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郑州犬学2 0 0 3 届硕士研究生毕业论文缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏保护机制的实验研究 缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏保护机制的实验研究 研究生张宛哲 导师李红刘章锁 郑州大学第一附属医院。肾内科 郑州4 5 0 0 5 2 中文摘要 背景与目的糖尿病肾病( d i a b e t i cn e p h r o p a t h y , d n ) 是糖尿病的一种常见的 微血管并发症，也是导致终末期肾脏病( e n ds t a g er e n a ld i s e a s e ，e s r d ) 的主要原 因。d n 具有特殊的结构及功能异常，如：高滤过、肾脏及肾小球肥大、系膜 基质积聚、肾小球基底膜增厚等。探讨d n 发病机制的理论多围绕这些结构及 功能异常而进行研究。越来越多的动物实验及细胞培养旨在寻找导致这些结构 及功能异常的因素。研究证实细胞因子生长因子在d n 的发病中起重要作用， 如内皮素1 ( e t 一1 ) ，一氧化氮( n o ) 和血管内皮细胞生长因子( v e g f ) 。e t 1 不仅可以呈剂量依赖性方式收缩体循环血管，升高血压，而且还可以收缩肾小 球系膜和出入球小动脉，加重肾小球毛细血管内高压。另外，e t 一1 可以促进肾 脏细胞增殖及胞外基质蛋白的合成，从而促进肾小球硬化。n o 对肾脏具有多种 作用，如扩张动脉、抑制血小板粘附和聚集、增加肾组织的血供、抗细胞增生、 抑制细胞外基质蛋白积聚以及增加血管通透性。内皮功能异常如内皮细胞对小 分子物质的通透性增加、内皮细胞增生等参与了d n 微血管并发症的发生。但 其具体机制尚不完全明了。鉴于v e g f 具有增加血管通透性、刺激内皮细胞分 裂、促进组织因子产生的特点，因此认为其参与了d n 内皮损伤的发生。 血管紧张素i i ( a n g i i ) 在糖尿病肾病发生发展中起重要作用，a n g 受体拮 抗剂( a r b ) 可在受体水平上完全阻断a n g i i 的作用而起肾保护作用。但其具 体机制不明。 本研究拟采用链脲佐菌素( s t z ) 诱导的糖尿病大鼠模型进行研究，观察糖 郑州火学2 0 0 3 届硕士研究生毕业论文缫沙坦对糖尿病大鼠肾脏保护机制的实验研究 尿病肾病不同时期肾组织局部e t 一1 ，n 0 以及v e g f 表达的动态变化，从而探讨 它们在糖尿病肾病的发生发展中所起的作用，同时应用a r b 类药物缬沙坦，观 察其对e t 1 ，n o 以及v e g f 的影响，了解其肾保护机制。 方法4 8 只健康雄性w i s t a r 大鼠，随机选取3 2 只，禁食1 0 h ，一次性腹腔 内注射新鲜配制的链脲佐菌素( s t z ) 5 0 m g k g ，其余1 6 只腹腔内注射相当体 积的柠檬酸缓冲液。注射s t z 7 2 h 后血糖 1 6 7 m m o l l ，尿糖十+ + 斟+ 抖的大鼠为 糖尿病大鼠，腹腔内注射柠檬酸缓冲液7 2 h 后血糖正常，尿糖阴性的大鼠为正常 大鼠。随后随机分三组：i 组：n = 1 6 ，正常大鼠，每天灌胃同体积生理盐水。 i i 组：n = 1 6 ，糖尿病大鼠，每天灌胃同体积生理盐水。i i i 组：n = 1 6 ，糖尿病 大鼠，每天灌胃缬沙坦混悬液2 4 m g k g d 。每组2 w 后均处死6 只，余鼠1 2w 后处死。实验期间大鼠均不限饮食及饮水，不给予降糖药物或胰岛素。处死前各 组大鼠i 煲l 定2 4 h 尿蛋白量、内生肌酐清除率、体重：处死后取出肾脏，测定。肾重 并应用放免法测定肾皮质组织中e t - 1 的含量，硝酸还原酶法测定l 肾皮质组织中 n o 含量，免疫组化检测肾小球内v e g f 的表达。 结果 1 1 组、i i 组、组大鼠2 w 末血糖分别与其1 2 w 末相比，差异均无统计学意 义( p o 0 5 ) ；组血糖与组相比差异均无统计学意义俨 o 0 5 ) 。 