（药物化学专业论文）血必净防治脓毒症作用机制的研究.pdf

；譬e=吖v；弘”，。 目录 刿i j j j f y 17 7 5 6 5 4 摘要 - l a b c t r a c t2 前言 - 3 刖吞 。喵 第一章血必净化学成分数据库的建立5 1 2 第一节血必净及其作用机制研究进展5 第二节血必净各单味药简介7 第三节构建血必净化学成分数据库1 0 第二章脓毒症作用网络效应及靶点1 3 1 8 第一节脓毒症简介 1 3 第二节脓毒症作用网络效应图1 4 第三章针对脓毒症炎症靶点的虚拟筛选 1 9 3 3 第一节常见炎症靶点简介 1 9 第二节血必净化学成分与炎症靶点的虚拟筛选2 3 第四章针对脓毒症免疫类靶点的虚拟筛选3 4 4 3 第一节常见免疫类靶点简介 - 3 4 第二节血必净化学成分与免疫类靶点的虚拟筛选3 7 第五章针对脓毒症凝血类靶点的虚拟筛选4 4 5 0 第一节常见凝血类靶点简介 4 4 第二节血必净化学成分与凝血类靶点的虚拟筛选4 6 第六章结果分析与结论5 卜6 1 第一节作用靶点的功能性分类 5 1 第二节各单味药材与各类靶点间作用效应5 4 第三节血必净化合物分子与靶点间的作用效应 5 7 参考文献喝2 硕士在读期间论文发表情况6 5 综i 苤1 5 6 j 酵c 谢：7 l 论文独创性声明7 2 中国医学科学院北京协和医学院清华大学医学部硕i ：学位论文 摘要 血必净由红花、丹参、赤芍、川芎、当归五味中药组成，是应用清热解毒、活 血化瘀法治疗脓毒症有效的中药复方之一。血必净主要通过抗炎、抑菌、抗内毒素 对脓毒症疾病的多个层次、各个环节进行阻断，从而降低发生率和死亡率，体现了 中药多成分、多途径、多环节、多靶点和“菌( 细菌) 、毒( 内毒素) 、炎( 炎症 介质) ”并治的特色和优势。但是，作为中药复方，血必净含有数百种化学成分， 其真f 的药效物质基础，人们还知之甚少，其防治脓毒症的分子机制尚未明确。故 有必要对其药效物质基础和分子机制进行研究，并作出科学的诠释。 本论文绘制了脓毒症疾病网络效应图，选择了脓毒症疾病所涉及到的药物作用 靶点，按照靶点的功能参照中医理论对上述靶点分为了君、臣、佐三类；构建了血 必净化学成分分子数据库，综合运用计算机辅助药物设计( c a d d ) 技术中的同源 模建、分子对接等方法，考察化合物分子与脓毒症靶点间的作用效应。结果发现血 必净中存在相当数量的化合物分子与脓毒症靶点有潜在作用效应，有作用效应的靶 点数目为1 7 个。 本论文对血必净防治脓毒症作用机制的研究，不仅为中药治疗脓毒症和中药复 方多靶点效应提供了科学依据，也为寻找脓毒症疾病活性先导物提供了一定的参考 和借鉴。 关键词：血必净；脓毒症；计算机辅助药物设计；药效学物质基础 j 参 中国医学科学院北京协和医学院清o # 人学医学部硕：i ：学位论文 a b s t r a c t x u e b i j i n gi n j e c t i o ni sa t r a d i t i o n a lc h i n e s ep r 印a r a t i o nw i t ht h em a i ni n g r e d i e n t s e x t r a c t e d 仃o mf l o sc a r t h 锄i ，r a d i xp a e o n i a er u b r a ，r h i z o m ac h u a n x i o n 岛r a d i x s a l v i a em i l t i o 打h i z a e 锄dr a d i xa n g e l i c a es i n e n s i s i ti sap r e s c r i p t i o nf o rr 锄o v i n g b l o o ds t a s i s 孤dr c l i e v i n gt o x i cs u b s t a n c e ，m a i n l yu s e df o r t h et r e a t m e n to fs 印s i s n r e f l e c t sm e1 1 l l eo ft h ec h a r a c t 嘶s t i c sa n da d v a n t a g e so ft c mb ym u l t i c o m p o n e n t ， m u l t i c h 锄l e l ，m u l t i 1 i i l k ，m u l t i t a r g e ta n dm ec o l l l _ b i 醇a t i o nt r e a t m e n to f ”b a c t e r i a ( g 锄s ) ，t o x i n ( l p s ) ，i n f l 锄m a t i o n ( i n n 锄m a t o r ym e d i a t o r s ) c u r r e n t l y ，i th a s b e e n r e p o n e dt h a