q u e n c ym a g n e t i cf i e l d ( 5 0 i - i zm f ) f o r3 0m i n u t e s t h e r eu n d e r l i n eac l o s er e l a t i o n s h i ph 吐w e e ne g f ra n d f a c t i n s oi ft h ee g f rs i g n a lp a t h w a yi sa f f e c t e db ym f , t h ef - a e t i ns i g n a lp a t h w a y w o u l db ei n v o l v e d i nt h i sr e s e a r c h , m e t h o d ss u c ha si m m u n o h i s t o e h e m i c a lm e t h o d ，w e s t e r nb l o t t i n g ， o p t i c a lm e t h o d ，ac o n f o c a lm i c r o s c o p e ，as c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ea n da na t o m i e f o r e em i c r o s c o p ew e r e u s e dt od e t e c tt h ee f f e c to f 5 0h zp o w e rf r e q u e n c ym a g n e t i cf i e l d o nm i c r o f i l a m e n ta s s e m b l yo fc h i n e s eh a m s t e rl u n g ( c h l ) e e l la n dh u m a na m n i o nf l c e l l f u r t h e ri n v e s t i g m i o n sw e r ec a r r i e do u tt ou n d e r s t a n dt h em e c h a n i s m 1 1 1 er e s u l t sc a l lb ec o n c l u d e da sf o l l o w s ：( 1 ) u s i n gt h em e t h o do fi m m u n o l a b e l l i n g ， w eo b s e r v e dt h a ti n t r a c e l l u l a rs t r e s sf i b e r si nc h le e l ld e c r e a s e da f t e re x p o s i n gc e l l st oa 0 4m t p o w e rf r e q u e n c ym a g n e t i cf i e l df o r3 0m i n u t e s 1 1 1 ec e l ls h a p eb e c a m em o r ef i a t a f t e re x p o s u r eo b s e r v e db yas c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e t l l ee g f rm a s sa s s o c i a t e d w i t ht h ed e t e r g e n t - i n s o l u b l ec y t o s k e l e t o ni n c r e a s e da f t e re x i ) o s u r et om a g n e t i cf i e l d m e a s u r e db yw e s t e r n - b l o t t i n g ( 2 ) 0 2m t , 5 0 h zm fi n d u c e dad e c r e a s ei nc e l ls k e l e t o n s t r e s sf i b e r si nf lc e l l n e wm i c r o f i l a m e n ta n df i l o p o d i ab u n d l e sa p p e a r e da tt h ee e l l p e r i p h e r ya f t e re x p o s u r e 1 n b es h a