2 2 w 束时l i 组、i 组的1 肾重，体重、2 4 h 尿蛋白量、内生肌酐清除率( c e r ) 与 i 组相比，明显增加，差异均有统计学意义( p 0 0 5 ) ；1 2 w 末时1 i 组、i i i 组的肾重，体重、 2 4 h 尿蛋白量、c c r 与i 组相比，明显增加，差异均有统计学意义( p 0 0 1 ) ， i 组上述指标与组相比，明显降低，差异均有统计学意义( 尸 o + 0 1 ) 。 3 ，肾脏切片h e 染色示2 w 末时i i 组、组大鼠的肾小球长径、肾小球内的细 胞数与i 组相比，明显增加，差异均有统计学意义( 尸 0 0 5 ) 。1 2 w 末时i i 组、i i i 组大鼠肾 小球长径大于i 组大鼠，差异均有统计学意义( p 0 0 1 ) ，肾小球内的细胞 数大于i 组大鼠，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) ，i i i 组上述指标与组相比， 明显降低，差异均有统计学意义( p o 0 1 ) 。 4 2 w 末时h 组、i 组大鼠肾组织匀浆n 0 2 n 0 3 水平均明显高于i 组大鼠( p 2 郑卅f 大学2 0 0 3 届硕士研究生毕业论文缬沙坦对糖尿痛大鼠肾脏保护机制的实验研究 o 0 1 ) ，i i 组大鼠肾组织匀浆n 0 2 n 0 3 水平与c c r 呈正相关( r = o 7 5 5 。p o 叭) ，l i 组、i i i 组大鼠肾组织匀浆e t 一1 水平均显著低于i 组( p o 0 1 ) ， i i 组大鼠肾组织匀浆e t 。1 水平与c c r 呈负相关( 产一o 6 8 5 ，p 0 0 5 ) ，与 n 0 2 n 0 3 - 水平呈负相关( f o 8 3 2 ，p o 0 5 ) 。1 2 w 末时i i 组、 i i i 组的大鼠肾组织匀浆n 0 2 n 0 3 水平与i 组相比，明显降低，差异均有统 计学意义( 尸 o 0 1 ) ，e t 1 水平与i 组相比，明显增加，差异均有统计学 意义( p o 0 1 ) ；i i i 组肾组织匀浆n 0 2 n 0 3 水平与i i 组相比，明显增加， 差异有统计学意义( p o 0 1 ) ，e t 1 水平与i i 组相比，明显降低，差异有 统计学意义( p 0 叭) 5 2 w 末时i 组大鼠肾组织中v e g f 有少量表达，i i 组、i 组大鼠v e o f 表达 明显增加，与i 组比较差异均有统计学意义( p 0 0 5 ) 。1 2 w 末时i 组 大鼠肾组织中v e g f 有少量表达，i i 组、i 组大鼠v e g f 表达明显增加， 与i 组比较差异均有统计学意义( 户 o 0 5 ) 2 a tt h ee n do f2w e e k st h er a t i oo f k i d n e yw e i g h ta n db o d yw e i g h t ，t h eq u a n t i t yo f 2 4 h ru r i n a r y p r o t e i na n d c r e a f i n i n ec l e a r a n c er a t ei n g r o u p 1 ia n d1 1 1w e r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s ei ng r o u pi ( 尸 0 0 5 ) a tt h ee n do f 12w e e k st h er a t i oo f k i d n e yw e i g h ta n db o d yw e i g h t ，t h eq u a n t i t yo f 2 4 h ru r i n a r y p r o t e i n a n de r e a t i n i n ec l e a r a n c er a t ei n g r o u p 1 ia n d1 1 1w e r es i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a ni ng r o u pi ( p 0 0 1 ) 。