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近红外技术和超细粉碎在甲壳素加工中的应用研究 摘要 甲壳素是一种丰富易得的可再生的天然高分子聚合物，被称为是2 1 世 纪大有开发前景的生物材料。但是由于甲壳素不溶于常规溶剂，实际应用 时最常采用的是其脱乙酰产物壳聚糖。本文就甲壳素及壳聚糖的脱乙 酰度的测定以及甲壳素脱乙酰制备壳聚糖方面的问题作了如下研究工作： 1 研究了以n 一乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖盐酸盐两种物质同时作为 标样，用紫外法测定壳聚糖脱乙酰度的方法。纯壳聚糖溶液的紫外吸收是 由壳聚糖中n 一乙酰氨基葡萄糖残基和氨基葡萄糖残基共同产生的，吸光度 与溶液中残基总摩尔浓度相除的值与壳聚糖的脱乙酰度成线性关系。用乙 酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖盐酸盐为标准在o 1 m 0 1 l 的盐酸溶液中得到回 归方程a c t = 一3 3 6 5 1 d d + 3 3 8 6 9 ，r 2 = 0 9 9 5 8 。这是一个准确、简单、方便、 可行的方法。 2 建立近红外测定甲壳素壳聚糖脱乙酰度的方法。制备1 6 个脱乙酰 度不同的甲壳素和壳聚糖样品，用1 3 cc p m a sn m r 法来标定这些甲壳素和 壳聚糖样品的脱乙酰度值。在n i r 建模过程中，在这些样品中加入不同含 量的水份、氢氧化钠、乙酸钠、蛋白质，以得到能消除它们对脱乙酰度测 定的影响的近红外定标方程。用m p l s r 技术得到了最佳定标方程，其交叉 验证标准偏差( s e c v ) 为o 7 9 5 5 ，交叉验证决定系数( 1 - v r ) 为0 9 9 8 9 ； 定标标准偏差s e c 为o 3 5 7 3 ，定标决定系数( r ；) 为o 9 9 9 8 。用验证样品 集对以上得到的最佳定标方程进行验证，以此来检验定标方程的准确性和 可靠性。验证结果为工作标准误差( s e p ) 为o 8 6 6 9 ，检验决定系数( r ：) 为0 9 9 8 6 ，线性斜率为1 0 0 0 9 。结果表明该方法快速、准确、可靠，r s d o 2 ( n = 9 ) ，可以用于壳聚糖生产过程中脱乙酰度的现场监测。 3 用h m b 一7 0 1 s 超微粉碎机对甲壳素进行超细粉碎。由于采用的是以 碾压为主的粉碎方法，碾磨轮的转速慢，配合以风选分级，整个粉碎过程 即使连续工作也不会发生高温现象，红外光谱分析表明，制得的超细甲壳 素的化学结构未发生明显变化。用激光粒度分布测量仪测得超细甲壳素的 粒度为d ( v ，5 0 ) 为2 5 9 9pm 。用扫描电镜对其形貌进行观察，发现超细粉 碎后的甲壳素颗粒均匀，呈不规则的片状，表面扭曲变形，边沿不整。经 测定分子量下降少，结晶度由6 2 7 6 下降到2 0 0 4 ，脱乙酰反应的活性大 大提高。 4 对超细甲壳素在浓氢氧化钠溶液中脱乙酰反应的动力学进行了研 究，对反应结果数据用d p s 处理得到能表明甲壳素脱乙酰的影响因子强弱 的回砂j 方程d d ( ) = 一1 4 2 5 0 8 + 3 4 0 0 n a o h ( ) + 1 2 0 9 t ( ) + o 7 4 5 t ( m i n ) 一1 6 9 4 l o - 2 n a 0 h 2 2 6 1 6 1 0 - 3 t 2 1 5 4 9 1 0 - 2 n a o h t + 1 0 6 1 1 0 喝t t 。实验表明超细甲壳素在浓碱溶液中的脱乙酰反应比较符合一 级化学反应规律，这是由于其结晶度低，颗粒小所致。还分别得出氢氧化 钠浓度分别为4 0 、5 0 和6 0 时超细甲壳素脱乙酰反应的活化能分别是 2 7 7 3k j m o l ，2 2 7 3k j m 0 1 ，1 7 2 9k j m 0 1 ，结果表明，超细甲壳素的 脱乙酰反应活化能低，脱乙酰反应较容易进行，其在更高浓度的氢氧化钠 i i 溶液中比低浓度的要更有甚者容易进行。 5 甲壳素经过超细粉碎后，其脱乙酰反应的活性提高了。将超细甲壳素 与过量的浓碱混合、浸渍后，马上过滤，将甲壳素滤饼进行加热脱乙酰反 应，可以制得脱乙酰度接近9 0 的壳聚糖产品，投料比约为甲壳素( g ) ：浓 n a o h 溶液( m 1 ) = 1 ：2 ，大大节约碱用量，降低了成本，减少污水排放。所得 产品能全部溶于稀盐酸中。但采用固体碱直接与甲壳素混合法来制备壳聚 糖效果不是太好，所制得壳聚糖脱乙酰度也不高，约在7 0 左右，所得产品 用稀盐酸溶解时还有很少量的不溶物。 6 由于超细甲壳素的结晶度低，颗粒小，碱溶液很容易就会渗透到颗 粒的内部，使甲壳素分子链上各单元都能接触到碱液，降低脱乙酰反应速 度可使脱乙酰随机地发生在甲壳素分子链上，制得半脱乙酰度的水溶性壳 聚糖，x 一射线研究表明其结晶度近乎零。 7 由于超细甲壳素的脱乙酰反应活性大大提高了，制备高脱乙酰度壳 聚糖不需要苛刻的条件，因而在制备壳聚糖时分子链的降解也不太多。