（应用化学专业论文）化学法和酶法制备L—鸟氨酸工艺条件的探讨.pdf

硕：f ：论文化学法和酶法制斋l 一鸟氨陵工艺条件的探讨 摘要 研究了化学法和酶法制备l 一鸟氨酸的工艺条件，寻找提取l 一精氨酸酶的简便 方法。对所制备的目标产物通过红外光谱( i r ) 、旋光测定进行结构表征，并借助氨 基酸分析仪进行纯度分析。通过设计正交实验，讨论反应时间、温度等因素对反应的 影响，确定各步反应中较佳的实验条件。化学法制备l 一鸟氨酸的较佳工艺条件为： 反应时间5 小时，反应p h 值9 5 ，l 一精氨酸盐酸盐与八水氢氧化钡的物质量比为1 ： 1 2 5 ，产率为7 7 5 。酶法制备l 一鸟氨酸的较佳工艺条件为：反应时间2 0 小时，反 应的温度为3 6 ，反应p h 值9 5 ，l 一精氨酸盐酸盐的物质量与l 一精氨酸酶活力单 位比为l m m o l ：4 4 单位，硫酸锰的物质量与l 一精氨酸酶活力单位比为5 r e t o o l ：8 8 0 单位，产率为7 8 3 。提取l 一精氨酸酶的较佳工艺条件为：牛肝的质量与t r i s h c l 缓冲液的体积比1 9 ：2 m l ，为加热温度6 0 。c ，保温时间5 m i n ，所提取的l 一精氨酸 酶活力单位为2 2 0 单位m 一。最后，对酶法制备l 一鸟氨酸的放大生产进行初步探索， 为工厂生产l 一乌氨酸提供依据。 关键词：l 一鸟氨酸l 一精氨酸化学法酶法工艺条件 顾一| ：论文化学法和酶法制备l 一鸟氨酸工艺条件的探讨 a b s t r a c t i nt h i sp a p e r ，t h ep r o c e s sc o n d i t i o n so fp r e p a r a t i o no fl o m i t h i n eb yc h e m i c a la n d e n z y m a t i cm e t h o d sw e r e s t u d i e das i m p l ea n dc o n v e n i e n tm e t h o do fe x t r a c t i n gt h e l a r g i n a s ew a sf o u n dt h es t r u c t u r eo ft h eo b j e c tp r o d u c tw a sc h a r a c t e r i z e db yt h ei n f r a r e d s p e c t r u ma n dt h eo p t i c a lr o t a t i o n ，a n dt h ep u r i t yo ft h eo b j e c tp r o d u c tw a sa n a l y s e db yt h e a m i n oa c i da n a l y z e r b yd e s i g n i n gt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，t h ef a c t o r so ft h er e a c t i o n s s u c ha st h et i m e ，t h et e m p e r a t u r ea n ds oo nw e r ed i s c u s s e d ，a n dt h eb e s tc o n d i t i o no fe a c h r e a c t i o nw a sd e t e r m i n e d t h el o m i t h i n ew a sp r e p a r e da tp h95f o r5 hw h e nt h em o lr a t i o f o rl a r g i n i n et ob a ( o h ) 2w a s1 ：1 2 5b yc h e m i c a lm e t h o d t h ep e r c e n t a g ey i e l dw a s 7 75 t h el o r n i t h i n ew a sp r e p a r e da t3 6 c a n dp h9 5f o r2 0 hb ye n z y m a t i cm e t h o d w h e nt h em o lo fl a r g i n i n et ot h ea c t i v eu n i t so fa r g i n a s ew a sl m m o l ：4 4 u n i t sa n dt h em o l o fm n s 0 4o ft ot h ea c t i v eu n i t so fa r g i n a s ew a s5 u n o l ：8 8 0u n i t st h ep e r c e n t a g ey i e l d w a s7 83 ：t h eb e s th e a t i n gt e m p e r a t u r eo ft h ee x t r a c t i o no ft h el - a r g i n a s ew a s6 0 t h e b e s tt i m eo fh e a tp r e s e r v a t i o nw