p eo f f a c t i ni nf lc e l lc o u l dr e c o v e ra f t e rr e m o v i n gt h e m ff o r2h o u r s t h em e a nh e i g h to f m i c r o f i l a m e n tc y t o s k e l e t o nd e c r e a s e da f t e re x p o s u r e o b s e r v e dw i t hac o n f o c a lm i c r o s c o p e 1 1 地c e l ls h a p e sb e c a m em o r ef l a ta n dl a m e l l i p o d i a a p p e a r e da f t e re x p o s u r e t h ee g f rm a s sa s s o c i a t e dw i t ht h ed e t e r g e n t - i n s o l u b l e c y t o s k e l e t o na n dt h ed e t e r g e n t i n s o l u b l ef - a c t i ni n c r e a s e da f t e re x p o s u r et om f _f 3 ) t h ea s s e m b l yo fa c t i ni nv i t r ow a sn o ta f f e c t e db vm f b u tt h ee f f i c i e n c yo fa s s e m b l y d e c r e a s e d 1 1 l e c h a n g e so f f a c t i ni n d u c e db ym fc o u l dn o tb ei n h i b i t e da f t e rc l e a r i n gt h e f r e er a d i c a lu s i n gu - t o c o p h e r o l ，o rb l o c k i n gt h ee g f rt y r o s i n ek i n a s eb yp d l 5 3 0 3 5 ，o r c h e l a t i n gt h ec a l c i u mi o n si nt h em e d i u mb ye t h y l e ng l y c 0 1 b i s ( 1 3 一a m i n o e t h y l e t h e r ) n ，n ，n ，n - t e t r a a c e t i ca c i d ( e g t a ) b u t ，t h ec h a n g e so f f a e t i ni n d u c e db ym fc o u l db e o b v i o u s l yi n h i b i t e db vp d l 5 3 0 3 5a s s o c i a t e dw i me g t a a b o v er e s u l t ss u g g e s t i n gt h a tt h ee f f b c to f5 0 h zm fo nf - a c t i na s s e m b l ya n dt h e e x p r e s s i o no fe g f rm a yp r e s e n tf i e l ds t r e n g t hd e p e n d e n te 仃b c t t h ee f f e c to nf a c t i n i n d u c e db vm fm a yf u n d e r m e n t a l l yh a v es o m e t h i n gw i t ht h ed e c r e a s eo na s s e m b l y e f f i c i e n c y o f f a e t i n , t h e c l u s t e r i n g o f e g f r a n d t h e i n f l o w o f t a l c i n m i o n s k e yw o r d s ：p o w e rf r e q u e n c ym a g n e t i cf i e l d ；f i b r o b l a s t ；f - a c t i n ；e g f