在 4 0 n a o h 中1 0 0 下反应1 5 0 分钟即可制得脱乙酰度为9 2 6 、粘均分子量 为1 6 8 1 0 5 的壳聚糖产品。实验结果表明用超细甲壳素为原料，在浓氢氧 化钠溶液中脱乙酰制备粘均分子量在百万以上的高脱乙酰度壳聚糖，是一 个简单、实用、有效的方法。 关键词：近红外脱乙酰度甲壳素超细粉碎动力学壳聚糖 i i i s t u d yo nt h ea p p l i c a t i o no fn e a ri n f r a r e d s p e c t r o s c o p ya n du i r r a f i n eg r i n d i n gi nt h e p r o c es s i n go fc h i t i n a b s t r a c t c h i t i ni so n eo ft h em o s ta b u n d a l l t ，e a s i l yo b t a i n e da n dr e n e w a b l en a t u r a l p o l y m e r s ，a n dh a sb e e nr e g a r d e da sa b i o m a t e r i a l i nw a i t i n g i nt h e2 1s tc e n t u 巧 b u tt h i sp o l y m e ri sn o ts o l u b l ei nu s u a ls o l v e n t sa n df o ri t su s e ，d e a c e 够l a t i o ni s c o m m o n l yp e 墒n l l e d a n ds ot h er e s e a r c hw o r ko nt h ed e t e m i n a t i o no ft h e d e g r e eo fd e a c e t y l a t i o no fc h i t i n c h i t o s a na n dt h ep r e p a r a t i o no fc h i t o s a n 行o m c h i t i nb yd e a c e 够l a t i o nh a v eb e e nc a 玎i e do u t 1 。d e t e 姗i n a t i o no ft h et h ed e g r e eo f d e a c e 够l a t i o n ( d d ) o fc h i t o s a nb y u v s p e c t r o p h o t o m e 哪u s i n gd u a ls t a n d a r d si si n v e s t i g a t e d t h eu va b s o r b a n c e o fap u r ec h i t o s a ns o l u t i o ni sc o n t r i b u t e db yt h en - a c e t y l g l u c o s 锄i n ea n d g l u c o s 锄i n er e s i d u e s ，t h ea b s o r b a n c ed i v i d e db yt h et o t a lm o l a rc o n c e n t r a t i o n o ft h er e s i d u e si s l i n e a r l yr e l a t e dt od d u s i n gn a c e t y lg l u c o s 锄i n ea n d g l u c 0 8 锄i n eh y d r o c h l o r i d ea ss t a n d a r d si no 1m o l lh y d r o c h l o r i ca c i ds o l u t u i o n ， t h e e q u a t i o n o b t a i n e d b y l i n e a r f e g r e s s i o n i s a c t = 一3 3 6 51 d d + 3 3 8 6 9 ， i 乎= o 9 9 58 t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h i si sas i m p l e ，r e l i a b l ea n dp r e c i s em e t h o d l o rd e t e r m i n i n gt h ed do fc h i t o s a n 2 d e t e r m i n a t i o no fd do fc h i t i n c h i t o s a nb yn e a ri n 疳a r e ds p e c t r o s c o p y i v w a ss t u d i