（生理学专业论文）gaba对小鼠回肠平滑肌自主收缩活动的影响.pdf

华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 g a b a l - a r g n o s o d q c g m p l n n a v d s g c g t p p ( r p n a n c a ( 、h n a d m s o p b s 英文缩略词表 g a m l x l aa m i n oa c i d l - a r g i n i n e n i t r i co x i d es j 6 a s c 1 h 一( 1 , 2 4 ) o x a d i a 2 0 1 0 - ( 4 , 3 一a ) q u i n o x a l i n 1 一o n e g u a n o s i n e3 5 - c y c l i cm o n o p h o s p h a t e n - - n i t r o - l - a r g i n i n e v a s o a c t i v ei n t e s t i n a lp e p t i d e s o l u b l eg u a n y l a t ec y c l a s e g u a n o s m et r i p h o s p h a t e a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e n o n - - a d r e n e r g i cn o n c b o l i n e r g i c a c e t y l c h o l i n e n o n a d r e n a l i n e d i m e t h y ls u l f l x i d e p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n y 一氨基丁酸 左旋精氨酸 一氧化氮合酶 可溶性鸟苷酸环化酶 抑制剂 环磷鸟苷 广谱型n o s 抑制剂 血管活性肠肽 可溶性鸟苷酸环化酶 三磷酸鸟苷 三磷酸腺苷 非。肾上腺索非胆碱能 乙酰胆碱 去甲肾上腺素 二甲基亚砜 磷酸缓冲液 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 g a b a 对小鼠回肠平滑肌自主收缩活动的影响 华中科技大学同济医学院生理教研室 研究生：田琴 导师：胡还忠 摘要 j e s s e n 等人就证实g a b a 不仅存在于中枢神经系统，还广泛的分布在胃肠道 等外周神经系统中【1 】o 有研究表明g a b a 对大鼠，豚鼠，猫和狗等动物消化道平 滑肌自主收缩活动产生影响，其作用效果因动物的种类和胃肠的部位不同而不 同。产生这种现象的原因可能是g a b a 的受体分布不同或对非肾上腺能非胆碱能 神经作用的缘故，但确切的原因还不十分明确。但g a b a 在小鼠回肠内的分布及 对小鼠平滑肌自主收缩的作用影响的研究尚未见报道。本实验运用免疫组织化学 的方法检查了g a b a 在小鼠回肠的分布；以小鼠回肠肌条收缩幅度变化为指标， 观察了g a b a 对小鼠回肠肌条自主收缩的抑制作用以及一氧化氮合酶( n o s ) 抑制 剂l n n a ，可溶性鸟苷酸环化酶( s g c ) 抑制剂o d q ，1 3 一受体抑制剂普萘洛尔 ( p r o p r a n o l 0 1 ) 对g a b a 抑制作用的影响。初步讨论了g a b a 对小鼠回肠自主收 缩作用时与n o ，a g m p 和b 一受体的相互关系。 实验结果： 1 小鼠回肠粘膜层及粘摸下层也有g a b a 阳性细胞和纤维分布：平滑肌肌层 可见g a b a 免疫反应阳性。 2 g a b a ( 1 l o 6 1 1 0 3 m o l l ) 抑制了小鼠回肠平滑肌自主收缩幅度。各 浓度g a b a 的幅度与对照组均有统计学差异( p o 0 5 ，n = 7 ) 。 4 n o s 抑制剂l _ n n a ( 1 l o m o l l 孵育标本后，再加入g a b a ( 1 1 0 “ m o l l ) 后，幅度抑制百分率为( 1 5 9 3 8 ) ，比单独同浓度的g a b a 的抑制百 分率下降，差别有统计学意义( p 0 0 5 ，n = 5 ) 。 与单独加入1 x 1 0 1 m o l lg a b a 相比，其抑制百分率由( 3 3 2 7 3 ) 下降到( 4 8 1 3 ) ，两者相比差异有显著统计学意义( p o o l ，n = 5 ) 。 6 用l - a r g ( 5 i 0 一h o l l ) 孵育标本1 5 m i n ，1 i 0 1 m o l lg a b a 幅度抑制百 分率仅为( 7 1 1 8 ) ，与单独同浓度的g a b a 幅度抑制百分率( 3 5 1 7 3 ) 相 比，差异有统计学意义( p o 0 5 ，n = 6 ) 。 7 用p r o p r a n o l o l ( 3 1 0 6 m o l l ) 孵育标本1 5 m i n ，再加入lx1 0 。