（生理学专业论文）内质网应激通过akttscmtor信号通路调控自噬.pdf

北京协和医学院皋础学院顾i ：研究生学位论文 目录 中文摘要2 英文摘要3 弓i 言4 一、内质网应激4 二、细胞自噬6 三、受体酪氨酸激酶信号通路9 四、a k t 厂r s c m t o r 信号通路1 0 材料与方法1 3 一、实验材料13 二、实验方法15 实验结果2 6 一、药物诱导的内质网应激引起受自噬调控的细胞凋亡2 6 二、a k t t s c m t o r 通路下调引起内质网应激诱导的细胞自噬2 6 三、a m p k 及p t e n 未参与内质网应激诱导的a l 汀通路下调一2 9 四、4 p b a 部分恢复药物诱导的内质网应激引起的a k t 通路下调3 0 五、4 p b a 通过上调p d g f r 及i r s l 部分恢复m t o r 过度活化诱导的内质网应 激引起的a k t 通路下调31 讨论3 3 总结3 6 缩略语表3 7 参考文献3 9 文献综述4 3 致谢。5 6 北京协和医学院接础学院硕f ：研究生学位论文 摘要 硕士研究生：秦亮 北京协和医学院基础学院 指导教师：张宏冰教授 生理与病理生理系 内质网是真核细胞一种重要的细胞器，是细胞内蛋白质合成，修饰，折叠的场 所。由于各种原因引起的内质网平衡的紊乱，称为内质网应激。内质网应激会引起 从内质网到细胞质和细胞核的信号传导，最终帮助细胞恢复稳态并得以存活。然 而，严重的内质网应激可导致细胞发生自噬和凋亡。对于调控这一过程的精确机制 目前知之甚少。本研究表明，内质网应激通过抑制m t o r 通路引起细胞自噬，进而 诱导细胞死亡。 本实验中，三种广泛使用的内质网应激的诱导剂，包括衣霉素，d t t 和m g l 3 2 均引起了l c 3 i 向l c 3 i i 的转化。该转化是细胞出现自噬的重要指标。同时，三种 药物也导致m t o r 的活性大幅度下降。而抑制自噬可以显著提高细胞在内质网应激 下的存活率。已知t s c 缺失的细胞中m t o r 被组成型激活。而本实验表明，在内 质网应激中，t s c 缺失细胞的自噬水平显著低于其对照组细胞。由此可见，内质网 应激导致的m t o r 活性降低，是由于其对a k t 厂r s c m t o r 信号通路的下调所致。 作为该通路中的两个重要调节蛋白，p t e n 及a m p k 并未参与该调控。4 一p b a 作为 一种帮助蛋白质正确折叠的化学伴侣分子，部分恢复了由内质网应激下调的 a k t 厂r s c m t o r 通路。 另外，根据相关文献报道，组成型激活的m t o r 可导致内质网应激。本实验结 果表明，由组成型激活的m t o r 所导致的内质网应激，减弱了r t 舯1 3 k a k t 通 路对多种生长因子的反应。同时，4 p b a 可以恢复该反应。据此，本实验提出一种 新的机制用以解释内质网应激引起的自噬，以及由m t o r 到川i 汀的负反馈作用。 关键词：内质网应激；自噬；m t o r ；a k t ；p d g f r 2 北京协和医学院皋础学院硕i j 研究生学位论文 a b s t r a c t m s c a n d i d a t e ：l i a j l gq i na d v i s o r ：p r o h o n g b i n gz h a n g d e p a r t m e n t so fp h y s i o l o g y & p a t h o l o g y ，i n s t i t u t eo fb a l s i cm e d i c a ls c i e n c e s ，c h i n e s e a c a d e m yo fm e d i c a ls c i e n c e s 甜l dp e k i n gu 1 1 i o nm e d i c a lc o l l e g e ，b e i j i n gl0 0 0 0 5 ， c h i n a 1 1 l e e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ( e r )i s 锄e s s e n t i a li m m c e l l u l a ro 娼a n e l l ep r o v i d i n g 印p a r a t u sf o rs y n t h e s i z i n gn a u s c e n tp r o t e i n sa s 、e l l a sm e i r 如r t h e rm o d i f i c a t i o n 锄d c o r r e c tf o l d i n g av a r i e t yo ff a c t o r sc o u l dd i s t u r bt l l eh o m e o s t a s i so fe c a l l e de rs t i e s s s e v e r a ld o 、n s t r e a ms i g n