（生物化学与分子生物学专业论文）番茄和拟南芥花发育相关基因的研究.pdf

中囝农业科学院博 后站报告 量鲁皇皇舅摹鼍喜量鲁鼍量皇舅i i 一一i一一i 一一一一一一；- 舅皇量 中文摘要 高等植物的花发育是其生命过程中晟重要的阶段，是植物个体由营养生长向生殖生长转变的 结果，是植物繁殖的基础。控制花发育的基因多为l d ) s b o x 基因，有的k 口d ) s - b o x 基因与花器官 的发生有关，有的与开花的早晚有关。本报告通过对番茄m a d s b o x 基因在拟南芥的异源表达探 索该基因的潜在功能，通过不育突变体的分离，试图发现新的不育相关基因。 1 番茄j o i n t l e s s 基因在拟南芥中的表达分析 j o i n t l e s s 是番茄控制果柄离层的基因，3 个具有不同长度启动子的表达载体p t m 0 1 ：g u s ， p t m 0 2 ：g u sa n dp t m 0 3 ：g u s ( 分别离起始密码子a t g7 2 3 b p 、1 8 7 4 b p 、3 6 4 0 b p ) 转化拟南芥 进行功能验证，结果表明：苗期p t m 0 1 ：g u s 在拟南芥的生长点表达，生殖生长期在拟南芥的 子房中表达；p t m 0 2 ：g u s 芽期和苗期在叶脉表达，在幼根的节表达，茎的生长点表达，生殖生 长期在花药和柱头表达；p t m 0 3 ：g u s 在芽期、苗期在叶片的叶脉表达，叶基部的节表达，在生 殖生长期在不同组织器官的节中表达。过量表达的结果表明该基冈能促进拟南芥开花提前。这些 结果表明，d 删7 l 嬲基因是在节特异表达的基因，控制节的发育与形成。节表达的功能特异性 需要全长启动子序列。 2 花发育突变体的分离鉴定 在拟南芥转基因筛选中，我们发现高度不育、果荚短小、莲座叶向下卷曲、而茎生叶片向上 卷曲的突变体。t a i l p c r 分析表明该突变体在拟南芥1 号染色体m 1 9 1 7 9 3 0 和a t l 9 1 7 9 4 0 基因间 隔区，及a t l 9 1 9 8 0 0 和a t l 9 1 9 7 9 0 基因间隔区有两个插入位点，基因分型结果表明这两个位点紧密 连锁。插入位点两侧基因的表达分析表明，a t l 9 1 7 9 3 0 的转录水平与该突变表型正相关。基因过 量表达初步试验结果表明，该基因能引起果荚不育，其它功能正在进一步验证中。 3 顺式互补基因对a t l 9 1 8 8 8 0 和a t l 9 1 8 8 9 0 的初步研究 a t l 9 1 8 8 8 0 和a t l 9 1 8 8 9 0 位于l 号染色体，在3 端顺式反义互补( c i s n a t s ) 。a t l 9 1 8 8 8 0 第 一个内含子部位有7 个小分子r n a ，其中6 个与该基因序列致，其茎环结构前体是一个微 r n a 8 3 7 ，另一个与该基因互补。a t l 9 1 8 8 9 0 的第5 个外显子处有一个小分子r n a ，其序列与该 基因一致。在现有的小分子数据库中没有发现与两个基因的互补区匹配的小分子r n a 。芯片的 数据和r t - p c r 的结果表明两个基因在盐胁迫、干旱胁迫、渗透胁迫、冷害胁迫、伤害胁迫下表 达相反，a t l 9 1 8 8 8 0 表达减弱而m 1 9 1 8 8 9 0 表达增强。在热胁迫下，两个基因都是下调表达。这些 结果表明这两个基因在胁迫下可能形成小分子r n a 调控这两个基因的表达。r n a i 和过量表达的 载体已经构建，功能验证正在进一步进行中。 关键词：加删7 l e 酗，拟南芥；节；不育；顺式反义互补基因对；小分子r n a 中国农q k 科学院博l j 后f 站报告 a b s t r a c t f l o w e rd e v e l o p m e n ti st h em o s ti m p o r t a n ts t a g ei nt h ew h o l el i f eo fh i g h e rp l a n t s ，w h e np l a n t s t r a n s f o r mf r o mv e g e t a t i v ep h a s et or e p r o d u c t i v ep h a s e ，a n dt h e r e f o r ep r o d u c ep r o g e n y m o s to fg e n e s r e l a t e dt ot h ef l o w e rd e v e l o p m e n ta l em a d s - b o xg e n e s ，s o m eo fw h i c ha l er e l a t e dt ot h ef l o w e ro r g a n d e v e l o p m e n t , w h e r e a so t h e r sa r er e l a t e dt of l o w e r i n gt i m e j o i n t l e s sg e n ei sam a d