tx u e b i j i n g 埘e c t i o nc a ne f f e c t i v e l yp r e v e n ta n d 骶a ts 印s i sb o t hi n e x p 丽m e n t a la sw e l la sc l i n i c a ls e t t i n 黟w h i l et h ep r e c i s em e c h a n i s mr 锄a i n s t ob e e l u c i d a t e d2 u si tc o n t a i n sh u n d r e d so fc h e m i c a lc o m p o n e n t s ，t h em a t e r i a lb a s i so fi t sr e a l e f 五c a c ya l s ou n c e r t a i n t oa d d r e s st h i si s s u e ，t h ep 印e rd r e wam a po nm en e 柳o r ke f f e c t so fs 印s i s ，a i l d s e l e c t e das 嘶e so fd r u gt a r g e t si n v o l v e di ns 印s i s t l l et a 唱e t sa r ed i v i d e di n t ot l l r e e g r o u p sa sm o n a r c h ，m i n i s t e r ，a s s i s t a n ti nt c mt h e o 哕a c c o r d i n g t ot h e i rr o l e si ns e p s i s n e t w o r k u s i n gc o m p u t e ra i d e dd r u gd e s i g n ( c a d d ) c o n s i s t i n go fh o m o l o g ym o d e l i n g m o l e c u l a rd o c k i n ge t c ，v i r t u a ls c r e e n i n gi sc a 喇e do u tt os e a r c hf o rt h ex u e b i j i n g m 0 1 e c u l e st h a tp o t e n t i a l l ya f f e c tt h es 印s i st a r g e t s a na g g r e g a t ea 1 1 a l y s i si sm e n p e r f o m e dt oe v a l u a t et h ec h e m i c a lc o m p o s i t i o n so fx u e b i j i n gm o l e c u l e s a n dt h e r e a r eac e n a i nn 、l m b e ro fc o n l p o u n d sh a v et h ep o t e n t i a le 侬c to nl7s 印s i st a r g e t s 0 u rr e s e a r c h 百v e sam o l e c u l a rd e s c r i p t i o no ft h em u l t i t a r g e te f f e c ta n da p h a r m a c o d y n 锄i c s m a t e r i a lb a s i so fx u e ：b i j i n g se f i f e c t o nt h eo m e rh a n d ， a s m u l t i t a r g e tc o u l db ean e w t r 饥di nt h ef i e l do fd m g d e s i g n ，o u rr e s e a r c hp o i n t sm ew a y t od i s c o v en e we 1 1 t i t i e sf o rs 印s i sd m g d e s i 印 k e yw o r d s ： x u e b i j i n g ；s 印s i s ； c a d d ；p h a 姗a c o d y i l a m i c sm a t 甜a lb a s i s 2 中国医学科学院北京协和医学院清华人学医学部硕i ：学位论文 1 上l 日l i百 脓毒症( s e p s i s ) 是指由各种感染或非感染因素引起的全身炎症反应，是临 床各科危重病患者常见的并发症之一，进一步发展可导致严重脓毒症、脓毒性休克 ( s e p t i cs h o c k ) 、多器官功能障碍综合症( m o d s ) ，是危重病患者的主要死亡原 因之一。