（微生物学专业论文）利用啤酒废酵母制备富铬酵母的研究.pdf

摘要 向培养基中添加无机铬( c r c l 3 - 6 h z o ) ，通过振荡培养制备富铬酵母。考察不同培养 条件( 包括培养基的种类：培养基中铬的添加浓度：培养基起始p h 值；振荡培养时间； 酵母添加量；培养温度等) 时制备富铬酵母的影响。 根掘单因素考察结果，以c r ”添加浓度、振荡培养时问、培养基起始p h 值及酵母添 加量为考察因素，设计个四因素三水平的正交实验。确定富铬酵母的最佳培养条件如 f ：采用麦芽汁为培养基；培养温度2 8 。c ；c r 3 + 浓度为6 0 毗m l ，培养基起始p h 为4 0 4 5 ，振荡培养时间为1 8 h ，啤酒酵母添加量为5 0 9 5 0 m u 培养基) 。 为进一步了解富铬酵母的富铬机理，采用红外分析法对空白废酵母和富铬酵母进行 了红外光谱分析。发现富铬酵母的红外吸收光谱图与空白酵母相比较有两处发生变化。 一是羟基的最大吸收位峰从3 3 1 7 c m 。蓝移至3 2 9 6 c m ，这可能是由于部分羟基参与了富 集，引起羟基最大峰位置蓝移。二是酰脓l i 带最大吸收峰由1 5 4 5 c m 。蓝移至1 5 3 8 c n 3 。 这神改变可能是由于酵母菌体上某些蛋白参与了对铬离子的富集。 氨基酸组成分析显示富铬酵母中各种氨基酸的含量大多高于未富铬的酵母样品，尤 其是赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等人体必需氨基酸的含量明显提高。 动物实验显示大鼠对富铬酵母中c r 3 + 的表观消化吸收率为8 9 0 3 ，巨大鼠对富铬酵 母这种有机铬形式的吸收率大大高于普通的无机铬盐。 关键词：富铬酵母；生物量；铬含量；红外光谱；正交实验；表观吸收率 a b s t r a c t t h r o u g ha d d i n gi n o r g a n i cc h r o m i u m ( c r c b 6 h 2 0 ) i n t o t h ec u l t u r e m e d i u m ， c h r o m i u m e n r i c h e dy e a s tw a sp r o d u c e db ym e a n so fs h a k i n gc u l t u r e e a c hk i n do fi n f l h e n c e f a c t o r so np r e p a r a t i o no fc h r o m i u m e n r i c h e dy e a s tfk i n do fc u l t u r em e d i u m ，c o n c e n t r a t i o no f c h r o m i u mi o i l ，i n i t i a lp ho fc u l t u r em e d i u m ，c u l t i v a t et i m e ，y e a s ta d d i n gq u a n t i t y , c u i t i v a t e t e m p e r a t u r e ) a r es t u d i e d a c c o r d i n gt ot h er e s u l to fs i n i g l ef a c t o rt e s t ，a l lo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ( f o u rf a c t o r sa n d t h r e el e v e l ) w a sd e s i g n e d ，t h es t u d i e df a c t o r sa r ec o n c e n t r a t i o no fc h r o m i u mi o n ，c u l t i v a t e t i m e i n i t i a lp ho fc u l t u r em e d i u ma n dy e a s ta d d i n gq u a n t i t y 1 飞eo p t i m u mc o n d i t i o ni sa s f o l l o w s ：t h ew o r ti sc h o s ea sc u l t u r em e d i u m ，c u l t i v a t et e m p e r a t u r ei s2 8 ，n l e c o n c e n t r a t i o no fc h r o m i u mi o ni s6 0 陬r 丌li n i t i a lp ho fc u l t u r em e d i u mi s4 0 4 5 ， c u l t i v a t et i m ei s1 8 h y e a s ta d d i n gq u a n t i t yi s5 0 9 5 0 m lc u l t u r em e d i u m i no r d e rt of i n do u tt h ec h r o m