a s5 r a i nt h eq u a l i t yo f b o v i n el i v e rt ot h ev o l u m eo ft h e b u f f e rs o l u t i o no ft r i s h c lw a slg ：2 m l t h ea c t i v eu n i t so ft h el a r g i n a s ee x t r a c t e dw e r e 2 2 0u n i t s m l a tl a s t ，t h em a g n i f i c a t i o no fp r e p a r a t i o no ft h el o r n i t h i n eb ye n z y m a t i c m e t h o d sw a ss t u d i e ds i m p l y , w h i c hp r o v i d e dt h ef o u n d a t i o nf o rt h ef a c t o r yp r o d u c t i o n k e yw o r d s ：l - o m i t h i n el a r g i n i n e c h e m i c a lm e t h o d e n z y m a t i cm e t h o dp r o c e s sc o n d i t i o n i l 硕士论文化学法和酶法制各l 一鸟氨酸工艺条件的探讨 1 前言 氨基酸及其衍生物是组成蛋白质的基本单元，广泛用于食品、医药、添自n # j j 及化 妆品行业。迄今为止，自然界中已发现1 8 0 多种氨基酸，其中参与蛋白质组成的常见 氨基酸或称基本氨基酸只有2 0 几种。除脯氨酸外，这二十几种氨基酸在结构上的共 同点是羧酸分子中一碳原子上的一个氢被氨基取代而成，故称为d 一氨基酸。除甘氨 酸外，所有u 一氨基酸的d 一碳原子皆为不对称碳，故都有d 一及l 一两种异构体。 人体可利用的氨基酸均为l 一氨基酸【1 l 。 氨基酸可作为葡萄糖的基质、氮的载体、神经递质，并与蛋白质转变、酶活性和 离子通量调节有关。在2 0 种氨基酸中，有8 种人体内不能合成，需外源供给，称必需 氨基酸。精氨酸与组氨酸体内虽能合成，但量不足，若长期得不到供应，也会造成负氮 平衡。与脂质类和糖类相比，非必需氨基酸在体内的储存量也较低。因此，氨基酸的 损耗偏多或供应不足均极易引起临床症状，需及时补充。氨基酸及其衍生物与人体皮 肤结构相似，易被皮肷吸收，能使老化和硬化的表皮恢复水合性和弹性，延缓皮肤衰 老。因此氨基酸在日用化工上的应用已有取代常用化工原料的趋势，如氨基酸和高级 脂肪酸制成的表面活性剂、抗菌剂，已成为最高效的添加剂而被广泛作用；精氨酸、 甘氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸的碳酸盐、聚天门冬氨酸等制成的护发剂、染发剂、永久 型烫发剂，发展成为时兴商品供应市场。用氨基酸合成的氨基酸羧酸型两性表面活性 剂，具有毒性低、刺激小、柔软、抗静电、杀菌等性能，在洗涤用品、化妆品、纺织 印染等方面有较大用途。人类对氨基酸的需求极为广泛，在医药领域的应用也日益发 展f ”。 1 1 国外氨基酸工业发展的现状 氨基酸应用史的第一页，是1 9 0 8 年日本发现谷氨酸单钠盐可作为食品调味剂。 1 9 1 0 a 日本味之索公司采用酸水解大豆蛋白提取谷氨酸钠。2 0 世纪4 0 年代初，日本味 之素公司的创始人菊地重雄找到一种工业化生产谷氨酸的新途径。即利用小麦粉加工 淀粉后剩下的谷朊为原料，首先用盐酸将其水解得到谷氨酸，然后加入纯碱中和即可 得到食品级的谷氨酸钠。谷氨酸是世界上第一个工业化生产的氨基酸单一产品。此后， 科学家利用蛋白质水解法可将羽毛、人发、猪血等原料水解成为氨基酸，但这些氨基 酸多为“混合型氨基酸”( 由若干种氨基酸所组成) 其拆分十分困难1 3 j 。 化学合成法是2 0 世纪5 0 年代发展起来的方法，理论上所有的氨基酸皆可由化学合 成法制造，但在目前，只有当采用其他方法很不经济时才采用化学合成法，如甘氨酸、 d l 一蛋氨酸及d l 一丙氨酸等。其他如d l 一苯丙氨酸、l 一丝氨酸、l 一苏氨酸及d l 硕士论文化学法和酶法制各l 一乌氨酸工艺条件的探讨 色氨酸等氨基酸也有采用合成法生产的。目前，化学合成法生产的氨基酸品种占总量 1 3 1 2 0 e 4 1 。 酶法生产氨基酸始于2 0 世纪7 0 年代。日本1 9 7 3 年采用固定菌体成功进行了天冬氨 酸的生产，开创了应用酶法生产氨基酸的先例，为发酵工程的发展注入了活力。它是 利用生物酶催化的立体专一性反应，从底物生产光学活性的氨基酸。反应大多在水溶 液中进行，条件温和，选择性高，底物浓度高，转化率高，副产物少，生产工艺简单， 分离精制容易。随着基因工程技术的迅速发展，有关酶的产量和活性显著提高，加上 固定化技术和生物反应器研究成果的配合，使酶法生产氨基酸的技术取得了重大进 展。产量较大的有丙氨酸、门冬氨酸、色氨酸等。目前，酶法生产的氨基酸品种占总 量的1 0 1 5 1 。 i 9 5 6 年，高重三在日本协和发酵研究所首次分离出谷氨酸产生菌，以糖蜜等为原 料直接发酵生产谷氨酸。次年，发酵法生产谷氨酸在日本问世。