e d s i x t e e nc h i t i na n dc h i t o s a ns 锄p l e sa r ep r e p a r e d ，a n dt h e i rd d v a l u e sa r e a n a l y z e db y1 3 cc p m a sn m r ac a l i b r a t i o ns a m p l es e tw 嬲 p r e p a r e db ya d d i n gv a r i o u s 锄o u n t so fw a t e r ，p r o t e i n ，s o d i u mh y d r o x i d ea n d s o d i u ma c e t a t e t t h e 口l s rm o d e lw i t hs e c o n dd e r i v a t i v es p e c t r ai nt h er a n g e o f1 1o o 2 0 0 0n my i e l d st h eb e s tr e s u l t s ，、v h i c ha 爬e c v = o 7 9 5 5 ，( 1 一之) = o 9 9 8 9 ：s e c = o 3 5 7 3 ，r 孑：o 9 9 9 8 。，s e p ：o 8 6 6 9 ， 尺；= o 9 9 8 6 ， s l o p e 2 1 0 0 0 9 。i tp r o v i d e sg r e a ta p p l i c a t i o np o t e n t i a l st ot h er e a l t i m ea n d o n - l i n ei n s p e c t i o nf o rt h eq u a l i 够m o n i t o r i n go fd e a c e t ) ，l a t i o np r o c e s sf o rt h e p r o d u c t i o no fc h i t o s a n 3 u l t r a f i n ec h i t i nw a sp r e p a r e d u s i n ga 玎、压b - 7 01su l t r a f i n eg r i n d e r a s s o c i a t e daw i n n o w e ra n dc h a r a c t e r i z e db yi r ，s e m ，x r d ，p a r t i c l ea n a l y s i s s i z e r t h ed i 锄e t e ro ft h ep a n i c l e si s d ( v ，5 0 ) = 2 5 9 9 p m ，t h ec 巧s t a l l i n i t y d e c r e a s e dt o2 0 0 4 行o m6 2 7 6 ，b u tt h em o l e c u l a rw e i g h td e c r e s e daf e wa n d t h er e a c t i o na c t i v i t yi n c r e a s e dal o t 4 t h ed e a c e t y l a t i o nk i n e t i c so fu l t r a f i n e c h i t i ni nn a 0 hs o l u t i o n 、s s t u d i e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ed e a c e t y l a t i o no fu l t r a f i n ec h i t i nf o l l o w e dt h e f i r s t o r d e rk i n e t i c sa ta ut i m eb e c a u s eo ft h el o wc 巧s t a l l i n i 够a n dt h es m a l l p a r t i c l es i z e t h ea c t i v a t i o ne n e r g yo fd e a c e t y l a t i o ni n4 0 、5 0 a n d6 0 s o l u t i o ni s2 7 7 3k j m o l ，2 2 7 3k j m o l ，l7 2 9k j m o l ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h e d e a c e t y l a t i o n r e a c t i o no fc h i t i na t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n p r o c e e d e de a s i e r ae q u a t i o nw a sg i v e n 行o mt h et o t a le ) 【p e r i m e n t a ld a t ab y r e g r e s s i o n ：d d ( ) = - 1 4 2 5 0 8 + 3 4 0 0 n a o h ( ) + 1 2 0 9 t ( ) + o1 7 4 5 x t ( m i n ) 1 6 9 4 1 0 2 n a o h 2 2 6 1 6 1 0 。