i u m e n r i c h e dm e c h a n i s m t h ed l r o m i u m e n r i c h e dy e a s t a n db l a n ky e a s tw e r ea n a l y z e db vi 1 1 f r a r e ds p e c t r u m ( m ) i ti ss h o w e dt h a tt h e r ea r et w o c h a n g e si nt h ei r t h ef i r s to n ei st i l a tm a xa b s o r p t i o np e a ko fh y d r o x y ls h i f t sf r o m 3 3 1 7 c m 。 t o3 2 9 5 c m1 、m a y b et h eh y d r o x y li n v o l v ee n r i c ho fc h r o m i u m t h es e c o n do n ei st h a tm a x a b s o r p t i o np e a ko fa m i d en ns h i f t sf r o m1 5 4 5 c m “t o1 5 3 8 c m m a y b es o m ep r o t e i ni nt h e y e a s ti n v , ) t v ee n r i c ho fc h r o m i u m t h ea m i d ea c i da n a l y s i ss h o w st h ec o n t e n to fa m i n oa c i d si nc h r o m i u me n r i c h e dy e a s t w a s h i 。g h e rt h a nt h a to fg e n e r a ly e a s t ，e s p e c i a l l yt h ec o n t e n t so fn e c e s s a r ya r a i n oa c i d s ，s u c h a sl y s i n e ，m e t h i o n i n e ，l e u c i n e ，i s o l e u c i n e a n i m a le x p e r i m e n ts h o w sa p p a r e n td i g e s t i v ea b s o r p t i v i t yo fr a ti s8 9 0 3 t h ed i g e s t i v e a b s o r p t i v i t yo fc h r o m i u me n r i c h e dy e a s t ，w h i c hi so r g a n i c ，b yr a t i s1 1 i g h e rt h a nt h a to f i n o r g a n i cs a l t k e yw o r d s ：c h r o m i u m e n r i c h e dy e a s t ；b i o m a s s ；c h r o m i u mc o n t e n t ；i n f r a r e ds p e c t r u m ； o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ；a p p a r e n td i g e s t i v ea b s o r p t i v i t y n x1 0 1 3 0 纵 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致 谢的地方外，论文中不包岔其他人l 二经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名j 兰坯垒 只期 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位 陵文的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机 构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：瑚 日期：迎：! ! ：! 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：径豳! ! 垡雯 通讯地址：出彳藉轴翰而强 f 指导教师签名：! 鱼盘 日期：州- ；口 电话：咝! ：鲤丝r 邮编：丛! 翌1 7 易 文献综述 1 1 啤酒废酵母的利用现状 目前我国啤酒工业年产啤酒约2 0 0 0 万吨，按每生产1 吨啤酒可回收废酵母 1 - 1 5 k g 计，每年能回收废酵母2 万。3 万吨。这是一种量大集中、营养丰富的可 再生资源。 目前国内大多数啤酒厂除将小部分酵母泥留作种子外，大部分连同其中残留 的啤酒直接排放掉，严重污染环境( 酵母泥的b o d 和c o d 均高达1 0 0 0 0 0 m g 几 以上) 。