6m o l l g a b a ，其幅度抑制百分率为( 1 4 6 + 2 6 ) ，与单独同浓度的g a b a 幅度抑制百分 率( 3 4 4 7 2 ) 相比，幅度抑制百分率降低，其差别具有统计学意义( p 0 o l ， n = 6 ) 。加入p r o p r a n o l o l 后使lxi 0 1 m o l lg a b a 的幅度抑制百分率比单独同浓 度的g a b a 的幅度抑制百分率降低，其差异也有统计学意义( p o 0 5 ，n = 6 ) 。 结论： 小鼠回肠有g a b a 能纤维分布。g a b a 对小鼠回肠自主收缩主要起抑制作用， 这种抑制作用与g a b a 受体所介导的c l _ 通道无关，而受n o 和b 一肾上腺素能受体 活动的影响。 关键词： g a b a b 一肾上腺素能受体n 0 回肠平滑肌 4 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 e f f e c to fg a b ao ns m o o t hm u s c l es p o n t a n e o u sc o n t r a c t i o n a c t i v i t i e so fm o u s ei l e u m t u t o r ：h uh u a n z h o n g c a n d i t a t i o n ：t i a nq i n a b s t r a c t j e s s e n sr e s e a r c h e sc o n f i r m e dt h a ty a m i n o b u t y t r i ca c i d ( g a b a ) i sn o t o n l yb e e ni nt h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ，b u ta l s ob e e ni nt h ep e r i p h e r a l n e r v o u ss y s t e m ss u c ha se n t e r i cn e r v o u ss y s t e m g a b am a ym o d u l a t et h e g a s t r o i n t e s t i n a lm o t i l i t i e so fr a t 、g u i n e a - d i g 、d o ga n dc a t s o m e r e s e a r c h e ss u g g e s tt h a te f f e c to fg a b ao nt h eg a s t r o i n t e s t i n a l s p o n t a n e o u sc o n t r a c t i o ni sv e r yc o m p l e x ，d e p e n d i n go nt h ep o s i t i o nw i t h i n t h eg a s t r o i n t e s t i n a lt r a c ta n dt h ea n i m a ls p e c i e ss t u d i e d t h ec o m p l e x a c t i o n so fg a b am a y b er e l a t et ot h ed i f f e r e n tt y p er e c e p t o r so fg a b ao r t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nn o n a d r e n e r g i cn o n c h o l i n e r g i cn e u r o n sa n dg a b a t h ee x a c tr e a s o n sw e r en o ts u r e f e wr e p o r t s ，h o w e v e r ，w e r ef o u n d e da b o u t d i s t r i b u t i o no fg a b ai nt h ea l i m e n t a r yt r a c ta n de f f e c t so fg a b ao n s p o n t a n e o u sc o n t r a c t i o no ft h es m o o t hm u s c l ei nm i c e i no u r e x p e r i m e n t s ， u s i n gt h ei m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o d ，t h e d i s t r i b u t i o n so fg a b aw e r ee x p l o r e di nt h em o u s ei l e u m t h ec o n t r a c t i o n c h a n g e so ft h ei s o l a t e ds m o o t hm u s c l