美疾病预防控制中心统计资料显示，美每年约有7 5 万人罹患脓毒症，其 中有超过2 2 5 万患者死亡；在欧洲每年估计有1 5 万人死于此疾病；我国尚缺乏 详细的临床流行病学资料，据推算每年可能有3 0 0 万例患者发生脓毒症；每年全球 有超过1 8 0 0 万严重脓毒症患者，且以每年1 5 速度递增，全球每天大约有1 4 0 0 人因此而死亡。脓毒症来势凶猛，病情进展迅速，患病率高、死亡率高、治疗费用 高。对人类健康构成严重威胁，给临床救治带来极大困难，造成经济发展的巨大负 担，是现代危重病医学面临的十分复杂而又艰巨的难题。 综上所述，加强脓毒症疾病防治的实验室及临床相关研究，具有十分重要的 理论价值和社会意义。现代医学、分子生物学等学科对于脓毒症发病机制诸方面的 研究较多，成果颇丰，但在临床治疗方面效果不大，故目前主要采用基础治疗和对 症治疗，临床效果不十分理想。现代医学在一定程度上可以较好地控制感染，但对 于感染后内毒素和炎症介质瀑布效应式的毒性作用至今却没有良策，故病死率较 高，是长期以来困扰医学界的世界性难题。 针对脓毒症现状，我国医药科研工作者在中医理论指导下，充分发挥祖国中医 药的特色和优势，结合中药复方多成分、多途径、多环节、多靶点的特点，丌展中 西医联合治疗脓毒症的研究，取得较好的成果。其中的“三证三法”整体辨证施治 效果明显，“三证 为：各种因素导致j 下邪交争、正气耗伤、邪毒阻滞、正虚邪 实。如出现热毒炽盛，即为毒热证；如出现败血阻滞，即为瘀血证；如出现脏腑虚 损、阴阳逆乱，即为急性虚证。针对“三证”创立了“三法”如下：即清热解毒法、 活血化瘀法、扶正固本法。“三证三法”对于早期脓毒症防治、预防m o d s 发生、 发展及预后诸方面都具有重要意义。故使用清热解毒法治疗解决“毒热”，活血化 瘀清除淤毒【】，可起到标本兼治的效果。 中药复方血必净是应用清热解毒、活血化瘀法治疗脓毒症中最常用且有效的中 药复方之一。血必净由红花、月参、赤芍、川芎、当归五味中药组成i z 】。现代药 理学研究证实，血必净主要通过抗灸，钔、抑菌、抗内毒象i o 】对脓毒症发病的多 个层次、各个环节进行阻断，从而降低脓毒症发生率和死亡率。血必净体现了中药 多成分、多途径、多坏节、多靶点和“菌( 细菌) 、毒( 内毒素) 、炎( 炎症介质) ” 并治的特色和优势，为防治脓毒症提供了有效手段和方法。但是，血必净作为中药 复方，含有数百种化学成分，其真j 下的药效物质基础，人们还知之甚少，其防治脓 中国医学科学院北京协和医学院清。仁人学医学部顾f ：学位论文 毒症的分子机制尚未明确。血必净作为治疗脓毒症的有效中药复方，我们有必要对 其药效物质基础和分子机制进行研究，并作出科学的诠释。 近年来，国际上药物研究呈现出新的发展趋势，随着生物学与计算机相关学科 的发展，计算化学和计算生物学已经介入到药物发现与开发的各个阶段，如药物先 导结构的优化和新靶标的发现，其中的虚拟筛选技术与以往的高通量筛选技术 ( h t s ) 相比具有独特的优越性。生命科学前沿技术、化学、计算机和信息科学等 学科与药物研究的交叉、渗透与结合同益加强，c a 叻、化学信息学、系统生物学和 生物信息学技术等学科的出现，为中药复方药效物质基础的研究提供了强大的工 具，为中药复方药效物质基础和分子机制的研究带来新的机遇，使综合应用上述研 究工具，实现中药复方药效物质基础的高效快速筛选成为可能。因此，充分利用现 代科学技术的一切成果，构建中药复方药效物质基础的筛选平台，对实现中药现代 化具有重要意义。 本论文在系统生物学和中医理论整体辨证施治理论指导下，系统全面考察脓毒 症疾病的发病机制，绘制了网络效应图；在此基础上选择了脓毒症所涉及一系列靶 点；最后综合运用运用计算机虚拟筛选技术研究中药复方血必净化合物分子与脓毒 症靶点间作用效应。通过研究血必净的药效物质基础，寻找血必净疗效发挥的真正 药效物质基础，为脓毒症的中药治疗提供相关理论支持。同时通过对本论文研究的 阐发，建立中药复方药效物质筛选与计算机辅助药物设计间联系，为后期计算机虚 拟筛选技术在中药研究领域中的应用提供一定的参考和借鉴。 中国医学科学院北京协和医学院清华大学医学部硕士学位论文 第一章血必净化学成分数据库的建立 第一节血必净复方及作用机制研究进展 对于脓毒症疾病的相关研究是现今危重病急救医学关注的焦点和前沿领域之 一。目前西医对于此病的治疗存在不足，因此积极探索中医药联合治疗有着广泛的 前景。黄帝内经中曾有论述：“今夫热病者。皆伤寒之类也”。温病学说在伤 寒论的基础上，补充完善了伤寒论的不足。目前对脓毒症的中医治疗多以伤 寒、温病为基础，以六经、卫气营血辨证为基本体系。本病的发生主要责之于两个 方面：一为正气不足，一为毒邪内犯。许多脓毒症患者还存在着不同程度脾胃虚弱 的表现。根据内经“有胃气者生，无胃气者死”的理论观点，效法东垣，在治 疗的过程中注意顾护患者的胃气，“注重后天之本”，往往可取得良好的疗效。 