t h e s ei n d e xi ng r o u p1 1 1w e r ea l ll o w e rt h a n t h o s e i n g r o u p i i ( p o 0 1 ) 3 a tt h ee n do f2w e e k st h eh es t a i n i n gs l i d e ss h o w e dt h e l o n g i t u d eo ft h e g l o m e p a l u s a n dt h en u m b e ro fg l o m e r u l u sc e l li n g r o u p i ia n d1 1 1w e r e s i g n i f i c a n t l ym o r et h a nt h o s ei ng r o u pi ( p o 0 5 ) ：a tt h ee n do f1 2w e e k st h e l o n g i m d t eo f t h eg l o m e r u l u sa n dt h en u m b e ro f g l o m e r u l u sc e l li ng r o u p i ia n d g r o u p1 1 1 w e r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s ei ng r o u pi ( p o 0 1 ) t h e s e i n d e x i ng r o u p1 1 1w e r e s i g n i f i c a n t l yl o w e r t h a nt h o s ei ng r o u pi i ( p 0 0 1 ) 4 a tt h e 曩l do f2w e e k sn 0 2 - f n 0 3 。l e v e li nt i s s u eh o m o g e n a t ei ng r o u pi ia n d1 1 1 w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti ng r o u pi ( 尸 o 0 1 ) i n g r o u p 1 i n 0 2 j n 0 3 l e v e lh a dap o s i t i v ec o r r e l a t i o nw i t hc c r ( ，= 0 7 5 5 p o 0 1 ) e t - 1l e v e li nr e n a l t i s s u eh o m o g e n a t ei ng r o u p1 ia n d1 1 1w e r el o w e rt h a nt h a ti ng r o u pi ( p 0 0 1 ) ： i ng r o u p1 ie t - 1l e v e lh a dan e g a t i v ec o r r e l a t i o nw i t hc c r ( ，。一o 6 8 5 ，p o 0 5 ) ， 6 郑j + i 大学2 0 0 3 届硕十研究生毕业论文缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏保护机制的实验研究 a n da n e g a t i v ec o r r e l a t i o nw i t hn 0 2 n 0 3 。l e v e l ( 严一0 8 3 2 ，p 0 0 5 ) a tt h ee n do f1 2w e e k s n 0 2 n 0 3 一l e v e li nt i s s u eh o m o g e n a t e i ng r o u pi ia n d1 1 1w e r el o w e rt h a nt h a ti ng r o u pi ( p o 0 1 ) e t 一1l e v e li n t i s s u e h o m o g e n a t ei ng r o u p i ia n d1 1 1w e r eh i g h e rt h a nt h a ti n g r o u pi ( p o 0 1 ) ：n 0 2 n 0 3 。