es t r i p sw e r er e c o r d e db yt e n s i o n t r a n s d u c e r ，a n dt h ec h a n g eo ft h et e n s i o nw a su s e da st h em a r k e rt o e v a l u a t et h ee f f e c t so fg a b a t h ee f f e c t so fg a b ao nt h ec o n t r a c t i o no f m o u s ei l e u ma n dt h ei n f l u e n c eo fl - n n a ，o d q ，p r o p r a n o l o lo nt h ea c t i o n 5 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 o fg a b aw e r ea n a l y z e d w ea l s oi n v e s t i g a t e dt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e ng a b a a n dn o ，b - r e c e p t o r r e s u l t s ： 1 t h ep r e s e n c eo fg a b ae r g i cn e u r o n si nt h em y e n t e r i cp l e x u sa n d s u b m u c o s a ln e u r o n sw e r ed e m o n s t r a t e di nt h ei l e u mo fm o u s e 2 4 5 6 7 g a b ai n h i b i t e dt h es p o n t a n e o u sc o n t r a c t i o no fm o u s ei l e u ma tt h e c o n c e n t r a t i o n sr a n g i n gf r o m ”l i 0 - 6t o1 l o - 3 m o l l ( p o 0 5 ，n = 7 ) w h e ng a b a( 1 i 0 6 m o l l )w a sa d d e di n t h e p r e s e n c e o f l - “n n a ( 1 1 0 m o l l ) ，i n h i b i t i o no fn i t r i co x i d es y n t h a s e ( n o s ) ，t h e a m p l i t u d ei n h i b i t o r yp e r c e n tw i t h ( 1 5 9 3 8 ) w a ss i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n tf r o ma m p l i t u d ei n h i b i t o r yp e r c e n t o f s i n g l e g a b a ( 1xl o “m o l l ) ( p o 0 5 ，n = 6 ) o d q ( 1 1 0 1 m o l l ) w a su s e dt oi n c u b a t et h ep r e p a r a t i o n sf o r1 5m i n b e f o r ea d d i t i o no fg a b a ( 1 l o “m o l l ) t h ec o n t r a c t i o na m p l i t u d e s c h a n g e df r o m ( 0 3 5 0 0 5 ) gt o ( 0 3 4 0 0 5 ) g t h e y d i dn o t c h a n g e d t h ep e r c e n to ft h ei n h i b i t i o na m p l i t u d e sr e d u c e df r o m ( 3 3 2 7 3 ) t o ( 4 8 1 3 ) t h e yh a v es t a t i s t i c a ls i g n i f i c a t i o n t h a t i st os a y ，o d qr e d u c e dt h ei n h i b i t o r ye f f e c t so fg a b a w h e nt h ep r e p a r a t i o n sw e r ep r e i n c u b a t e dw i t hl - a r g ( 5xi 0 m o l l ) ， t h ee f f e c to fg a b aa tt h ec o n c e n t r a t i o no f1xl o “m o l lw a sf a ll e n b u t t h ee f f e c to fg a b aa tt h ec o n c e n t r