3 t 2 1 5 4 9 l o 2 n a o h t + 1 0 6 1 1 0 。3 t t 5 a c h i t o s a nw a sp r e p a r e db yi m m e r s i n gm e t h o d 仔o mu l t r a n n ec h i t i n p u t v u l t r a f i n ec h i t i ni ne x c e s s i v ec o n c e n t r a t e dn a o hs o l u t i o n ，a n dt h a nf i n e r i m m e d i a t e l y ，m e a n w h i l et h ec h i t i n n a o hs o l u t i o nr a t i o ( w v ) o ft h ef i l t e rc a k ei s a b o u t1 ：2 ，h e a tt h ef i l t e rc a k ef o rac e r r t a i nh o u r s ，ac h i t o s a np r o d u c tw i t hd d a l m o s 乏r e a c ht o9 0 w a so b t a i n e d 6 w r a t e r - s o l u b l ec h i t o s a nw 瓠p r e p a r e d 行o mu l t r a f i n ec h i t i nb ys l o w d o w nm ed e a c e t y l a t i o nr a t e ，t h ex - r a yd i 行 a c t i o ns h o w e dt h a tt h ec 巧s t a l l i n i t y o ft h eh a l f a c e 够l a t e dc h i t o s a no b t a i n e d 仔o mu l t r s f i n ec h i t i n i sa l m o s tz e r o 7 t h eu l t r a f i n ec h i t i ni se a s i e rt ob ed e a c e t y l 甜e dt h a nb e f o r e ，a n dh i g hd d c h i t o s a nc a nb ep r e p a r e du n d e rm i l dc o n d i t i o n d e a c e t y l a t i o no fu l t r a f i n ec h i t i n i n4 0 n a o ha t1 0 0 f o r1 5 0 m i n ，ac h i t o s a nw i t hd d 9 2 6 ，【v 1 6 8 1 0 5 、a s o b t a i n e d t h ee x p e r 矗n e n tr e s u l ti n d i c a t e dt h a tp r e p a r a t i o no fc h i t o s a nw i t hh i 曲 m o l e c u l a rw e i g h ta n dh i g hd df r o mu l t r a n n ec h i t i ni sa s i m p l ea n de c o n o m i c a l a l t e r n a t i v e k e yw o r d s ：n e a 卜i n f r a r e d ；d e g r e eo fd e a c e t y l a t i o n ；c h i t i n ；u l t r a f l n e g r i n d i n g ；k i n e t i c s ；c h i t o s a n v i 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体，均已在论文中明确说明并致谢。 做轹历协眇 伊y 八i u 胪衫年j 月7 9 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 囫即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：三f 矗札导师签名： 加州v 圆叼年，乍月诌日 广西大学博士掌位论文近红外技术和超细粉碎在甲壳素加工中的应用研究 1 1 甲壳素 第一章前言 甲壳素是一种在自然界大量存在的可再生的生物质天然聚合物，存在量仅次于纤 维素。