（应用化学专业论文）固定化微生物技术处理含氟有机废水的研究.pdf

摘要 摘要 简述了目前含氟有机废水的一般处理方法，对生物技术处理含氟有机化合物进行综述。 从被含氟有机化合物污染的污泥中筛选、分离、富集得到7 株优势菌株，对其进行了研究， 包括生物忍耐性实验、游离菌种和固定化菌种降解含氟有机化合物研究、固定化包埋小球的 载体改性研究及其用包埋小球处理三氟甲苯研究。研究结果如下： 1 、从两个采样点污泥中分离得到7 株可降解有机氟化合物并且以有机氟化合物为唯一碳源 的菌株z l - z 7 。 2 、z l - z 7 为经过三氟甲苯和三氯三氟乙烷驯化后得到的菌株，对三氟甲苯和三氯三氟乙烷有 很强的忍耐能力，当其含量达到1 0 0 0 m g l 仍然能够生长。若菌株没有经过全氟辛酸、 苯、4 氟苯甲酸的驯化，则忍受能力不强，在底物浓度达1 0 0 0 m g l 不能生长。 3 、z 3 降解全氟辛酸，结果表明在2 - c 位置上的一个氟被一个氢所取代，即全氟辛酸被生物 脱氟。z 1 ，z 2 ，z 3 ，z 4 降解三氟甲苯的降解率分别为1 0 0 ，9 8 5 5 ，9 7 0 2 ，9 8 0 7 。三氟甲 苯的降解途径，可能是先水解，后氧化开环，然后环断裂，形成的长链烃断裂变成短链 烃。同时有部分降解产物可能进一步反应，晟后释放出f 。 4 、制备了海藻酸钙包埋菌种小球，包埋后，包埋小球降解三氟甲苯的降解效率和脱氟率明 显提高，原因可能是包埋后菌种浓度增加。 5 、通过改变海藻酸钙凝胶组成，添加硅藻土、蛋白质，使用交联剂己二胺、戊二醛等方法， 提高了固定化包埋小球交联的密度和机械强度，保持了固定化小球对三氟甲苯的降解活 性。制各海藻酸钙小球合理的凝胶组成是3 ( w v ) 海藻酸钠和3 ( w v ) 氯化钙溶液。包 埋小球经过己二胺一戊二醛处理之后，小球的表面结构成网格状，内部网格复杂化，不 均匀程度增加。 6 、通过加入海藻酸钠和在烧杯壁上设置挡流板降低了制备聚乙烯醇复合载体包埋小球的难 度，制各复合载体包埋小球的载体和添加剂的最佳浓度为：聚乙烯醇质量浓度为1 0 ， 海藻酸钠质量浓度为1 o 。 7 、从经济、实用性方面来说，海藻酸钙包埋剂优于聚乙烯醇。 关键词：固定化，菌种，三氟甲苯，包埋，降解 东南大学硕士学位论文 a b s t r a c t g e n e r a lm e t h o d so ft r e a t i n go r g a n o f l u o r i n ew a s t e w a t e ra r eb r i e f l yd e s c r i b e da n dt h e t r e a t m e n to f o r g a n o f l u o f i n ec o m p o u n d sb y b i o t r e a t m e n tt e c h n o l o g yi sr e v i e w e d s e v e n b e n z o t r i f l u o r i d ed e g r a d i n gs t r a i n sw e r eg o tb yt h ee n r i c h m e n t ，i s o l a t i o na n ds c r e e n i n g s t u d i e s h a v eb e e nc a r r i e do u ti n c l u d i n ge n d u r a n c eo fs t r a i n s ，c a p a b i l i t yo ft h e s ei s o l a t e ds t r a i n si nf r e ea n d i m m o b i l i z e df o r m st od e g r a d eb e n z o t r i f l u o r i d e ，t h em o d i f i c a t i o no fi m m o b i l i z e db a c t e r i aa n d d e g r a d i n gb e n z o t r i f l u o r i d eb yc o m p o s i t em a t e r i a la sc a r r i e r t h em a i nc o n c l u s i o nd r a w nf r o mt h ee x p e r i m e n tc a nb es u m m a r i z e da sf o l l o w e r s ： 1s e v e ns t r a i n s ，z l - z 7 ，w h i c hc a n u s et h eo r g a n o f l u o r i n ea sas o l es o u r c eo fc a r b o na n de n e r g y ， w e r eg o tb ys c r