a l i n gp a t h w a y sc o u l db ei n d u c e dt 0r e s p o n de rs t r e s s ，a n d f i n a l l yr e s u l ti nt h er e s t o r a t i o no ft h eh o m e o s t a s i s h o w e v e r ，e rs 仃e s st h a tc a nn o tb e r e s c u e dr e s u l t si na u t o p h a g y 锄dc e ud e a t l l ，w h i l et h ep r e c i s em e c h a i l i s mw 硒l a r g e l y u m m o w n h e r ew ed e m o n s t r a t e dt h a te rs t r e s s i n d u c e dc e l ld e a t hw 2 l sm e d i a t e db y a u t o p h a g yw h i c hw a sp a r t l ya t t r i b u t e dt ot h ei n a c t i v a t i o no ft h em a m m a l i a nt 2 u r g e to f r 印锄y c i n ( m t o r ) t i l r e ew i d e l yu s e de rs t r e s si n d u c e r si n c l u d i n gt u n i c a m y c i n ，d t ta n dm gl3 2l e dt ot h e c o n v e r s i o no fl c 3 一it ol c 3 一i i ，ac o m m o n l yu s e dm a r k e ro fa u t o p h a g y ，嬲w e l la st h e d o w m e g u l a t i o no fm t o rc o n c lj r r e n t l y t h ep r e s e n c eo fa l l t o p h a g yi n h i b i t o rg r e a t l y i m p r o v e dc e l ls u i v a lu n d e re rs t r e s s t s c - d e f i c i e n tc e l l s 谢t hc o n s t i t u t i v ea c t i v a t i o n o fm t o re x h i b i t e dm o r er e s i s t 锄c et oe rs t r e s s i n d u c e da u t o p h a g y ，c o m p a r e dw i t ht h e i r w i l d t y p ec o u 】呲e 印a r t s fu ：r t h e m o r e ，o u rs t u d i e ss h o 、v e dt h a te rs t r e s s i n d u c e d d e a c t i v a t i o no fm t o rw a sa t t r i b u t e dt ot h ed o w n r e g u l a t i o no fa k t t s c m t o r p a t h w a y p h o s p h a t a l s ea n dt e n s i nh o m o l o g ( p t e n ) a n da m p - a c t i v a t e dp r o t e i n 妯n a s e ( a m p k ) a s “旧r e g u l a t o r si n “sp a m w a ys e e m e dt ob ea b s e n ti n “sr e g u l a t i o n a sa c h e m i c a lc h 印e r o n eh e l p i n gt h ec o n e c tf o l d i n go fp r o t e i i l s ，4 - p h e n y l b u t 蛐ca c i d ( 4 - p b a ) p a r t l yr e s c u e da k t 厂r s c m t o rp a t h w a yi nd r u g i n d u c e da c u t ee r s t r e s s m o r e o v e r ， c o n s t i t u t i v e l y - a c t i v a t e d m t o r i n d u c e d l o n g - t e m e rs 仃e s sa t t e n u a t e d r t l 卯1 3 l 淞k ts i g n a l i n gp