中医药治疗类似于脓毒症样各种热证中，常有清热解毒类，回阳救逆类以及开 闭固脱类方剂自1 9 8 5 年发现黄连对内毒素攻击大鼠有保护作用以来，已有实验证 明双花、蒲公英、连翘、地丁、败酱草、乌梅、大黄、蛇床子等中药在体外可以抑 制内毒素的鲎试剂反应；双花、连翘、黄芩、赤芍的精提物与内毒素接触后能导致 l p s 结构破坏；大青叶、青蒿素、月参素、肉桂、附子、云苓、阿胶、犀角、水牛 角等对内毒素均有拮抗作用。月参素、青蒿素体内外均可抑制l p s 刺激的白细胞分 泌t n f q 、i l l 、i l 一6 ，提高内毒素攻击小鼠存活率。目前证实具有拮抗内毒素作 用的单味中药多集中在清热解毒、益气、活血化瘀、温阳、滋阴等。 血必净注射液是在依据中医配伍理论指导下，依照“菌、毒、炎 并治原则， 体现了中药复方的多层次、多途径、多靶点效应。配合抗生素使用治疗上述疾病， 在一定程度上可有效提高临床治愈率，降低病死率。血必净注射液的主要成分为赤 芍、川芎、丹参、红花和当归等活血化瘀药。而活血化瘀类中药多具有改善微循环， 增加血流量，减少血小板的黏附和聚集，抑制纤维母细胞合成胶原，降低急性炎症 时毛细血管的通透性，减少炎性渗出，改善局部血液循环，促进炎症吸收，并使炎 症病灶局限化，抑制炎性肉芽肿形成，同时增强网状内皮细胞的吞噬功能和吸附能 力，使血肿和其他坏死组织易被吸收，从而促进病变的修复和治愈等功效。研究显 示，血必净注射液具有对抗内毒素及发病有关的多种炎性递质的作用，促进免疫功 能恢复，现将其药理作用要点概括如下： 对炎症改善的影响： 1 联合抗生素可降低内毒素含量。 2 抑制炎性介质h m g b 一1 释放。 对免疫恢复的影响： 3 促进t r e g 凋亡，改善免疫平衡。 。 比较有效的药 改善方面，而 统全面完整地 中国医学科学院北京协和医学院清华大学医学部硕士学位论文 第二节血必净各单味药简介 化学成分分子库建立之前，有必要对该方各单味中药材进行调研与分析，使分 子库的建立更具目的性与合理性。以下内容详细列举了其名称、药材描述、性味、 药理作用、功能主治以及有效成分等项目。 l 、红花 英文名称s a f f l o w e r 拉丁文名f l o sc a r t h a m i 药材描述菊科植物红花( c a r t h a m u st i n c t o r i u sl ) 的干燥花，为中华人民共 和国药典1 9 9 0 年版收载。 药材性味味辛，性温。 药理作用具有镇痛，抗心律失常，降压，兴奋心脏，扩张冠状血管，抗心肌缺血，扩张 外周血管，增强耐缺氧能力，改善微循环，降血脂，抗凝血、抗血栓，抑制平滑肌、解 痊，性激素样作用，兴奋子宫，免疫调节，抗炎，抗细菌，抗肠寄生虫，可能具有致畸、 致突变、致癌。 功能主治及归经活血止痛，活血通经，归心、肝经。 主要成分含红花黄色素及红花苷，另含脂肪油，又称红花油，是棕榈酸、硬脂酸、 花生酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等脂类。 2 、丹参 英文名称r o o to fd a n s h e n 拉丁文名r a d i xs a l v i a e 药材描述唇形科植物丹参( s a l v i am i l t i o r r h i z ab u n g e ) 的干燥根及根茎，为中 华人民共和国药典1 9 9 0 年版收载。 药材性味丹参性微寒、味苦。 药理作用镇静催眠，镇痛，降压，抗血小板聚集，扩张冠状血管，抗心肌缺血，扩张外 周血管，增强耐缺氧能力，改善微循环，抗脑缺血，降血脂，抗动脉粥样硬化，抗凝血、 抗血栓，抗胃损伤、抗溃疡，保肝，抗氧化，抗肺损伤，改善肾功能，性激素样作用，免 疫调节，抗炎，抗过敏、抗组胺，抗细菌，抗真菌，抗肿瘤，促进骨折愈合，促进烧伤、 创伤愈合。 功能描述具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功能。 功能主治与归经止痛，养心安神，活血祛瘀，凉血，消肿，调经，归心、肝经。 。 中国医学科学院北京协和医学院清华大学医学部颐l ：学位论文 主要成分根含菲醌类化合物，如丹参酮i 、丹参酮i ia 、丹参酮i ib 、隐丹参酮、 丹参酮甲酯、异丹参酮i 、异丹参酮i i 、异隐丹参酮、丹参新酮、此外，尚含鼠尾 草酚、二氢丹参酮i 、丹参新醌甲、丹参新醌乙和丹参新醌丙及儿茶醛等。 3 、赤芍 英文名称r a d i xp a e o n i a er u b r a 拉丁文名p a e o n i aa n o m a l al 药材描述毛莨科植物芍药( p a e o n i al a c t i f l o r ap a l l ) 、川赤芍( p a e o n i av e i t c hi i l y n c h ) 的干燥根，为中华人民共和国药典1 9 9 0 年版收载。 药材性味赤芍味苦，微寒。 药理作用镇静催眠，镇痛，扩张冠状血管，降压，增强耐缺氧能力，降血脂，抗动脉粥 样硬化，抗凝血、抗血栓，抗血小板聚集，促进消化液分泌，保肝，抗氧化，改善肺功能， 抗细菌，抗肿瘤，抗突变 功能描述具有清热凉血，散瘀之功能。 功能主治与归经活血祛瘀，清热凉血，归肝经。 