s - b o xg e n ei n t o m a t o i nt h i s r e p o r tw et r a n s f e rj o i n t l e s st oa r a b i d o p s i si no r d e rt oc h a r a c t e r i z e t h eg e n ea n d d i s c o v e ri t sn e wf u n c t i o n i na d d i t i o n ，w ei s o l a t e dam u t a n tr e l a t e dt of l o w e rs t e r i l i t yi no r d e rt of i n d n e wg e n e sa n ds u b s e q u e n t l yt h e i rf u n c t i o n si na r a b i d o p s i s 1 c h a r a c t e r i z a t i o no fj o i n t l e s sg e n ei na r a b i d o p s i s t h r e ec o n s t r u c t sp t m 0 1 ：g u s ，p t m 0 2 ：g u sa n dp t m 0 3 ：g u sf o rj o i n t l e s sg e n ep r o m o t e r w e r et r a n s f o r m e di n t oa r a b i d o p s i s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h es h o r t e s tp t m 0 1 ：g u se x p r e s s e di nt h e a p i c a lm e r i s t e md u r i n gt h es e e d l i n gs t a g ea n di n t h eo v a r yd u r i n gt h e r e p r o d u c t i v es t a g e t h e p t m 0 2 ：g u sa n dp t m 0 3 ：g u sh a dt h eg a m ee x p r e s s i o np a t t e r ni nt h el e a fv e i na n dr o o tn o d e ，b u t d u r i n gt h es e e d l i n ga n dr e p r o d u c t i v es t a g e p t m 0 3 ：g u se x p r e s s e di nt h e d i f f e r e n tn o d e si n c l u d i n g t h el e a fn o d e ，f l o w e rn o d ea n db r a n c hn o d e p t m 0 2 ：g u se x p r e s s e di nt h ea p i c a lm e r i s t e ma tt h e s e e d l i n gs t a g ea n do n l yi n t h ea n t h e ra n ds t i g m aa tt h e r e p r o d u c t i v es t a g e o v e r e x p r e s s i o no f j o i n t l e s sg e n ei na r a b i d o p s i ss h o w e ds h o r t e n e dv e g e t a t i v ep h a s e t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e j o i n t l e s sw a sag e n ec o n t r o l l i n gn o d ed e v e l o p m e n ta n di t sf u n c t i o nn e e d st h ef u l ll e n g t hp r o m o t e r 2 i d e n t i f i c a t i o no fam u t a n tw i t hs h o r t s i l i q u e ，c u r l e yr o s e t t el e a f c a u l i n el e a fa n dd e t e r m i n a t e i n f l o r e s c e n c e at - d n ai n s e r t i o nm u t a n tw i t hs h o r ts i l i q u ea n dc u r l e yr o s e t t el e a fa n dc a u l i n el e a fw a sc r e a t e d b yt a i l p c rp r o c e d u r e ，t w