a t i o no fl 1 0 3 m o l lh a dn o s i g n i f i c a n tc h a n g e p r o p r a n o l o l ( 3 i 0 m o l l ) i n h i b i t e dt h e e f f e c to fg a b aa tt h e 6 兰主登蔓查兰旦篓垦堂堕 堡圭兰焦丝苎 c o n c e n t r a t i o no f1 1 0 1 m o l la n di 1 0 o l l a f t e rt h es t r i p sw e r e p r e t r e a t e dw i t hp r o p r a n o l o l ( 3 xl o m o l l ) ，t h ei n h i b i t o r yp e r c e n t o fc o n t r a c t i l ea m p l i t u d eo fg a b a ( ix 1 0 1 m o l l ) r e d u c e df r o m ( 3 4 4 - - + 7 2 ) t o ( 1 4 6 - + 2 6 ) c o m p a r e dw i t hs i n g l eg a b a ( i l o 。6 m o l l ) c o n cl u s i o n ： g a b a e r g i cf i b e r sd i s t r i b u t e di nm o u s ei l e u m g a b ai n h i b i t e dt h e s p o n t a n e o u sc o n t r a c t i o no fm o u s ei l e a cs m o o t hm u s c l e ，t h i si n h i b i t o r y e f f e c ti si n f l u e n c e db yn oa n dt h ee x c i t a t i o no f b r e c e p t o r b u tt h e e f f e c ti si n d e p e n d e n to ft h ec 1 一c h a n n e lt h a tg a t e db yg a b a r e c e p t o r k e yw o r d s ： g a b a ，n o ，8r e c e d t o r ，s m o o t hm u s c l e ，i l e u m 7 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 第一部分用免疫组织化学方法检查g a b a 在小鼠回肠中的 分布 刖百 肠道神经系统( e n s ) 是独立于交感、副交感神经的自主外周神经系统：由 肌间神经丛和粘膜下神经丛所组成，并由兴奋性神经元、抑制性神经元及有关递 质按一定规律组成局部反射回路，支配从食管起到肛门为止的整个消化道，调节 胃肠活动，被称为胃肠的“小脑”【2 】og a b a 是胃肠道n a n c 能神经的主要递质之 一，起抑制性作用。应用免疫组化对大鼠、豚鼠动物的胃肠道的g a d a 的分布进 行研究，结果表明，胃肠道肌间神经丛和粘膜下神经丛分布有较多的g a b a 能神 经元分布， 1 - 2 。 j e s s e nk p 用3 h g a b a 孵育分离的豚鼠回肠及三段结肠肌间神经丛，观察 到所有的神经节均被标记，其中结肠内神经节标记强度高于回肠。用相同的方法 证明g a b a 存在于大鼠消化道内各部位的神经丛中“。g a d 是g a b a 合成的限速酶。 用r n a 蛋白序列测定方法证实g a d 6 5 和g a d g 7 的m r n a 都存在于大鼠的小肠组织中。 在不同种动物或同种动物消化道的不同部位，g a d 的类型、分布层次、密度及数 量都有所不同删。 g a b a f b 性细胞不仅存在神经元中，而且在大鼠的胃粘膜细胞和豚鼠的小肠 粘膜及内分泌细胞都有g a b a 免疫样阳性反应。但有关g a b a 在小鼠消化道，特 别是小鼠回肠中的分布的研究尚未见报道。 本工作用免疫组化的方法检查g a b a 特异性免疫反应阳性结构在小鼠回肠 中的分布，为机能学实验提供形态学基础，有利于对g a b a 在消化系统中的作用 及其生理学意义进行深入探讨。 1 试剂与溶液 材料和方法 8 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 多聚甲醛购于g i b c o n 公司，兔抗鼠g a b a 多克隆抗体购于s i g m a 公司， d o w s p “免疫组化双染试剂盒购于福建迈新生物工程有限公司。 