当时由于成本问题， 该项技术没有用于工业化生产。近年来，随着遗传生物化学和生物工程技术的发展， 发酵法已成为目前生产氨基酸的主要方法。其生产的品种占总量的6 0 左右。在短短 的几十年中，氨基酸生产技术博采众多学科成就之长，出现一种氨基酸可以用若干种 方法生产，彼此竞争使生产技术不断提高与完善的兴旺局面，终于今天发展成为一门 各种氨基酸品种配套齐全、生产方法众多的新产业。进一步促进氨基酸应用向多元化 发展，使之广泛涉及医药、食品、饲料等与人类生活和健康有密切关系的几大行业 6 。 氨基酸及其衍生物逐渐成为药用中间体。2 0 世纪9 0 年代以前，氨基酸通常被作为 营养性输液原料( 占药用氨基酸的8 0 ) 。2 0 世纪9 0 年代后期起，氨基酸及其衍生物逐 渐成为合成活性药物的重要原料。据国外统计数字表明，1 9 9 8 年全球5 0 0 种畅销药物 中约有1 8 ( 9 0 种) 使用氨基酸及其衍生物作为基本中间体或关键体。1 9 9 8 年作为合成 药物中间体的氨基酸原料销售额首次超过营养性( 输液用) 氨基酸原料的确切销售额。 这是氨基酸工业发展史上的一个里程碑p 】。 全世界氨基酸的年需求量以每年1 0 的速度增长。1 9 9 9 年蛋氨酸生产能力达n 7 2 万t ，产量为4 8 9 万t ；赖氨酸生产能力达n 6 0 万t ，产量4 3 万t 。作为食品添加剂占 4 0 ，饲料添加剂占4 0 ，医药保健等占2 0 。2 0 0 3 年全球氨基酸消费量约为1 6 0 万t ， 其中应用在食品工业的氨基酸占总消费量的6 0 左右，主要用于增加食品营养、防止 食物变质、消除异味、提高食品风味，药用氨基酸份额相对较小，但增长趋势看好。 世界范围内，氨基酸的主要生产国有日本、美国、德国、法国、印尼、泰国、韩国及 我国等。日本在氨基酸的研究开发、生产技术、产品种类、产量方面居世界领先地位。 味之素公司控制全球氨基酸市场6 0 的份额，年产味精约5 8 万t ，占全球消费量( 1 7 0 万t ) 的3 4 ：饲料赖氨酸约为2 7 万t ，约占2 0 0 4 年世界总量7 7 万t 的3 5 ；苏氨酸为4 5 万t ，约占世界总量的7 0 ；色氨酸为1 2 0 0 t ，约占世界总量的8 0 。而德 訇d e g u s s a 公 硕士论文化学法和酶法制备l 一鸟氨睃丁艺条件的株讨 司目前已成为能同时生产蛋氨酸、赖氨酸、苏氨酸和色氨酸4 种饲料氨基酸的企业， 并会将其工作重点从中国转到东欧地区。味丹国际公司是亚洲区域以发酵技术生产氨 基酸产品、食品添加剂及淀粉工业产品的生产制造商；除生产味精外，还计划生产聚 谷氨酸( p g a ) 产品。2 0 0 4 年，韩国c j 公司积极扩张其海外市场的动物饲料和生物制药 业务陋i 。 1 2 国内氨基酸工业发展的现状 同国外的先进水平相比，我国氨基酸工业存在较大差距，主要表现在产品品种 少、生产规模小、生产水平低。5 0 年代，只生产味精( 谷氨酸) ，其它品种基本没有。 国内氨基酸工业是从6 0 年代开始逐步发展起来的，先后开展了蛋白质水解提取法、化 学合成法、发酵法和酶法生产氨基酸的研究。从1 9 5 8 年开始筛选谷氨酸生产菌，同时 进行了大量谷氨酸发酵基础研究，1 9 6 4 年首先在上海投入工业化生产。随后，在北京 又分离选育出棒杆菌a s l 2 9 9 和钝齿棒杆菌a s l 5 4 2 两株谷氨酸生产菌，各地先后采用 发酵法生产谷氨酸。接着，国内不少科研与生产单位又进行了其他氨基酸的研究，初 步建立了我国自己的氨基酸工业。7 0 年代开始以水解法制备胱氨酸为起点，同时开发 了精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、半胱氨酸等产品。我国的谷氨酸钠( 味精) 产量居世界首 位，赖氨酸产量也居世界前列。苏氨酸产量由于引进苏联的生产菌种，有了很大的提 高。国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司，湖北八峰氨基酸公司，但目前无论 生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。在8 0 年代中后期，我国从日本的味之素、协 和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品，1 9 9 1 年销售量为二千 万瓶，1 9 9 6 年达六千万瓶。主要厂家有无锡华瑞，北京费森尤斯，昆明康普莱特，但生产 原料都依赖进e l 【9 】。 1 9 9 9 年国内氨基酸产值3 0 亿元，2 0 0 0 年达4 0 一f l 元。目前，精氨酸、组氨酸、丝氨 酸、色氨酸等品种的生产依然是我国氨基酸产业的瓶颈。氨基酸原料药生产企业现已 发展到近百家，年生产能力2 0 多万吨，年产量约1 0 万吨( 不包括主要生产味精的谷氨 酸，我国谷氨酸年产量已达6 0 余万吨) 。其中赖氨酸产量最大，为6 万多吨，其次为蛋 氨酸、甘氨酸等。药用氨基酸产量达4 0 0 0 多吨，比l o 年前增长近6 倍，年均增长率近 2 0 。一些氨基酸的产量在世界位居前列，如胱氨酸及半胱氨酸系列产品由于该产 品是从头发等毛发中提取出来的，我国有丰富的资源优势，产量一直居世界领先。