a t b 、) r a yi i lr e s p o i l s et 0t h es t h u l a t i o nb yv 撕o u sg r o w c h f a c t o 璐，w h i c hc o u l da l s ob ep a r t l yr e s t o r e db y4 一p b a c o i l s i d e r i n gt h er e c e n tr e p o nt h a t c o n s t i t u t i v ea c t i v a t i o no fm t o rt r i g g e r se rs 仃e s s ，o u rs 眦ym a yh e l pp r o p o s ea s i g n a l i n gp a t h 、v a yr e s p o n s i b l ef o re rs t r e s s - i n d u c e da u t o p h a g ya n dai l o v e lm e c k m i s m a c c o u n t i n gf o rm en e g a t i v ef e e d b a c k 舾mm t o r t oa k t k e yw o r d s ：e rs 眈s s ；a u t o p h a g y ；m t o r ；a k t ；p d g f r 3 北京协和医学院幕础学院顾i ：研究生学位论文 引言 一、内质网应激 内质网是真核细胞中膜蛋白及分泌蛋白合成的重要场所。与此同时，蛋白质的 各种翻译后修饰和折叠，例如n 糖链和二硫键的形成等也都在内质网中进行【l 】。 这一过程广泛存在于所有真核细胞内，因此受到极其严格的调控：只有正确修饰、 折叠的蛋白才能被转运出内质网，否则将通过各种途径被降解。然而，许多因素可 以导致这一精确调控机制出现异常。例如，在生理条件下，蛋白分泌负担的增加引 起内质网超负荷反应；在病理条件下，错误蛋白的堆积导致蛋白无法被正常运出内 质网【2 】。由此导致的内质网稳态的破坏统称为“内质网应激”。当内质网应激出现 时，为恢复细胞内环境稳态，维持细胞生存，真核细胞启动一系列信号通路，统称 为“未折叠蛋白反应 。三个定位于内质网膜上的蛋白负责监控内质网应激并启动 未折叠蛋白反应：肌醇依赖内质网至细胞核信号激酶l ( i r e l ) ，类r n a 依赖蛋白 激酶内质网激酶( p e i 水) 以及转录激活因子6 ( a t f 6 ) 。当内质网处于稳态时，它们 都处于未活化状态。而内质网应激发生时，它们可以被迅速将其激活，进而启动下 游信号通路( 图1 ) 。 内质网应激导致i i 也l 寡聚化及自身磷酸化，并激活其r n a 内切酶活性。i i 迮1 可切割x 盒结合蛋白l ( x b p l ) 的m r n a ，使其成为成熟的m r n a 。x b p l 的成熟 i i l 】 a 编码碱性含有亮氨酸锌指结构的转录因子，它能增强分子伴侣蛋白b i p 等的 转录活性。分子伴侣蛋白表达的上调可促进内质网功能恢复，帮助新生蛋白的正确 折叠包装。p e r k 属于真核细胞蛋白质翻译起始复合体蛋白激酶家族成员，是位于 内质网的i 型膜蛋白。其n 端可感受内质网应激的信号，而c 端有丝苏氨酸蛋白 激酶功能域。p e r k 活化后能够特异性地磷酸化真核翻译起始因子2 a ( e i f 2 a ) 第 5 l 位丝氨酸。e i f 2 a 被磷酸化后则失去起始蛋白质翻译的活性，进而使得胞内蛋白 合成的整体水平被下调。a t f 6 是i i 型膜蛋白，其c 端位于内质网腔内。活化的a t f 6 的n 端切割段可转移到细胞核内促进转录因子x b p l 等基因的转录。 当内质网应激出现后，细胞主要通过两种途径清除堆积的蛋白：蛋白酶体途径 和自噬途径【1 3 】。自噬途径可快速清除大量堆积蛋白，但是剧烈的自噬会引发细胞 凋亡。 未折叠蛋白反应在内质网应激的早期主要起到保护细胞及重建内质网稳态的 作用，例如降低大部分蛋白质的合成从而减轻内质网负荷；加速内质网分子伴侣基 因的表达以协助蛋白质折叠；清除不能正确折叠的蛋白质等。然而，当内质网应激 过于剧烈以致稳态重建失败时，未折叠蛋白反应则可以通过启动细胞凋亡途径来诱 导发生内质网应激过度的细胞死亡。内质网应激可诱导c a s p a s e 1 2 表达，同时也导 致c a s p a s e 7 转移到内质网表面，然后导致细胞死亡。同时，内质网应激还可启动 4 北京协和医学院皋础学院硕i j 研究生学位论文 自噬途径来诱导细胞凋亡。近年来，大量文献报道内质网应激在许多疾病中发挥重 要作用，特别是代谢相关疾病如糖尿病及肥胖。另外，内质网应激与其他疾病，如 癌症及神经退行性疾病也高度相关( 详见文献综述) 。 m l s f 0 i d e dp m t e i n so r a i t e r a t i o n si ne rh o m e 0 s t a s i s n u c l e u s 图l ：错误折叠的蛋白及内质网稳态的破坏可造成内质网应激，进而激活下游的朱折叠蛋白反 应，其中最主要的三条信号通路为l r e l ，p e r k 及a t f 6 。