p b s 液体( m m o l l ) ：n a c l0 1 ，n a 2 h p 0 40 1 ，n a h 2 p o , 0 1 p h = 7 3 - 7 4 2 实验方法 2 1 免疫组织化学染色： 2 1 1 免疫组织化学染色步骤： ( 1 ) 以1 戊巴比妥钠( 1 m g k g ) 腹腔注射麻醉小鼠； ( 2 ) 打开腹腔； ( 3 ) 取材：以回盲部为标志取回肠组织； ( 4 ) 0 1 m o l lp b s 漂洗3 次； ( 5 ) 4 多聚甲醛液( 以0 0 1 m o l lp b s 配制，内含1 蔗糖、o 5 叠氮钠) 固定3 6 h ： ( 6 ) 自来水冲洗干净； ( 7 ) 上升梯度酒精脱水( 每次1 2 h ) ； ( 8 ) 香柏油透明1 2 h 2 次； ( 9 ) 石蜡包埋： ( 1 0 ) 石蜡切片4 - 5 m ； ( 1 1 ) 6 0 7 0 烘片4 - 6 h ： ( 1 2 ) 脱蜡( 4 5 6 0 ) ； ( 1 3 ) 自来水漂洗； ( 1 4 ) 0 1 m o l lp b s 漂洗； ( 1 5 ) 微波炉高中低火各5 m i n 进行抗原热修复； ( 1 6 ) 自然冷却； ( 1 7 ) 3 过氧化氢( 新鲜配制) 1 8 e 3 0 1 0 m i n ； ( 1 8 ) 0 0 1 m o l lp b s 漂洗，3 m i n 3 次； ( 1 9 ) 吸去p b s ； ( 2 0 ) 滴加正常非免疫动物血清1 0 m i n ： ( 2 1 ) 滴加兔抗鼠g a b a 多克隆抗体( 一抗) ( 1 ：1 0 0 ，1 ：2 0 0 ) ，4 e 冰箱过夜： 9 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 ( 2 2 ) 回温( 至室温) ； ( 2 3 ) 3 7 2 h ： ( 2 4 ) 0 o l m o l lp b s 漂洗，5 m i n x 3 次； ( 2 5 ) 除去水分； ( 2 6 ) 滴加生物素标记的二抗1 8 3 0 。c2 0 m i n ； ( 2 7 ) 0 o l m o l lp b s 漂洗，3 m i n 3 次； ( 2 8 ) 除去水分； ( 2 9 ) 滴加辣根过氧化物酶标记的链卵白素，1 8 3 0 c2 0 m i n ( 3 0 ) 0 o lm o l lp b s 漂洗，5 m i n 3 次； ( 3 1 ) 0 0 1 h 。0 ：d a b ( 新鲜配制) 显色，3 l o m i n ； ( 3 2 ) h a r r i s 苏木素复染： ( 3 3 ) 0 1 盐酸酒精分化； ( 3 4 ) 1 氨水返蓝； ( 3 5 ) 上升梯度酒精脱水； ( 3 6 ) 二甲苯透明； ( 3 7 ) 加拿大树胶封片。 ( 3 8 ) 光镜观察拍片。 2 1 2 免疫组织化学显色对照实验： ( 1 ) 以非免疫动物血清替代一抗，其他步骤相同。 ( 2 ) 以波形蛋白替代g a b a 抗体，显色步骤相同。 结果 组织化学方法显示的g a b a 阳性反应产物呈褐黄色颗粒。在小鼠回肠腺上 皮基底部g a b a 阳性反应产物呈带状分布；皱襞中央显示g a b a 阳性反应；回肠粘 膜下层g a b a 免疫反应阳性产物呈条状分布；小鼠回肠肌层内可见g a b a 特异免疫 反应阳性( 见图1 ) 。 讨论 免疫组化二步法为免疫酶标抗体法的简称，也为间接法。该方法法所用的 i 0 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 第一抗体是细胞组织内抗原的特异性抗体。第二抗体为用酶标记的第一抗体的抗 体。优点在于用同一种酶标记抗体，可以与多种一抗结合检查，放大了抗原抗体 结合的信号，能有效得降低背景着色，具有较高的特异性。 本实验结果显示，小鼠回肠肠壁粘膜下层和粘膜层有g a b a 分布。 胃肠的神经支配包括内在神经系统和外来神经系统两大部分。胃肠内在神 经系统又称肠神经系统，是由存在于消化管壁内无数的神经元和神经纤维组成的 复杂的神经网络。包括粘膜下神经丛和肌间神经丛。 我们实验结果显示，小鼠回肠组织中神经系统和粘膜层的g a b a 样阳性反 应，提示g a b a 可能作为肠内在系统的神经递质之一或和内分泌物质参与对回 肠平滑肌的运动和腺体分泌活动的影响。 g a b a 在小鼠回肠内分布的免疫组织化学实验，为机能学实验研究提供了 形态学基础。 1 1 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 第二部分：观察g a b a 对小鼠回肠运动的影响 刮f百 近几十年，g a b a 在胃肠系统的分布和作用越来越引起人们的兴趣。形态学 的研究表明g a b a 及其合成酶谷氨酸脱羧酶( g a d ) 存在于小肠的一些神经元上“。 从小肠到结肠的壁内神经丛中存在g a b a 样免疫阳性神经元，g a b a 能神经纤维从 肠肌层到粘膜外层都有分布0 1 。我们的免疫组织化学实验研究发现，小鼠回肠内 在神经系统和粘膜内有g a b a 样免疫阳性反应。利用免疫组织化学方法和体外杂 交技术证明在大鼠的胃，小肠和大肠的粘膜下层和肠肌层存在b i c u c u l l i n e 敏感 的g a b a 。受体和p a c l o f e n 敏感的g a b a 。受体”“。在培养的豚鼠小肠肌层神经元中 也有明显的g a b a 。受体表达嘲。 