of l a n k i n gs e q u e n c e sw e r ei s o l a t e d t h et - d n ai n s e r t e di n t ot w ol o c a t i o n s o nc h r o m o s o m ei o n ew a sl o c a t e db e t w e e na t l g l 7 9 3 0a n da t l 9 1 7 9 4 0 ，a n dt h eo t h e rl o c u sw a s b e t w e e na t l 9 1 9 8 0 0a n da t l 9 1 9 7 9 0 t h et r a n s c r i p t i o nl e v e lo fa t l 9 1 7 9 3 0g e n ew a sc o r r e l a t e dw i t ht h e m u t a n tp h e n o t y p e t h ep r e l i m i n a r yr e s u l ts h o w e dt h a to v e r e x p r e s s i o no fa t l 9 1 7 9 3 0g e n ei na r a b i d o p s i s c a nc a u s es t e r i l i t ya n ds h o r ts i l i q u ei nt h ee a r l yd e v e l o p m e n t a ls t a g e 3 p r e l i m i n a r ys t u d yo nap a i ro fc i s - n a t u r a la n t i s e n s et r a n s c r i p t s ( c i s n a t s ) i na r a b i d o p s i s a t l 9 1 8 8 9 0a n da t l 9 1 8 8 8 0w e r eo v e r l a p p i n gc i s n a t u r a la n t i s e n s et r a n s c r i p t so nc h r o m o s o m e1 s e v e ns m a l lr n aw e r ef o u n di nt h ei n t r o no fa t l 9 18 8 8 0 ，o fw h i c hs i xm a t c h e dt h ep r e c u r s o ro ft h e m i c r o r n am i r 8 3 7a n do n ew a sc o m p l e m e n t a r yt oa t l 9 1 8 8 8 0 o n es i r n aw a sf o u n di nt h ef i f t he x o n 中国农, l k 乖t 学院博 ：后i v , 站报告 o fa t l 9 18 8 9 0g e n e s u r p r i s i n g l y , n os m a l lr n aw a sf o u n di nt h eo v e r l a p p i n gr e g i o no ft h ec i s n a t s p a i ri nt h es m a l lr n a d a t a b a s e s ns i l i c om i c r o a r r yd a t am i n i n ga n dr t - p c ra n a l y s i ss h o w e dt h e t r a n s c r i p t i o nl e v e lo fa t l 9 1 8 8 8 0w a sd e c r e a s e d ，a n dt h et r a n s c r i p t i o nl e v e lf o ra t l 9 1 8 8 9 0w a si n c r e a s e d u n d e rt r e a t m e n t so fs a l t ，d r o u g h t ，o s m o s i s ，l o wt e m p e r a t u r ea n di n j u r y t h et r a n s c r i p t i o nl e v e lf o rb o t h c i s n a t sd e c r e a s e du n d e rh o ts t r e s s t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h ec i s n a t sa t l 9 1 8 8 9 0a n da t l 9 1 8 8 8 0 m a yp o t e n t i a l l yp r o d u c es i r n au n d e re n v i r o n m e n ts t r e s s t or e g u l a t et h e i rt r a n s c r