主要成分含芍药苷，此外还含芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷；另含苯 甲酸，鞣质。据报道，芍药根含( z ) 一( 1 s ，5 r ) 一b 一蒎烯一1 0 基b 一巢菜苷 及芍药新苷等。 4 、川芎 英文名称r i z o m eo fc h u a n x i o n gl i g u s t i c u m 拉丁文名r h i z o m al i g u s t i c ic h u a n x i o n g 药材描述伞形科植物川芎( l i g u s t i c u mc h u a n x i o n gh o r t ) 的干燥根茎，为中 华人民共和国药典1 9 9 0 年版收载。 药材性味川芎味辛，性温。 药理作用镇痛，益智，降压，强心，扩张冠状血管，抗心肌缺血，扩张外周血管，钙桔 抗，改善微循环，抗脑缺血，抗凝血、抗血栓，对血液流变学的影响，抗血小板聚集，改 善肺功能，利尿，改善肾功能，免疫调节，抗辐射，抗肿瘤 功能描述具活血行气，祛风止痛功效。 功能主治与归经活血祛瘀，行气疏肝，祛风止痛，归肝、胆、心包经。 主要成分含挥发油、阿魏酸、4 一羟基一3 一丁基酞内酯、大黄酚、瑟丹酸、1 一( 5 一羟基一2 一呋喃基) 一9 氢一吡啶( 3 ，4 ，6 ) 吲哚、川芎嗪( 四甲基吡嗪) 及异 亮氨酰缬氨酸酐、内酰胺等。 5 、当归 中困医学科学院北京协和医学院清华大学医学部硕士学位论文 多文名称r o o to fc h i n e s ea n g e li c a 拉丁文名r a d i xa n g e li c a es i n e n s i s 药材描述伞形科植物当归 a n g e l i c as i n e n s i s ( 0 1 i v ) d i e l s 的干燥根，为中 华人民共和国药典1 9 9 0 年版收载。因产地不同商品名又有秦归( 陕西、甘肃) 、 西当归、岷当归( 甘肃) 、云当归( 云南) 之称。 药材性味当归味甘、辛，性温。 药理作用镇静催眠，镇痛，抗心律失常，解热、降温，降压，抗血小板聚集，增强造血 功能，扩张冠状血管，抗心肌缺血，扩张外周血管，增强耐缺氧能力，降血脂，抗动脉 粥样硬化，抗凝血、抗血栓，抑制平滑肌、解痉，止泻，利胆，保肝，抗氧化，平喘，利尿， 改善肾功能，免疫调节，抗炎，抗辐射，抗过敏、抗组胺，抗细菌，抗肿瘤。 功能描述有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效。 功能主治与归经止痛，活血，润肠通便，调经，补血，归心、肝、脾经。 主要成分含挥发油和非挥发性两类。挥发油中中性油占总油的8 8 。主要有q 一 蒎烯、月桂烯、b 一罗勒烯、藁本内酯、新当归内酯、维生素b 1 2 等，其中藁本内 酯为主要成分，加上根油及叶油中尚未定性的几个色谱峰，至少有4 4 个化学成分； 其次是酚性油，主要有香荆芥酚、苯酚、对甲苯酚；酸性油主要有邻苯二甲酸、癸 二酸等。非挥发性化学成分有新当归内酯、阿魏酸等1 8 种，另外，当归中还含有 多种氨基酸和多种微量元素。 j 中困医学科学院北京协和医学院清华大学医学部硕：t 学位论文 第三节构建血必净化学成分数据库 通过查询中国科学院有机化学所的化学专业数据库【，l 和d r d u k e s p h y t o c h e m i c a l a n de t h n o b o t a n i c a ld a t a b a s e s 【s l 数据库中红花、丹参、赤芍、川 芎、当归五味中药的所有化学成分信息，在此基础上通过检索维普、万方、中国知 网c n k i 、美国国立生物技术信息中心n c b i 、美国化学文摘c a 、c s a 等国内外数据 库检索上述中药材2 0 0 4 一至今报道的化学成分信息邮】，并附加每个化学成分的生物 活性数据( i c j 。) ，在此基础上建立血必净的化学成分数据库，几乎涵盖了目前已 报道的上述中药材所有化学成分信息。 血必净化学成分数据库构建的大致步骤如下： 1 页面设计 ( 1 ) 设定数据库的文件名进入w i n d o w s 后双击i s i s b a s e 图标，打开 i s i s b a s e ，在f i l e 菜单栏中单击“n e wd a t a b a s e ，设定数据库文件名：x b j d b 。 ( 2 ) 定义域名出现“c r e a td a t a b a s e ”画面后，根据内容需要，设立相应的 域名( f i e l dn a m e ) 。定义域名就是将各种需要管理的信息给与设定，以便管理。 所有需要收入数据库的信息，都需要定义一个域名，并根据信息特点，设置域名类 型。 2 框架设计 域名定义结束后，单击“s a v e ”键保存，转入下一个画面，设计表格。 ( 1 ) 策划表格在“0 p t i o n ”的下拉菜单栏选“s h o wr u l e r ”，单击左侧的 “b o x 图标，参照标尺画表格。