机能学实验研究表明，根据动物的种类不同、同种动物胃肠的具体部位不 同，g a b a 。和g a b a 。受体所引起胃肠运动的作用也不完全一样。g a b a 和g a b “受体 激动剂可引起非肾上腺素能非胆碱能( n a n c ) 抑制性中间神经元的兴奋，导致豚 鼠结肠平滑肌的舒张“。这种舒张现象在大鼠十二指肠，狗的回盲部也可观察到 o “。g a b a 还可能通过中间神经元上的g a b a 。受体，与其他递质共同发挥作用“。 g a b a 通过g a b a 。受体抑制突触前神经末梢c a 2 + 的内流，减少乙酰胆碱的释放，使 平滑肌的舒张“3 1 “3 。g a b a 。受体激动剂b a c l o f e n 可使豚鼠结肠的平滑肌产生舒 张效应“。g a b a 作用于g a b a 。受体，也能对n a n c 神经元的机能活动产生影响、 并与其他神经递质之间存在相互作用“。还有人发现，g a b a 受体的活动可引 起豚鼠的回肠和结肠兴奋反应，认为是促进了乙酰胆碱的释放而产生的结果。1 。 g a b a 。受体不仅存在视网膜上，有研究证明在小鼠神经内分泌肿瘤细胞 s t c 一1 上也有g a b a 。受体m r n a 的表达“。g a b a c 受体可使细胞内的c a 2 + 浓度增加， 表明g a b a 在调节消化道内分泌腺的活动也可能起重要的生理作用。 对大鼠，豚鼠，猫的离体胃肠道平滑肌运动的生理学研究表明，g a b a 通过 g a b a ，g a b & 受体产生作用“”“。但有关g a b a 对小鼠胃肠平滑肌，特别是回肠 1 2 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 平滑肌影响的研究尚未见报道。g a b a 对胃肠道运动作用的具体机制的阐明也还 有待进一步的研究。 n o 是胃肠道n a n c 神经元释放的一种递质，对大鼠空肠环形肌，豚鼠结肠纵 形肌，小鼠胃电活动和机械活动、十二指肠、空肠及回肠的自主收缩均有抑制作 用。”“。人们认为n 0 为一种脂溶性的气体分子，可迅速扩散至其靶细胞，并通 过细胞膜进入胞浆，与胞内的s g c 分子中亚铁血红素结构上的f e ”结合，通过改 变s g c 蛋白分子空间构型提高酶活性，被激活的s g c 催化胞内g t p 转变为c g m p ， 使胞内c g m p 浓度增加。c g m p 作为第二信使，一方面降低胞内c a 2 + 浓度，引起肌 肉张力降低，收缩力减弱；另一方面使c g m p 依赖性蛋白激酶g ( p k g ) 活性升高， 促进肌蛋白磷酸化，导致平滑肌舒张。有资料表明，在大鼠十二指肠中，g a b a 能通过n a n c 神经释放n o 引起十二指肠的舒张“。 g a b a 在小鼠回肠是否也通过c g m p 途径或者影响n o 而发挥作用? 其作用与 b 一受体对胃肠道运动的抑制有何关系? 临床研究表明g a b a 与胃肠系统某些疾病有着密切关系。g a b a 能加重十二指 肠溃疡病，g a b a 。受体激动剂b a c l o f e n 能减轻溃疡的程度和范围。在胃癌组织中 g a b a 含量高于正常组织，使用g a b a 以及g a b a 。受体激动剂b a c l o f e n 可抑制胃癌 的生长o ”。此外，g a b a 还在肠易激综合征、胃一食管反流病等胃肠运动障碍疾 病的发病中起到重要作用o 。因此，对g a b a 的深入研究，将有助于为讨论g a b a 对胃肠道平滑肌的生理作用及其作用机制、阐明胃肠道相关疾病的发生，发展和 建立有效的防治措施提供实验依据。 本部分工作主要观察g a b a 对小鼠回肠平滑肌自主收缩活动的影响，并初步 探讨g a b a 的作用与n o ，c g m p 和b 一受体之间的关系。为深入开展对消化道平滑 肌运动生理学调控机制的研究奠定基础。 材料与方法 1 试剂与溶液 g a b a ，p i c r o t o x i n ，l - n n a ，o d q 等试剂购于s i g m a 公司。l - a r g 购于中国科 学院武汉分院( 日本生产，国内分装) 。p r o p r a n o l o l 购于上海三维制药有限公 司。n a c i ，k c i ，c a c l 。，m g s 0 4 ，n a h c o “k h 。p o 。，葡萄糖均为国产分析纯试剂。o d q 用 1 3 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 二甲亚砜( 国产分析纯) 配置，其他试剂用k r e b s 液配置到所需的浓度。文中 试剂溶液浓度均为浴液中的终浓度。 k r e b s 液( m m o l l ) ：n a + 1 3 7 4 ；k + 5 9 ；c a 2 + 2 5 ；m 9 2 + 1 2 ：c 1 1 3 4 ：h c 0 3 1 5 5 ； h 2 p 0 3 - 1 2 ；g l u c o s e1 1 5 。9 5 0 j i l l l0 2 + 5 0 m l lc 0 2 饱和；p h 值7 4 ； 2 实验方法 健康成年昆明雄性小白鼠大约6 0 只，体重3 5 9 左右，由华中科技大学同济 医学院动物中心提供。