l e v e li nt i s s u eh o m o g e n a t ei ng r o u p1 1 1 w a s h i g h e rt h a n t h a t i n g r o u p i i ( p o 0 1 ) e t 一1l e v e l i ng r o u p1 1 1 w a ss i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h a t i n g r o u p i i ( p o 0 1 ) 5 a tt h ee n do f2w e e k st h e r ew a sal i t t l ev e g f e x p r e s s i o n i ng l o m e m l u si ng r o u pi i n g r o u p i ia n di i it h e r ew e r es i g n i f i c a n tu p r e g u l a t i o no fv e g fe x p r e s s i o ni n g l o m e r u l u s ( 尸 0 0 5 ) a tt h ee n do f1 2w e e k st h e r e w a sal i t t l ev e g f e x p r e s s i o ni ng l o m e r u l u si ng r o u pi ，a n dt h e r ew e r es i g n i f i c a n t u p r e g u l a t i o no fv e g fe x p r e s s i o ni ng l o m e r u l u s i ng r o u p i ia n dh i ( p o 0 5 ) ；实验期间s t z 注射大鼠出现明显的多饮多尿、消瘦：2 w 及1 2 w 后，s t z 注射大鼠的肾组织在光镜下可观察到肾小球面积明显增大，长 径增加；肾小球内细胞数明显增多；部分肾小球基质扩大，基底膜增厚。表中的 n 为鼠数。 塑型查兰! 塑望堡兰堑壅兰兰些鲨苎 塑鲨塑翌塑堡堕盔堕堕壁堡芝塑型墅塞堕堡塞 2 血糖的变化 1 2 w 末血糖与2 w 末相比，差异均无统计学意义 0 0 5 ) ；2 w 末、1 2w 末 i i i 组血糖与i i 组相比差异均无统计学意义( p 0 0 5 ) 。见表1 。表中的n 为鼠数。 表1 各组大鼠血糖( m m o l l ) 的变化( 孑s ) 与同组2 w 末比较：+ p 0 。0 5 ；与i i 组比较：6 p 0 0 5 时间差异lf = 3 9 3 5 p = 0 0 5 4 组别差异；f = - 2 4 6 ，4 9 2p = o 0 0 0 3 肾重，体重的变化 2 w 末i i 组、i i i 组的肾重体重与i 组相比，明显增加，差异均有统计学意义 ( p o 0 5 ) ；1 2 w 末i i 组、 i i i 组的肾重体重与i 组相比，明显增加，差异均有统计学意义( ， 0 0 5 ) 。见表2 。表中的n 为鼠 数。 表2 各组大鼠肾重体重( 1 0 。) 的变化( i s ) 与i 组比较：+ ， 0 0 5 ”p o 0 1 2 w 末：f = 9 1 5 4 0p = 0 0 0 0 1 2 w 末：f = 1 3 2 0 0 7p = 0 0 0 0 4 郑州大学2 0 0 3 届硕十研究生毕业论文 缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏保护机制的实验研究 4 2 4 h 尿蛋白、内生肌酐清除率的变化 2 w 末1 i 组、i i i 组的2 4 h 尿蛋白、内生肌酐清除率( c c r ) 均明显高于i 组大 鼠，差异均有统计学意义( p o 0 5 ) 。