1 8 1 1 年法国自然史学家h b r a c o n n o t 教授从蘑菇中发现了它，1 8 2 3 年法国科 学家a 0 d i e r 从甲壳类昆虫的翅鞘中分离出同样的物质，认为它是一种新型纤维素， 便命名为c h i t i n 。 1 8 4 3 年，法国的a p a y e n 发现c h i t i n 与纤维素的性质不同。同 年，法国人j l l a s s a i g n e 发现c h i t i n 中含有氮，从而证明c h i t i n 不是纤维素。1 8 5 9 年，法国人c r o u g e t 将c h i t i n 放在浓k o h 溶液中煮沸，洗净后可溶于有机酸中。 1 8 7 8 年，g l e d d e r h o s e 用盐酸水解c h i t i n 得到氨基葡萄糖和醋酸。1 8 9 4 年e g i l s o n 进一步证明了其中含有氨基葡萄糖，后来的研究表明，甲壳素是由n 一乙酰氨基一伊葡 萄糖单体f ，沪g l c n a c ) 通过夕一1 ，4 糖苷键连接而成的直链高分子化合物f l j ( 见图卜1 ) 。 蘸。眵一 o 图卜1 甲壳素的化学结构 f i g 1 1 c h e m i c a ls t n i c t i i r eo f c h i t i i l 甲壳素在自然界中主要存在于节肢动物( 主要是甲壳纲如虾、蟹等，含甲壳素 2 0 3 0 ，高的达5 8 8 5 ) 、软体动物、环节动物、原生动物、腔肠动物、海藻及 真菌等中，另外在动物的关节、蹄、足的坚硬部分，动物肌肉与骨结合处，以及低等植 物中均发现有甲壳素的存在。它是地球提供给人类除植物纤维素外的第二大生物资源， 自然界唯一大量存在的碱性多糖，是一种可再生的生物资源。每年生物合成量约为 l o o 亿吨【2 1 。由于其无毒、可生物降解、良好的生物相容性和成膜性等优良特性，近年 来已在化工、环保、医药、食品、化妆品、农业等方面得到了广泛应用5 1 ，被称为 是2 1 世纪大有开发价值和开发前景的生物材料f 1 6 】。 广西大掌博士掌位论文近红外技术和超细粉碎在甲壳素加工中的应用研究 甲壳素在自然界中虽然广泛存在，但工业生产一般是以虾、蟹加工中的废弃的虾、 蟹壳为原料。制备方法有化学法【1 7 1 8 1 和生物法【1 9 2 0 1 ，化学法包括两个主要步骤即脱蛋 白和脱钙，一般用强酸和强碱来进行处理( 见图卜2 ) 。这两个步骤的顺序可以互换， 如果要回收蛋白质就先进行脱蛋白处理。 l 竺竺习恭烈垂嵯凳匝卜匝旧 l 一2 4 h ，3 0 l j2 4 h ，3 0 l - 一l 一l 一 图卜2 化学法制备甲壳素 f 嘻l - 2 p r o d u c t i o ns c h e m eo f c h i 咖u s 吨c h e m i c a lm e t h o d 甲壳素是白色或灰白色无定型、半透明固体，相对分子质量因原料不同而有数十 万至数百万。由于甲壳素分子内、分子间存在很多强的氢键的作用( 见图1 3 ) ，形成 了紧密有序的大分子结构，溶解性能很差，不溶于水、稀酸、稀碱、浓碱和一般有机 溶剂，虽然可溶于浓的盐酸、硫酸、磷酸和无水甲酸，但同时主链发生降解，大大限 制了它在很多方面的应用，实际应用时多采用其脱乙酰产物壳聚糖( c h i t o s a n ) 。 图卜3 甲壳素分子内的氢键 f 培l - 3h y d r o g c nb o n d si l lc h i t i nm o l e c u l e 在甲壳素的晶体中因为糖链的排列方向的变化而存在三种不同的结晶体，它们 是：甲壳素、b 甲壳素和y 甲壳素。通过x 射线衍射研究表吲2 1 ，2 2 1 ，a 甲壳素 是由交替反向的分子链组成( 见图1 4 ) ，分子间产生的氢键作用较强，是三种甲壳素 中最稳定的形态，自然界中含量最多的和易得的就是q 甲壳素。在b 甲壳素中，糖 分子链是平行排列的 2 1 2 3 ，2 4 1 ，这样使得分子间的作用力较弱，其稳定性也比q 甲壳素 2 o o 近红外技术和超细粉碎在甲壳素加工中的应用研究 差，脱乙酰反应较为容易。在溶解或溶胀的情况下b 甲壳素即可转化为q 甲壳素【2 5 1 ， 在盐酸溶液中甚至是固态的b 甲壳素也可以转化为甲壳素【2 6 1 。y 甲壳素则被认为 是q 和b 甲壳素的杂合形，在自然界中较少存在。 ： 图卜4a 一甲壳素( 左) 和b 一甲壳素( 右) 的分子排列 f 蛾1 - 4a m n g c m e n to f c h i t mm o l e c u l e si l l 洳c h i t i i l ( 1 e 妨彻dp c h i t i n ( r i 曲t ) 由于甲壳素的溶解性能很差，其分子量的测定存在一定困难。通常是在 d m a c l i c l 溶液中用粘度法、光散射法和凝胶渗透色谱法进行测型2 7 2 8 】，二水氯化 钙的甲醇饱和溶液也曾用于测定【2 9 1 。