i p t i o nl e v e l s t h e f u n c t i o n so ft h i sc i s n a t si su n d e rf u t h e ri n v e s t i g a t i o n k e yw o r d ：j o i n t l e s s sa r a b i d o p s i s ；n o d e ；s t e r i l i t y ；c i s - n a t s ；s i r n a 中国农业科学院博卜后j 站报告第一章番茄j o i n t l e s s 幕冈在拟南芥中的过量表达 第一章番茄j o i n t l e s s 基因在拟南芥中的过量表达 1 前言 高等植物的花发育是其生命过程中最重要的阶段，也是植物发育的中心环节，花器官发育的 基本单位是同心轮，典型的双子叶植物的花由4 轮不同的花器官组成。由外到内，第一轮是由萼 片组成；第二轮是花瓣；第三轮是雄蕊，即产生花粉的雄性生殖器官；在最里边是心皮，是雌蕊 生殖器官，常常是几个心皮结合，胚珠和种子在里面形成。随着对模式植物拟南芥和金鱼草的研 究，提出花发育的著名的a b c 模型( w e i g e l ，1 9 9 4 ) 。a b c 模型认为花器官分别由具有不同功能活 性的三类基因决定，a 类基因控制萼片的形成，a 、b 类基因决定花瓣的形成，b 、c 共同决定雄 蕊，心皮单独由c 类基因控制。在拟南芥中，a 类功能基因包括，4 彪勿一j ( 删，a l p 2 , b 类功能 基因包括肥z 尸五9 厂化朋尉( 肋，c 类功能基因含有彳倒删艿0 0 。随着新的突变体的发现，科学 家又发现了d 、e 类基因，提出了a b c d e 模型( t h e i e n ，2 0 0 1 ) ，在拟南芥中d 类基因指的是s h p i 2 ( m o o r ee ta 1 ，2 0 0 5 ) 和s t k ( b r a m b i l l a , 2 0 0 7 ) ，决定胎座和胚珠中央分生组织的特征( a n g e n e n t ， 1 9 9 6 ) 。e 类基因是s e p a l l a t a l 2 3 ( e c k a r d t ，2 0 0 3 ；d i t t a ，2 0 0 4 ) 。在拟南芥a b c d e 模型中除a p 2 外， 所有的基因都是m a d s b o x 基因家族的转录因子。 m a d s b o x 基因是一个大的基因家族，m a d s 是m c m l 、a g a m o u s 、d e f l c i e n s 和s r f 的首字母缩写。其中m c m l ( m i n i c h r o m o s o m em a i n t e n a n c e l ) 是参与酵母细胞周期、细胞生长、 细胞代谢、专一性( s p e c i a l i z a t i o n ) 和决定细胞类型的调节因子( m e s s e n g u ya n dd u b o i s ，2 0 0 3 ) a g a m o u s ( a g ) 和d e f i c i e n s ( d e f ) 分别是拟南芥和金鱼草花器官特征基因( f l o r a lo r g a n i d e n t i t y ) 的产物( s o m r r 圮r e ta 1 ，1 9 9 0 ；y a n o f s k ye ta 1 ，1 9 9 0 ) ；s r f ( s e r u mr e s p o n s ef a c t o r ) 是人类 血清应答因子( n o r m a ne ta 1 ，1 9 8 8 ) 。序列分析表明，在这些转录因子中都含有一个由5 6 - 5 8 个氨 基酸组成的高度保守的结构域，称之为m a d s b o x 结构域。从而将这类基因称之为m a d s - b o x 基因。 m a d s b o x 基因在模式植物拟南芥、金鱼草中首先发现，在其他植物水稻、马铃薯、番茄等 植物中也有同源基因。许多m a d s - b o x 基因与花发育相关。许多m a d s - b o x 基因是转录因子， 在植物的生长发育中起着重要的作用。除了与花器官的发育有关，许多m a d s b o x 基因在调控开 花早晚方面也有一定的作用，促进开花的基因如：a g l 2 0 ( b o r n n e r , 2 0 0 0 ) 、a g l 2 4 ( y u ，2 0 0 2 ；m i c h a e l s e ta 1 ，2 0 0 3 ) 、c o n s a n s ( c d ) ( m o u r a d o v , 1 9 9 8 ) 、s o c l ( m o o n ，2 0 0 3 ) ；抑制植物开花的基因如： f l c ( m i c h a e l s ，1 9 9 9 ) 。、f l m ( s c o r t e c c i ，2 0 0 1 ) 、f r l ( c l a r k e ，1 9 9 5 ) 、s v p o t a r t m a n n ，2 0 0 0 ；l e e 。