1 2 w 末i i 组、1 1 i 组的2 4 h 尿蛋白量、内生肌酐清除率与i 组相比，明 显增加，差异均有统计学意义( p 0 0 1 ) ，i i i 组与i i 组相比，上述指标均明显降 低，差异均有统计学意义( p 0 0 1 ) 。见表3 - 4 。表中的n 为鼠数。 表3 各组大鼠尿蛋白( m g ) 的变化( z s ) 与i 组比较：+ p 0 0 5 “尸 o 0 1 2 w 末：f = - 4 5 6 1 0p = 0 0 0 0 1 2 w 末：f = 4 6 6 4 8p = 0 0 0 0 表4 各组大鼠内生肌酐清除率( m l m 哟的变化( 孑s ) 与i 组比较：+ p 0 0 5 “p o 0 1 ； 2 w 末：f = 2 6 0 0 8p = o 0 0 0 1 2 w 末：户3 1 4 5 3p = - o 0 0 0 郑州大学2 0 1 ) 3 届硕士研究生毕业论文 缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏保护机制的实验研究 5 肾脏形态学变化 2 w 末1 i 组、i 组的大鼠的肾小球面积大于i 组大鼠的肾小球面积，比较肾小 球跃径差异有统计学意义( p 0 0 1 ) ，肾小球内的细胞数，增生明显，与i 组相 比，差异均有统计学意义( p 0 0 5 ) 。见图1 3 。1 2 w 末i i 组、i 组的大鼠l 肾小球面积均大于i 组大鼠的肾小 球面积，比较肾小球长径，差异均有统计学意义( p 0 0 1 ) ，肾小球内的细胞数， 增生明显，与i 组相比差异有统计学意义( p o 0 1 ) ，i i i 组与i i 组相比，明显降 低，差异有统计学意义( p o 0 1 ) 。见表5 - 6 及图4 - 6 。表中的n 为鼠数。 表5 各组大鼠肾小球长径( m m ) 的变化( z s ) 与i 组比较：。p o 0 5 “p 0 0 1 2 w 末：f - - 7 1 5 1p = - 0 0 0 7 1 2 w 柬：f = 3 4 0 6 9p = 0 0 0 0 表6 各组大鼠肾小球内细胞数的变化( 孑s ) 与i 组比较：+ p 0 0 5 “p o 0 1 2 w 末：f = 9 5 8 7p = 0 0 0 2 1 2 w 末：f = 7 6 1 4 9 p = 0 0 0 0 1 6 郑卅1 大学2 0 0 3 届硕士研究生毕业论文 缬沙坦对糖尿病太鼠肾脏保护机制的实验研究 6 肾皮质匀浆n o 和e t 1 的变化 2 w 末i i 组、i i i 组大鼠肾组织匀浆n 0 2 - n 0 3 - 水平均明显高于i 组，差异有 统计学意义( p 0 0 1 ) ；i i 组大鼠肾组织匀浆n 0 2 n 0 3 水平与c c r 呈j 下相关 ( r = 0 7 5 5 ，p o 0 1 ) ，i i 组、i 组大鼠肾组织匀浆e t 一1 水平均显著低于i 组， 差异有统计学意义( p o 0 1 ) ，i i 组大鼠肾组织匀浆e t 一1 水平与c c r 呈负相关 ( f o 6 8 5 p o 0 5 ) ，与n o r n 0 3 - 水平呈负相关( r = 一0 8 3 2 ，p o 0 5 ) 。1 2 w 末组、m 组的大鼠 肾组织匀浆n 0 2 n 0 3 水平与i 组相比，均明显降低，差异均有统计学意义( p o 0 1 ) ，e t 一1 水平与i 组相比，明显增加，差异有统计学意义( p o 0 1 ) ，i l i 组肾组织匀浆n 0 2 悄0 3 水平与i i 组相比，明显增加，差异有统计学意义( p o 0 1 ) ，e t 一1 水平与i i 组相比，明显降低，差异有统计学意义( p 0 0 1 ) 。见 表7 - 8 。表中的n 为鼠数。 表7 各组大鼠肾皮质匀浆n 0 2 n 0 3 ( um o l g p ) 的变化( 孑s ) 与1 组比较：+ p 0 0 5 “p o 0 1 ； 2 w 末：f = - 1 3 0 1 5p = 0 0 0 1 1 2 w 末：f = 7 1 9 1 0p = - 0 0 0 0 望鲨! 