按住鼠标左键向右下方拉动，即可产生一个方框 ( b o x ) 。另外，在“o b j e c t 下拉菜单栏中选“p a r t i t i o nb o x ”，可把方框分成 若干部分。 ( 2 ) 选定域名单击“0 b j e c t ”，在“0 b j e c t ”下拉菜单栏中选“s e t f i e l d ”，也可以双击“b o x ”选定域名。 ( 3 ) 给每个b o x 命名单击左侧“t ”图标，再单击某一b o x ，输入名称，即为 该b o x 命名。然后单击“b o r d e rp a t t e r n ”，设置“s t y l eb o r d e r s ”的特性，包 括边界线的宽度、颜色、类型等，使表格明晰实用并美观。 ( 4 ) 保存表格在“f i l e 的下拉菜单栏中单击“s a v ef o r m ”，并为该表格 取一名称：s t y l e f r m 。 至此，一个名为“x b j d b s t y l e f 珈”的数据库构架已经建成，下一步将向其 中注入相应的数据和信息。 3 数据输入 ( 1 ) 打开数据库打开i s i s b a s e 进入页面，单击页面左上角的“f i l e ”，在 其下拉菜单中选“o p e nd a t a b a s e ”，选定文件名x b j d b 进入 中困医学科学院北京协和医学院清华大学医学部硕：t 学位论文 “x b j d b s t y l e f r m ”数据库。 ( 2 ) 输入数据在“x b j d b s t y l e f r m ”数据库页面，单击左上方“u p d a t e ” 图标，先在“i d ”栏中输入一个初值“o o l ”，再根据域名输入相应的数据。 ( 3 ) 数据更新填完一张表以后，单击左上方“e d i t ”，在其下拉菜单中单击 “n e wr e c o r d ”，这时屏幕中出现第二张表格，再根据域名填入相应的数据，如此 反复。 ( 4 ) 数据随加此后每次进入“x b j d b s t y l e f r m ”数据库画面，输入新的数 据时，操作如下：先把以前的记录调出。具体做法是单击上方“q u e r y ”图标，再 单击上方“s e a r c h ”选项，在其下拉菜单中单击“r e t r i e v ea l l 。翻到最后一页： 单击左侧的“g ot o1 a s tr e c o r d ”图标 4 结构输入 ( 1 ) 切换到i s i s d r a w 画面单击左上方“u p d a t e 图标，双击表中 “s t r u c t u r e 的域或单击左上角彩色图标。 ( 2 ) 构建分子单击屏幕左侧或上方的分子片段，再把鼠标指向分子相应部 位，单击鼠标即可以连接。较复杂的分子片段可以从文件找到，具体操作如下： 单击屏幕上方的“t e m p l a t e s ”，在“t e m p l a t e s ”下拉菜单中单击 “f i l e ”。 打丌“t e m p l a t e s 子目录，找到所需片段的文件名，取所需片段。 把该片段连接到分子的相应部位。 ( 3 ) 加杂原子 单击屏幕左侧的“一a 一 图标。 单击分子相应的部位，输入或选择杂原子。 在任意位置单击鼠标，杂原子即可加上。 ( 4 ) 加带电荷原子 单击屏幕上方的“s t y l e ”在“s t y l e ”，下拉菜单中单击“a t o m ”。 在“a t o m ”页面单击“s y m b o l ”，选定所需原子；单击“c h a r g e ”，选定电 荷。 单击屏幕左侧的“a 一”图标。 单击分子中相应的部位，带电荷原子即可加上。 ( 5 ) 选择字体及加氢 选定分子：单击左上角“”图标，按下鼠标左键围绕整个分子拉丌，松开 鼠标左键。 选择字体：单击屏幕上方的“s t y l e 在“s t y l e ”下拉菜单中单击 “f o n t ”，选定字体，如可以选择“a r i a l 字体。 加氢：单击屏幕上方的“c h e m ，在“c h e m ”下拉菜单中单击 据库中相应的位 建了血必净五味 个、川芎5 2 个、 中国医学科学院北京协和医学院清f # 人学医学部硕士学位论文 第二章脓毒症发病机制及靶点 第一节脓毒症简介 脓毒症发病机制非常复杂，目前比较公认涉及到炎症、免疫、凝血以及其他方 面如组织损害等一系列基本问题，与机体多系统、多器官病理生理改变密切相关， 构成一个有机复合体。 一、炎症：炎症方面作用机制逐渐，主要是是由于如手术外伤各种感染和非感 染因素激活了机体单核巨噬细胞系统，并促使一系列炎性介质如t nf 【i 。- ：0 】、高迁移 族蛋白h m g b 一1 1 2 l l 等的释放，并引起瀑布式效应。严重感染时，细菌内毒素通过可直 接或间接作用于补体系统、凝血纤溶系统导致各器官功能损伤，并促发体内单核 巨噬细胞和中性粒细胞的聚集、激活，并释放出多种细胞因子和具有直接细胞毒性 的物质。