( 来自p r o fl i n gq i ) 一些诱发内质网应激的理化因素如脂质过量堆积、胞内能量流动和养分利用障 碍与肥胖密不可分。同时，肥胖增加了许多内分泌器官及系统中细胞对蛋白质合成 北京协和医学院皋础学院硕i ：研究生学位论文 的需求。除肝脏外，肥胖动物脂肪组织中p e i 和e i f 2 a 磷酸化水平都明显高于非 肥胖正常对照组，然而肌肉组织中却未发现这些变化。这些结果表明，肥胖与主要 发生在肝脏和脂肪组织中的内质网应激息息相关。体外实验表明，内质网应激可引 起包括肝脏、肌肉和脂肪等外周组织的胰岛素抵抗。内质网应激能激活i r e l ，继而 引起c j u l l 氨基端激酶( c - j u nn t e n l l i n a lk i n a s e ，k ) 信号通路活化。i r e l 一刷k 信 号在2 型糖尿病患者肝脏胰岛素抵抗中发挥了重要作用。给予k 抑制剂s p 6 0 0 1 2 5 或州k 抑制肽显著改善了糖尿病小鼠的胰岛素抵抗和葡萄糖耐量。内质网应激还影 响脂质代谢。内质网应激可以激活固醇调节级联反应。高糖血症、肥胖及磺脲类药 物的长期应用等可导致胰岛d 细胞损伤，损伤后p 细胞的凋亡与2 型糖尿病的发生 密切相关。d 细胞对内质网应激反应极度敏感，内质网应激介导的p 细胞凋亡在糖 尿病的发生过程中发挥着重要作用。 内质网应激还存在于神经退行性疾病中。蛋白沉积是许多神经退行性疾病的共 同特征。各种原因引起的蛋白沉积及其所引发的胶质细胞激活、局部炎症免疫反应、 氧化应激、代谢增加、低氧状态、钙平衡失调等都可能干扰蛋白质在内质网中的折 叠，从而引发内质网应激。内质网应激影响了神经信号传递及轴突运输，并激活了 与细胞死亡等有关的信号通路。 二、细胞自噬 自噬意为自体吞噬，是一个细胞内物质通过溶酶体被降解的过程。自噬广泛存 在于真核细胞中。与蛋白酶体途径相比，自噬不仅可以降解蛋白质，还可降解长半 衰期的蛋白复合体，甚至整个细胞器【4 】。自噬在进化过程中高度保守，从酵母、果 蝇到脊椎动物包括人中都可以找到与其相关的同源基因。发生自噬的细胞胞质中会 出现大量游离的膜结构，称为前自噬泡。前自噬泡逐渐发展，成为由双层膜包被的 自噬泡，其中包裹着变性坏死的细胞器和部分细胞质。自噬泡的外膜与溶酶体膜融 合，内膜及其包裹的物质进入溶酶体腔，被溶酶体中的酶水解。水解后的小分子被 重新释放，从而得以被细胞再次利用( 图2 ) 。根据细胞内底物运送到溶酶体腔方 式的不同，哺乳动物细胞自噬可分为三种主要类型：巨自噬、微自噬和分子伴侣介 导的自噬f 5 ，6 】。 自噬在调控细胞生存中扮演一把双刃剑的角色。在细胞饥饿、生长因子缺乏和 缺氧等条件下，以及一些病理状态下，自噬对维持细胞的存活有积极作用。它通过 平衡细胞合成和分解代谢以稳定细胞内环境。自噬通过分解暂时不需要的蛋白复合 体来获得小分子的氨基酸，用于合成对细胞存活更为重要的蛋白质。然而，过度的 自噬可以导致细胞的程序性死亡，这一途径被称为i i 型程序性细胞死亡。自噬和凋 亡由各自特定的蛋白执行，然而其各自的信号通路间存在错综复杂的相互作用。两 者间精确的调控机制尚不清楚。 6 北京协和医学院幕础学院硕i ：研究生学位论文 图2 ：发生自噬的小鼠肝细胞形态变化。a 包裹了线粒体、内质网膜及核糖体的起始自噬泡 ( a v i ) 开始形成。b 自噬泡膜通常夹在两层粗面内质网膜中间，其内容物开始降解， 但仍可见内质网膜。c 自噬泡已发展为晚期的降解自噬泡( a v d ) ，其内容物已部分降 解。d 自噬泡已完全降解，此时内质网膜也已被完全消化。( 米自p r o fe e v a - l i i s a e s k e l i n e n ) 虽然大量的自噬相关基因0 翻被报道，其具体的调控机制还有待进一步研究。 目前研究最为广泛的两条自噬调节信号通路包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白( m t o r ) 通路及三磷酸肌醇( i p 3 ) 通路。对m t o r 及i p 3 的抑制均可诱导自噬的发生，而 这两条通路之间似乎并无相互或联合作用 4 ，7 】。目f ； 广泛熟知的自噬发生通路是： 家族i i i 磷脂酰肌醇3 激酶( p 1 3 k ) 复合体负责调控自噬泡膜的凝集，并包裹胞质 蛋白、蛋白聚集体甚至细胞器。b c l 2 可通过结合并抑制p 1 3 k 复合体的重要组分 b e c l i n1 ( 酵母a t 9 6 的同源物) 来抑制这一过程。a 蟾1 2 一a t 9 5 一a t g l 6 及a t 9 8 - p e 复 合体( 哺乳动物中被称为l c 3 i i ) 可以和跨膜蛋白a t 9 9 一起被转运至自噬泡，从而 帮助自噬泡的扩展。自噬泡形成后，大部分的a t g 蛋白从其上解离，使得自噬泡与 溶酶体融合，并导致自噬泡内容物的降解( 图3 ) 。 