因此，啤酒废酵母这种生物资源的再利用应该引起重视。 啤酒工业产生的啤酒酵母有上面啤酒酵母和下面啤酒酵母。上面酵母发酵结 束后酵母细胞悬浮于液面，形成酵母泡盖。而发酵结束后下面酵母大部分凝集而 沉淀。我国啤酒生产主要利用下面发酵酵母。 在啤酒酵母细胞中，水约占7 5 8 5 ，干物质约占1 5 - 2 5 。在干物质中 蛋白质为4 5 5 5 ，脂肪3 7 ，主要是磷脂、固醇和不饱和脂肪酸，核酸约 占6 ，以及灰分约8 ，和大量糖类f 约3 0 ) 。 因酵母含有大量蛋白质和维生素，所以可加工成优质饲料。用饲料酵母喂养 畜禽可促进生长和改善肉的质量，喂貂可以改善皮毛质量，养蚕可增加产丝量。 酵母蛋白富有多种氨基酸，包括人体必需的8 种氨基酸，蛋白含量是牛羊肉的 2 - 3 倍，猪肉的3 - 4 倍，蛋类的5 倍，营养价值极高，且易吸收，所以又是人的 食品的理想原料【”。 目前国内外关于对啤酒废酵母的利用的研究很多，其中主要有以下几方面： ( 1 ) 利用啤酒废酵母生产酱油【2 , 3 , 4 , 5 1 将啤酒废酵母采用自溶科学工艺，并将废酵母自溶水解液加至低盐固态法酱 油生产的浸出过程，使其与酿造酱油自然溶合，生产的酱油不仅氨基酸含量高， 而且又不失酱油特有的发酵风味，是一种比原酿造酱油更鲜美、更富营养的酱油 新品种。 ( 2 ) 利用啤酒废酵母提取核糖核酸 6 , 7 1 近年来，随着核酸应用领域的不断扩大，特别是核糖核酸在医药、食品、农业、 保健美容等行业的应用开发，使核糖核酸需求量不断增加，出现了供不应求的局 面。作为啤酒工业的副产物之一啤酒废酵母中核糖核酸的含量可达3 1 1 ，是核 糖核酸生产的较好的原料，充分利用啤酒废酵母提取核糖核酸，既减少环境污染， 又创造了可观的经济效益。 ( 3 ) 利用啤酒废酵母提取碱不溶性葡聚糖1 8 , 9 l 酵母细胞壁含有碱不溶性、酸溶性、碱溶性三种葡聚糖。其中碱不溶性葡聚 糖是高分支的b ( 1 3 ) d 葡聚糖，重合度( d p ) 1 4 5 0 1 5 0 0 ，有3 的b ( 1 _ 6 ) 链间连 接。酵母的b f l 3 1 d 葡聚糖能增强哺乳动物免疫活力，有抗癌、抗细菌抗病 毒、降低血脂等功能。同时还有保湿、成膜、无刺激性等特点，故广泛用于医药、 食品、化妆品等行业。 f 4 ) 利用啤酒废酵母生产酵母精【1 , 1 0 】 酵母精是酵母的抽提物，是将酵母细胞内的蛋白质降解成氨基酸，核酸降解 成核苷酸制得人体可以直接吸收利用的可溶性营养及风味的浓缩物。除氨基酸核 昔酸外还含有维生素、有机酸和矿物质等多种营养成分。因而酵母精是兼具营养、 调味和保健三大功能的优良的食品添加剂。 ( 5 1 其他方面的应用 啤酒废酵母除了有上述应用外还可以用于s o d 1 ”、叶酸【1 2 】、果糖磷酸钠f 1 3 】 ， 物质提取的原料。 l _ 2 铬的生物学慧义 _ l 2 。1 铬的生物学意义 现代医学已证实铬( i ) 是动物和人体必需的微量元素之一，它主要经过肠道 吸收、由尿排泄，并广泛地分布在生物体的各个组织器官和体液中。铬在体内主 要通过与蛋白质、酸以及其他各种低分子量配体结合，加强胰岛素的作用，进一 步参与机体糖代谢和脂代谢的进行，从而发挥其生物功能，促进生物体的生长发 育。 1 9 5 5 年美国科学家s c h w a r z 和m e r t z 首次发现了酿酒酵母或猪肾粉的酸性水 解产物中可以提取出一种能够恢复大鼠葡萄糖耐量损伤的因子，他们把这种未经 鉴明的活性因子称为葡萄糖耐量因子( g l u c o s e t o l e r a n c ef a c t o r ，g t f l 1 4 , 1 5 】。1 9 5 9 年他们进一步发现铬( i i i ) 的化合物能够恢复大鼠损伤的糖耐量，认为铬( i 1 1 ) 是构 成g t f 的重要组成部分【1 6 。因此，确认了铬( i i i ) 是一种人体和动物必需的微量 元素。 根据现有的一些研究结论m1 8 1 ，可以认为铬主要是胰岛素的协同因子或加强 剂。在葡萄糖摄入、葡萄糖氧化为c 0 2 和葡萄糖转化为脂肪等涉及胰岛素功能 的相关方面，均发现铬可加强胰岛素的作用，但是对胰岛索而言，铬并不是其取 代物。 另外，与其他微量元素不同的是，铬( i i i ) 的代谢、体内分布以及其生物功能 2 的体现都依赖于铬( 1 1 1 ) 化合物的具体化学形态。并非所有形态的铬( 1 1 1 ) 化合物都 具有生物活性。无机铬难以吸收，而有机铬配合物较容易吸收，此外，只有某种 或某几种特定形态的铬化合物才具有生物活性，吸收到体内的其他形态的铬只有 转化成为生物活性铬后才能发挥其生物功能。 1 2 2 铬r ) 参与的代谢及相关疾病 铬( i i l l 作为胰岛素的协同因子，必然要影响胰岛素参与的代谢过程。其最显 著的生理功能是降低血糖的作用，这是因为胰岛素一方面可以提高组织摄取葡萄 糖的能力：另一方面还会抑制肝糖原的分解，并促进肝糖原和肌糖原的合成。另 外胰岛素还可以提高糖原、脂肪酸和蛋白质的合成速度，抑制糖原的脂肪酸的分 解代谢。因此，铬饵i ) 也会相应地参与糖代谢和脂代谢，对蛋白质的代谢也有 定的影响。 