2 0 0 3 年氨基酸出口量达3 万余吨，比上年增长1 1 3 ，出口金额7 0 0 0 多万美元，几乎占领 了世界市场。我国市场医药、饲料、饮料等方面对氨基酸需求旺盛，需求量逐年大幅 上升，每年都从国外进口大量氨基酸以满足需要。近几年，进口金额一直位居我国医 药原料药进口额排名的前几位【l 。 我国药用氨基酸的最大应用领域为氨基酸输液。目前，氨基酸输液每年以1 5 一 1 硕：l 论文化学泣和酶法制各l 一乌氨酸工艺条件的探讨 2 0 的速度递增。我国于7 0 年代末、8 0 年代初首次试制成功支链氨基酸3 h 注射液和1 4 h 氨基酸注射液。但由于种种原因发展比较缓慢，至1 9 8 5 年全国氨基酸的产量只有1 0 0 万瓶，到1 9 8 6 年一1 9 9 0 年发展速度加快，以年均7 0 的速度增长，1 9 9 0 年全国总产量 达到1 5 0 0 万瓶，比1 9 8 5 年增长1 4 倍，品种也增加至1 3 个，达到了输液的基本自给。1 9 9 0 年一1 9 9 3 年氨基酸输液产率持续稳定增长，年均增长率为5 0 左右，1 9 9 3 年总产量达 n 5 0 0 0 万瓶左右，品种发展到1 5 个。2 0 0 3 年我国有1 5 亿瓶的氨基酸输液市场，年销 售额超过1 0 亿元lo 中国药典收载的氨基酸类品种，1 9 5 3 年版和1 9 6 0 年版均为零； 1 9 7 7 年版有4 种；1 9 8 5 年版减为3 1 0 ：1 9 9 0 年版增为5 1 0 ；1 9 9 5 年版增至1 2 1 0 ；1 9 9 8 年 又增补至2 6 种。现行的2 0 0 0 年版收载了1 9 9 5 年版增补后的全部，即原料药2 2 种，制剂4 种i i “。我国氨基酸类药近1 0 年虽发展迅速，但与发达国家比较，无论在品种、产量或开 发能力上，均有较大差距，不能满足市场需求。目前，我国进口的近2 0 0 种生化药中，氨 基酸类约占四分之一，其中制剂品种略多于原料药，制剂中近一半为输液，这也说明我 国氨基酸类药有着广阔发展前途口j 。表1 2 列出了部分氨基酸的国内外生产概况和发 展动态。 表l2 氨基酸的国内外概况和发展动态 硕：i ：论文 化学法和酶法制器l 一乌氨酸工艺条件的探讨 l 组氨酸发酵、提取 l 一异亮氩酸发酵 l 一亮氨酸提取 l 一赖氨酸 发酵、酶法 d l 一蛋氨酸合成 l 一苯丙氨酸 合成、发酵 l 一脯氨酸 发酵 l 一丝氨酸合成、发 酵、提取 酸胺化生产，得率6 0 由血粉水解提取 鹰潭生化厂、宜昌三峡 药厂等发酵法生产 由血粉水解制备，满足 国内需求，并出口 南宁和泉州两地生产， 产酸率6 7 天津化：| _ = 厂引进的法国 技术 津北生化药厂_ l - 4 甘氨酸 为原料与苯甲醛反应而 制得 上海天厨味精厂、张家 港味精厂采州发酵法生 产 四川南充药厂采用提取 法生产 有成本低，得率高等 优点 采用直接发酵法生 产，产酸率2 一3 日本也j 目发酵法生 产，产酸率3 一4 日本也采用提取法生 产 日本等国采用发酵法 生产，产酸率 1 0 法国、美国、日本等 国合成法生产： 艺已 经很成熟 日本等国采刖直接发 酵法和合成法生产 日本发酵法生产，产 酸率5 一6 日本采州前体发酵法 和合成法生产 剂及其它化学制 品的原料 主要用于医药：l 业 主要州于医药：j ： 业 主要用于医药：i ： 业 主要用于饲料和 食品： 业 主要用于饲料： 业 主要用于生产二 肽甜味剂 主要削于医药： 业 主要用于医药和 化妆品工业 l - - 苏氨酸发酵 天津市氨基酸公司采用 日本味之素、协和发目前，：t e 要n - t 引进前苏联基因j i 程菌 酵、田边制药采用发医药：r 业，但在 发酵生产，产酸率5 酵法生产，产酸率食品、饲料工业 6 6 8 中有极大潜力 l - - 色氨酸 发酵、合 武汉药厂州：【业副产物日本昭年电l ：采用前 目前，主要用于 成、酶法邻硝基乙苯制成吲哚， 体添加发酵法生产，医药：f 业，但在 再用合成法生产d l - - 味之素和田边制药用饲料工业中有极 色氨酸，经酶法拆分得l 合成法生产大潜力 一色氨酸 颁：匕论文化学法和酶法制备l 一鸟氨酸工艺条件的探讨 1 3 鸟氨酸 鸟氨酸是1 8 7 7 年杰费在喂养安息香酸的鸟尿之水解液中发现的，故命名为鸟氨 酸。它是细菌细胞膜和多肽类抗生素的组成成分，可以作为氨基酸输液原料。能促进 生长激素的分泌，以协助机体代谢过多的脂肪，与精氨酸配合使用具有很好的减肥效 果。在动物体内主要参与尿酸循环，对于体内氨态氮的排出有重要作用。鸟氨酸是维 持免疫系统和肝功正常不可缺少的，能解毒氨及帮助肝再生，除在医药上作为试剂与 注射液外，还通常与精氨酸一起用作保肝、强身、解毒剂之类药剂的原料。在皮肤和 结缔组织中含有高浓度的鸟氨酸对于愈合和修复损伤组织非常有益。鸟氨酸是由体内 的精氨酸合成的，反过来，它又是瓜氨酸、脯氨酸和谷氨酸的前体。鸟氨酸能将氨转 化为尿素与谷氨酰氨，因此补充鸟氨酸可为解毒途径提供酶的作用物i l ”。当身体制造 尿素，精氨酸便会被新陈代谢掉，身体转为制造鸟氨酸。用动物做的实验证明鸟氨酸 和精氨酸能令身体生产更多合成代谢的、促进生长的荷尔蒙，包括胰岛素和生长荷尔 蒙，来促进肌肉生长。此外，鸟氨酸还用于配制恢复疲劳的发泡饮料【】“。 