r 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包 含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：盔蛰日期：型 尘塑 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校 有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版 和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入 学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用 本规定。 学位论文作者签名：稽t 午 日期：21 ! 工王q 导师签名：弛 日期：二塑邸生 华东师范大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第一节电磁辐射生物效应 第一章引言 生物组织对于外电磁场来讲是一种介质，影响电磁场作用的生物因素有：生 物材料的组成、生物体的磁性、外场作用的部位和生物的种属、机能状态及它对 外场的敏感性等。在神经冲动的传导、肌肉的运动、大脑的活动等多种生命运动 中均存在质子与电子传递和离子转移。电磁场可以影响质子、电子和离子的运动、 速度或方向，从而可以对生命活动产生影响。 电磁辐射问题近几年在国内外引起了广泛的关注，电脑及其它家用电器可发 射出电磁辐射，产生极低频的电磁场。环境电磁场已成为最广泛的环境质量影响 因素之一，国际上把它称为是继水污染、空气污染和噪声污染以后的第四大污染 源。人群流行病学调查的结果表明，输电线工频磁场( 属于极低频磁场，e l f - m f ) 暴露可能与白血病和乳腺癌等发病率增高有关【1 ，2 ，3 】。美国环境健康科学研究 所( n i e h s ，1 9 9 8 ) 和国际癌症研究机构( i a r c ，2 0 0 1 ) 均把e l f m f 定义为人 类的可疑致癌源( h t t p ：w w w e l e c t d c a l p o l l u t i o n c o m l l o y d _ m o r g a n e x c e r p t s h t m l ) 近几年来，科学家在分子、细胞或动物水平进行了一系列的研究，但由于对电磁 辐射健康效应认识存在较大知识缺口，时至今日，有关e l f m f 的生物学效应及 作用机制还未阐明。为此，世界卫生组织( w h o ) 已经制定了长达l o 年的电磁场 研究规划( h t t p ：w w w w h o i n t p e h o e m f r e s e a r c h ) ，并每年根据具体情况及时调整。 2 0 0 5 年w h o 再次召开极低频电磁场环境健康纲要工作组会议( e n v i r o n m e n t a l h e a l t hc d t e d a ( e h c ) t a s kg r o u pm e e t i n g ) ，会议认为目前最主要的挑战是揭示 低强度( 环境水平) 的电磁场与细胞的相互作用及其作用机制，尤其是e l f m f 与肿瘤发生的可能关系及机制。 电磁场作用于生物体，能引起两类生物效应。一类是使其温度升高，并由此 而引起生理和病理变化的作用，这叫做热效应。这是生物体内各层次的生物物质 吸收电磁能后转成为热能之故。热效应有如下特点：在平衡态附近时，生物系 统对电磁场的响应一直到1 0 5 v m 的场强时都是线性的；系统产热正比于场强平 方；这种热效应和其它不同加热方式加热生物系统所产生的效应是相同的。在 临床医学的应用中，目前较为成熟的是利用电磁能的热效应进行肿瘤的高温治疗 和一般的电磁热疗。当然电磁辐射效应对生物体也有不利的影响。例如会使脑功 能失调、甲状腺机能亢进、头痛、易激动等症状。长期受一定强度电磁辐射所产 生的热效应，会使心电图异常，易引发白内障、月经失调、男性不育等 4 ，5 ，6 】。 电磁场引起的另一类生物效应叫做非热效应，即是指电磁场通过使生物体温度升 高的热作用以外的方式改变生理生化过程的效应，更严格一些，如果电磁波传递 第1 页 华东师范大学2 0 0 7 届硕士学位论文 的能量对分子各自由度的能量具有选择性，即这时介质各自由度的能量不满足玻 尔兹曼平衡分布，这样的情形就应该属于非热效应。电脑、电视机、微波炉等家 用电器产生的电磁场通常频率低、强度弱，能量通量小( 其光子能量比氢键和范 德瓦尔斯力小两个数量级) ，难以引起生物体或受辐射细胞内的明显温升，引发 的就是非热效应【7 ，8 】。