2 0 0 7 ) 等。番茄的j o i n t l e s s 是一个m a d s - b o x 基因，从同源性上看与拟南芥的s v p 、a g 也2 4 关系最近。 但在功能上，j o i n t l e s s 是控制番茄花与果柄离层形成的基因，与果实的脱落有关( m a te ta 1 ，2 0 0 0 ； 1 中国农业科学院博十后h 站报告 第。章番茄j o i n t l e s s 基冈作拟南芥中的过量表达 ! 。i 。,i, iii l 量皇曼皇 m a o ，2 0 0 1 ) ，与拟南芥的这两个基因没有关系。 脱落是植物器官叶片、花、果实发育过程的正常现象，脱落发生在植物的离区( a d d i c o t t ，1 9 8 2 ) 。 早期脱落特别是花和果实的早期脱落严重影响农作物的产量，所以脱落一直是受到解剖学家和生 理学家的重视( z h a n g ，2 0 0 0 ) 。离层的形成过程中，植物激素乙烯刺激细胞产生酶降解离区细胞间 的薄层( a b e l e s ，1 9 6 8 ；r o b e r t s ，1 9 8 4 ；y a n g ，1 9 8 4 ；w o l t e r i n g ，1 9 8 8 ；m i c h a e l se ta 1 ，2 0 0 3 ) 。离区形成的 生理与过程众所熟知，但其分子生物学机制直至番茄j o i n t l e s s 基因被成功图位克隆，才解开 它的神秘面纱( m a oe ta 1 ，2 0 0 0 ；m a o ，2 0 0 1 ) 。在番茄果柄离区在果柄的中间位置，由于它有一个节 ( j o i n t ) 所以非常容易识别，番茄自然突变体j o i n t l e s s 不能形成离层，所以不能正常脱落( b u t l e r , 1 9 3 6 ) 。在西红柿商品化生产过程中，果柄离区的缺失对机械化采收非常有利( z h a n ge ta 1 ，1 9 9 4 ) ， 同时还可减少搬运、运输过程果柄对果实的损伤( l u k y a n e n k o ，1 9 9 1 ) 。 在拟南芥中s h p l 2 控制果荚的开裂与种子脱落( m o o r ee ta 1 ，2 0 0 5 ) ，s t k 能影响株柄的形成 ( b r a m b i l l a , 2 0 0 7 ) ，现在s h p l 2 、s t k 、j o i n t l e s s 三个基因是大家都认可的与离层形成有关的基 因。但j o i n t l e s s 与拟南芥的m a d s - b o x 基因中同源性最高的并不是s h p i 2 和s t k ，而是 s v p ( h a r t m a n n ，2 0 0 0 ；l e e ，2 0 0 7 ) ，a g l 2 4 ( y u ，2 0 0 2 ；m i c h a e l se ta 1 ，2 0 0 3 ) 。二者均是控制营养生长 期的长短或开花早晚的基因，与果荚的脱落无关。本试验通过对番茄控制果柄离层的基因 j o i n t l e s s 基因在拟南芥中过量表达，揭示该基因的潜在功能。 2 中国农q k 科学院博十后站报告第一章番茄j o i n t l e s s 幕冈布拟南芥中的过量表达 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n al ) 拟南芥野生型( e c o t y p e ：c o l u m b i a ) 。拟南芥种子用0 5 n a c l 0 ( v v ) ，进行表面消毒8 分钟， 灭菌的蒸馏水漂洗3 次，播种到m s 培养基上，4 c 春化3 天，然后继续放于光照培养室生长( 温 度：2 2 ) 。 2 1 2 酶、试剂、宿主菌及质粒载体 本试验各种限制性内切酶及k l e n o w 酶购自n e b 公司，r n a a s e a ，t a q d n ap o l y m e r a s e 等购 自天根生化，i v i g xg a l ，卡那霉素、羧苄青霉素、利福平购自s i g m a 公司。 克隆载体p g e m t - e a s yv e c t o r 购自p r o m e g a 公司。大肠杆菌为d h 5 a 、t o p l 0 。 根癌脓杆菌为g v 310 1 ，表达载体为p g f c 5 9 4 1 。 2 2 方法 2 2 1 表达载体的构建 表达载体的构建利用j o i n t l e s s 基因o r f 间的片断连接到p g f c 5 9 4 1 表达载体3 5 s 启动子下 ( m a oe ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 2 2 2 表达载体向农杆菌感受态细胞的转化 1 ) 每2 0 l l 农杆菌感受态细胞加l 山( 1 0 0 - 2 0 0 n g d n a ) 表达载体d n a ，混匀，加到无菌电转杯中， 电激转化，转化完成，用移液枪把转化的细胞转移到1 5 m l 离心管中，加入3 0 0 m l y e b 液体培养 基，2 8 c ，2 5 0 r p m 培养3 个小时： 2 ) 取6 p l 电转的细胞加1 0 0 t l y e b 液体培养基，混匀，涂布在含有1 0 呻g ，l l l lk a n 和1 2 5 1 t g m lr i f 的y e b 平板上，2 8 c 约4 8 小时。 