1 3 1l 一鸟氨酸的性质 l 一鸟氨酸化学名称j , j a ，b - 二氨基戊酸，分子式为c 5 h 1 2 n 2 0 2 ，相对分子质量为 1 3 2 1 6 ，熔，点2 2 0 。c 一2 2 7 ，旋光度 a d ”= 2 8 4 。( c ( l 一乌氨酸) = 2 0m o l l ， 5 m o l l 1 h c l 为溶剂) ， o d 2 5 = 1 2 1 。( c ( l 一乌氨酸) = 2 0 m o ll ，水为溶剂) ， o d 2 5 = 2 6 3 ( c ( l 一鸟氨酸) = o 2 5m o l l ，6m o l l 。h c l 为溶剂) 。结构式为： c b 2 n h 2 ( c h 2 ) 2 c h n h ， c o o h l 一鸟氨酸难以结晶，通常是浆状物。易溶与水、乙醇，微溶于乙醚。通常作为 试剂使用的是其鸟氨酸单盐酸盐，l 一鸟氨酸单盐酸盐易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、 乙醚。 1 3 2l 一鸟氨酸盐酸盐的制备现状 现有制备l 一鸟氨酸盐酸盐的方法，以实现工业化生产的l 一精氨酸为起始原料，采 用微生物发酵法 1 6 - 1 7 】，酶法1 8 - 2 4 或化学合成法2 5 1 制得。1 9 5 7 年，k i n o s h i t a 等报道了利 用谷氨酸棒杆菌的瓜氨酸缺陷型( c i t ) 或精氨酸缺陷型( a r g 一) 突变株发酵生产鸟 颤：l ：论文 化学法和酶法制 rl 一鸟氢酸工艺条件的探讨 氨酸。此后，0 k u m u r a 和s h i b u y a 等人在这方面也做了大量的工作1 2 7 “j 。日本协和 氨基酸株式会专利公开采用发酵法生产氨基酸，以l 一精氨酸为起始原料，用微生物 发酵法使其逐步降解，经微生物消化得l 一鸟氨酸盐酸盐，所用的微生物制剂是洗涤 过的链球菌培养代谢产物的悬浮液29 1 。国内潘韵1 6 - 1 7 1 等人也研究了用微生物发酵法生 产l 一鸟氨酸，以谷氨酸棒杆菌为出发菌株定向选育鸟氨酸高产菌，进行发酵生产鸟氨 酸。1 9 9 5 年d o n a l de r i v a r d 等人用氢氧化钡水解l 一精氨酸盐酸盐的方法制备l 一鸟 氨酸盐酸盐。 1 4 研究本课题的意义及要解决的问题 鸟氨酸的生产以日本为主，生产厂家主要有味之素、田道制药和协和发酵三家。 目前，鸟氨酸仅在日本的市场规模就达到1 5 4 l 日元，且其需求量正在不断上升。但乌 氨酸的生产却极不容易，微生物发酵法合成是国外流行的方法，该类工艺开发周期长、 资金投入大。采用酶法和化学法生产l 一鸟氨酸，国内目前尚未有人做过这方面的研 究。因此，采用酶法和化学法生产l 一鸟氨酸的研究具有重大的理论意义和经济意义。 本实验的主要任务是采用化学法和酶法制备l 鸟氨酸，建立表征方法，以及寻 找提取l 一精氨酸酶的简便方法。开发出一种既能提高产品收率和质量，又能降低生 产成本，减少环境污染的工艺路线。另外通过设计正交实验，对其结果进行处理，讨 论反应时间、温度等因素对反应的影响，确定各步合成中较佳的实验条件，对所制备 的目标产物通过红外光谱( i r ) 、旋光测定进行结构表征，并通过氨基酸分析仪进行 纯度分析。最后，对酶法制备l 一鸟氨酸进行放大生产，为工厂生产l 一乌氨酸提供 依据。 坝士论文 化学法和酶法制备l 一乌氨酸工艺条件的探讨 2l 一鸟氨酸的制各路线 2 1 制备路线的设计 氨基酸的生产方法有4 种：发酵法：酶法；化学合成法和蛋白质水解提取法1 4 j 。 ( 1 ) 发酵法 发酵法是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对菌株的质诱变等处 理，选育出各种营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性变异株，以解除代谢调节中的反 馈抑制与阻遏，达到过量合成某种氨基酸的目的。发酵法包括直接发酵法和添加前体 发酵法。氨基酸产生菌是实现发酵法生产氨基酸的前提，在氨基酸发酵的建立和改进 中起着非常重要的作用。根据氨基酸产生菌的遗传性状，可将其分为四类：第一类为 直接使用野生型菌株由糖和铵盐发酵生产氨基酸，如谷氨酸；第二类为营养缺陷型变 异株；第三类为氨基酸结构类似物抗性变异株；第四类为营养缺陷型( 或渗漏型) 兼结 构类似物抗件变异株。目前，工业生产中除谷氨酸发酵外，大多采用第四类氨基酸产 生菌。应用发酵法生产氨基酸产量最大的是谷氨酸，其次是赖氨酸，其余可用陔法生 产的品种有苏氨酸、异亮氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、乌氨酸、瓜氨酸等。色氨 酸、亮氨酸、丙氨酸等虽然也可用发酵法生产，但因产酸水平较低实用价值不大。 ( 2 ) 酶法 酶法与发酵法紧密相连，是发酵工业发展的产物，但发酵法与酶法之间又有区别。 发酵法是利用微生物的生命活动过程，将简单的碳源、氮源，通过复杂的代谢活动生 成天然产品，品种上有其局限性。而酶法是利用微生物中特定的酶作为催化剂，使底 物经过酶催化生成所需的产品，因底物选择的多样性，故而不限于制备天然产品，借 助酶的生物催化，可使许多本来难以用发酵法或合成法制备的光学活性氨基酸有工业 生产的可能。