查兰! 竺! 旦堡主竺壅皇兰些丝苎 堡鲨竺翌董垦堕查堕堡壁堡芏塑型堕塞墼婴窒 表8 各组大鼠肾皮质匀浆e t 一1 ( p g m g p ) 的变化( 孑s ) 与i 组比较：+ p o 0 5 “p 0 o l 2 w 末：f = 7 1 4 9 8p = 0 0 0 0 12 w 末2 w 末f = 7 9 3 6 5p = 0 0 0 0 7 肾小球v e g f 的表达 2 w 末i 组大鼠肾小球中有少量v e g f 表达，i i 组、i 组大鼠v e g f 表达明 显增加，与i 组比较差异有统计学意义( p 0 0 5 ) ，见图7 - 9 。1 2w 末i 组大鼠 肾小球中v e g f 有少量表达，i i 组、i 组大鼠肾小球中v e g f 表达明显增加， 与i 组相比差异有统计学意义( p 0 0 1 ) ；i i i 组大鼠肾小球中v e g f 表达强度比 i i 组降低，差异有统计学意义( p 0 0 1 ) 。见表9 及图1 0 1 2 。i 、i i 、i i i 组2 w 时的鼠数均为6 ，1 2w 时的鼠数均为1 0 。表中的n 为肾小球数目 表9 各组大鼠肾小球v e g f 的表达强度 与i 组比较：+ p o 0 5 “p o 0 l ； 2 w 末：= - 1 2 4 1 5 。- - 0 0 0 9 12 w 末：月2 4 4 3 5 p = o 0 0 0 郑州大学2 0 0 3 届硕士研究生毕业论文缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏保护机制的实验研究 讨论 d n 是糖尿病微血管并发症之一，早期以肾小球肥大、系膜扩张、基底膜增 厚、肾小球高滤过为特征，随病程进展，逐渐出现肾小球硬化【3 j 。近年来发现，e t 和n o 这一对互为拮抗效应的血管活性物质在多种疾病发生发展中具有重要作 用。但其对糖尿病肾病的作用及机制尚不明。近几年的研究表明v e g f 与糖尿 病视网膜病变有关，在糖尿病视网膜病变患者的视网膜中，v e g f 及其受体表达 增加h 1 。而糖尿病视网膜病变与糖尿病肾病关系密切，均为糖尿病的微血管病变 1 5 , 6 1 两者在发病机制上存在相似之处，因此v e g f 可能在糖尿病肾病中起一定的 作用，但其具体机制尚不清。a r b 类药物由于可以阻断a n g i i 而具有肾保护作 用，在临床上广为应用，但其具体机制尚未完全明了。由于a n 9 1 i 可以调节肾 脏局部n o ，e t 一1 以及v e g f 的表达【7 1 ，面上述因子在d n 的发展中可能起重 要作用，所以推测a r b 可能通过影响肾脏局部的n o ，e t 1 以及v e g f 的表 达而起肾保护作用的。国内外已有研究证实a r b 在糖尿病肾病对e t 一1 及n o 有一定影响，但大部分测定的是血液或尿液中的e t 一1 和n o 8 - 1 1 对肾组织局部 e t 1 和n o 的影响研究较少1 1 2 1 3 1 ，而肾组织局部的n o ，e t 一1 直接参与了早 期d n 的发生发展，因此测定肾组织局部的n o ，e t 1 的含量作为指标比测定 血、尿中上述几种物质更为敏感。国外研究表明应用r a s 阻断剂后，糖尿病视 网膜组织局部v e g f 水平降低，新生血管形成减少 4 j o 而应用r a s 阻断剂对d n 肾脏局部v e g f 的表达是否有影响，国内外尚未见类似报告。本实验通过动物实 验观察糖尿病不同病程中n o 、e t 一1 、v e g f 在肾脏组织中的动态表达，探讨 上述因子对糖尿病肾病发生发展所起的作用，同时观察r a s 阻断剂中的a r b 类药物缬沙坦对肾组织局部e t 1 ，n o 以及v e g f 的影响，探讨其肾保护机制。 1 缬沙坦对糖尿病大鼠肾小球病交的保护作用 糖尿病状态下肾脏局部的r a s 异常激活，作为r a s 途径中一个重要环节 的a n g i i 生成增多，并与其特异性受体结合后发挥生理作用，其受体主要有a t l 型型丛堂兰塑! 