3 中同农业科学院博 ：后m 站报告 第一章番茄j o i n t l e s s 基夭1 在拟南芥中的过量表达 2 2 3 阳性克隆的鉴定 挑取平板上长出的单菌落，接种到y e b 液体培养基( 1 0 0 恤f n jk a n 和1 2 5 斗g ，i n lr i f ) 中，2 8 0 振荡过夜，提取质粒d n a ，酶切检测，同时以质粒d n a 为模板进行p c r 扩增鉴定。 2 2 4 拟南芥的转化 1 ) 取大约生长三周的拟南芥进行转化； 2 ) 取已经鉴定的菌液千分之一接种到5 0 0 m l y e b 液体培养基中，2 8 c 振荡培养至o d 6 0 0 为0 8 ； 3 ) 4 0 ，5 0 0 0 r p m ，离心1 5 分钟收集菌液； 4 ) 用大约2 5 0 m l 的渗透缓冲液( 1 x 大量元素，5 蔗糖) 重悬，至o d 6 0 0 为0 8 ，加s e l w e t5 c l 山 ( 终浓度为0 2 ) ； 5 ) 拟南芥倒置于重悬液中进行侵染； 6 ) 用保鲜膜包裹植株，避光，低温( 1 6 c ) ，放置2 4 小时后正常生长。 2 2 5 阳性植株的筛选 1 ) t 1 代种子经过春化后直接播种到花盆中，正常生长1 天，用0 5 o 的p p t 除草剂喷雾筛选， 连续喷3 天，约l 周后，非转化植株枯黄，而真正的转化株则生长旺盛。收获的种子为配代种 子。他代种子可以首先在含有p 盯除草剂的m s 培养基上筛选，再移栽到土中生长。 2 2 6 转化植株的p c r 检测 1 ) d n a 的快速提取： 为了快速检测转化植株而又不影响转化植株的正常生长，本实验采用了一个简单快速的d n a 提取方法( e d w a r d s ，1 9 9 1 ) 。具体方法如下： a 取拟南芥一片叶放入离心管，液氮速冻，用m m 3 0 0 磨样仪，磨1 5 秒： b 每管加入4 0 0 1 a l 提取b u f f e r ( 2 0 0 m m i r i s c i ，p h7 5 ，2 5 0 m mn a c i ，2 5 m me d t a ，0 5 s d s ) ， 震荡器上剧烈振荡5 秒，室温放置1 小时； c1 3 0 0 0 r p m , 离心l m i n ； 4 中国农业科学院博l j 后 ：站报告第一一章番茄j o i n t l e s s 堆冈祚拟南芥中的过鼍表达 量曼量皇曼量鼍宣舅ii i_i =i=_ii _ i 蔓量毫皇量量寡鼍曼曼曼寡 d3 0 0 1 x l 上清加3 0 0 1 t l 异丙醇，室温放置2 r a i n ； e13 0 0 0 r p m , 离心5 m i n 。 f 真空干燥，加5 0 1 a l1 x t e 。 2 ) p c r 鉴定 目的基因j o i n t l e s s 的扩增，1 0 1 a l 反应体系如下： d n a 1 0 x p c rb u f f e r d n l p ( 2 5 m m ) 1 6 p , l 2 0 1 d 0 1 6 1 x l j o i n t l e s s 引物( 1o i _ t m ) 0 4 1 t l t a q 酶 d d h 2 0 0 1 “l “l 共 1 0 1 x l 反应程序为：9 4 ，5 m i n ；3 0 个循环( 9 4 ，l m i n ；5 5 。c ，3 0 s e c ，7 2 c ，l m i n ) ；7 2 。c ，2 0 m i n ， 1 5 c 保温。j o i n t l e s s 的引物序列为： j o i n ti f5 - g a a a a a t i a a g g c a a c a g g t g a t - 3 j o i n tir 5 - 丌兀g g 9 9 1 队g a f t 兀t a c a l m - 3 抗除草剂基因( b a r ) 的扩增，2 0 1 x l 的反应体系如下： i o x p c rb u f f e r2 o “l d n t p ( 2 5 m m ) m 9 2 + ( 2 5 m m ) 0 1 6 1 x l 1 4 4 1 x l b a r 基因的p r i r a e r ( 2 0 m m ) 各3 2 1 j1 d n a d d h o 4 1 x l 5 8 斗1 共 反应程序为：9 4 2 2 ，5 r a i n ；2 2 个循环( 9 4 c ，3 0 s e e ；6 8 c ，2 m i n ) ；7 2 c2 0 r a i n ；1 5 c 保温。 