目前，能用酶法生产的氨基酸已有1 0 多种，如用延胡索酸和铵盐为原料， 经天冬氨酸酶催化生产l 一天冬氨酸；用l 一天冬氨酸为原料，在天冬氨酸一d 一脱羧 酶作用下生产l 一丙氨酸；以吲哚和l 一丝氨酸为原料，在色氨酸合成酶催化下合成l 一色氨酸：在精氨酸脱亚胺酶催化下，使l 一精氨酸转变为l 一瓜氨酸：以甘氨酸及 甲醇为原料，在丝氨酸转羟甲基酶催化下台成l 一丝氨酸；以甘氨酸和乙醛为原料， 在苏氨酸醛缩酶催化下生成l 一苏氨酸。 ( 3 ) 化学合成法 化学合成法是利用有机合成和化学工程相结合的技术生产或制备氨基酸的方法， 是制造氨基酸的重要途径之一。但氨基酸种类较多，结构各异，故不同氨基酸的合成 方法也不相同。不过通常可归纳为一般合成法及不对称合成法两大类。前者产物皆为 d l - - 型氨基酸混合物，后者产物为l 一型氨基酸。一般合成法包括卤代酸水解法、氰 胺水解法、乙酰氨基丙二酸二乙酯法、异氰酸酯( 盐) 合成法及醛缩合法等；不对称合 r 颁：i ：论文 化学法和酶法制备l 一鸟氨酸工艺条件的探讨 成法包括直接合成、一酮酸反应及不对称催化加氢等方法。它的最大的优点是在氨 基酸品种上不受限制，除制备天然氨基酸外，还可用于制备各种特殊结构的非天然氨 基酸。 ( 4 ) 蛋白质水解提取法 以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合 物，经分离纯化获得各种氨基酸的方法称为水解法。随着氨基酸生产技术的进步。由 蛋白质水解法提取氨基酸这一古老的生产方法受到很大的冲击，传统的水解法生产谷 氨酸已失去其存在的价值。半胱氨酸的生产也面临酶法的激烈竞争但是在药用氨基 酸的生产中仍有其存在的价值。目前，我国至少有6 种氨基酸尚需要用提取法生产， 它们分别是组氨酸、精氨酸、亮氨酸、丝氨酸、胱氨酸及酪氨酸。 随着氨基酸生产技术的进步，由蛋白质水解法提取氨基酸的生产方法受到很大的 冲击，至今尚未发现直接提取l 一鸟氨酸的蛋白质原料。发酵法制备l 一鸟氨酸国内 已有人做出研究【1 “1 7 1 。酶法生产氨基酸具有工艺简单、周期短、耗能低、专一性强、 收率高等特点。如何获得廉价的合成底物和酶源是这一方法能否成立的关键。本实验 的酶法制备l 一鸟氨酸采用已经实现工业化生产的l 一精氨酸为合成底物，以牛肝为 酶源，从牛肝中提取l 一精氨酸酶【2 ”。化学法合成氨基酸的最大优点是氨基酸品种上 不受限制，且成本低。国内尚未有人做过这方面的研究，研究化学法合成l 一鸟氨酸 具有重大的理论意义和经济意义。因此，本实验采用化学法和酶法两种方法制备l 一 鸟氨酸。 2 2 化学法制备l 一鸟氨酸 采用弱碱( b a ( o n ) 2 ) 水解精氨酸得到鸟氨酸和少量的瓜氨酸，用硫酸中和水解 液生成钡盐得以沉淀，产物留在中和液中。把中和液过滤，盐酸酸化滤液，把滤液浓 缩到适当的浓度，加入无水乙醇，冷却浓缩液，得到l 一鸟氨酸盐酸盐粗品结晶。 化学法制备l 一鸟氨酸的有关反应方程式如下： 2 h n = c ( n h 2 ) n h ( c h 2 ) 3 c h ( n h 2 ) c 0 0 h h c i+ 2 b a ( o h ) 2 ( h n z c ( n h 2 ) n h ( c h 2 ) 3 c h ( n h 2 ) c o o ) 2 b a + b a c l 2 + 2 h 2 0 堡圭堡兰 些兰望塑堕鲨型鱼! 二里塑墼三苎堑丝竺堡堕 一 ( 2 ) ( 3 ) ( 4 ) ( h n ：c ( n h 2 ) n h ( c h 2 ) 3 c h ( n h 2 ) c 0 0 ) 2 b ab a ( o h + ) 2 0 | | b a ( o h ) ， ( h 2 n c n h ( c h 2 ) 3 c h ( n h 2 ) c o o ) 2 b a f r n h 2 ( c h z ) 3 c h ( n h 2 ) c o o ) 2 b a ( n h 2 ( c h 2 ) 3 c h ( n h 2 ) c o o ) 2 b a+ h 2 s 0 4 2 n h 2 ( c h 2 ) s c h ( n h 2 ) c o o h + b a s 0 4 n h 2 ( c h 2 ) 3 c h ( n h 2 ) c o o h + h c l 2 3 酶法制备l 一鸟氨酸 n h 2 ( c h 2 ) 3 c h 烈h 2 ) c o o h h c i 以l 一精氨酸酶为催化剂，催化分解l 一精氨酸为l 一鸟氨酸和尿素。反应方程 式如下： l - - 精氨酸+ h z o 生! 羔望马一鸟氨酸 +尿素 l 一精氨酸酶( l - a r g i n a s e ，a r g ) 的系统名称为l 一精氨酸：脒基水解酶( e c 3 5 3 1 ) ，能水解精氨酸生成鸟氨酸和尿素。精氨酸酶广泛存在于动物的肝脏和植物中， 酵母和细菌中也有。 l 一精氨酸酶能溶于水和稀缓冲液，干粉在4 c 下储存可以稳定半年。l 一精氨酸 酶的激活剂为：m n ”、f e ”、c o ”、n i ”；抑制剂为：a g + 、h g + + 、z n “、l 一鸟氨酸、 l 一赖氨酸、柠檬酸和硼酸盐口。 