这些活性物质可破坏结构蛋白及生物膜，增高血管通透性及激活凝血过程， 进一步加重微循环障碍及组织损害。 二、免疫：在脓毒症发展过程中，机体天然屏障反应障碍，不能及时清除体内 的内毒素，从而导致机体过度免疫反应，是脓毒症加剧的主要因素。机体补体裂解 加剧而产生大量的c 5 a 1 2 2 1 ，而过量的c 5 a 已被证明可以抑制中性粒细胞的杀菌功能。 脓毒症免疫紊乱的机制包括两个方面：即炎性介质向抗炎因子漂移和细胞凋亡与免 疫麻痹。人们逐渐意识到到机体并非一直处于促炎状态，免疫功能紊乱与大量淋巴 细胞凋亡及免疫受抑状态密切相关1 2 3 】。 三、凝血：凝血系统异常在脓毒症发生、发展过程具有极为重要的作用。脓毒 症时凝血系统活化，并促进炎症的进一步发展；反之炎症也引起凝血系统活化，二 者相互影响，从而脓毒症的恶化。抑制凝血系统的活化则可抑制失控性炎症反应， 改善脓毒症患者的预后。因此，研究凝血系统在脓毒症中的作用有助于进一步揭示 脓毒症复杂发病机制。 四、其他方面：由于机体蛋白降解显著增强，多伴有长期持续的负氮平衡，严 重影响患者预后。研究证实，泛素一蛋白酶体途径在转录和翻译水平激活是导致脓 毒症时骨骼肌蛋白高分解代谢的主要原因。研究发现细菌d n a 或某些特殊基序本身 可能就是病原菌的致病因素之一，细菌d n a 和内毒素具有协同作用。c d 一1 4 启动子 c 1 5 9 t 基因多态性与机体对脓毒症的易感性有关。 中国医学科学院北京协和医学院清华大学医学部硕士学位论文 第二节脓毒症作用网络效应图 脓毒症疾病与机体多系统、多器官病理生理性改变均有密切联系。尽管目前脓 毒症相关研究如分子生物学、生物化学等领域已经取得了很大的进展，但其根本的 分子机制还仍不清楚。其既存在着促炎反应，又存在着抗炎反应，大量的细胞因子 和趋化因子瀑布式效应及神经内分泌因素等构成了复杂的网络。我们在系统全面完 整考察国内外有关脓毒症发病机制方面的文献，在科学总结前人工作的基础上，应 用g e n e g o 公司m e t a d m g 模块，以炎症、免疫、凝血为基础，以内毒素产生、进 入细胞内、细胞核所引发的一系列信号转导通路为主线，将其涉及到的三条主线 ( m a p k 、j a k s t a t 、n f k b ) 各途径涉及到受体以及产生的细胞因子大致过程 绘制了脓毒症发病机制网络效应图( 见图1 2 ) 。 一、炎症失衡与免疫紊乱 炎症是机体的一种保护性防御反应。脓毒症时，机体丧失了对感染早期促炎反 应的调控，并产生全身性炎症反应。促炎介质t n f 一0 【2 4 】、i l 1 的过度释放导致不可 逆的过度炎症反应，造成组织损伤、弥散性毛细血管损伤甚至器官功能障碍等。由 于脓毒症病程是渐进的序贯反应，以炎症反应开始，随即出现免疫抑制，脓毒症患 者免疫障碍表现为丧失迟发性变态反应、不能清除病原体、易感医院性感染等。脓 毒症免疫紊乱的机制包括如下两个方面：一是促炎介质向抗炎因子漂移；一是细胞 凋亡与免疫麻痹。而免疫功能紊乱与大量淋巴细胞凋亡及免疫受抑状态密切相关。 二、脓毒症信号转导通路 各类因素引起细菌细胞壁破裂并释放内毒素，通过与相关受体如l b p 、 c d l 4 【2 5 】、t l r s 【：s 】等结合将内毒素信号转入细胞内，引起一系列的的级联反应并最 终将信号转导入核内，引起体内代谢网络紊乱并释放一系列炎性介质如i l - 1 、 t n f 0 【2 4 l 等等。上述代谢紊乱过程导致体内炎性介质的瀑布式效应，最终导致脓毒 症疾病【2 l2 8 】。脂多糖结合蛋白( l b p ) c d l 4 是机体识别和调控内毒素作用的关键蛋 白之一，l p s l b p 复合物与细胞表面c d l 4 厂r l r s 受体结合后，将内毒素信号传导 到细胞核。t o n 样受体( t l r s ) 的跨膜蛋白作为信号转导的受体参与了致病因子的信 号转导过程，其中t l r l 和t l r 4 的作用尤为显著。脓毒症时多种刺激因素激活细 胞膜上的受体酪氨酸激酶后，可通过r a s m a p k 、j a k s t a t 和n f k b 三条信号途 径级联放大，并最终传递到染色体基冈卜，调节基冈的表达。上述途径在脓毒症疾 病的炎症失衡、免疫紊乱、凝血等病理生理过程，f l 起着鼋要作用。 2 1j a k - s t a tj a 刚s t a t 足脓毒症疾病中比较重要的信弓通路之一，参与 中国医学科学院北京协和医学院清 ；人学医学部硕士学位论文 了多种病理和生理反应。细菌内毒豢、外毒素等刺激均町激活j a k s t a t 【2 9 1 通路。 各种刺激导致机体释放的细胞冈j ，与伯父受体结合后，可导致受体亚基上的j a k 相 互靠近，并经磷酸化而被激活。j a k 还可使受体酪氨酸残基磷酸化，使受体与含有 s h 2 区的s t a t 结合；s t a t 1 于j a k 髂化l 刚磷酸化，从而受体的亲和力下降而脱 离受体，穿过细胞核膜进入核内，并结合于特定的犟囚启动子序列，增强m r n a 表 达。