7 北京协和医学院堆础学院硕i ：研究生学位论义 a u t o l y s o m e 图3 ：自噬泡形成过程。自噬是发生于亚细胞水平的膜结构动态的变化过程，在即将发生自噬 的细胞胞浆中首先出现人量游离的膜性结构，该结构逐渐发展，包裹部分胞浆，形成前 自噬体。最后自噬体外膜与溶酶体膜融合，溶酶体内各种水解酶类就会将自噬体内的成 分连同自噬体内膜一起降解。自噬的发生需要特定基冈( 彳翻编码的蛋白质的参与，其中 由a t 9 3 、a t 9 5 、a t 9 7 、a t 9 1 0 、a t g l 2 和l c 3 参与组成两条泛素样蛋白加工修饰系统。( a n n u r e vg e n e t 。2 0 0 9 ，4 3 ：6 7 9 3 ) 尽管自噬这一现象早已被发现，然而直到近十年，有关它的研究才取得突破性 进展，其在各种生理及病理过程中的作用也被逐步发现 8 ，9 】。自噬在很多f 常的 生理过程中扮演重要角色，特别是细胞分化和个体发育，如酵母孢子形成及分化， 昆虫的多态性及哺乳动物产后黄体细胞的退化等。当自噬功能被抑制或干扰时，细 8 北京协和医学院堆础学院硕i ：研究生学位论文 胞的降解功能会出现障碍，并导致多种疾病的发生，如癌症及神经退行性疾病。研 究发现，肿瘤细胞的自噬水平显著低于j 下常细胞。即使无血清及氨基酸的饥饿仍不 能诱导其自噬升高。同时，在肿瘤动物模型中也观察到类似的结果。进一步研究表 明，许多肿瘤细胞中都可见自噬相关基因的缺失。另一方面，许多神经退行性疾病 的发生都伴随有溶酶体降解能力的障碍。溶酶体降解过程受到干扰常常导致胞内蛋 白质积聚和主要蛋白质降解系统的改变，进而引起神经元死亡。在阿尔茨海默病， 亨廷顿氏舞蹈病以及帕金森病人中都常常检测到自噬相关基因的突变。 三、受体酪氨酸激酶信号通路 受体酪氨酸激酶( r t k ) 家族包含一系列具有内在酪氨酸激酶活性的细胞表面 受体，例如血小板源生长因子受体( p d g f r ) ，类胰岛素生长因子l 受体( i g f l r ) 及上皮生长因子受体( e g f r ) 等。它们以配体控制的方式调节多种细胞生理事件。 另一方面，它们的异常激活在肿瘤发生发展中常常扮演重要角色【1 0 】。与相应配体 结合后，r t k 形成二聚体，进而激活其自身酪氨酸激酶活性。随着酪氨酸残基被磷 酸化，r t k 通过与下游蛋白保守区域的相互作用，激活多条信号通路。一般说来， r t k 主要通过激活三条下游通路来传递抗凋亡及促进细胞增殖的信号： r a s 脚m e kl 2 e r kj a k st a t 以及p 1 3 a k t 【l l 】。 r a s r a f m e k l 2 e r k 通路又被称作丝裂原活化蛋白激酶( m a p k ) 信号通路。 m a p k 是一个丝氨酸苏氨酸激酶超家族，其激活包含了一系列级联反应：丝裂原活 化蛋白激酶激酶激酶( m a p k k k ) 通过磷酸化激活丝裂原活化蛋白激酶激酶 ( m a p k k ) ，m a p k k 再进一步通过磷酸化激活m a p k 。m a p k 通路的激活受到 一系列辅助结合蛋白的调节。辅助结合蛋白帮助m a p k 与特定的蛋白复合体结合， 从而使其具有高度的对胞外刺激的依赖性。m a p k 主要包括胞外信号调节激酶 ( e i 水) ，州k 及p 3 8 激酶三条信号通路。m a p k 可以通过转运进入细胞核，进而 直接磷酸化并激活转录因子，从而调节相关基因的表达。 j a n u s 激酶( j a k ) 是一个酪氨酸激酶家族，该家族成员可磷酸化定位于质膜上的 信号传导及转录活化因子( s t a t ) 。磷酸化的s t a t 可转移至细胞核内，进而激活 相关基因的转录。目前在哺乳动物中已鉴定出s t a t 家族的7 个成员，分别是 s t a t l 、s t a t 2 、s t a t 3 、s t a t 4 、s t a t 5 a 、s t a t 5 b 和s t a t 6 。s t a t 可介导 多种生物学功能，其中最重要的是参与机体免疫应答和调控细胞增殖与细胞转化。 大多数人类肿瘤中可见s t a t 的组成型激活，尤其是s t a t l 、s t a t 3 和s t a t 5 。 s t a t l 的功能主要与生长抑制有关，而s t a t 3 和s t a t 5 可通过抑制凋亡或诱导细 胞增殖参与肿瘤的发生和发展。 r t k 对下游的家族ip 1 3 k 的激活主要通过两种不同机制：r t k 直接与p 1 3 k 结合，或首先磷酸化辅助结合蛋白，例如胰岛素受体底物( i r s ) ，然后辅助蛋白直 9 北京协和医学院皋础学院硕l ：研究生学位论文 接结合并激活p 1 3 k 。p 1 3 k 可磷酸化4 、5 二磷酸磷脂酰肌醇( p i p 2 ) ，从而形成3 、 4 、5 三磷酸磷脂酰肌醇( p i p 3 ) 。a k t 与磷酸肌醇依赖蛋白激酶l ( p d k l ) 在质 膜上与p i p 3 结合，从而被p d k l 在t 3 0 8 位磷酸化进而被激活。 