先将l 一精氨酸盐酸赫用去离子水溶解，再用3 0 的氢氧化钠调p h 值至9 5 ， 然后加入少量的硫酸锰溶液，补充纯水至规定的体积，之后再加入一定单位的l 一精 ln 顿： 论文化学法和酶法制备l 一鸟氨酸工艺条件的探讨 氨酸酶，在3 6 下反应2 0 小时。反应到时间后，用盐酸调节p h 值到7 0 ，然后浓 缩至原体积的三分之一，加入双倍体积的无水乙醇，放入冰箱冷冻5 到8 小时，得到 结晶产物。 硕： 一论文 化学法和酶法制符l 一乌氨酸工艺条件的探讨 3 实验部分 3 1 主要原料和仪器 3 1 1 实验原料 本方法所用水，为蒸馏水或同等纯度的水。 精氨酸盐酸盐医药级 精氨酸钠赫医药级 氢氧化钡 化学纯 氯化钡分析纯 硫酸分析纯 盐酸 分析纯 n 一萘酚分析纯 氯化锰分析纯 三羟甲基氨基甲烷生化试剂 磷酸二氢钠化学纯 磷酸氢二钠分析纯 硫酸锰化学纯 硫酸铵分析纯 氢氧化钾分析纯 二氯化汞分析纯 碘化钾分析纯 无水乙醇分析纯 丙酮分析纯 市售牛肝 3 1 2 实验仪器 循环水式真空泵 紫外分光光度计 红外吸收光谱仪 旋光仪 离心机 氨基酸分析仪 多功能食品粉碎机 所用其他原料如下： 上海康达生物化学品有限公司 上海康达生物化学品有限公司 上海市化工专科学校实验工厂 泗联化工厂 南京化学试剂一厂 上海实意化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 南京化学试剂一厂 汕头市西陇化工厂 上海化学试剂二厂 南京化学试剂一厂 南京化学试剂一厂 上海化学试剂二厂 汕头市西陇化工厂 国药集团化学试剂有限公司 上海实验试剂有限公司 s h z d ( i i i )巩义英山谷予华仪器厂 s p 2 1 0 0 u v上海光谱仪器有限公司 b r u c kt e n s o r 2 7德国b r u c k 公司 w z z 一2 b 上海精密科学仪器公司物理光学仪器厂 常州国华电器有限公司 f z 一1日本曰立公司 c d e l 一2 3 b上海京达电器制造公司 坝卜论文化学法和酶法制薪l 一乌氨酸工艺条件的探讨 数显恒温水浴锅 h h 一4 国华电器有限公司 3 2 制备步骤 3 2 1 化学法制备l 一鸟氨酸 a 操作步骤 ( 1 ) 水解：向带有磁力搅拌、球形冷凝管的2 5 0 m l 三口烧瓶中加入4 2 9 的l 一 精氨酸盐酸盐，加入6 3 9 的八水氢氧化钡，再加入5 0 m l 蒸馏水，用盐酸调节p h 值至9 ，加热回流5 小时。坂口试验检查不出l 一精氨酸的存在。 ( 2 ) 中和去除钡盐：用稀硫酸中和水解液，生成硫酸钡沉淀。离心去除硫酸钡。 取上清液，分别加入1 2 滴硫酸试液和氯化钡试液，无显著的白色沉淀生成。 ( 3 ) 盐酸酸化：用盐酸将p h 值调至4 o 一4 5 。 ( 4 ) 浓缩结晶：把滤液减压浓缩到1 0 m l ，冷至室温，加入两倍体积的无水乙醇， 冷却至5 。c ，维持1 2 h ，减压过滤，烘干得白色颗粒状固体2 1 4 9 。 b 实验记录 表321 化学法制备l 一b 氨酸的实验现象 顺：f j 论文化学法和酶法制备l 一鸟氨酸工艺条件的探讨 c 结构表征 a 红外谱图分析 i r ( k b r 压片，c m 1 ) v ：伯胺的特征吸收峰3 5 0 0 - - 3 3 0 0 处出现两个吸收带( n h 的不对称和对称伸缩振动) ，谱带强度较弱；1 6 5 0 一1 5 8 0 ( n h 键面内弯曲振动) ， 较宽的中等强度吸收峰。1 2 2 0 一1 0 2 0 ( c n 伸缩) 弱峰。 所得白色固体所做的红外谱图( 附图二) 与鸟氨酸标准样谱图( 附图一) ( s i g m a 公司) 见附图。 b 旋光测定川 溶液样品的配制：准确称取l 一鸟氨酸赫酸盐标准样品2 9 ，加6m o ll 。1 的盐酸 配入5 0 m l 容量瓶中，准确称取l 一精氨酸盐酸盐样品2 9 ，加6m o l l “的盐酸配入 5 0 m l 容量瓶中。准确称取合成的样品1 9 ，加6 m o ll “的盐酸定容至2 5 m l 容量瓶中。 旋光度的测定：将样品溶液装入旋光管测定旋光度，记下样品管的长度l d m 及 溶液的浓度，然后按公式计算其比旋光度。数据如表3 2 2 ： 1 0 0x 【n 】d = + z ( t 一2 0 ) i c 式中： t l 旋光性物质在温度为t ，光源的波长为 时的旋光度，一般 用钠光( 为5 8 9 3 a ) ，用a d t 表示； t 测定时的温度； c 【标尺盘转动角度的读数( 即旋光度) ： l 旋光管的长度，d m ； c 质量浓度( 1 0 0 m 溶液中所含的样品的克数) 。 硕士论文化学法和酶法制备l 一鸟氨暧工艺条件的探讨 z 温度校正系数，一0 0 3 表32 2 精氨酸鸟氨酸的比旋光皮 由表3 2 2 可以得出，所合成的样品的比旋光度值2 0 6 7 与l 一鸟氨酸盐酸盐文献 值的比旋光度值2 0 ，6 3 一致，说明所合成的样品是l 一鸟氨酸盐酸盐。 3 2 2 酶法制备l 一鸟氨酸 3 2 2 1l 一精氨酸酶的提取 a 缓冲液的配制 1 l 溶液中含有0 0 5 m o l 的氯化锰和0 1 t o o l 的t r i s - - h c l ，用盐酸调节p h 至7 0 左右。 