这一名词在提出的时候曾引起一些物理学和工程学方面的 专家的非议。他们认为电磁波作为一种能量形式在体内被吸收后最终都要变成热， 即分子的热运动，因此不可能有什么非热的效应，随着研究工作及对实验现象理 解的深入，电磁波的生物非热效应逐渐普遍地为人们所接受。 电磁场的非热效应具有非线性【9 】、相干性【l o 】、协同性 1 0 1 、阂值性 1 1 】以及 “窗”特性【8 ，1 2 】( 频率窗、功率窗、时间窗) 等特点，关于弱电磁场的生物效应 在7 0 、8 0 年代就提出了许多理论来解释。如跨膜离子回旋共振理论【1 3 】，玻色爱因 斯坦凝聚理论【1 4 】、量子粒子结合效应理论 1 5 1 、膜动力学场致变化理论【1 6 】、非 线性效应理论 9 】等。每个理论都具有一定合理性，但是，由于生物系统的复杂性， 上述每个理论都只能解释部分实验结果，对其它众多实验现象却无法解释。近年 来，随着非线性科学和混沌动力学理论的发展、学者们将该理论与生物信息学和 系统科学等相结合 1 7 1 ，提出了一些新的理论模型较好地解释了弱电磁场作为触发 器引发非热效应的机理。 多年来，弱电磁场的生物效应的实验研究已积累了大量的数据，在理论上也 提出了一些新的假设。但很多数据存在矛盾和分歧 1 8 ，1 9 ，2 0 1 ，无法对弱电磁场 是否对人类健康有影响下一个明确的结论，弱电磁场生物效应的研究是一个充满 挑战的领域。 目前已有大量研究工作就低频弱电磁场对细胞信号通路的影响展开。细胞的 信号跨膜传导系统具有级联放大的特点，能有效解释低频弱电磁场能量小却效应 显著的现象。将细胞信号转导的研究成果和方法用于解决电磁场非热效应的机理 问题较为合适，从细胞信号转导的角度研究低频弱磁场的生物效应有重要的意义。 在动物细胞中广泛存在着细胞外基质质膜细胞骨架连续体。胞外信号可以通 过这个连续体向胞内传递信号，胞内信号也可以通过这个连续体向胞外传递信号 【2 1 1 。细胞骨架系统与细胞的各种生命活动密切相关，因此研究低频弱电磁场对细 胞骨架信号通路的影响对研究环境电磁辐射对人类健康影响的问题有重要价值。 第二节细胞微丝骨架系统和表皮生长因子受体 1 微丝骨架 细胞骨架( e y t o s k e l e t o n ) 是指真核细胞中的蛋白纤维网络结构。发现较晚， 主要是因为以往一般电镜制样采用锇酸或高锰酸钾低温( 0 - 4 c ) 固定细胞，细胞 第2 页 华东师范大学2 0 0 7 届硕士学位论文 骨架大多被破坏。直到2 0 世纪6 0 年代后，采用戊二醛常温固定，才逐渐认识到 细胞骨架的客观存在。 细胞骨架的概念正在不断的发展之中，早期的细胞骨架仅指微丝和微管，目 前，狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝( m i c r o f i l a m e n t ) 、微管( m i c r o t u b u l e ) 和中间纤维( i n t e m e d i a t ef i l a m e n t ) ；广义的细胞骨架还包括细胞核骨架 ( n u c l e o s k e l e t o n ) 、核纤层( n u c l e a rl a m i n a ) 和细胞外基质( e x t r a e e l l u l a rm a t r i x ) ， 形成贯穿于细胞核、细胞质、细胞外的一体化网络结构。 微管是细胞内的主要支架，并为细胞内物质运输指引方向；中间纤维是起主 要支撑作用的细胞骨架成分，使细胞具有张力和抗剪切力；微丝维持细胞形态特 征，使细胞能够运动和收缩；微丝、微管和中间丝位于细胞质中，实际上均由蛋 白质分子单体以非共价键结合在一起构成多聚体蛋白，在形态上里纤维状。细胞 中的大多数多聚体纤维蛋白可以解聚( 去组装) 和再次聚合( 组装) ，并由此参 与调控细胞功能。 细胞骨架的研究是当前细胞生物学中最为活跃的领域之一，近年来发现细胞 骨架不仅在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作 用，而且还参与许多重要的生命活动，如：在细胞分裂中细胞骨架牵引染色体分 离，在细胞物质运输中，各类小泡和细胞器可沿着细胞骨架定向转运；在肌肉细 胞中，细胞骨架和它的结合蛋白组成动力系统；在白细胞的迁移、精子的游动、 神经细胞轴突和树突的伸展等方面都与细胞骨架有关。另外，在植物细胞中细胞 骨架指导细胞壁的合成。总之，细胞骨架与细胞生命活动密切相关。 