h 前文献报道的j a k 激酶有4 个，s t a t 有6 个。脓毒症时细胞因子明显增多， 众多免疫细胞内s t a t 活化明显，与细胞凋亡、急性肺损伤、脓毒性休克等相关。 在脓毒症的发生、发展和转归中可能具有重要作用。 2 2m a p k r a s m a p k 信号途径足：r a s 活化后，依次催化r a f l 、m e k 和m a p k 相继磷 酸化j f ：级联放大。m a p k 活化后通过转移进入核内，催化e s t 等基囚编码的e l k 和 m 清反应因f 、c j u 科3 0 i 、三体复合因了等核转j = ：因f 的磷酸化，从而凋。镥基冈转录， 促进细胞有丝分裂和增赡。目前发现的m a p k 主要4 种哑犁：e r k 、k 、p 3 8 卫j 、 e r k 。 2 3n f k b j j 二n f k bl ：游激酶较多，信号途径的活化较复杂。无活性状态的n f k b 位 于胞浆中，由二聚体p 5 0 p 6 5 与另一种抑制旺基i k b 组成，i k b 业基与p 6 5 垭基的 结合，掩一箍n f k b 的核内转移信号，使n f k b 不能接近核孔复合物的受体，i 砸不 能剑达核内：i k b 磷酸化i k b k 催化完成，并依赖泛索化，然后m2 0 s 蛋白酶复 合物降解i k b ：i k b 降解后的n f k b 迅速活化，舅二向核内转移。通过结合于众多的 基冈肩动予卜，n f k b 信号途径可介导t n f a 、i f n 吖、b c l 2 和b c l x l 等腿冈表 达的调i 常。 2 4 三条信号转导通路间的交汇 2 4 1l p s 、t n f a 和i l 1 的释放可抑制i l 6 、i l 1 0 ，并活化s t a t 。l p s 通 过p 3 8 m a p k 作用一j 二l l 6 受体g p l 3 0 ，使j a k 1 磷酸化受抑，导致s t a t 1 和s t a t 一3 活化受抑。 2 4 2脓毒症时j a 对s t a t 通路的活化可增强l p s 诱导n f k b 的信号，健进 n f k b 与d n a 结合。山于i f n 吖活化s t a t 1 ，使i k b 仅从杂合子p 5 0 p 6 5i 二的降 解加快，从而使n f k b 产生活性增强，以诱导i n o s 酶m r n a 表达增加。 三、脓毒症与凝血障碍 主要有两种途径：一方面，脓毒症时，机体释放多种促炎介质以对抗感染，同 时也促进了凝血因子f a c t o r 激活。其大致过程如下：凝血因子f a c t o r 与暴露的内 皮下结构表面结合，并使其激活。活化的因子可以激活因子；然后由活化的凝 血因子f a c t o r 、c a 和磷脂组成的复合物将凝血因子f a c t o rx 激活，产生 - - 中国医学手牛学院北京协和医学院清华大学医学部硕- 上学位论文 凝血酶；凝血酶将可溶性纤维蛋白原转化为不可溶的纤维蛋白。另一方面，机体释 放的多种促炎细胞因子还可以诱导内皮和单核细胞表面组织因子( t f ) 的表达，启 动凝血。t f 是连接免疫系统和凝血的关键介质，是凝血的主要激活物。其大致过 程为：t f 与活化的凝血因子f a c t o r 作用，形成复合物，该复合物又可以激活凝血 因子f a c t o r x 和；随着凝血因子f a c t o r 、和v 的激活，凝血级联反应经凝 血酶介导的不断扩大，并最终产生大量凝血酶。在脓毒症早期，由于l p s 、t n f 0 【、 i l l 等诱导，血管内皮细胞出现损伤，组织因子( t f ) 、血管性假性血友病因子等因 子释放增多，激活血小板及其他凝血因子f a c t o r ，促进血小板的黏附、聚集和凝血； 此外，纤溶酶原激活物( p a ) 同时释放，激活了纤溶系统；内源性抗凝系统活性增强， 抗凝血酶i i i ( a t i i i ) 、蛋白c 和组织因子途径抑制物( t f p i ) 等被消耗。内皮细胞释放 的纤溶酶原激活物抑制剂( p a i 1 ) 通过抑制纤溶酶的产生，纤溶系统被进一步抑制， 大量纤维蛋白不能降解，加重了凝血功能紊乱。 四、补体与凝血系统 补体系统、体内凝血系统和纤溶系统的活化均依赖多种成分级联的蛋白酶裂解 作用，均借助丝氨酸蛋白酶结构域发挥效应。补体系统的活化可产生炎症反应，并 影响凝血及纤溶系统，从而导致机体正常组织细胞的损伤。补体系统分别经三种途 径被顺序活化，然后通过共同的末端通路，最终形成具有溶细胞作用的膜攻击复合 物，参与机体特异性和非特异性免疫效应机制。补体活化过程产生具有炎症介质作 用的过敏毒素c 3 a 、c 4 a 和c 5 a 的活性片段。它们通过与细胞表面相应受体结合， 激发细胞脱颗粒，释放组胺之类的血管活性介质，从而增强血管通透性并刺激平滑 肌收缩。三种过敏毒素中，尤以c 5 a 的作用最强，c 5 a 还是一种有效的趋化因子。 4 1c 5