用粘度法测定甲壳素分子量时用m a r i 【_ h o u w i n k 方程进行计算。 7 7 ：k m 口 在不同条件下的甲壳素溶液的m a r k h o u w i n k 方程参数也不同： 表卜1 甲壳素的m a r k h 叫w i n k 方程参数 t a b l el - lm a r k h o u w i n kp a r a m e t e r so fc h i t i n 近红外技术和超细粉碎在甲壳素加工中的应用研究 1 2 壳聚糖 壳聚糖是甲壳素的脱乙酰产物，其化学结构如下( 图卜5 ) ： 蘸。移一 图卜5 壳聚糖的化学结构 f i g 1 5c h e m i c a ls 仃u c n 鹏o fc h i t o s 锄 壳聚糖为白色无定形、半透明、略有珍珠光泽的固体，因原料不同和制备方法的 不同，分子量也从数十万至数百万不等。不溶于水和碱溶液，可溶于稀的盐酸、硝酸 等无机酸和大多数有机酸，但不溶于稀的硫酸和磷酸。 壳聚糖有很好的吸附性、成膜性、通透性、成纤性、吸湿性和保湿性。 壳聚糖的分子量是壳聚糖的重要性能指标之一，测定方法常用的有凝胶渗透色谱 ( g p c ) 法和粘度法。 g p c 法就是用高效凝胶渗透色谱柱，以已知分子量的葡聚糖为标准样品，经过普 适校正后得到标准工作曲线，在相同条件下就可以测定壳聚糖样品的重均分子量瓦， 再根据样品的色谱图计算出样品的数均分子量砑。= 蔷瓷历。g p c 不仅可以测定 其分子量，还可以测定其分子量的分布情况【3 3 1 。 粘度法是快速而简单的测定高分子化合物分子量的方法，此方法的理论根据是著 名的m a r k h o u w i n k 方程，所测得的分子量称为粘均分子量。 对于一定的高分子、溶剂和温度体系，k 和q 值是常数。但不同条件下测得的各 参数值是不同的。壳聚糖在不同的溶剂体系中所测得的m a r k h o u w i n k 方程参数见表 广西大学博士掌位论文近红外技术和超细粉碎在甲壳素加工中的应用研究 表卜2 在不同溶剂中壳聚糖的m a r k h o u w i n k 方程参数 7 r a b l el 2m a r k h o u w i n kp a r 锄e t e r so fc h i t o s a n 访v a r i o u ss o l v e n t s 由于壳聚糖的脱乙酰度会有不同，其对k 和q 值会有影响，需用光散射法对其 进行订定，结果如下： ( 1 ) ：在o 1 m 0 1 l 1 c h 。c 0 0 n a + o 2m o l l - j c h 。c o o h 溶剂中和3 0 条件下不同脱 乙酰度的壳聚糖溶液的m a r k h o u w i n k 方程参数值例见表1 3 。 表1 3 在0 1 m o l l 。1 c h 3 c o o n a o 2m 0 1 l 1 c h 3 c o o h 溶剂中 不同脱乙酰度的壳聚糖的m a r k h o u w i i l k 方程参数 t a b l e1 3m a 融h o u w i n kp a r a m e t e r s 矗) rc h i t o s a nw i t hd i 虢r e n ta v e r a g ed d i no 1 m o l l 。1 c h 3 c o o n “0 2m o l l l c h 3 c o o h 5 近红外技术和超细粉碎在甲壳素加工中的应用研究 ( 2 ) 在0 3m 0 1 l 。1a e o h 0 2m o l l 。1a c o n a 溶剂中不同脱乙酰度的壳聚糖溶 液的m a r k h 叫w i n k 方程参数值刚见表1 4 。 表1 4 在o 3m o i l 1a c o h o 2m 0 1 l 1a c o n a 溶剂中 不同脱乙酰度的壳聚糖的m a r k h o u w i n k 方程参数 t a b l e1 - 4m a r l ( _ h o u w i n kp a r a m e t e r sf o rc h i t o s a nw i t hd i 行e r e n ta v e r a g ed d i n0 3m o l l 1a c o h 0 2m o l l 。la c o n a 1 3 甲壳素脱乙酰制备壳聚糖 1 3 1 甲壳素脱乙酰制备壳聚糖 甲壳素通过脱乙酰来制备壳聚糖是甲壳素研究的核心，因而甲壳素脱乙酰反应的 研究引起了国内外学者的重视。人们提出了许多制备的方法，归纳起来主要有有生物 法和化学法。 生物法就是用甲壳素脱乙酰酶( e c 3 5 1 4 l ， c h i t i nd e a c e t y l a s e s ，c d a ) 对甲 壳素进行脱乙酰处理，反应过程如下【4 0 1 ( 图卜6 ) ： c h i t i n + h n c h i t o s a n 图卜6 甲壳素脱乙酰酶催化反应 f i g 1 6 t h ec a t a l ) ，t i cr e a c t i o no fc h i t i i ld e a c e t y l 雒e s + c h 3 c o o h 壬 广西大学博士掌位论文近红外技术和超细粉碎在甲壳素加工中的应用研究 c d a 广泛存在于自然界，尤其是一些真菌和昆虫中，几种从真菌中分离提纯得到 的c d a 的一些生物化学特性己被研究【4 1 舶】。