1 1 微丝结构及功能 微丝( m i e r o f i l a m e n t ，m f ) ，是由肌动蛋白 ( g a c f i n ) 组成的直径约7 r i m 的 骨架纤维，又称肌动蛋白纤维( a e t i nf i l a m e n t ) 。微丝和它的结合蛋白( a s s o c i a t i o n p r o t e i n ) 以及肌球蛋白( m y o s i n ) 三者构成化学机械系统，利用化学能产生机械运 动。 ( i ) 、分子结构 根据等电点的不同可将高等动物细胞内的肌动蛋白分为3 类：a 肌动蛋白、b 肌动蛋白和丫肌动蛋白，相对分子质量为4 3 1 0 3 。a 分布于各种肌肉细胞中，b 和1 r 分布于肌细胞和非肌细胞中。肌动蛋白的单体为球形分子，称为球形肌动蛋 白g a c t i n ( g l o b u l a ra e t i n ) ，外观呈哑铃状。它的多聚体称为纤维形肌动蛋白f a e t i n ( f i b r o u s a e t i n ) 。肌动蛋白纤维是由两条线性排列的肌动蛋白链形成的螺旋，状如 双线捻成的绳子( 图1 、2 ) 。 第3 页 华东师范大学2 0 0 7 届硕士学位论文 图l 微丝纤维的负染电镜照片 图2 微丝纤维结构模型 肌动蛋白在进化上高度保守，酵母和兔子肌肉的肌动蛋白有8 8 的同源性。 不同类型肌肉细胞的c t - 肌动蛋白分子一级结构( 约4 0 0 个氨基酸残基) 仅相差4 6 个氨基酸残基，p - 肌动蛋白或丫- 肌动蛋白与舡横纹肌肌动蛋白相差约2 5 个氨基 酸残基。在含有a t p 和c 矿以及低浓度的n a + 、k + 等阳离子溶液中，微丝趋于解 聚成g - a c t i n ；而在m 矿+ 和高浓度的n a + 、c 溶液诱导下，( - a c t i n 则装配成纤维 状肌动蛋白，新的g - a c t i n 加到微丝末端，使微丝延伸。a t p a c t i n ( 结合a t p 的肌 动蛋白) 对微丝纤维末端的亲和力高，a d p a c t i n 对纤维末端的亲和力低，容易脱落。 当溶液中a t p a c t i n 浓度高时，微丝快速生长，在微丝纤维的两端形成a t p a c t i n “帽予”，这样的微丝有较高的稳定性。伴随着a t p 水解，微丝结合的a t p 就变 成了a d p ，当a d p a c 缸暴露出来后，微丝就开始去组装而变短。 微丝具有极性，肌动蛋白单体加到( + ) 极的速度要比加到( ) 极的速度快 5 1 0 倍。溶液中a t p 肌动蛋白的浓度也影响组装的速度。当处于临界浓度时， a t p a c t i n 可能继续在( + ) 端添加、而在( ) 端开始分离，表现出一种“踏车” 现象( 图3 ) 。肌动蛋白可以在体外装配成微丝，其结构与细胞中分离的微丝相同。 细胞中微丝参与形成的结构除肌原纤维、微绒毛等属于稳定结构外，其他大 都处于动态的组装和去组装过程中，并通过这种方式实现其功能。细胞松弛素 ( c y t o e h a l a s i n ) 可切断微丝纤维，并结合在微丝末端抑制肌动蛋白加合到微丝纤 维上，特异性的抑制微丝功能。鬼笔环肽( p h a l l o i d i n ) 与微丝能够特异性的结合， 使微丝纤维稳定而抑制其功能。荧光标记的鬼笔环肽可特异性地显示微丝。 第4 页 华东师范大学2 0 0 7 届硕士学位论文 图3 肌动蛋白的踏车行为 ( 2 ) 微丝的功能 微丝除参与形成肌原纤维外还具有以下功能： a 形成应力纤维( s t r e s sf i b e r ) ：非肌细胞中的应力纤维与肌原纤维有很多类似之 处：都包含m y o s i ni i 、原肌球蛋白、f i l a m i n 和q a c t i n i n 。培养的成纤维细胞中 具有丰富的应力纤维，并通过粘着斑固定在基质上。在体内应力纤维使细胞具 有抗剪切力( 图4 ) 。 b 形成微绒毛：微绒毛的内芯由肌动蛋白丝束组成。 图4 应力纤维结构模型 第5 页 华东师范大学2 0 0 7 届硕士学位论文 图5 细胞的变形运动( 根据m o l e c u l a rb i o l o g yo f t h ec e l l4 t h 书末动画改编) c 细胞的变形运动：分为四步【图5 】：微丝纤维生长，使细胞表面突出，形成 片足( 1 a m e l l i p o d i u m ) ；在片足与基质接触的位置形成粘着斑：在m y o s i n 的作用下微丝纤维滑动，使细胞主体前移；解除细胞后方的粘和点。