e e n i n gs i n d g ef r o mt w os i t e s 2t h ee n d u r a n c eo ft h es t r a i n sw a sd o n ef o rs e v e ns t r a i n s z 1 z 7w a sd o m e s t i c a t e di nt h ec o n d i t i o n o f b e n z o t r i f l u o r i d ea n dc h l o t r i f l u o r o e t h a n es ot h e yg r o we v e nw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f c o n t a m i n a n t sw a su pt ot 0 0 0 m g l b u tt h e yd o n td o m e s t i c a t ei nt h ec o n d i t i o no f b e n z e n e ， 4 - f l u o r o b e n z o a t e ，s ot h e yd o n tg r o ww h e nt h e i rc o n c e n t r a t i o nw a su pt o1 0 0 0 m g l 3p e r n u o r i n a t e d - o c t a n o i ca c i dw a sb i o d e g r a d a b l ea n dd e f l u o r i n a t e db ys t r a i nz 3 b e n z o t r i f l u o r i d e d e g r a d a t i o ni s1 0 0 ，9 8 5 5 ，9 7 0 2 ，9 8 0 7 r e s p e c t i v e l yf o rz l ，z 2 ，z 3 ，z 4 ap r o p o s e dp a t h w a y f o ro x i d a t i v ed e g r a d a t i o no fb e n z o t r i f l u o r i d ew a sd i s c u s s e d w et h o u g h tb e n z o t r i f l u o r i d ew a s d e g r a d e dv i ai n t r o d u c t i o no ft w oh y d r o x y lg r o u p sb o t ho r t h oa n dm e t at oe a c ho t h e r t h e r e s u l t i n gd i e l sw a so x i d i z e da n dt h e nr i n gc l e a v e dt h a tf o r m e dl o n gc h a i nh y d r o c a r b o nt o b e c o m es h o r tc h a i nh y d r o c a r b o n t h em e t a b o l i t e sw e n to i lr e a c t i n ga n da tl a s tp a r tm e t a b o l i t e s e x c r e t e df l u o r i d e 4c a m u ma l g i n a t eg e lc a p s u l e sh a v eb e e nu s e da sb a c t e r i ai m m o b i l i z a t i o nm a t r i x s t u d i e sh a v e b e e nc a r r i e do u to nt h ec a p a b i l i t yo ft h e s ei s o l a t e ds t r a i n si nf r e ea n di m m o b i l i z e df o r m st o d e g r a d eb e n z o t r i f l u o r i d e t b er e s u l ts h o w sb e n z o t f i f l u o r i d ed e g r a d a t i o na n dd e f l u o r i n a f i o n i n c r e a s ea f t e ri m m o b i l i z e db e c a u s eb a c t e r i ac o n c e n t r a t i o ni sh i g h e l 5v a r i o u st e c h n i q u e sw e r ee m p l o y e dt oi m p r o v et h es t