f 1 ) 铬( 1 1 1 ) 与糖代谢及糖尿病 糖尿病是一组广泛存在于世界各地、具有不同病因与发病机制、以高血糖为 主要标志的内分泌代谢临床综合症。它主要可以分为i 型糖辰病f 胰岛素依赖型 糖尿病) 和i l 型糖尿病( 非胰岛素依赖型糖尿病) ，此外还有血糖未达糖尿病标准但 确又高于正常者的葡萄糖耐量损伤。体内缺铬与患糖尿病之间存在着定的关 系：一方面，糖尿滴患者体内的铬含量显著降低；另一方面，缺铬现象严重的地 区糖尿病的发病率也高【1 9 2 0 1 。 1 9 6 6 年g l i n s m a n n 等人【2 1 】就报告了铬可以辅助治疗糖尿病，临床实验也充 分地证实了铬在改善糖尿病患者耐量方面的作用。实验表明，铬可以改善机体受 损的葡萄糖耐量，能够有效降低糖尿病患者特别是非胰岛素依赖型糖尿病患者的 血糖水平，对糖尿病的治疗过程起到一定的辅助作用。因此，糖尿病患者补铬可 以降低对胰岛素或口服降糖药的需要量。 ( 2 ) 铬( i i i ) 与脂代谢及高脂血症、动脉粥样硬化 铬( i i i ) 与脂类的代谢特别是胆固醇代谢之间也存在着f 分重要的联系。铬( 1 1 1 ) 能增加胆固醇的分解和排泄，同时可维持正常的血清胆固醇的浓度，缺铬) 能 使脂类代谢发生紊乱，出现以血清中t c ( t o t a lc h o l e s t e r o l ，总胆固醇) 和t g ( t d 掣y c e r i d e ，甘油三脂) 等的升高为主要特征的高脂血症( 含高胆固醇血症) 【矧。 相关动物实验表明，低铬饮食的大鼠随年龄的增加会出现血清胆固醇和动脉 脂升高的现象，甚至出现动脉斑；而长期喂高胆固醇饮食的兔子在诱发出动脉粥 样硬化斑后，再经补铬可以观察其动脉硬化斑会显著地缩小，动脉胆固醇含量也 会显著地降低。 现代医学已十_ 分明确高脂血症特别是血清t c 、t g 、l d l - c ( l o wd e n s i t y l i p o p r o t e i n c h o l e s t e r o l ，低密度脂蛋白胆固醇) 和载脂蛋白b 等地增高，以及 h d l - c ( h i g hd e n s i t yl i p o p r o t e i n c h o l e s t e r o l ，高密度脂蛋白胆固醇1 和载脂蛋白 a 等的降低是诱发动脉粥样硬化乃至冠状动脉粥样硬化性心脏病( 冠心病1 的重要 原因之。因此，降低t c 、t g 和l d l c ，提高h d l - c 是预防和治疗动脉粥样 硬化和冠心病等疾病的有效手段。 而补铬可以降低血液中的t c 、f g 和l d l c ，提高h d l - c ，对防治高脂血 症以及因此而引起的脂质沉淀和动脉粥样硬化等疾病具有一定的作用。 1 2 3 铬( 1 1 1 ) 的生理需要量 尽管人们已经认识到了微量元素铬所具有的重要生理意义，然而在铬的生理 需要量方面尚无明确的结论。这首先是因为人们对铬生物功能产生机制的了解程 度还很有限，无法从理论上进行预测：其次受现有分析测试水平的限制，很难避 免在大量有机物背景下进行铬痕量分析时因玷污或挥发造成的分析结果失真，无 法真实地了解经膳食的铬摄入量的体内分布；此外如前文所述，铬生物功能的体 现有赖于铬化合物的具体化学形态，因此更是加大了确定铬生理需要量的难度。 而过，到目前为止也有些关丁馅摄入推荐量数据 报道吲。茭围医学 会( n c r i c a nm e d i c a l a s s o c i a t i o n ，a m a ) 根据临床全静脉营养的需要，召集：囱关的 专家论证推荐成人经静脉摄入的元素铬应为1 0 l 靴d 。美国的饮食推荐量 ( r e c o m m e n d e dd i e t a r ya l l o w a n c e s ，r d a ) 则建议铬的膳食安全适宜摄入量为成人 5 0 “。2 0 0 , u g d 。 然而，尽管铬的需要量如此之少，但是缺铬的问题仍然存在，这主要是由于 饮食倾向于更多的精加工食品而造成的。一方面，食品在精加工的过程中会大量 丧失其中所含的铬，从而减少了铬的摄入量；此外，这些精加工食品还会促进体 内贮存铬的大量排泄。因此，许多人从饮食中摄入的铬量不能满足饮食推荐量的 要求。 1 3 富铬酵母的研究 铬的生物功能的体现强烈地依赖于铬( i i i ) 化合物的具体化学形态，并非所有 形态的铬( i l i ) 化合物都具有生物活性。因此选择适当的铬载体是一个非常关键的 问题。最理想的生物活性铬无疑就是葡萄糖耐量因子g t f ，但是迄今为止，人 们还没能完全了解g t f 的成分与结构，因此，不可能利用纯的g t f 制剂。目前， 研究人员已经公认，无机铬形式的补铬制剂不利于吸收，而有机铬则能明显地改 善铬的吸收，所以，适宜的铬载体应当是有机形式的。其中主要的形式有富铬酵 母、吡啶羧酸铬【2 6 1 、葡萄糖酸铬【2 7 】和加铬复合纤维【2 8 】等，其中富铬酵母是效果 最好、使用最普遍的有机铬制剂，即酵母是铬的优良载体之一。 富铬酵母的铬载体是酿酒酵母f 又称啤酒酵母，s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ， 以酿酒酵母作为铬的有机载体具有诸多优势，应用意义十分显著。 