如此不 断循环，细胞向前移动。阿米巴原虫、自细胞、成纤维细胞都能以这种方式运 动。 d 胞质分裂：有丝分裂末期，两个即将分离的子细胞内产生收缩环，收缩环由平 行排列的微丝和m y o s i ni i 组成。随着收缩环的收缩，两个子细胞的胞质分离， 在细胞松驰素存在的情况下，不能形成胞质分裂环，因此形成双核细胞。 e 顶体反应：在精卵结合时，微丝使顶体突出穿入卵子的胶质里，融合后受精卵 细胞表面积增大，形成微绒毛，微丝参与形成微绒毛，有利于吸收营养。 f 其他功能：如细胞器运动、质膜的流动性、胞质环流均与微丝的活动有关，抑 制微丝的药物( 细胞松弛素) 可增强膜的流动、破坏胞质环流。 ( 3 ) 正常细胞与肿瘤细胞微丝骨架差异 正常细胞与肿瘤细胞的生物学遗传特性有较大的差异。这些差异表现在细胞 形态、增殖和运动能力、细胞彼此之间以及细胞与基质之间的连接等诸多方面的 变化，所有这些差别又均与细胞骨架密切相关 2 2 】。通常正常细胞具有发育良好的 微丝骨架，分布于细胞内并与细胞膜相连，而肿瘤细胞微丝骨架不完整或已受损。 1 2 成纤维细胞内微丝的排列分布 根据细胞种类和细胞生理状态的不同，微丝在细胞中会形成各种结构。通常 第6 页 华东师范大学2 0 0 7 届硕士学位论文 一个铺展好的成纤维细胞具有足状伪足( 1 a m e l l i p o d i a ，也叫层状伪足、板状伪足) 、 丝状伪足( f i l o p o d i a ) 、应力纤维( s t r e s sf i b r e s ) 和弓形结构( a r c s ) 【2 3 ，这些微 丝形成的结构处于动态变化中引起细胞形变和迁移 图6 】。 图6 成纤维细胞中微丝的排列分布简图。l a m ：足状伪足( 1 a m e l l i p o d i a ) ，f i l ：丝状伪足 ( f i l o p o d i a ) ，p b ：外周束( p e r i p h e r a lb u n d l e ) ，p b l ：带足状伪足的外周束( p e r i p h e r a lb u n d l e w i t hl a m e l l i p o d i u m ) ，v s f ：腹面应力纤维( v e n t r a ls t r e s sf i b r e ) 。d s f ：背面应力纤维( d o r s a l s t r e s sf i b r e ) ，a r c ：弓形结构( a r e ) ，m s ：微端丝( m i e r o s p i k e ) ，n ：细胞核( n u c l e u s ) 。 2 表皮生长因子受体 表皮生长因子受体( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r , e g f r ) 是一种广泛分布于 人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，是鸟类成红细胞白血病病毒( a v i a n e r y t h r o b l a s t i cl e u k e m i a v i r a l ，v - e r b - b ) 致癌基因同源体，为h e r e r b b 家族的四个成 员之一，故又名h e r l 或e r b b l 。e g f r 及其配体是细胞信号传导系统的一部分。 研究表明，e g f r 基因拷贝数增加或者过度表达，均能促进正常细胞的转化和恶 性肿瘤的转移。e g f r 的信号传导网络在肿瘤的形成和发展过程中占了重要的地 位。 e g f r 的信号通路传导始于配体诱导的二聚化作用【图7 】。配体与受体结合后， 引起受体的二聚化，形成同型或异型二聚体。二聚化的受体发生交联磷酸化，即 一个受体使另外一个受体上特定酪氨酸残基磷酸化，激活胞内区的酪氨酸激酶 ( t k ) 亚区，从而激发下一级信号传导。t k 亚区随着二聚体的形成及c 末端酪 氨酸的磷酸化而被激活是信号传导的第一步。受体c 末端上特定的酪氨酸残基被 磷酸化，为具有s h 2 ( s r eh o m o l o g y2 ) 结构域或者p t b 结构域的蛋白质信号分子提供 停泊位点【2 4 】，这些信号分子包括：衔接蛋白( 如s h e 、c r k 、g r b 2 、g - r b 7 、o a b l 、 d o k - r ) ，激酶( 如s r c 、c h k 和p 1 3 k ) ，蛋白酪氨酸磷酸酶( 女i s h p l 和s h p 2 ) 。