b a r 基因引物为： b a r f 5 t c t g c a c c a t c g t c a a c c ：a c t a c a t c 一3 5 中国农、i p 科学院博十j 舌h 站报告第一章番茄j o i n t l e s s 幕阕存拟南芥中的过量表达 b a r r 5 c a g a a a c c c a c g t c a t g c c a g t i 一3 2 2 7 转化植株的s o u t h e r n 检测 1 ) d n a 的提取采用c t a b 法： a 拟南芥植株液氮研磨。 b 加入0 7 m l6 5 预热的c t a bb u f f e r ，振荡混匀，6 5 水浴9 0 m i n 。 c 加入等体积的氯仿：异戊醇( 2 4 1 ) ，摇匀1 5 m i n 。 d1 2 0 0 0 r p m ，离心1 0 m i n 。 e 上清加入2 3 体积的异丙醇，混匀，室温放置1 5 m i n ； f 1 2 0 0 0 r p m ，离心1 0 m i m g 沉淀用乙醇醋酸钠( 7 6 9 6 乙醇+ 0 2 m 的醋酸钠) 洗2 次， h 上清去掉，室温放置无酒精味；加3 0 i t l1 t e 。 2 ) 转化植株的s o u t h e r nb l o t 分析： 不同转化株系用屁胡i 和肪d 脚完全酶切，大约1 6 小时。电泳转膜杂交，按照s a m b r o o k ( 2 0 0 1 ) ， 用质粒酶切的j o i n t l e s se d n a 全长作探针进行杂交。 2 2 8 转基因植株的r t - p c r 表达分析 1 ) r n a 的提取 r n a 的提取采用t r i z o l 试剂盒( 中国百泰克公司) ，具体方法如下： a 小麦叶片加液氮研磨，每5 0 1 0 0m g 组织加l m l t r i z o l ，在震荡器上剧烈混匀； b 样品在室温放置5 m i n ，使核酸和蛋白完全分离； c 加0 2 m l 氯仿，盖好管盖，剧烈震荡1 5 s e c ，室温放置3 m i n d4 c ，1 0 0 0 0 x g 离心1 5 m i n l e 上清加0 5 m l 异丙醇，混匀，室温放置1 0 m i r a f 4 c ，1 0 0 0 0 xg 离心l o m i n ，去上清； g 加l m l7 5 的乙醇( 用d e p c 水配置) 洗涤沉淀。每使用l m l t r i z o l 至少加l m l 乙醇。 h4 c 。7 5 0 0 xg 离心5 m i n ，去上清； i 室温晾至无酒精味，加d e p c 水溶解； 6 中国农业科学院博十后m 站报告 第一章番茄j o i n t l e s s 基冈在拟南芥中的过量表达 2 ) 反转录 反转录采用s u p e r s c r i p t t m r n a s e hr e v e r s et r a n s c r i p t a s e ( i n v i t r a g e n ) ； a1i llo l i g o d t l 2 1 8 ( 5 0 0 i l g m 1 ) ，力口l n g 一5 斗g 总r n a ，力口1ull o r d dd n t p ，丰h 水至01 2 i 1 ； b 6 5 c ，5 m i n ，冰浴5 m i n ，离心机上甩一下，加4 斗l5 的第一链b u f f e r ，2 u l0 1 md t t ，l u1r n a s eo u l 删( 4 0 u 1 1 1 ) ； c 混匀4 2 ，2 m i r a d加11 tls u p e r s c r i p t t mi i i r n a s e hr e v e r s et r a n s c d p t a s e ( 2 0 0 u ) ； e4 2 ，5 0 m i r a7 0 ，1 5 m i n 。 3 ) r t - p c r 表达分析 首先用看家基因表达的a c t i n 和u b i q u i t i n 的特异引物扩增，以调c d n a 的浓度一致。 a c f i n 上链引物为5 a g a a c a g t g l r g t a a g o c t c a a c 3 下链引物为5 ，1 3 a g c t 兀1 a c r ( 圮c t c g a a c a t g g 3 7 反应程序为： 9 4 5 m i n ，3 0 个循环( 9 4 c3 0 s e c ；5 5 c3 0 s e c ；7 2 cl m i n ) ，7 2 c 延伸1 5 m i n ，1 5 保温。 