舅硕+ 研丝毕业论文缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏保护机制的实验研究 和a t 2 两种亚型，它主要与a t l 受体结合发挥收缩血管、促进肾脏细胞增生的 生物学效应。【1 4 。卅a r b 与a t 】受体特异性结合，竞争性拮抗a n gi i 的作用， 即在r a s 的最后环节阻断各种途径产生的a n g i i ，从而具有肾保护功能。本实 验发现w i s t a r 大鼠在s t z 注射后2 、1 2 w 末，其2 4 h 尿蛋白、肌酐清除率、肾 重体重、肾小球直径、肾小球内细胞数均明显高于同时期正常大鼠，显示有肾 脏病变。经2 w 缬沙坦治疗后的糖尿病大鼠上述指标均无明显改善，而经1 2 w 缬沙坦治疗的糖尿病大鼠上述指标却有明显改善，推测短期缬沙坦治疗虽然可 能有肾保护作用，但由于疗程过短，其肾保护作用尚未表现出来，而长期治疗 则可充分表现出其肾保护作用。经1 2 w 缬沙坦治疗后糖尿病大鼠血糖没有明显 改变，因此推测缬沙坦的肾保护作用并非通过降低血糖完成的。此时大部分指 标仍高于正常大鼠，推测可能是由于糖尿病肾脏病变是多因素共同结果所致， 所以它的舫治除了长期应用a r b 类药物以外还应该包括降糖、降脂、降压、 控制饮食、适当运动等其他措施。 2 缬沙坦对糖尿病大鼠肾小球病变保护作用的可能机制 e t 和n o 是一对互为拮抗效应的血管活性物质，研究证实它们在d n 病变 中起重要作用。n o 是l ，精氨酸经一氧化氮合酶催化形成的一种内皮源性舒张 因子。它的化学性质活跃，在体内很快代谢为n 0 3 。和n 0 2 。，因此n 0 3 。和n 0 2 。 的浓度之和才准确代表体内n o 的水平。e t 有e t 一1 、e t 一2 、e t - 3 三种异构 体，其中e t 1 是发挥肾脏生物学效应的主要形式。因此本实验测定的是肾皮质 局部的n 0 3 - 和n 0 2 以及e t 1 水平分别代表肾脏局部n o 和e t 的含量。 1 9 3 4 年c a m b i e r 首次报道糖尿病患者早期存在肾小球滤过率增加，动物实 验也证实在早期肾小球入球小动脉舒张，毛细血管内压力升高，出现所谓的“高 灌注、高压力、高滤过”。以后动物实验和临床观察都证实这种不正常的肾脏 高功能与糖尿病肾脏损害关系密切，是导致肾小球硬化的主要机制。但导致糖 尿病早期肾小球高滤过的原因尚不明。 本研究发现在s t z 诱导大鼠发生糖尿病2 w 时，大鼠肾重体重及2 4 h 尿蛋 白量显著增j j h ( p 0 0 1 ) ，常规病理显示肾小球体积增大，肾小球长径显著大于正 2 0 郑州大学2 0 0 3 届硕士研究生毕业论文 缬沙蛔对糖尿病大鼠肾脏保护机制的实验研究 常大鼠( p 0 0 1 ) ，说明糖尿病大鼠的肾脏在2 w 即糖尿病早期就发生明显病变： 肾小球肥大、肾小球内细胞增生。此时肾脏的c c r 也显著增2 n ( p 0 0 1 ) ，说明肾 小球存在高滤过现象。同时实验发现2 w 糖尿病组大鼠肾脏度质匀浆中的 n 0 2 。n 0 3 - 水平明显高于正常组( p 0 0 1 ) ，并与c c r 呈诈相关关系，而e t 一1 水 平显著低于正常组( p o 0 1 ) ，并与c c r 呈负相关，提示早期肾小球的高滤过状 态与肾组织局部n 0 2 - n 0 3 - 浓度升高以及e t 1 水平下降有关。而且e t 1 水平 与n o z n 0 3 水平呈负相关，提示两者呈此消彼长的关系。本实验通过免疫组 化技术还发现2 w 糖尿病大鼠肾小球内v e g f 的表达明显增加，与正常大鼠有 显著差异( p 0 0 1 ) ，提示v e g f 在糖尿病早期肾小球高滤过机制中也起一定作 用。 n o 是一种内皮源性舒张因子，它可使血管平滑肌舒张， 当n o 浓度升高 时，扩张肾小球入球小动脉比出球小动脉显著【1 7 】，肾小球灌注增加，跨膜压增加， 可以导致肾小球高滤过。