r u c t u r a ls t a b i l i t yo ft h ei m m o b i l i z e ds o l i d g e l ，t h e s et e c h n i q u e si n c l u d ec h a n g i n gt h ec o m p o s i t i o no fg e l l i n gc o m p o n e n t s ，a p p e n d i n g d i a t o m i t ea n ds t a r c ha n du s i n gc r o s s l i n k i n ga g e n t sl i k e1 ，6 - d i a m i n o h e x a n ea n d g l u t a r a l d e h y d e t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e s eo p e r a t i o n se n h a n c et h ec r o s s - l i n k e dd e n s i t yo ft h e p o l y m e r i cb e a d s ，i n c r e a s es t r u c t u r a ls t r e n i g t ha n dm a i n t a i n e dt h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo ft h es o l i d m a t r i x a t y p i c a l c o m p o s i t i o no f 3 ( w v ) o f b o t h n a - a l g i n a t ea n d c a l c i u mc h l o r i d es o l u t i o n h a ss h o w np r o m i s i n gr e s u l t sw i t hr e s p e c tt ob o t hs t r e n g t ho ft h eb e a d sa n db e n z o t r i f l u o r i d e d e g r a d a t i o n s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p es t u d i e so ft h ei m m o b i l i z e ds o l i di n d i c a t e st h a tt h e 。 e x t e m a ls t r u c t u r eo fc a l c i u ma l g i n a t eb e a db e c o m er e t i c u l a t i o n ，i n t e m a lr e s e a ui sc o m p l e xa n d i t s a s y m m e t r yi si n c r e a s i n ga f t e rt r e a t m e n tw i t h1 , 6 - d i a m i n o h e x a n ea n dg l u t a r a i d e h y d e 6i tw e r ee m p l o y e dt ol o w e rt op r e p a r ep o l y v i n y la l c o h o lc o m p o s i t em a t e r i a lc a r r i e rg e lc a p s u l e s b ya p p e n d i n gn a - a i g i n a t ea n ds e tb l o c k b o a r di nb e a k e r , i t so p t i m a lc o n c e n t r a t i o ni s1 0 ( w v ) p o l y v i n y la l c o h o la n d1 ( w v ) n a - a l g i n a t ep r e p a r i n g p o l y v i n y la l c o h o lc o m p o s i t em a t e r i a l c a r r i e l 7c a - a i g i n a t ea sc a r d e ri s s u p e r i o rt op o l y v i n y la l c o h o lc a r r i e r a sr e s p e c tt oe c o n o m ya n d p r a c t i c a b i l i t y k e y w o r d s ：i m m o b i l i z e d ，b a c t e r i a ，b e n z o t r i f