这些酶都是糖蛋白，而且都表现出较高的 热稳定性和严格的专一性。由于c d a 只作用于水溶性的以b 一( 1 4 ) 一键相连的n 一乙酰 一d 一氨基葡糖聚合物【4 7 5 0 1 ，而甲壳素又是不溶于水的，这样就造成了脱乙酰酶对甲壳 素的反应活性太低，使得甲壳素的酶法脱乙酰的速度太慢，脱乙酰产物的脱乙酰度也 不高，目前还没有应用价值。 化学法就是用热的浓氢氧化钠对甲壳素进行脱乙酰来制备壳聚糖。一般来说，就 是将甲壳素在4 0 6 0 的氢氧化钠溶液中加热到1 0 0 1 4 0 下进行脱乙酰处理几小 时，得到了可溶于稀酸的壳聚糖 5 3 1 。骆广生等研究表明n a o h 浓度低于3 0 时， 无论温度多高，反应时间多长，脱乙酰度都小于5 0 ：张一烽等【5 5 】也用对比实验证 明，无论是增大n a 0 h 浓度，提高反应温度还是延长反应时间，都不能一次脱乙酰制 得脱乙酰度大于9 0 的壳聚糖。为了提高产品的脱乙酰度，或加快脱乙酰反应速度， 或减少碱的用量等，有人在碱液法的基础上进行了各种改进。早在1 9 7 9 年，美国的 p e n i s t o n 【5 6 1 就将微波处理应用于壳聚糖的制备中，最近有关应用微波技术来制备壳聚 糖的文献也不少5 7 彤】，采用微波的特点就是反应时间短，产品的粘度高。周家华【6 4 1 、 李战军【6 5 1 等则采用超声波场来强化甲壳素的脱乙酰反应，其研究表明在超声波中甲壳 素的脱乙酰反应不用加热，可提高反应速度，得到的产物脱乙酰度和粘度较高。夏士 朋【6 6 】在乙醇碱水溶液中加入十六烷基三甲基溴化铵作为相转移催化剂，在反应温度 1 0 0 ，n a o h 浓度3 5 条件下制得了脱乙酰度为7 3 5 的的壳聚糖。宋庆平等【67 j 贝0 在弱极性丁醇介质中，直接加入固体n a o h ，并加入相转移催化剂，在n a 0 h 浓度仅为 1 5 左右的低碱度条件下，就可制得脱乙酰度大于9 0 的壳聚糖。分步脱乙酰法【6 8 】 则是将甲壳素在浓碱中反应一段时间后取出用水进行清洗，再继续用碱进行脱乙酰反 应，如此反复多次即可得到高脱乙酰度的壳聚糖。 另外还有碱熔法【6 9 】，就是将3 0 克甲壳素与固体氢氧化钾在氮气保护下共熔，1 8 0 加热搅拌3 0 分钟熔融物，然后小心地倒入乙醇中，生成的胶状沉淀用水洗至中性， 这样就得到了粗的壳聚糖。将这些粗壳聚糖溶于5 甲酸中，再用稀氢氧化钠溶液使 之沉淀析出，过滤，洗涤至中性。如此重复三次，最后得到的沉淀物洗净后被溶于 5 0 左右的0 1 m o l lh c l 中，接着再慢慢加入浓盐酸，直至出现沉淀，这是壳聚糖 近红外技术和超细粉碎在甲壳素加工中的应用研究 的盐酸盐。经透析几天，离心分离，用乙醇洗涤，再用乙醚洗涤。由于碱熔法反应条 件强烈，得到的产物主链降解严重，大概只有约2 0 个糖单元，分子量较低，使得壳 聚糖的使用范围受到了限制。 f u j i t a 法【7 0 】是一个日本的专利，其特点是烧碱用量比其它方法要少得多，但一 直没有推广应用。其法是将1 0 份甲壳素与1 0 份5 0 的n a 0 h 混合拌匀，再与1 0 0 份 液体石蜡混合，于1 2 0 加热搅拌2 小时，然后将反应混合物倾入8 0 份水中冷却， 过滤，用水充分洗涤后干燥，得8 份壳聚糖，其游离氨基含量达9 2 。 1 3 2 完全水溶性壳聚糖的制备 壳聚糖一般只能溶于一些稀的酸性水溶液中，不能直接溶于中性的水中，这在很 大程度上限制了壳聚糖的应用。 s a n n a n 等【7 l 7 2 1 将碱性甲壳素在1 0 的氢氧化钠溶液中于室温条件下放置7 0 小时 得到一种脱乙酰度约为5 0 的壳聚糖产品，该产品可以溶于中性的水中。脱乙酰度过 高或过低都不能溶于中性水中而只会溶胀，在4 5 一5 5 范围内才是可溶的。后经x 一 射线衍射研究表明，这是由于反应是在均相中进行的，所得产品的n 一乙酰氨基在糖 链上形成随机分布，破坏了原有分子链的二级结构，使结晶度大大降低，几乎成无定 形结构，增强壳聚糖分子链的亲水性。因此，用高脱乙酰度的壳聚糖在均相条件下进 行乙酰化反应也可制得完全水溶性壳聚糖。即以高脱乙酰化的壳聚糖为主要原料，在 乙酸水溶液一乙醇一吡啶介质中，用乙酸酐在壳聚糖的n 位进行均相乙酰化反应，控 制产品的脱乙酰度为5 0 左右，可制得在p h = 1 1 4 范围内具有良好水溶性的壳聚 糖【7 3 - 7 8 1 。 水溶性壳聚糖的制备路线见图卜7 。 个秽o 。 