四、a k t 厂i s c ，m t o r 信号通路 a k t 又被称为蛋白激酶b ( p k b ) ，是一个丝氨酸苏氨酸激酶。a k t 可被一系列 上游信号激活，包括r t k 、整合素、b 细胞和t 细胞受体、细胞因子受体及g 蛋 白偶联受体等。自从首次作为一种原癌基因被发现以来，a k t 以其在多种细胞事件 中的核心调控地位逐渐成为人们关注的热点( 图4 ) 。例如：a k t 是胰岛素信号通 路及糖代谢的主要调节分子；a k t 可以通过对细胞周期蛋白依赖性激酶( c d k ) 的 抑制蛋白p 2 l 及p 2 7 的直接抑制来促进细胞增殖；a l 汀还可通过直接抑制前凋亡因 子如b a d 及叉头转录因子家族( f o x o 家族) 来促进细胞生存。a k t 是细胞内主要的 促进细胞生存及增殖的调控分子，多种癌症及胰岛素相关代谢异常疾病中都频繁检 测出其异常调控。 图4 ：几种最主要的a k t 底物在细胞功能调控中的作用。a k t 可直接磷酸化这些底物，进而 导致其激活或火活。a k t 对这些底物的调节作用在细胞内各种生理事件( 如细胞存活、 生长、增殖、葡萄糖吸收、代谢以及血管生成) 中具有重要意义。( c e l l ，2 0 0 7 ，1 2 9 ： 1 0 北京协和医学院皋础学院硕i ：研究生学位论文 1 2 6 1 1 2 7 4 ) 两个重要的抑癌基因分别位于其上下游并负责下调该通路的活性：磷酸酶与 张力蛋白同源物( p t e n ) 可以通过催化p i p 3 向p i p 2 的转化来抑制a k t 的活性 1 2 】； 结节硬化症复合体l 2 ( t s c l 厂r s c 2 ) 异源二聚体可抑制m t o r 的活性【1 3 】。a k t 可 以磷酸化t s c l 厂r s c 2 复合物中t s c 2 上的多个磷酸化位点，进而抑制t s c 2 对大脑 丰富r a s 同源系( 1 油e b ) 的g t p 酶活性，从而造成i 地e b g t p 水平升高。由于r h e b g t p 激活m 1 o 所以a k t 可以通过抑制t s c l 厂r s c 2 来激活m t o r 。m t o r 是一个丝 氨酸苏氨酸激酶，其对细胞大小和细胞增殖的调节作用主要通过磷酸化两个重要底 物实现：真核翻译起始因子4 e 结合蛋白l ( 4 e b p l ) 和核糖体p 7 0 s 6 激酶1 ( s 6 k 1 ) 。 4 e b p l 的磷酸化导致其失活并与真核翻译起始因子4 e 分离，从而起始c 印依赖的 m r n a 翻译。而s 6 k 1 的磷酸化则导致其被激活，进而启动核糖体蛋白的翻译。m t o r 引起s 6 k 1 和4 e b p l 磷酸化这一途径能够被各种生长因子和营养物质迅速激活。 因此，m t o r 可通过控制蛋白生物合成来调节细胞的生长。由于m t o r 信号通路 负责许多编码细胞g 1 期和s 期必需蛋白的m i a 的翻译，所以对m t o r 的抑制 会引起细胞在g 1 期的延缓或者阻滞( 图5 ) 。 另一方面，过度活化的m t o r 又可以反过来抑制a k t 。t s c 的缺失会导致结 节硬化症，它以器官的组织缺陷和错构瘤为特征，其典型的症状是皮脂腺瘤，智能 减退及癫痫发作。而m t o r 对a k t 的这种负反馈机制被认为是结节硬化症病人的 肿瘤通常为良性的主要原因【1 4 】。人们提出几种不同的机制用以解释这种负反馈机 制：一种理论认为t s c 缺失细胞中p d g f r 的降低起主要作用【1 5 】；而另一种理论 将a k t 的降低归因于m t o r 诱导的i r s l 的降解和细胞内转位【1 6 1 9 】。 图5 ：哺乳动物细胞中的m t o r 信号通路。其中，m t o r 复合体l 对雷帕霉素敏感，它包含了 m t o r ，r a p t o r ，m l s t 8 和p r a s 4 0 。t s c l 2 r h e b 是m t o r 复合体l 上游的主要调控分 子。多种上游蛋白可通过磷酸化等途径对t s c l 2 的活性进行诃1 j f ，其中最重要的两种 调节分子是a k t 和a m p k 。前者可通过对t s c 2 的磷酸化使t s c l 2 复合体解聚，而后 者可激活t s c l 2 复合体的功能。a m p k 的活性直接受细胞内a m p a t p 水平的调控。 通过磷酸化s 6 k l 及4 e b p l ，m t o r 复合体l 整合了细胞能量水平、生长因子及w n t 信 号来调控蛋白翻译。而磷酸化的s 6 k l 又可通过对i r s 上的若干丝氨酸位点的磷酸化导 致其降解，进而下调p 1 3 i 淞k t 通路。m t o r 复合体2 包含m t o r ，r i c t o r ，s i n l 及m l s t 8 ， 它主要通过调节p k c n 及a k t 来调控细胞结构及生存。