l u o r i d e ，e n t r a p m e n t ，b i o d e g r a d a t i o n i i 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 研究生签名： 日期： 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复 印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和 纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布 ( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办 理。 研究生签名： 咎e 壶 导师签名：f日期： 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 引言 已知的环境污染物达数十万之多，其中大量的是有机物。所有的有机物污染物，可根据 微生物对它们的降解性，分成可生物降解、难生物降解和不可生物降解三大类。作为一个整 体，微生物分解有机物的能力是惊人的。可以说，凡在自然界存在的有机物，几乎都能被微 生物所分解。有些种类甚至能降解9 0 种以上的有机物，它能利用其中任何一种作为唯一的 碳源进行代谢。 半个多世纪以来，人工合成的有机物大量问世，如杀虫剂、除草剂、洗涤剂等，但由于 微生物具有极其多样的代谢类型和很强的变异性，近年来的研究，己发现许多微生物降解人 工合成的有机物，甚至原以为不可生物降解的合成有机物，也找到了能降解它们的微生物。 微生物能逐步通过各种调节机制适应变化了的环境。它们可通过自然突变形成新的突变种也 可由基因调控产生诱导酶以适应新的环境条件。产生的新酶体系的微生物就具备了新的代谢 功能，从而能生物降解或转化那些原来不能生物降解的污染物。因此，通过研究，有可能使 不可降解的或难降解的污染物转变为能降解的，甚至能使它们迅速、高效去除。 由于含氟有机化台物的许多独特的性质，合成含氟有机化合物在过去几十年里迅猛发 展，其应用也越来越广泛。各种结构的含氟化有机物已广泛应用于喷雾推进剂、表面活性剂、 冷冻剂、塑料、麻醉剂、杀虫剂、杀菌剂、植物生长调节剂、医药、胶粘剂、灭火剂，甚至 是血液的替代品大量的含氟有机化合物的广泛使用，使它们在环境中长期存留，逐步累积， 对人类的生存环境和人体健康构成严重威胁。含氟有机化合物是人工合成的有机物，与天然 存在的化合物相比，环境中的微生物能否将它们降解，确是一个受人关注的问题。近年来， 关于卤素化台物对环境的毒性影响及卤素化合物生物降解实验研究报道的较多，并在微生物 的驯化、分离，生物脱卤降解机理研究等方面取得了一些成果。但这些研究主要集中于氯代 有机化合物，而氟代的有机物很少被选取作为微生物降解研究的对象。这是由于有机氟化合 物c f 键的键能比c - h 键、c a 键的键能大，键长短，同时由于氟原子的屏蔽效应，还使 c - c 键变牢固，使同氟原子结合的部位稳定性增高，因此，含氟化合物分子被认为是生物惰 性的，难以被生物降解的。 已有的数据表明，所有的已知的由生物产生的氟化有机物都是只包含一个氟原子的， 即天然含氟化台物是单氟取代的，而人工合成的含氟化台物通常都是多氟代的，甚至是全氟 的。环境污染物中氟化合物研究较集中的是三氟乙酸，资料表明氢化氟化物( h f c s ) 和碳 氢氟化合物( h c f c s ) 被大气对流层中的羟基自由基攻击就生成三氟乙酸，三氟乙酸可在不 同条件下被生物降解为二氟、一氟乙酸，同时产生甲烷，或被降解为三氟甲烷。生物学转化 有机氟化合物，c - f 键受到直接攻击而断裂的例子仅见于单氟，多氟有机化合物的生物降解 和转化，在亲和反应、氧化反应、还原反应中，攻击与氟邻近的官能团会导致脱羧、脱磺酸 基、脱氨基以及氟的消去，但更多出现的情况是在母体化合物结构改变的同时，并不发生脱 氟。 对含氟有机化合物浓度较高的废水一般是先采用化学处理，焚烧处理法等【1 1 方法使其浓 度降低后再进行后续处理。化学处理法是采用氧化剂对含氟有机化合物进行氧化处理，该法 的优点是处理设备简单、投资少、处理效果好，并具有随时进入工作状态的特点，特别适用 于不稳定排放的场合。如美国的杜邦公司、英国i c i 公司曾采用该法处理有机氟残液。缺点 是处理费用较高，且该法不适合高浓度、大水量的处理场合。焚烧处理法是将有机氟残液与 燃料气通入焚烧炉进行高温焚烧，有机氟化合物分解，生成c 0 2 、f i f 及微量c f 4 等混合气 体，再经过石灰乳吸收、中和、急冷，c 0 2 等混合气体经高烟囱排入大气，h f 等与石灰中 和生成氟化钙浑浊液经沉淀后排放。该法优点是设备简单、占地面积小、处理效果好、投资 东南大学硕士学位论文 低，但是耗热量大，需投加燃油，处理费用较高，氟类物质无法回收，对焚烧炉的炉体损耗 较大。