n h 2 h 歹厶一歹c d e a c e t y l a t i o 巴 h 鑫一，4 p 、厶卜 n h ：o c h h o - n a c e t y l a t i o n l - m ：w a t e r _ s o i u b l e 图卜7 水溶性壳聚糖的合成路线 f i g 1 7s y n t h e t i cr o u t e st ow a t e r - s o i u b i ec h i t o s 锄 近红外技术和超细粉碎在甲壳素加工中的应用研究 另外，用强制渗透法在4 5 的氢氧化钠溶液中对甲壳素进行脱乙酰处理制得半乙 酰化的壳聚糖，在水中呈粘稠透明状，经果胶酶适当水解后可完全溶于水【7 9 】。 1 3 3 甲壳素碱脱乙酰反应动力学及反应机理 尽管人们己在脱乙酰化方面做了很多的实验研究，但对于非均相甲壳素脱乙酰的 机理，人们的研究相对较少。最早可见于s a n a n 【7 2 】等人对甲壳素脱乙酰的动力学初步 研究，提出了在均相介质中的脱乙酰基速率常数公式： ，2 3 0 3 ， 口 露= i o g f以一x ( 1 2 ) 其中：a 是乙酰氨基的起始浓度， x 是水解t 时间后形成的氨基浓度 s a n a n 假定脱乙酰反应是准一级反应，并计算出2 5 时的k 值为9 2 1 0 弓h 一， 3 0 的k 值为1 8 1 0 - 2 h 一，4 0 的k 值为5 5 1 0 2 h 。但在实际生产中，甲壳素 脱乙酰化是在非均相中进行的，为此蔡中丽【8 0 】等人研究了2 5 氢氧化钠醇水反应介 质中醇含量变化对甲壳素脱乙酰反应的影响，以及该反应在1 ：l ( v v ) 醇水条件 下的动力学行为，分别于4 0 、5 5 和7 0 恒温反应一定时间后测定脱乙酰度。将 4 0 、5 5 和7 0 反应温度下产物的 一1 n ( 卜d d ) 分别对反应时间t 作图，得 到斜率分别为1 7 1 0 之、3 5 1 0 之和5 8 1 0 ，相关系数分别为o 9 6 、0 9 8 和o 9 9 的三条直线，这说明脱乙酰反应为一级反应，求得动力学方程为： i n ( 1 一d d ) = 幻 ( 1 3 ) l n 后= 一3 6 1 0 3 _ 尺f + 9 9 l ( 1 4 ) 式中dd 为产物脱乙酰度，k 单位：h ，t 单位：h 。根据以上方程可估算在同样反 应介质下，某反应温度，获得一定脱乙酰度壳聚糖所需的时间。 谢利平【8 1 j ，陈炳埝f 8 2 】，g a l e d 【8 3 1 ，m e t h a c a n o n 【5 3 】等人也对不同来源的甲壳素进行 了研究，得出了相应的公式。以上对脱乙酰反应动力学的研究都能得到与动力学一级 反应相吻合的规律。但文献报道的实验结果均证明甲壳素脱乙酰化反应只在反应初期 符合一级反应动力学规律，而反应进行到一定程度后则严重偏离此规律。黄兴龙f 8 4 】 研究了在8 0 ，4 0 n a 0 h 条件下，刘长霞【8 5 】研究了1 1 0 ，4 0 n a 0 h 条件下甲壳素 9 广西大掌博士掌位论文近红外技术和超细粉碎在甲壳素加工中的应用研究 脱乙酰度随时间的变化，都证明了反应进行到一定程度会出现严重的拖尾现象。通过 分析可知，此规律对于制备高脱乙酰度的壳聚糖是不适用的，因此人们提出新的脱乙 酰化动力学模型。 n o v i k o u 【8 6 1 把甲壳素脱乙酰反应分为两个反应阶段： x t h 土x t 3x t h x t 3 x t h 卫mx t h 二 m k m o x t 3 其中x t h 表示甲壳素，x t 3 表示壳聚糖，m 代表中间体，由此得出了求解脱乙酰 度的方程： 4 = ( 4 t m 一哦) 【l 一乏- 拿主 p 9 9 9 ， 并经过两次重结晶进行纯化。其余化学品均为分析纯。 2 1 2 2 壳聚糖的制备。 将3 0 9 甲壳素粉与3 0 0 m 1 4 0 的n a o h 溶液混合均匀后经低温碱化，之后分别于 近红外技术和超细粉碎在甲壳素加工中的应用研究 8 0 下反应1 h ，2 h ，4 h 和6 h ，经洗涤后将产品溶于0 1m 0 1 l 。h c l 溶液中，去除 不溶物，在溶液中加入l m 0 1 l jn a o h 将壳聚糖析出，收集沉淀并用去离子水充分 洗涤至中性，冷冻干燥，制得4 个脱乙酰度不同的壳聚糖样品。 2 1 2 3 紫外光谱 标样和壳聚糖样品的紫外光谱用岛津u v2 5 0 1 p c 型紫外光谱仪( 日本s h i m a d z u 公司) 进行扫描测定，测定时将标样和壳聚糖样品溶于0 1m 0 1 l 1 的h c l 溶液中。 2 1 2 4 元素分析 壳聚糖样品的元素分析用p e 2 4 0 0 i i 型元素分析仪( p e r k i n e l m e r 仪器公司) 测定， 壳聚糖样品的脱乙酰度用以下公式计算： 肋= 去( 8 一祟凳) 1 0 0 ( 2 - 2 ) 2 、 1 2 7 “。厶7 2 1 2 5 测定原理 壳聚糖通常是以甲壳素为原料在浓碱中高温加热进行脱乙酰来制备的，该法制得 的壳聚糖含有的杂质量很低，几乎可以把它看成是纯物质。那么壳聚糖溶液的紫外吸 收就可以认为是由氨基葡萄糖残基和乙酰氨基葡萄糖残基共同贡献的。根据双物质的 紫外吸收原理，紫外吸收具