首先，酿酒酵母发酵制品的安全性好。酿酒酵母是一种不产生内毒素日遗传 背景较清楚的微生物。据国家舰定【2 9 j ，微生物中除了酿酒酵母、脆罐酵母和拈 草杆菌等5 种作为食用无需做毒性实验外，其它微生物都必须通过两年以上的毒 性实验。因此，以酿酒酵母作为食用菌种能够保证安全不致病。 其次，酿酒酵母发酵制品易于生产。酿酒酵母是人类最早驯化利用的微生物 菌种，也是现代发酵工业中历史最悠久、使用最频繁的微生物菌种，它的发酵工 艺成熟，生产周期短，便于生产，生产成本也很低廉。 再次，酿酒酵母还具有能够富集多种微量元素的优良性能，是目前作为微量 元素载体可能性最大的菌种【3 0 l 。除了本论文所涉及的利用酵母富集铬元素外， 利用酿酒酵母富集铁【3 1 , 3 2 , 3 引、锌【3 4 , 3 5 】、锗【3 6 0 7 】和硒【3 8 , 3 9 】等元素的有关研究也是当 前的一些热点课题。酿酒酵母的这种性能有剥于进一步开发富含多种微量元素的 酵母制品。酵母菌除了对微量元素具有较好的富集能力，还可提供相当数量的蛋 白、必需氨基酸及丰富的维生素、酶、甘露寡糖及一些重要的辅助因子等。 目前国内外对酵母富集铬进行的各种研究【4 0 , 4 1 , 4 2 j 3 , 4 4 , 4 5 , 4 6 , 4 7 , 4 8 , 4 9 主要是利用 富含c r ”的培养基传代培养并结合微生物诱变技术以及细胞融合技术筛选具有 较强富集能力的新型酵母菌株。但酵母对于铬的吸收有一定的限度，培养基中铬 浓度过高时会抑制酵母菌生长，在高铬浓度培养条件下，酵母的收率往往较低。 合适的培养条件对富铬酵母的生产有较大的影响。国内外对富铬酵母的研究大多 以在培养基中添加醋酸铬或氯化铬等无机化合物考察培养条件，确定最优培养基 为目的。最佳培养条件以及最优培养基配方的确定是以富铬酵母中的有机铬含量 及生物量确定的。所谓有机铬是指以结合态与酵母体内的有机物结合在一起的铬 离子，一般不能通过洗涤、透析等方式出去。生物体对金属元素的无机离子形式 吸收能力极差，常有肠胃不适甚而胃出血的现象，而对有机形式f 即结合在生物 有机物质上1 的吸收和生物利用能力都高于无机形式。酵母富集金属离子后，可 以将无机形式有效的转化为有机形式利于生物体的吸收。因为对富铬酵母的研究 的主要目的就在于将来为生物体所吸收利用，故而有机铬含量是一个十分重要的 衡量指标。 目前国内外还对富铬酵母的理化性质及元素进行一系列分析【5 0 , 5 1 , 5 2 , 5 3 5 4 , 5 5 1 。 考察富集铬后酵母菌体中的营养成分以及其它微量元素的变化。研究表明，酵母 富集铬后铬含量的上= 升对与普通酵母相比富铬酵母中的各种元素均发生变化 p “”l 。富铬酵母的f e 、z n 、c r 、c u 、c o 、b a 、s r 、n a 等元素含量则均高于普通 酵母。但富铬酵母的k 、m n 、p 、v 、m g 、c a 的元素含量明显低于普通酵母。富 铬酵母中的氨基酸含量大多高于普通酵母样品，尤其是赖氨酸、蛋氯酸、亮氨酸、 异亮氨酸等人体必需氨基酸的含量明显提高。其原因可能是由于铬的加入，促使 酵母细胞的生长及细胞内相关代谢反应的加强使营养价值得到提高【5 8 】。 1 4 富铬酵母的应用 1 4 1 富铬酵母对猪、牛、羊生产性能的影响 在饲料中添加一定数量有机铬可提高牲畜生长速度和瘦肉率，改善胴体品 质，降低背膘厚度等j 5 ”。此外酵母铬还可以可降低牲畜血清中尿素氮的含量。 显著提高血清总蛋白含量以及日增重、料肉比，改善肉品质【删。添加酵母铬后， 牲畜体合成蛋白质能力有所增强，从而提高氮的吸收、利用率，使其代谢产物明 显减：p 。这有利了二蚩臼质的合成和沉积，表现为肌肉量增加，这或许是皿清总蛋 岛含量升高的原因1 6 u 。添加酵母铬可提高机体中肌蛋白合成过程中所需的吾种 酶蛋白的含量，促进蛋白合成，提高瘦肉率，降低脂肪沉积，从而改管肉品质，6 2 】。 添加酵母铬既：育降低血清中甘油三酯、胆固醇的作用，同时在一定程度上又能提 高高密度脂蛋白胆固醇含量，说明添加酵母铬可改善机体脂类代谢。 1 , 4 2 富铬酵母对禽类生产性能的影响 在种蛋鸭的饲料中添加酵母铬，一方面可以增强种蛋鸭抗应激能力，减少应 激对产蛋的影响，从而提高了产蛋率，减缓了产蛋高峰过后产蛋率下降的速度。另 一方面可以使受精率、孵化出壳率、总产蛋量提高，进而提高了种蛋鸭的繁殖性 能【删。而铬对繁殖能力的影响，是通过铬增加了组织对胰岛素的敏感性来介导 的，胰岛素增加了黄体激素的释放频率，促进了卵泡的发育，提高了排卵速率， 从而提高了总产蛋量，延长了有效产蛋时间。胰岛素增加了黄体激素的释放频率， 促进了精原细胞发育，提高了精子的生成速度，从而提高了种蛋的受精率。 饲料中添加酵母铬，沉积到受精种蛋中的铬，在种蛋孵化过程中，提高了胚胎对 氮的吸收，促进核糖核酸合成。铬增加了胚胎胰岛素的合成，增加了葡萄糖转化 为糖原的数量，为雏鸭出壳时提供了充足的能量，从而提高了孵化出壳率【。 在肉鸭肉鸭饲料中添加酵母铬，既能够提高肉鸭肉鸭生长速度与饲料报酬， 又可以提高胸腿肌占活重的比例，降低皮脂、腹脂占活重的比例1 6 7 , 6 s 】。