因而，客观上需要一种高效、稳定、经济的处理含氟有机废水的方法。而微生物技术 能较好满足含氟有机废水处理要求。 生物技术在环境领域的应用已有多年历史，其中有较早的活性污泥法处理工业废水及 2 0 年来发展起来的生物修复技术。目前，应用生物降解原理治理有毒有机废水所具有的潜 在优势得到了广泛认可。它不仅经济、安全，而且所能处理的污染物阈值低、残留少，其应 用前景看好。应用微生物来治理有毒有机废水的研究正受到世界各国重视。 本研究期望应用生物强化技术及固定化微生物技术，通过向自然菌群体中投加能降解 含氟有机物的高效、兼性菌株，再通过固定化技术把微生物进行固定化以达到迅速、有效降 解目标去除物的目的。 含氟有机化合物的降解取决于含氟有机化合物的结构。如三氟、二氟和单氟乙酸还原 脱卤，单氟化合物水解脱卤，碳氟键很难被直接攻击而破裂口1 。攻击邻近官能团可能是亲 核氧化，或者还原，从而引起脱羧，去磺化，去氨基和氟的消除【4 j 。还原脱卤似乎要求极端 的和不寻常的还原条件，至今仅仅在不能重复的产生甲烷的条件下才能被还原口】 1 2 好氧生物降解 微生物在降解有机氟化合物时，可以利用环境中的氧或人为提供的氧进行好氧降解。氧 作为最终电子受体，接受被氧化的底物在氧化过程中所释放的电子。氧的的另一作用是像被 氧化的底物一样参与生物化学反应，最终被化合到反应的生成物中。一般情况下，氧需要在 加氧酶的激活下，成为激活态氧。只有激活态的氧才能参与反应。大量研究已经发现各种生 物所持有的加氧酶有1 0 0 多种，如单加氧酶、双加氧酶等。 一般来说，含氟苯甲酸的衍生物降解是通过在邻位或者对位引入两个羟基口j 。产生的二 醇氧化裂开生成顺、顺已二烯二酸或者顺、顺已二烯二酸盐半醛衍生物作为中间体睁”。如 4 氟苯甲酸在细菌作用下降解，在1 ，2 加双氧酶攻击下，脱羧产生4 氟二酚m 4 m 。 w u n d e r w a l d ，u 等1 1 q 以酚作为唯的碳源和能源，研究了二氟化酚在青霉菌作用下水解脱氟， 发现2 ，3 ，2 ，舢，2 ，5 一和3 , 4 一二氟酚能很快被转变。在6 小时内青霉菌能把开始浓度为0 0 5 r a m 二氟化酚完全转变，最终二氟化酚有5 0 7 0 脱氟。但o l t m a n n s 等1 2 1 发现在生金丝菌r h 0 2 5 作用下4 氟苯甲酸直接脱氟。g o l d m a n 等【1 “报告了假单细胞菌代谢氟代苯甲酸的机理，该 微生物通过非选择性的苯甲酸+ 1 ，2 - 双加氧酶催化2 - 氟1 ，2 - 二氢一1 ，2 - 二羟基苯甲酸反应。 在该反应中2 _ 氟苯甲酸( 大于8 5 ) 自发脱氟生成邻苯二酚，并通过3 一氧己二酸途径进行 一步降解。这种消除氟的途径可能是加氧酶脱氟催化的，该酶的作用是将氧引入苯甲酸。有 关氟代脂肪 z ，z 划： n 7 例。o 专i 蝽。 图1 1 氟乙酸盐在微生物m o r a x e l l as p 作用下可能的降解途径 烃降解研究者发现菌种p s e u d o m o n a ss p p 、f u s a r i u ms o l a n i 及m o r a x e l l as p 能脱氟降解氟 2 第一章文献综述 乙酸盐。其中胁r 如s p 脱氟降解效果最好。在酶的活性部位，天冬氨酸1 0 5 羧酸盐部位 充当亲核菌种攻击氟乙酸盐，取代氟并且产生固定酶酯中间体。后组氨酸- 2 7 2 充当底物， 从水分子中脱去质子，产生氢氧根离子，断开酯中间体，释放出乙醇酸盐，如图1 1 所示。 t w i g g l e 等口6 】研究了单氟己酸钠( 1 0 8 0 ) 发现，1 3 种细菌和1 1 种霉菌能从1 0 8 0 中脱氟， 其中霉菌f u s a r i u mo 掣s p o m m 有最大的脱氟能力，在1 2 天脱氟率达到4 5 。加入土壤中的 1 0 8 0 在p h 5 6 降解率大于在p h 6 8 ，显示了霉菌在脱氟中扮演了重要的角色。 1 3 厌氧生物降解 自从厌氧生物处理技术问世1 0 0 多年以来，有机污水厌氧处理工艺在近3 0 年来有了较 快的发展。开始把有机污水的厌氧处理作为环境工程与能源工程的一项重要技术来对待。还 原脱卤是卤代有机化合物厌氧降解的最重要步骤，也是第一步。还原脱卤是指在脱去卤原子 的同时给分子提供电子。分子中的卤原子被来自水中的氢原子取代的过程叫做水解脱卤。另 一种脱卣方式是邻位脱卤，即卤代芳香族化台物的邻位的两个卤原子被同时脱除。脱卤后的 中间产物可发生开环反应。到目前为止，研究卤素化合物的厌氧脱卤集中在含氯芳香族化合 物。例如，含氯芳香族化合物能在不同的还原条件下被降解【l “2 2 。在脱硝条件下 3 c h l o r o b e n z o a t e s ，4 - c h l o r o b e n z o a t e s 能被降解，然而3 - c h l o m b e n z o a t e s 在离子还原和产甲烷 条件下也能被降解 1 8 - 1 9 1 。 