关于m t o r 复合体2 的上游调 控通路目前尚不清楚，已知它可通过磷酸化a k t 的s 4 7 3 位点帮助a k t 激活。( c e l l 陀s e a r c l l ，2 0 0 7 1 7 ：6 6 6 6 8 1 ) 北京协和医学院甚础学院硕i ：研究生学位论文 l n s u i i n j 己薹叁 i ， ，f 撇1 2甏mltj k 穷j 囟黟壁蚕触哕卜 1 2 北京协和医学院慕础学院颂i j 研究生学位论文 材料与方法 一、实验材料 1 细胞系 小鼠胚胎成纤维细胞( m e f s ) ，包括野生型对照细胞及t s c l 、t s c 2 、p t e n 敲除的细胞( z 贮，壬、弼c 2 乒和尸珏) 均由本实验室保存。逆转录病毒包装细胞 p t 6 7 购自c l o n t e c h 公司。 2 菌株 ec d ，fd h 5 0 【感受态细胞购自北京天根生化科技公司，用于质粒的转化与扩增。 3 质粒载体 逆转录病毒载体p l x i n - h y g 由p l x i n - n e o 改造而来；p l x i n - h y g - a k t l ( e 1 7 k ) 质粒由本实验室构建。 4 化学试剂耗材 所有化学试剂均购自相关公司： s i 舯a - a l d r i c h 公司：胰蛋白酶、潮霉素、雷帕霉素、衣霉素、4 苯基丁酸( 4 p b a ) 、 类胰岛素生长因子l ( i g f l ) 、上皮生长因子( e g f ) 、血小板源生长因子( p d g f ) 及 3 ( 4 ，5 二甲基噻唑一2 ) 2 ，5 二苯基四氮唑溴盐( m t t ) m e r c k 公司：巴佛洛霉素a 1 、m g 1 3 2 及3 甲基腺嘌呤( 3 m a ) p r o m e g a 公司：二硫苏糖醇( d t t ) 、十二烷基磺酸钠( s d s ) 、溴酚蓝及三羟甲 基氨基甲烷( t r i s ) n e u r o n b c 公司：d m e m 培养基 t h e 珊os c i e m i f i c 公司：胎牛血清 i n v i t r o g e n 公司：4 一1 2 b i s t r i sn u p a g e 蛋白电泳预制胶、“p o f e c t a m i n e2 0 0 0 转染试剂及用于w e s t e mb l o t 实验的蛋白分子量标准 p i e r c e 公司：用于w e s t e mb l o t 实验的化学发光底物 o x o i d 公司：酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂粉 t a k a r a 公司：d n ap 如高保真聚合酶、所有限制性内切酶、t 4d n a 连接酶 a m e r e s c o 公司：t w e e n 2 0 、二甲亚砜( d m s o ) a x y g e n 公司：去r n a 酶的枪头、枪头盒 m i l l i p o r e 公司：0 4 5 “mp v d f 膜 f u i i 公司：x 光片及显影定影浓缩液 北京鼎国生物科技有限公司：氨苄青霉素、去r n a 酶的e p 管 天津市化学试剂一厂：e d t a 北京协和医学院揍础学院顾f ：研究生学位论义 华北制药股份有限公司：青、链霉素混合液 威格拉斯生物技术公司：高纯度质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒 赛百盛生物公司：g o l d v i e w t m ( g v ) 核酸染料、琼脂糖 天根生物有限公司：d n a 分子量标准，包括l k bd n al a d d e r 及d l 2 0 0 0 上海生工生物工程有限公司：合成所有引物及测序 广州锐博生物公司：设计并合成所有s i i a 其他常规试剂均为进口分装或国产分析纯。 5 抗体 s 锄t ac m z b i o t e c h n o l o g yi n c 公司：t s c 2 ( s c 一8 9 3 ) 、p - a c t i n ( s c 4 7 7 7 8 ) 及 p h o s p h o p e r k ( t h r 9 8l ，s c 一3 2 5 7 7 ) u p s t a t eu s ai n c 公司：p d g f r p ( 撑0 6 4 9 8 ) 、p t e n ( 群0 7 137 2 ) 、e g f r ( 撑0 6 8 4 7 ) 及i r sl ( 群0 6 - 2 4 8 ) c e ns i g i l a l i n gt e c h l l o l o g y 公司：p h o s p h o a m p k 旺( t l l r l 7 2 ，撑2 5 3 5 ) 、a k t ( 群9 2 7 2 ) 、p h o s p h o r a k t ( s e r 4 7 3 ，撑9 2 7 1 ) 、 i g f l r n ( 群3 0 2 2 ) 、e i f 2 0 【( 撑9 7 