b 具体操作步骤 取牛肝1 0 0 9 加冰冷的缓冲液1 5 0 m l ，放入粉碎机中搅成匀浆，放入冰箱静置6 h 。 以4 0 0 0 rm i n “离心1 0 m i n ，上清液小心倒出。将上清液置于6 0 水浴锅中保温5 m i n ， 边保温边搅拌，然后置于冷藏室4 。c 6 。c 冷却，再离心，取上清液，加两倍体积的4 的丙酮混匀。以4 0 0 0r m i n l 离心1 5 m i n ，取沉淀。加少量缓冲液溶解，慢慢搅拌 至全溶。再以4 0 0 0r m i n l 离心1 0 m i n ，取上清液，用离子交换柱层析进行纯化，将所 得清液测酶活力单位。 c 离子交换柱层析 3 2 】 有些高分子物质含有一些可以分离的基团，例如一s 0 3 h ，一c o o h 等，可以和溶液中 的离子产生交换反应，这类高分子物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交 换树脂，离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有机溶剂的固态高分子材料。由于一定 坝：| ：论文化学法和酶法制备l 一鸟氨陵工艺条件的探讨 的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗脱过程中，不同的离子在离子交换 柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。离子交换层析原理是利用蛋白质表面的带电 基团和离子交换树脂上带相反电荷的离子基团相互结合来纯化蛋白。离子交换柱分为 阳离子交换柱和阴离子交换柱，前者主要用来纯化偏碱性的蛋白质，后者则用来纯化 偏酸性的蛋白质。绝大部分蛋白都偏酸性，所以阴离子交换柱用得更加普遍一些。 l 一精氨酸酶中的杂蛋白影响酶活力测定的显色反应，进而影响酶活力测定的准 确性。对l 一精氨酸酶进行离子交换柱层析，可以除去杂蛋白。经过离子交换柱层析 后的酶清液可以直接进行酶活力测定。本实验采用的是7 3 1 型离子交换树脂，进行蛋 白纯化。将7 3 l 型离子交换树脂干法装柱，用t r i s h c i 缓冲液平衡柱子，将提取的 酶清液注入柱内，以t r i s h c l 缓冲液为洗脱液洗脱。 具体操作步骤：将7 3 1 型离子交换树脂先进行活化，在1 0 5 的烘箱中烘干，利 用干法将其装在内径l c m ，长度5 0 c m 的玻璃柱中，先用洗脱液把树脂中的空隙填满， 稳定2 4 小时，再将要提纯的酶分批倒入柱中，用洗脱液分批洗脱。收集洗脱液，用 于酶的活力测定。 取1 0 0 i _ t l 洗脱液至试管中，加入5 0 l 精氨酸底物( l 一精氨酸盐酸盐0 1 9 溶 于0 2 m o l lp h 7 0 磷酸盐缓冲液中，定容至1 0 0 m l ) 。将试管放入恒温水浴锅中， 3 7 下反应3 0 m i n 。取出，加入4 0 0 p l l t o o ll 。h 2 s 0 4 中止反应。再在试管中加入8 m l 水，i m l 纳氏试剂，生成红棕色沉淀。取没有做离子柱层析的酶清液，做同样的试验， 则生成红棕色沉淀和乳白色沉淀。具体提纯的效果，除去杂质的结构等需要进步研 究。 d l 一精氨酸酶活力单位的测定【3 3 】 a 酶活定义 在3 7 。c ，每分钟催化产生1 , l t m o l 的氨为一个活力单位。 利用纳氏试剂测定该酶催化精氨酸时释放出的氨来表示酶活力。 l - a r g i n i n e + h2 0 马l - c i t r u l l i n e + n h3 m 扎州h 一一胁n 一卜+ 7 1 + 3 h 2 0 c 纳氏试剂的配制 称取1 5 9 氢氧化钾，溶于5 0 m l 水中，冷至室温。称取5 9 碘化钾，溶于1 0 m l 水中，在搅拌下，将2 5 9 二氯化汞粉末分次少量加入于碘化钾溶液中，直到溶液呈 坝： 论文 化学法和酶法制备l 一乌氨陵_ t 艺条件的探讨 深黄色或出现微米红色沉淀溶解缓慢时，充分搅拌混和，并改为滴加二氯化汞饱和溶 液，当出现少量朱红色沉淀不再溶解时，停止滴加。在搅拌下，将冷的氢氧化钾溶液 缓慢地加入到上述二氯化汞和碘化钟的混合液中，并稀释至l o o m l 于暗处静置2 4 h ， 倾出上清液，贮于棕色瓶中，用橡皮塞塞紧。存放暗处，此试剂至少可稳定一个月。 d 标准曲线 配制浓度为1 的硫酸铵母液，取1 9 硫酸铵固体，加蒸馏水定容于l o o m l 容量 瓶中。分别取l m l ，2 m l ，3 m l ，4 m l ，5 m l 至5 0 m l 容量瓶，加蒸馏水定容配制成 0 0 2 、0 0 4 、0 0 6 、0 0 8 和0 1 0 的硫酸铵溶液。分别在六只试管中加入 l m l 上述浓度的硫酸铵溶液，8 m l 水，l m l 纳氏试剂，在6 4 0 n m 处测定其吸光度。 所得数据如下表： 表32 3 不同饺离子浓度对应的吸光度值 铵离子浓度m m 0 1 l 吸光度值 0 02 0 1 8 1 3 03 0 2 7 2 o 01 7 4 03 6 1 o 5 6 07 5 5 根据表3 2 3 的数据，可得6 4 0 n m 波长下的标准曲线如下图所示 堡：! = 堡兰 些兰鲨塑堕鲨型鱼土二皇望堕曼兰堑型塑