s h e 蛋 第7 页 华东师范大学2 0 0 7 届硕士学位论文 白通过p t b 结构域与e g f r 的c - 末端t y r l1 7 3 和t y r l1 4 8 结合，通过s h 2 结构域 与t y r l1 7 3 结合；p l c 结合至u t y r l1 7 3 和t y r 9 9 2 ；g r b 2 结合至l j t y r l 0 6 8 、t y r l 0 8 6 ； s h p i 结合至l j t y r l l 7 3 。近膜信号经过细胞质中各种衔接蛋白、酶等的级联反应到 达核内，最主要的信号通路包括m a p k 通路、p 1 3 k 通路、c _ s r c 通路。 + + + + + + 凋亡迁移黏附细胞周期进程分化增殖 图7b g f r 信号通路图 g o i 等【2 5 研究发现e g f r j 恿过r a l g t p a s e 间接使酪氨酸激酶c s r e 活化，活 化的c s r e 接着磷酸化s t a t 3 和c o r t a c t i n 蛋白，前者为转录激活因子；后者能够 分别与丝状肌动蛋白和a r p 2 3 蛋白复合物结合，增强两者间的相互作用，促进肌 动蛋白的聚合 2 6 】，成为细胞运动的主要驱动力，见图7 左侧路线。 3 细胞骨架与e g f r 的关系 外界信号到达膜上，引起细胞的快速反应之一是膜下微丝网络的结构变化， 导致细胞形态学和底物粘附力的改变。微丝被认为是该过程信号传导中必经的环 节和组成部分。很多实验结果表明e g f r 的激活与微丝骨架有关联，a e t i n 多聚化 受e g f r 与细胞骨架结合的调控 2 7 ，2 8 ，2 9 。 e g f r 是酪氨酸激酶型受体家族细胞膜受体，它的过度表达会导致细胞增殖失 第8 页 华东师范大学2 0 0 7 届硕士学位论文 控，同时使细胞更容易发生转移 3 0 ，3 l 】。在外界的刺激下，它通过与配体e g f 的结合，诱发二聚化并启动膜内t k 域的自我磷酸化，将e g f r 活化并转变为高亲 和性组群【3 2 ，通过下游信号通路将信号传至细胞核内，从而改变细胞增殖、附 着、运动等宏观性质。有证据表明，在e g f r 的t k 域附近的残基a a 9 8 4 9 9 6 之 间有细胞骨架a e t i n 的结合位点 2 8 ，3 2 ，而该结合位点还与人体白血病的产生有 密切关系 3 3 】。一旦高亲和性e g f r 被纤维化a e t i n ( f a e t i n ) 细胞骨架结合，会导 致e g f r 自我磷酸化消失，使e g f r 转变为低亲和性组群 3 2 1 ，进入代谢循环。因 此，e g f 和f a c t i n 分别行使着e g f r 信号通路的“开”和“关”的功能 3 2 ，3 4 。 f - a e t i n 结合到e g f r 上，形成e g f r - f a e t i n 信号通路( 图8 ) ，决定细胞的迁移 性。e g f r f a c t i n 信号通路是细胞感受外界刺激和自我适应、调节的一个重要信 号途径。环境信号激活e g f r ，使激活信号在全细胞范围内均匀分布，然后通过 e g f r f a c t i n 信号通路将外界信号转化为a e t i n 骨架的局域性反应，从而调节和 改变细胞运动- 迁移的方式和方向【3 5 】。e g f r 的激活是a c t i n 多聚化激活的先决条 件，也是细胞骨架f - a e t i n 响应外界刺激的一个先决步骤【3 5 】。 图8 受体一细胞骨架信号通路( 参照陈主初主编的病理生理学，2 0 0 5 年，第一版。p 5 1 ， 图4 1 0 ，有少许补充) 第9 页 华东师范大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第三节本文的研究目的和意义 电磁场辐射可能导致各种健康效应已被普遍认同。电磁场辐射作为一种特殊 的污染，己引起人们越来越多的关注。许多国家都在电磁场生物和环境效应上进 行了大量的研究，以制定相应的电磁辐射防护安全标准。随着电气化的发展，人 类暴露在电磁辐射中的强度、时间与日俱增，极低频磁场( e l f m f ) 与肿瘤发 生的关系及机制成为目前环境健康研究工作中最主要的挑战之一。至于环境弱电 磁场的微弱刺激如何激发出强大的生物学应答，越来越多的证据表明，弱电磁场 首先通过细胞膜将物理信号转换成生物信号，再将生物信号放大而导致生物学效 应的产生。