e t 1 具有强烈的缩血管作用，而且它对肾血管的缩血 管作用比对其他部位血管敏感1 0 倍以上，可引起出入球小动脉的收缩，导致肾 血管阻力升高、肾小球血流速度下降、肾血流量减少，从而降低肾小球滤过率； 另外，e t 1 还可通过收缩系膜细胞、减少肾小球滤过面积和超滤系数而减低肾 血流量【1 8 1 ，降低肾小球滤过率。所以如果e t 1 水平下降就可以使肾血管及肾 小球系膜收缩减轻从而造成g f r 升高。而本实验也证实在糖尿病早期，肾脏 局部n o 含量升高和e t 一1 水平下降与内生肌酐清除率升高相关。有研究表明 v e g f 具有强烈的增加血管通透性的作用，其活性是组胺的5 0 0 0 倍，它主要是通 过增加内皮细胞内囊泡( v e s i c u l a r v a c u l o l a ro r g a n e l l e ，v v o ) 的功能来发挥此作用 的。应用免疫组化技术发现血管内皮细胞的基底膜面和v v o 中有v e g f 【l 。 v v o 之间、v v o 与胞膜之间相互作用，可形成有利于大分子物质通过的“小 窗”( f e n e s t r a e ) 。局部注射v e g f 可观察到v v o 功能增加，从而提示v e g f 通 过调节v v o 之间的“窗口”开启而促进血管通透性增加。在肾脏中，v e g f 主 要由肾小球足突细胞表达，而肾小球内皮细胞则表达其受体( 主要是v e g f r 2 ) 作 为其靶细胞。由于肾小球足突细胞和肾小球内皮细胞是构成肾小球滤过膜的主 要部分，结合v e g f 具强效促血管通透性作用，因此v e g f 被认为是调节肾小球 通透性的重要因子之一；而且v e g f 可以减少肾小球基底膜阴离予数目【2 0 1 ，并诱 2 1 兰芏型塑三盟主! ! 鎏生兰些鲨苎 塑鲨些翌塑垦堕查璺塑壁堡塑! ! 型墅壅竺堑塞 导肾小球内皮细胞小窗形成，所以v e g f 可能通过同时影响肾小球基底膜的 电荷屏障及机械屏障而调节肾小球的通透性。1 2 j 时d n 时，肾小球足突上皮细 胞增加v e g f 的表达和分泌，增加的v e g f 有可能穿过肾小球基底膜，与内皮细 胞上的v e g f 受体结合而发挥其促血管通透性增强的作用，从而调节肾小球滤 过膜的通透性，增加对血浆蛋白通透性，从而导致蛋白尿形成。已有大量研究证 实v e g f 在蛋白尿生成中起重要作用，l i j i m a 等将大剂量v e g f 注射至大鼠体 内可诱发蛋白尿的发生【2 2 1 。 e t 与n o 是一对互为拮抗效应的血管活性物质，n o 本身对e t 有抑制作 用，而e t 可以弓| 起血管平滑肌细胞表达n o s 。在正常生理情况下，它们处于动 态平衡，对血管张力进行调节。一旦平衡打破就会引起肾脏功能及血流动力学改 变。在糖尿病早期，高血糖使细胞外液扩容，l 肾脏及全身毛细血管扩张，肾内皮n o 生成和释放增多脚】。由于浓度升高的n o 对e t 1 有抑制作用所以e t 水平 降低，因此升高的n o 对入球小动脉的舒张强于出球小动脉，肾血流增加：同时e t 下调可使肾动脉收缩减轻、肾小球系膜收缩减轻，也使肾血流增加，两方面因素 迭加，导致糖尿病早期的肾小球高灌注、高滤过。而当肾小球处于高血流动力学 的情况时，肾小球毛细血管内压增高可以导致机械牵拉损伤，系膜细胞是主要的 靶细胞，而最近有报道证实机械牵拉可诱导h m c 表达v e g f 【2 4 j 结合v e g f 是 强效促皿管通透因子的事实，可以推测继发于肾小球高压的机械牵拉通过诱导 v e g f 表达而在肾小球通透性异常中起一定作用。而且有人认为v e g f 的促血 管生成，微血管通透性及内皮依赖性扩张的这些效应大部分由e n o s 介导【2 “。 体外及体内实验均证实v e g f 在高糖培养基中可以增加鼠内皮细胞i n o s 活性， 诱导产生n o 2 “。而在培养的鼠、人血管平滑肌细胞中，加入外源性n o 后发现 v e g f 合成与分泌增加，当加入n o 抑制剂时，v e g f 合成和分泌减少【2 2 7 1 。上述 研究提示v e g f 与n o 之间存在正反馈，即n o 可促使v e g