适应性喂养1 周。实验前小鼠禁食2 4 h ，自由饮水。颈椎 脱臼处死，迅速沿腹白线打开腹腔，从回盲部向上取回肠4 5 c m ，置于9 5 0 m l l o ：+ 5 0 m l lc o ：饱和的k r e b s 液中。在盛有k r e b s 液的培养皿中，用眼科剪 清除标本上的肠系膜并制成l c m 长的标本。将标本置于3 7 0 5 c 的恒温浴槽中， 恒温浴槽内装有9 5 0 i i l l l0 2 + 5 0 m l lc o 。混合气体饱和的k r e b s 液l o m l 。标本 的一端固定于恒温浴槽底部的通气钩上，另一端连于定标后的2 0 g j z l 0 0 型肌肉 张力换能器( 高碑市新航机电设备有限公司) 的应变梁上，换能器与 m e d l a b u 4 c s 生物信号采集处理系统( 南京美易) 连接，记录和处理标本自主 运动张力的变化。实验前给予标本0 5 9 的前负荷，平衡l h 左右，平衡期间每 1 5 m i n 换9 5 0 m l l0 5 + 5 0 m l lc o 。混合气体饱和的3 7 0 5 。ck r e b s 液1 次， 使标本的自主运动基本稳定( 张力的基线和幅度维持基本不变) 。实验试剂用微 量加样器直接在孵育液面下1 2 眦处沿管壁加入到恒温浴槽中，每次加药的容 积为i o o i j l ，加液总量不超过浴液的5 。药物使标本出现反应后，用9 5 0 m l l0 2 + 5 0 m l lc o ：混合气体饱和的3 7 0 5 ck r e b s 液冲洗2 3 次，要求收缩力基 本恢复到加药前的水平后再进行下一项实验。收缩力显著不能恢复的标本弃之更 换。如需加拮抗剂时，加入拮抗剂孵育1 5 m i n 后再加入激动剂。 3 数据处理 生物信号采集处理系统记录的收缩曲线变化高度作为肌条收缩幅度。以张力 变化幅度抑制百分率为统计指标。 幅度抑制百分率= ( 加药前收缩幅度- a n 药后的收缩幅度) 加药前收缩幅度 x1 0 0 。其中加药前的收缩幅度：加药前l m i n 内的平均收缩幅度( 有拮抗剂孵 育时为加激动剂前l m i n 内的平均收缩幅度) ；加药后的收缩幅度：5 m i n 内收缩 活动稳定后l m i n 内的平均幅度。 1 4 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 数据由s p s s l l 5 软件进行统计学分析。数据结果用平均值标准误( x s e ) 。 用配对t 检验进行比较组内加药前后的差异。多组间用方差进行检验，组间用 l s d 进行检验。p o 0 5 ) 。加入g a b a ，试剂终浓度分别为l 1 0 6m o l l ，1 1 0 m o l l ，l l o “ m o l l 和l 1 0 1 m o l l ，加药后l m i n 内出现收缩幅度下降，冲洗后收缩幅度基本 能恢复到加药前的水平。各浓度的g a b a 对小鼠回肠的自主收缩主要表现为抑制 作用( 见图2 ) 。1 1 0 1 m o l l 至1 1 0 6 m o l l g a b a 幅度抑制百分率分别为( 1 5 2 2 7 ) ，( 2 8 5 4 4 ) ，( 2 6 2 4 6 ) 和( 3 4 7 7 4 ) 。l 1 0 1 m o l l g a b a 加药前收缩幅度是( o 4 3 0 0 7 ) g ，加药后收缩幅度是( o 2 9 0 0 6 ) g 。l 1 0 1 m o l lg a b a 加入后使收缩幅度由( o 4 3 o 0 5 ) g 下降到( o 3 7 0 0 5 ) g ， 各浓度g a b a 加药前后都有统计学意义( p o 0 5 ，n = 7 ) ( 见图3 ) 。 3 l - n n a 对g a b a 作用的影响 预先用n o s 的抑制剂l - n n a ( i i 0 5 m o l l ) 孵育标本1 5 m i n 后，再加入ix i 0 “m o l l g a b a 其自主收缩幅度由( 0 3 9 0 0 4 ) g 变为( 0 3 2 o 0 4 ) g ，变化有统 计学意义( p o 0 5 ，n = 6 ) 。其抑制百分率为( 1 5 9 3 8 1 ) ，比单独同浓度 的g a b a 幅度抑制百分率( 3 3 2 7 3 ) 下降，差别有统计学意义( p 0 0 5 ，n = 5 ) ( 见 图4 ) 。与单独加入1 1 0 o l lg a b a 相比，其抑制百分率由( 3 3 2 7 3 ) 下降 到( 4 8 1 3 ) ，两者相比差异有显著统计学意义( p o 0 1 ，n = 5 )( 见图5 ) 。 加入与o d q ( 1 1 0 1m o l l ) 等温等体积的二甲亚砜对1 1 0 1 m o l lg a b a 的抑 制作用无影响。 5 l a r g 对g a b a 抑制效应的影响 用l - a r g ( 5 1 0 1 m o l l ) 孵育标本1 5 m i n ，加入浓度为l i 0 6 m o l l 的g a b a ， 标本的自主收缩幅度抑制百分率仅为( 7 1 1 8 ) ，与单独同浓度的g a b a 幅度抑 制百分率( 3 5 1 7 3 ) 相比，差异有非常显著的统计学意义( p o 0 5 ，n = 6 )( 见图6 ) 。 