此外有机 铬可降低干物质排泄量，可减少蛋白质排泄，增加钙、磷的存留。还可以提高血 清中谷草转氨酶、高密度脂蛋白胆固醇、磷离子的含量，降低血清谷氨酰转肽酶 和总脂的含量【“。 1 4 。3 富铬酵母对鱼类生产性能的影响 添加酵母铬可有效提高鲤鱼的抗应激能力进而提高鱼的运输成活率。鱼类存 长途运输时，应激导致机体葡萄糖代谢增加机体增加葡萄糖利用导致机体铬动 员增加，而铬一旦被动员就不能再吸收而是由尿中排出。日粮中提供了充足的有 生物活性的铬，被机体积储，就能抵抗应激对铬的消耗，从而提高运输成活率。 添加酵母铬还可以提高鱼类运输后暂养成活率。运输时鱼体表面粘液容易脱 落，在暂养容易受细菌感染，从而引起死亡，降低哲养成活率。在运输应激状态 f 铬可以提高外周组织对葡萄糖的利用，从而加快乳酸和生糖氨基酸的糖原合成 速度，从而加快粘糖蛋白的合成，保证了粘液的及时合成与分泌【”】。 酵母铬还可以增强鱼体外周组织对葡萄糖的有效利用，减少了蛋白质的降 解。而鱼类在新陈代谢的分解供能时，通常是优先分解蛋白质供能。因此，补铬 可使蛋白质最大限度地用于体储和生长：另一方面，铬通过g t f 协同和增强胰 岛素的作用，增强胰岛素的分泌，提高葡萄糖的利用率。 此外添加酵母铬还可降低鱼类运输损耗率。铬通过改变皮质醇产量和胰岛素 功能而影响动物对应激的反应。日粮中添加足够的生物活性，使鱼在运输中保持 更平静温和；另一方面可强化胰岛素功能，增加肌糖原的储存，减少运输损耗1 7 ”。 1 。5 利用啤酒废酵母开发富铬酵母的可行。炷 如前所述，一方面现代啤酒工业在生产啤酒的同时，生产了大量的啤酒废酵 母，如何充分有效的利用这些啤酒废酵母已经成为急待解决的问题：另一方面， 铬( 1 1 1 1 在人和动物体内所起的重要作用又不断被元素医学界的研究人员所揭示， 成为目前该领域内的研究热点之一，各种类型的生物活性铬制剂也因此得以出 现。而本研究利用啤酒废酵母这一优良的微量元素载体可以生产具有生理意义的 富铬酵母。 目前已有的富铬酵母的生产多是将酵母菌接入到特制的培养基中，通过纯培 养来富铬，培养周期长，生产条件要求严格，且生产成本高。而如果直接利用啤 酒废酵母制各富铬酵母可以降低培养周期，而且由于原料易于获得且价格低廉， 富铬酵母的生产成本低，适合工、世化规模生产i ”。 而在此基础上，进一步的研究可以从富铬酵母中提取和分析g t f 纯物质的 方面延伸，一也可以由此更加关注铬这个富有争议的元素的营养性、毒理性和它们 之间的关系，为进一步的相关研究奠定一定的基础。 总之，利用啤酒废酵母制备富铬酵母，可以有效地利用可资源化的固体废弃 物，变废为宝，化害为利，具有一定的环境效益和经济效益，同时也可以为相关 研究奠定基础。 二实验材料与方法 2 1 试验材料 啤酒废酵母：实验当天从辽宁天湖啤渺。育限责任公司取回废酵母j4 , 0 0 0 r l m i n 离一l , 1 5 m i n 。弃上清液，得沉淀的啤酒酵母泥备用。 2 2 培养基配方 y e p s 培养基：酵母粉1 ，蛋白胨i ，蔗糖2 ，p h 4 5 。 y e p d 培养基：酵母粉1 ，蛋白胨1 ，葡萄糖2 ，p h 4 5 。 y e p m 培养基：酵母粉1 ，蛋白胨1 ，麦芽糖2 ，p h 4 5 。 麦芽汁培养基：1 0 0 麦芽汁。 实际使用过程中向培养基中添加适量氯化铬( c r c l 3 6 h 2 0 ) ，调节培养基中 c r 3 + 的浓席， 2 3 实验仪器 l d 5 2 a 低速离心机( 北京医用离心机厂1 s w - c j 一1 c 标准净化工作台f 上海阳光实验仪器有限公司) h z 2 4 振荡培养箱( 常州国华电器有限公司) s w c j 一1 c 型医用净化工作台( 上海阳光实验仪器有限公司、 y x 2 8 0 a 手提式不锈钢蒸汽消毒锅( 上海三申医疗器械有限公司) f a 2 0 0 4 电子分析天平( 上海天平仪器厂) 3 5 1 0 原子吸收分光光度计f 安捷伦科技 = 海分析仪器有限公司、 p i - i b 4 p h 计( 上海精密科学仪器有限公司1 s p e c t r u mg x 型傅里叶变换红外光谱仪( 美国p e r k i n e l m e r 公司) 8 5 0 一i 】型自动氨基酸分析仪( 日本日立公司 2 。4 培养条件的优化 无菌状态下，将新鲜制各的酵母泥加到含铬培养基中，摇床振荡培养。考察 不同培养条件：培养基种类、c r 3 + 添加量、接种量、培养时间、培养温度及培养 基起始p h 值对富铬酵母生物量和铬含量的影响。 2 5 生物量i j , 0 n 定 培养物4 ，0 0 0 r m i n 离心2 0 r a i n ，收集沉淀菌体，蒸馏水洗涤3 次，6 5 。c 烘干 至恒重，称重。计算富铬酵母生物量，每组数据均重复三次，结果以平均数标 准差形式出现。 2 。6 铬含量的测定 采用静置浸出离心分离法测定富铬酵母中有机铬的含量。将o + 2 2 0 3 9 酵母 于粉加入盛有9m l 蒸馏水的离心管中，每隔一段时间进行彻底地搅拌，静鼹1 2 h ， 然后以4 ，0 0 0 r m i a 离心2 0 m i n ，反复进行几次，将下层沉淀转入凯氏烧瓶，加入 8m l 混酸溶液( 高氯酸：硝酸= 4 ：1 ) ，加热至酵母完全被硝化，且溶液无色。