特异基因j o i n t l e s s 基因特异的引物 j o i n t l e s s 上链引物为5 - g a a a a a i t a a g g c a a c a g g t g a m 3 下链引物为5 ：v i t r g g g g t i a g c i t i t a c a t r a 3 s v p 上链引物为：5 - a c t g g t i t g a c g c g t g t g a t r g a 一3 下链引物为：5 - t a a g c c g a g c c t a a g g g a a g t g t c 一3 a g l 2 4 上链引物为5 - t c c a t c g a a g t c a a c t c t g c t g g a t c 一3 下链引物为5 - g t c v f c a t g c a a g t a a c a t c a a c 一3 f l c 上链引物为5 - t i a g t a t c t c c g g c g a c q f r g a a c c c a a a c c 一3 下链引物为5 - a g a t r c t c a a c a a g c t t c a a c a t g ；a g t r c g 一3 m a f l 上链引物为5 - t c c t c c g g t g a c g a c a t i t c 3 下链引物为5 - t g c c a g c a a c g t a t r c t i t c 一3 m a f 2 上链引物5 一a c a t t g l g g g t a r c c g g t g a ，r r a g g a l 3 下链引物5 a a t c a g g c t i g t aa g l 盯aa g g t g a a a g c - 3 p c r 程序为：9 4 5 m i n ；2 8 个循环( 9 4 c3 0 s e c ；5 5 c3 0 s e c ，7 2 。cl m i n ，) ，7 2 c 延伸1 5 m i n ， 1 5 ( 2 保温。 7 中国农业科学院博卜后i l l + ，。+ 报告 第一章番茄j o i n t l e s $ 摹冈神：拟南芥中的过量表达 2 2 9 转基因植株的表型鉴定 r r 3 代转基因种子播在含有7 m j 扎p 门的m s 培养基上4 春化3 天，2 2 c 条件下光照培养4 天。在含p p t 的m s 培养基上正常生长的植株转移到土中进行培养，并进行性状的观察和记载， 统计分析。 8 翟娑誊尘型些：i 二些篓尘鐾型尘型掣娑 3 结果与分析 31 转j o i n t l e s s 基因植株的筛选 构建j i 确的质 t 载体转入农杆龋g v 3 1 0 1 ，川蘸花侵染( f l o r a ld i p p i n g ) 的办法转化拟南芥 t 1 代种r 通过喷嚣筛选。 转化历怕t 1 代种f 半铺到靖葬基l 存化3 二 天后，川05 的p p t 除草剂喷霉筛选转化植株。 常生k ，i # # 化 f i 株运渐枯萎。通过除草剂筛选， 32 转化植株的p c r 鉴定 然后“接播种刨营养r 中k 止常生艮1 0 转化协株告有抗弥草剂的b a r 基闻仍然能够正 我们得到j - 3 5 株抗除草剂的转基冈植株。 提取日j 性植株的总d n a ，州找体引物j o i n t l e s s 墓【埘取b a r 犟因怕引物分别扩增 j 0 1 n t l e s s 舸【b a r 基闻。刚性植株能够扩增出3 7 3 b p 和4 0 0 b p 的目的条带，l m 采转化机株则无 p c r 产物。通过p c r 鹱定共得刮3 2 株刚性植株 a b m1234567 891 01 i m 目1转基目植株的p c r 驻证 埘# v t l e s s 基因的扩增：b 豫草剂b a r 基因的扩增 ( 1 ，3 4568 9 10 ，1 1 为转番茄j o i n t , l e s s 基目的拟南芥值株，2 ，7 1 0 为野生型) f i g1i d e n t i f y i n g t h e g c n l cp 】ba = p c k m r j o i n l e s sg e n e ；b = p c r f o r b ”嚣n e c s 27a n d 】0a n w t l a n e s j3 i o6a n d l 89 d l i d i i l e r e n l t r s g m l i c ( 3 5 s ：j o i n t l e s s ) p l a n t s ) ：；：毖酱：i ：暨= ：= 罂：2 ：2 彗：鲨辇 33 转基因植株的s o u t h e r nb i o t 检测 为，进一步证实p c r 鉴定的准确性，对部分转化植株进行，s o u t h e r nb l o t 检测分析 s o u t h e r nb l o t 的结果表明( 图1 5 ) ，不同的株系转化基因的拷贝数不同。转基因株系1 7 ，3 2 均 为3 个拷贝，株系2 、1 2 和株系1 8 为1 个拷贝，株系1 9 、4 0 为2 个拷贝，株系5 、1 4 、1 9 为多 个拷贝。 m152 1 21 41 71 91 84 03 2 固2 转基目檀株的s o u t h e r nb l o t 验证 i 是野生型对照2 到1 0 分别是t 目的转基因椿系 f i g2i d e t t i f i n g t h e t r a n s g 咖cd i a a bb ys 叫t h e mb l o t l a n e l i s w i l d t y p e 0 n