6 p r o p r a n o l o l 对g a b a 抑制效应的影响 用p r o p r a n o ! o l ( 3 i 0 “m o l l ) 孵育标本1 5 m i n ，再加入1 1 0 “m o l lg a b a ， 其幅度抑制百分率为( 1 4 6 2 6 ) ，与单独同浓度的g a b a 幅度抑制百分率( 3 4 4 7 2 ) 相比，幅度抑制百分率降低，其差别具有非常显著的统计学意义( p 0 o l ，n = 6 ) 。加入p r o p r a n o l o l 后使1 1 0 3 m o l lg a b a 的幅度抑制百分率为( 9 9 9 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 1 0 9 ) 比单独同浓度的g a b a 的幅度抑制百分率( t 5 8 3 2 ) 降低，其差 异也有统计学意义( p 0 0 5 ，n = 6 ) ( 见图7 ) 。 讨论 g a b a 对小鼠回肠平滑肌的自主收缩起抑制作用。对照组加入与实验试剂 溶液等温等体积的k r e b s 液对肌条收缩活动没有影响，说明g a b a 导致小鼠回 肠平滑肌自主收缩活动受抑制是g a b a 的作用，而不是药物以外的其他因素的效 应。l i 0 6 m o l lg a b a 抑制率达到( 3 4 7 7 4 ) ，1 1 0 1 m o l l 的g a b a 抑制率 为( 1 5 2 1 7 2 ) ，两者有显著差别。1 1 0 - 3 m o l l 的6 a b a 对部分标本有增强 收缩的效应。低浓度的g a b a 对小鼠回肠主要表现抑制作用，但高浓度的g a b a 抑制作用减弱，部分标本出现增强收缩效应，与b a y e r 等人报道g a b a 对大鼠结 肠收缩运动作用结果一致，b a y e r 等人发现g a b a 在低浓度表现为抑制大鼠结肠 自主收缩运动的作用，高浓度时对大鼠结肠平滑肌出现了双相作用，即抑制收缩 后出现增强收缩活动的效应，或者单向的增强收缩的作用o ”。g a b a 。受体可通过 增加胆碱能纤维释放乙酰胆碱来增强小肠的自主收缩。g a b a 。受体在突触前通过 抑制c a ”通道使a c h 的释放减少而产生抑制作用“”。6 a b & 受体和g a b a 。受体可通 过对非肾上腺能非胆碱能神经活动的调节，来改变消化道平滑肌的运动功能。不 同浓度的g a b a 对小鼠回肠平滑肌自主收缩活动的双向影响可能与上述不同受体 的不同效应有关。 我们免疫组织化学实验的结果显示了粘膜层有g a b a 阳性细胞。阳性细 胞能分泌出g a b a ，发挥效应。k r a n t i sa 等人认为在大鼠十二指肠近端能够调节 胃肠粘膜血流量。g a b a 和b a c l o f e n 可使局部血流产生剂量依赖性下降，但不能 被b i c u c u l l i n e 阻断，表明g a b a 在小鼠回肠粘膜层可能参与了粘膜血流量调节。 小肠粘膜血流量的变化可改变小肠的机能活动状态。小肠状态的不同，药物所产 生的效应也不同。g a b a 的多种效应也可能与小肠粘膜血流量不同而引起小肠不 同的状态有关。所以，g a b a 在在体动物中对胃肠道的作用更复杂。 p i c r o t o x i n 是g a b & 受体所形成c l 一通道的抑制剂。用p i c r o t o x i n 孵育标 本后，各浓度的g a b a 抑制作用比各浓度单独的g a b a 抑制作用虽有所下降，但其 差异无统计学意义，说明g a b a 对小鼠回肠平滑肌的抑制作用不是通过g a b a 。受 1 7 华中科技大学同济医学院硕士学位论文 体所形成c l 一通道介导的，或者说g a b a 受体在此不起到主要作用，可能是通过 g a b a 。受体而产生抑制效应。 近年的研究表明，n o s 为一个双区结构，c 端为还原酶区，含有钙调蛋白 ( c a m ) 结合位点；n 端为氧化酶区，含有l - a r g 的结合位点，此区也与酶的催 化活性有关。l - a r g 进入神经末梢后，激活电压依赖式c a 2 + 通道，c a ”内流，使得 末梢内的c a ”浓度增加，激活n o s 。l - a r g 在n o s 的催化下，生成n o 。而l - n n a 是l 一精氨酸的类似物，它可以与l - a r g 竞争n o sn 端的结合位点，为广谱的n o s 的抑制剂，从而减少n o 的生成。 广谱型n o s 抑制剂l - n n a ( 1 1 0 m o l l ) 孵育标本后，抑制了g a b a 的抑 制作用，g a b a 幅度抑制百分率降低，差异有统计学意义。表明n 0 参与了g a b a 对小鼠回肠运动抑制作用。免疫组织化学证明g a b a 能神经纤维上n o s 阳性，n o s 阳性的神经细胞也可有g a b a 阳性哺3 。这也为