将 冷却后的硝化液转入1 0 m l 容量瓶，再用5 硝酸溶液定容。原子吸收分光光度 测试条件为：灯电流i = 1 2 m a ，通带a a = 1 6n m ，波长k = 3 5 7 8f 1 1 t i ，燃烧器高 度= 7 。5m m ，空气流量= 9 4l r a i n ，乙炔气流量= 2 5l r a i n t 4 ”。根据标准曲线即可 得出待测样中的铬含量。，每组数捌均堕技三次，结果以平均数标准差形式出现。 2 7 红外光谱分析 采p e r k i n e l m e r 公司的s p e c t n l mg x 型红外光谱仪进行红外光谱分析。分别 称取一定量的空白酵母和富铬酵母，- 与1 5 0m gk b r 充分混匀，压片，在相同条件 下测定红外吸收光谱【7 3 1 。 2 8 氨基酸组成分析 分别准确称取2 0 m g 富铬酵母和窄白酵母，置于水解管中。在水解管内加 6 m o l l 盐酸1 0 1 5m l ，加入重蒸酚3 4 滴，再将水解管放入冷冻剂( n a c l 与 冰按1 ：3 混合) 中，冷冻5r a i n ，抽真空，充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重 复三次后在充氮气状态下封口，将封口水解管放于1 1 0 的恒温干燥箱内水解 2 2 h ，取出冷却后打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管， 将水解液全部转移n s om l 痞量瓶内，用去离子水定容。吸取滤液1m l 于5m l 容量瓶内，4 0 5 0 。c 真空干燥，残留物用1 2 m l t k 溶解，再干燥，反复进行两 次，最后蒸干，用1m l 柠檬酸钠缓冲液( p h 2 2 ) 溶解，即得待测样品i ”】， 采用日立8 5 0 一i i 型自动氨基酸分析仪测定，分析空白酵母和富铬酵母的氪基 酸组成。 2 9 大鼠对富铬酵母的表观消化吸收率的测定 2 9 1 合成饲料 按a o a c 基本饲料配方【7 4 】配制合成饲料，见表1 。 表l 合成饲料配方 2 , 9 2 具体方法 取3 0 只大鼠随机分为三组，雌雄各半，两组为实验组，组为对照组，在鼠 笼中单笼饲养，以玻璃瓶装蒸馏水为饮用水。先以合成饲料自由进食饲喂一周为 适应期。 实验期间将第一实验组的饲料中铬盐去除，按铬含量为6 0 p p m 添加富铬酵母 粉，并按酵母蛋白含量扣除加入的酪蛋白量。笫二实验组添加普通酵母粉，同样 处理，添加铬盐( c r c l 3 6 h z o ) ，含量为6 0 p p m 。用b a s 0 4 糊灌胃作粪便标记， 实验期为5 d 。记录总进食量和排粪便量。对照组仍然喂食合成饲料，添加铬盐 ( c r c l 3 6 h 2 0 ) 含量为6 0 p p m 【7 5 j 。 粪便置于8 0 c 烘干至恒重、称重、研磨成粉。消化定容后原子吸收分光光度 法测定含铬量。 2 9 3 消化吸收率的计算 消化吸收率( ) = 型絮掣1 0 咣 3 结果与讨论 3 1 培养基对酵母富集铬的影响 5 0 0 r a l 三角瓶中， 注- x , 5 0 m lc r 3 + 浓度为6 0 叻m l 的培养基。接x 5 0 9 f zt 糊 的啤酒废酵母，培养基p h 调至4 5 ，培养温度2 8 。c ，摇床转数1 5 0 r m i n 。振荡培 养1 6 h 。测定富铬酵母生物量及铬含量。结果如图1 和图2 所示。 8 0 0 7 6 0 0 三 诗5 0 0 。 删 扣 船3 0 0 舶0 1 呻 庞 图1 培养基种类对富铬酵母生物量的影响 图2 培养基种类对富铬酵母铬含量的影响 嘲 叼 哺 蟠 销 姚 蚴 口g。百璺删蟀剥 由图1 和图2 可见：啤酒酵母在不同的培养基中的生长状况和富集铬的能力 是不同的。培养基对酵母生物量的影响较明显，选用麦芽汁培养基( w o n ) 能够 获得较大生物量。但对于铬含量而言，使用4 种培养基并没有明显的差异，综合 考虑，确定麦芽汁培养基为最适培养基，在后续的实验中均采用麦芽汁培养基。 3 - 2c r 3 + 浓度对啤酒废酵母富集铬的影响 5 0 0 m l 三角瓶中，注入5 0 m l 不同c r 3 + 浓度的麦芽汁培养基。接入5 魄压榨过 的啤酒废酵母，培养基p h 调至4 5 ，培养温度2 84 c ，# g ) ：a 删1 5 0 f r a i n 。振荡培 养1 6 h 。测定富铬酵母生物量及铬含量。结果如图3 所示。 奄 8 b 啦l s 州 图3 培养基c r 3 + 浓度对富铬酵母生物量和铬含量的影响 由图3 可见，培养基中铬离子浓度在1 0 0 6 0 叭g m l 范围内时，随培养基c r 3 + 浓度的增加，富铬酵母的生物量呈递增趋势，当培养基c r + 浓度j 盔_ 6 0 0 # g m l 时富 铬酵母生物量达到最大值1 0 6 5 _ + 0 1 5 9 1 0 0 m l 。