因此，将细胞跨膜信号转导的研究成果和方法用于解释e l f m f 非热效 应的机理正在被广泛接受 3 6 1 。 肿瘤细胞的显著特征包括细胞增殖失控及细胞迁移性改变，而细胞的这些生 命活动都与生长因子受体和细胞骨架的信号通路密切相关。在调节细胞的增殖， 迁移，分化和凋亡中起到重要作用的表皮生长因子受体( e g f r ) 与细胞微丝骨架 紧密关联，两者在肿瘤细胞和正常细胞中表达差异明显。 e g f r 隶属于酪氨酸蛋白激酶受体家族，酪氨酸激酶受体家族在一系列恶性肿 瘤的发生发展中起重要作用。在动物实验和人体肿瘤的研究发现，由于e g f r 及其 配体表达失调所致的异常e g f r 信号传导与肿瘤密切相关。已知6 0 的肿瘤中存在 着e g f r 过度表达，尤其在实体瘤中如乳腺癌，头颈部肿瘤，非小细胞肺癌，前列 腺癌中，e g f r 的表达率更高。e g f r 的高表达可以促进肿瘤细胞的增殖、血管生 成、黏附、侵袭和转移，抑制肿瘤细胞的凋亡，e g f r 高表达的肿瘤患者易发生转 移，复发时间短，复发率高、存活期短。因此，表皮生长因子已成为最常见的基 因治疗的靶点之- - 3 7 ，3 8 。 已经发现，在多种肿瘤细胞中，f - a c t i n 被大量修饰【3 9 】，并发现f a c t i n 细胞骨 架功能相关的一些重要的信号分子，如p 1 3 k ，p l c - ，g e l s o l i n 等活性和或协同表 达的上调等与乳癌等癌症的发生和术后转移密切相关 4 0 ，4 1 ，4 2 。肿瘤细胞与正 常细胞的细胞骨架有明显的差异，通常肿瘤细胞的微丝骨架不完整或已受损，微 丝走行不如正常细胞规贝j j 4 3 。细胞骨架的异常改变己成为反映肿瘤细胞的恶性的 生物学行为的特征之一，特别是细胞内微丝束的破坏与转化细胞和动物肿瘤的高 转移性明显相关r 4 4 。细胞的转移过程中形成的板状伪足和丝状伪足这两个富 含f a c t i n 的细胞结构与细胞的运动密切相关1 4 3 】。外界的物理和化学刺激( 如致癌因 子 4 5 】、可见光 4 6 】、紫外光、离子辐射等 4 7 】) 可以改变细胞骨架的性质和功能。 由此可见，f a e t t n 细胞骨架在肿瘤细胞的转移中起着至关重要的作用，是外界刺激 导致细胞病理变化的潜在的作用点。 第1 0 页 华东师范丈学2 0 0 7 届硕士学位论文 有报道称，在配体缺或的情况下，0 4m t ，5 0h z 交流磁场可诱导c h l 细胞 e g f r 的聚集 4 8 1 ，我们前期的实验结果表明：0 4m t ，5 0h z 交流磁场引起的离 体和在体e g f r 聚集能被e g f r 特异性酪氨酸激酶抑制剂p d l 5 3 0 3 5 抑制 4 9 ，5 0 l 。 就e g f r 信号系统而言，配体受体结合导致的受体二聚化是启动信号转导、激活 e g f r 激酶活性的最初和关键一步 5 1 1 。因此，磁场能诱导e g f r 聚集，就可能启 动e g f r 的信号系统，激活e g f r 的t k 域活性，进而对与之紧密相连的微丝骨 架产生影响，我们研究工频磁场刺激对细胞骨架的影响旨在探索e l f - - m f 与肿瘤 发生的可能关系及机制。 本文中我们研究了工频弱磁场辐照对c h l 细胞和f l 细胞微丝骨架的影响，并 进一步探讨了这种影响可能的机制，从细胞分子生物学水平上揭示电磁污染的生 理病理性效应，为探讨电磁辐射是否具有诱癌或非致癌作用提供实验证据，为卫 生防治措施的探讨以及环境电磁辐射健康风险评估提供科学依据。 第1 1 页 华东师范丈学2 0 0 7 届硕士学位论文 第二章材料与方法 第一节试剂 p h a l l o i d i n - t r i t c ( c a t ：p 1 9 5 1 ，s i g m a ) ，d a p i ( 4 , 6 一d i a m i d i n o 一2 一p h e n y i n d o l e ，c a t ： d 9 5 6 4 ，s i g m a ) ，a c t i n ( c a t ：a 3 6 5 3 ，s i g m a ) ，e g f r ( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r , c a t ：e 2 6 4 5 ，s i g m a ) ，e g f r 一抗( 1 0 tn o ：g 0 8 0 4 s a n t ac r u zb i o t e c h n o l o g y ) ，a c t i n 一抗( c a t ：b s