2 2 ) 、 p h o s p h o - e i f 2 0 【( s e r 5l ，撑9 7 21 ) 及c l e a v e dc a s p a s e 一3 ( 群9 6 61 ) a b c 锄公司：l c 3 ( a t 4 8 3 9 4 ) 北京中杉公司：h r p 标记山羊抗兔i g g ( z b 一2 3 0 1 ) 及h r p 标记山羊抗小鼠i g g ( z b - 2 3 0 5 ) p s 6 ( s e r 2 3 5 2 3 6 ) 和s 6 抗体由多肽c a k r r ri ，p s p s l r a 及c n g y d t s a q e d m t n h 2 注射兔子得到免疫血清后纯化获得。 6 仪器设备 北京六一仪器厂：水平电泳仪 北京宾达英创公司：多用脱色摇床 江苏太仓d h z d 公司：恒温振荡培养箱 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司：干式恒温器、真空泵 梅特勒一托利多仪器有限公司：酶标仪 青岛海尔公司：4 、2 0 冰箱 苏净集团安泰公司：超净工作台 b i o r a d 公司：紫外凝胶检测和成像系统、温度梯度p c r 仪 c o m i n g 公司：所有细胞培养相关塑料耗材，包括离心管、细胞培养瓶、细胞 培养板、细胞培养皿 e p p e n d o r f 公司：冷冻离心机、手动移液器 f o n t l as c i e n t i f i c 公司：一8 0 超低温冰柜 1 4 北京协和医学院堆础学院硕i ：研究生学位论文 i n v i t m g e n 公司：适用于预制胶的电泳槽、转膜仪等全套用于w e s t e mb l o t 实验 的设备 o l y m p u s 公司：倒置相差显微镜、荧光显微镜 t h e 肌of o 咖a 公司：c 0 2 恒温细胞培养箱 t h e m l os c i e n t i f i c 公司：常温台式离心机 二、实验方法 1 缓冲液配制 ( 1 ) 化学药物储存液 氨苄青霉素溶解于d d h 2 0 中，配制成1 0 0 m 咖l 浓度( 1 0 0 0 ) ，储备于2 0 。 衣霉素溶解于l o o d m s o 中，配制成2 m 咖l 浓度( 1 0 0 0 ) ，储备于2 0 。 d t t 溶解于d d h 2 0 中，配制成2 0 0 m m 浓度( 1 0 0 0 ) ，尽量现用现配。 m g l 3 2 溶解于l o o d m s o 中，配制成5 m m 浓度( 1 0 0 0 ) ，储备于2 0 。 巴佛洛霉素a 1 溶解于1 0 0 d m s o 中，配制成1 0 0 肛m 浓度( 1 0 0 0 x ) ，储备于2 0 。 m t t 溶解于p b s 磷酸缓冲液中，配制成5 m m l 浓度( 1 ) ，用0 2 2 肛m 滤膜过 滤以除去溶液旱的细菌，储备于4 避光保存。 3 m a 直接溶于培养基中，浓度1 0 m m ，尽量现用现配。 雷帕霉素溶解于1 0 0 甲醇中，制备成1 0 肛m 浓度( 1 0 0 0 ) ，储备于一2 0 。 4 p b a 溶解于1 0 0 d m s o 中，配制成5 0 0 m m 浓度( 1 0 0 ) ，储备于2 0 。 i g f l 溶解于1 0 0 d m s o 中，配制成2 0 “m 浓度( 1 0 0 0 ) ，储备于2 0 。 e g f 溶解于l o o d m s o 中，配制成1 0 0 m g m l 浓度( 1 0 0 0 x ) ，储备于一2 0 。 p d g f 溶解于1 0 0 d m s o 中，配制成5 0 m m l 浓度( 10 0 0 ) ，储备于2 0 。 ( 2 ) 大肠杆菌培养基 l o o o m l 液体l b 培养基( 1 ) ： 胰蛋白胨 l o 0 9 酵母提取物 5 o g n a c l 1 0 0 9 d d h 2 0 9 5 0 m l n a o h 调p h 值至7 0 ，加水至1 0 0 0 m l ，高压灭菌，凉至5 0 左右后加入氨苄 青霉素至终浓度为10 0 p g m l 备用。 若配制固体l b 培养基，则按照上述方法，在定容到1 0 0 0 m l ，灭菌前再加入1 5 9 琼脂粉，同样高压灭菌，加入抗生素，混匀后用来铺平板，铺好后于4 储存。 1 5 北京协和医学院堆础学院硕i ：研究生学位论文 ( 3 ) w e s t e mb l o t 所用缓冲液 a 5 0 m l 细胞裂解液( 1 ) ： 2 s d s5 m l d t t ( 1 m ) 5 m l t r i s ( 1 m ) ，p h6 8 3 m l 1 0 0 甘油 5 m l d d h 2 0 加至5 0 m l b 1 0 0 0 m lm e s s d s 蛋白质电泳缓冲液( 2 0 ) ： m e s 1 9 5 2 9 t r i sb a s e 1 2 1 2 9 2 0 s d s 1 0 0 m l d d