此后随着培养基中c ，+ 浓度的增 加，富铬酵母的生物量呈现下降趋势，说明培养基中c p 在较高浓度时，由于铬 元素的毒性作用对酵母的生长和代谢产生了抑制作用，故不利于酵母的生长，也 就不利于酵母生物量的获得。 由图3 可见当麦芽汁培养基中c r 3 + 浓度由1 0 叽g m l 增加到6 0 叩g m l 利 ，随着 c r 3 浓度的增加富铬酵母的铬含量电随之增加。当培养基铬浓度达至l 1 6 0 陬g m l f l v j 出现最大值为7 4 7 。4 _ + 8 3 t m g g 。此后再增加麦芽汁培养基中c r j + 的浓度，富铬酵 母铬含量反而呈现下降趋势。分析原因可能是因为培养基中c r “浓度过高时，由 于铬元素的毒性作用，明显抑制了酵母的生长和代谢，同化铬到菌体内的代谢作 用也受到了抑制。此时酵母对无机铬生物转化作用几乎停止，使进入胞体内的铬 主要以无机态存在。所以，综合富铬酵母的生物量和铬含量两个因素，确定麦芽 汁培养基中c r “添加浓度为6 0 眙咖l 时最佳。 3 3 培养时间对啤酒废酵母富集铬的影响 5 0 0 m l 三角瓶中，注入5 0 m l c r 3 + 浓度为6 0 叽g r n l 的麦芽汁培养基。接入5 0 9 压榨过的啤酒废酵母，培养基p h 调至4 5 ，培养温度2 8 ，摇床转数1 5 0 f f m i n 。 振荡培养不同时间。测定富铬酵母生物量及铬含量。结果如图4 所示。 图4 培养时间对富铬酵母生物量和铬含量的影响 由图4 可见，随着培养时间的延长，富铬酵母生物量在开始一段时间内呈递 增趋势。当培养达到1 6 h 后再继续延长培养时间时，生物量增加不显著。这可能 是由于培养基中营养物质不断减少，酵母生长能力也随之降低，导致富铬酵母生 物量的降低。此外由图可见，随着培养时间的延长，富铬酵母铬含量呈现先上升 后下降的趋势。当培养达到1 4 1 8 h 左右，酵母中铬含量达到最大。综合考虑富 铬酵母铬含量和生物量，确定富铬酵母的最佳培养时间为1 6 h 。 3 4 麦芽汁起始p h 值对啤酒废酵母富集铬的影响 5 0 0 m l 三角瓶中，注入5 0 m l c r 3 + 浓度为6 0 叽m l 的麦芽汁培养基。接n 5 0 9 压榨过的啤酒废酵母，调节培养基为不n p h 值，培养温度2 8 ，摇床转数 1 5 0 r m i n 。振荡培养1 6 h 。测定富铬酵母生物量及铬含量。结果如图5 所示。 昌 i 删 嚣 圳 图5 培养基起始p h 值对富铬酵母生物量和铬含量的影响 由图5 可见，随着培养基起始p h 值的增加，富铬酵母生物量和铬含量均星 t 观先上升后下降的趋势。而往p h 值为4 5 时生物量和铬占”量均达到最大值，k 此，确定啤酒废酵母富铬的最佳p h 值为4 5 。 3 5 培养温度对啤酒废酵母富集铬的影响 5 0 0 m l = _ 角瓶中，注入5 0 m lc r 3 + 浓度为6 0 印m l 的麦芽汁培养基。接) 5 0 9 压榨过的啤酒废酵母，调节培养基p h 值为4 5 ，控制不同的培养温度，摇床转数 1 5 0 r r a i n 。振荡培养1 6 h 。测定富铬酵母生物量及铬含量。结果如图6 所示。 图6 培养温度对富铬酵母的影响 由图6 可见，富铬酵母生物量随温度变化呈现先上升后下降的趋势，在2 8 达到峰值，这也符合酵母菌的最适生长温度，而温度的变化对富铬酵母铬含量的 变化基本没有影响。所以，由实验得出啤酒酵母富集铬的最佳的温度为2 8 ”c 。 3 6 酵母的添加量对啤酒废酵母富集铬的影响 5 0 0 r 1 1 l 三角瓶中，注入5 0 m lc r 3 + 浓度为6 0 雌g m l 的麦芽汁培养基。接入不 同量的压榨过的啤酒废酵母，使得酵母添加量和培养基之比呈现不同比例，调节 培养基为4 5 ，培养温度2 8 。c ，摇床转数1 5 0 r m i n 。振荡培养1 6 h 。测定富铬酵母 生物量及铬含量。结果如图7 所示。 占 2 瓷 咖 霉 州 图7 酵母泥添加量对富铬酵母的影响 由图7 可见，酵母添加量为5 0 9 5 0 m l ( 培养基) 时，所得富铬酵母生物量和酵 母铬含量均达到最大值。因此，确定啤酒废酵母最佳酵母添加量为5 0 9 5 0 r a l ( 培 养基1 。 3 。7 正交实验 设计一个四因素三水平的正交实验。队确定富铬酵母的最佳培养条件，正交 实验设计表见表2 。 表2 正交实验设计表 酵母生物量正交实验直观分析表见表3 。 表3 酵母生物量的直观分析表 + 各参数代表意义 k n 表示以n 水平试验的富铬酵母的生物量之和i 。k i = 瞄3 ，k 2 = k 2 3 ，k 3 = k 3 3 ，表 示三个水平对应的平均值。r 表示因素极差，即k 1 、k 2 、k 3 中最大值与最小值之差。 1 7 从以上实验结果可确定最优培养条件为a 3 8 2 c 3 d 3 ，即：c r 3 + 浓度为 6 0 0 z g m l ，培养基起始p h 为4 5 ，振荡培养时间为i 8 h ，啤酒酵母添加量 6 0 9 5 0 m u 培养基) 。 根据表中极差值大小，排列出影响实验冈素的主次顺序： 主啪 d ( 酵母添加量) a ( 铬浓度) c ( 培养时间) b ( 起始p h 值) 富铬酵母生物量的方差分析，