表1 1含氟有机物生物转变可能的降解机理 降解机理反应式 环境或者培养 直接还原脱氟 c f 3 c 0 2 h + 2 e + h + - - * c h f 2 c 0 2 h + f a n a e r o b i cs e d i m e n t 【3 】 间接氧化脱氟 c c l 2 c f 2 + 4 h 2 0 - c 2 0 4 。+ 2 e 。+ 8 h + + 2 f + 2 c 1 p p u f i d a ( d i o x y g e n a s e ) 1 2 9 1 亲核直接水解c f h 2 c 0 2 + h 2 0 - - h o c h 2 c 0 2 h + f 十 i + p s e u d o m o n a d 飘 r 鸭一+ 一p + “。口c 刚+ r 一十一+ 舢r o o b a c t e 山m ( a e r o n - c ) 同 亲核脱羧非直c f h 2 c o c 0 2 h + h 2 0 - - ，c h 3 c 0 2 h + f + w + c 0 2p y m v a t ed e h y d r o g e n a s e 接脱氟，水解 在厌氧环境下，研究者发现含氟芳香族化合物对生物降解有强烈的抑制+ 2 “。有限 的研究发现，在厌氧环境下，单氟芳香族化合物在脱硝作用能被降解【8 ”2 ”。v a r g a s 等c 2 8 i 研究发现，把酚和苯作为对照物，在2 6 星期，在所有的电子接受体下，在一年内氟化酚没 有降解。在脱硝条件下2 珂u o m b e n z o a t e 、4 - f l u o r o b e n z o a t 各自在8 4 天、2 4 天能降解，而 3 - f l u o r o b e n z o a t 没有被降解。在硫酸还原、离子还原、产甲烷条件f3 种苯甲酸异构体不能 被降解，3 种苯甲酸异构体在脱硝条件下，用不同的沉淀物作为接种体能完全矿化降解成 c 0 2 。研究还发现2 一f i u o r o b e n z o a t e 培养并不能降解4 - n u o r o b e n z o a t e ，显示出两种苯甲酸培 养是不同的和菌种的专一性。v i s s c h e r 等【3 1 也报道了单氟乙酸盐在产生甲烷条件f 还原脱氟， 还报道了三氟乙酸( t f a ) 在产甲烷和硫酸还原条件下脱氟成为二氟乙酸，单氟乙酸和乙酸， 这些产物断键产生甲烷。但是这种情况以后就没有发生过，导致认为三氟乙酸( t f a ) 对生 物降解有强烈的抑制 4 1 。 部分含氟有机物的降解机理如表1 1 所示。 1 4 环境因子对微生物的影响 3 东南大学硕士学位论文 1 4 1 温度 水温对活性污泥的细菌有较大的影响。对任何一种细菌都有一个最适生长温度，这个最 适生长温度与产生某种代谢产物的最佳温度条件并不完全一致在一定的温度范围内，随着温 度的上升，细菌加速生长。此外还有最低生长温度和最高生长温度。 所谓最低生长温度就是指低于这一温度时，这种细菌的生长就停止了，但并未死亡，我 们就是利用这个原理在低温下包藏菌种。最高生长温度就是指高于这个温度细菌生长停止， 并最终导致死亡变质。根据温度范围，人们将微生物分成不同的类群 3 0 1 ： 嗜冷微生物：最适生长温度5 2 0 中温微生物：最适生长温度2 0 4 5 嗜热微生物：最适生长温度4 5 - 5 5 1 4 2 酸碱度 生物体的生化反应都在酶的参与下进行，酶反应需要合适的p h 值范围，因此废水的酸 碱度对活性污泥中细菌的代谢活力有很大的影响。废水的生化处理实践表明，废水酸碱度以 p h 值范围在6 0 9 0 之间较为合适。活性污泥中的细菌经过驯化对酸碱度的适应范围可进一 步提高o ”。 1 4 3 营养物质 活性污泥中微生物的生长、繁殖极其代谢活动都离不开营养，此外营养同污泥的结构也 是有着密切的关系的。因此，营养问题是污水处理的运行管理中最为重要的问题之一。 细菌所需要的营养物质包括碳源，氨源，无机源类，毒物，溶解氧。 1 碳源 碳是构成污泥微生物体的重要元素，细菌体内各种元素所占比例的通式为c 5 h 7 n 0 2 碳可占污泥干重的5 0 。含碳有机物还是细菌重要的能源。 2 氮源 氮也是构成微生物体的重要元素，菌体蛋白质、核酸等分子中都有氦元素，氮可占菌体 干重的1 0 。细胞一般较易利用氨态氮。 3 无机盐类 细菌体内的蛋白质和酶中还含有少量s 和p 。p 还是核酸的重要组分，p 可占菌体干重 的1 - 2 。s 还是污泥中自氧性硫细菌的能源。此外，细菌还需要 k , m n ，m g ，c a ，f e ，c o ，z n ，c a 等元素作为营养。但其需要量甚微，一般废水能够自己满足 需要。 4 毒物 凡在废水中存在的对活性污泥中的细菌具有抑制或杀害作用的物质都称毒物。细菌经 驯化后，会大大提高对某些有毒化学物质的忍受能力。 5 溶解氧 不同细菌对氧有不同的反应。根据细菌和氧的关系，我们可以把细菌分为好氧性细菌、 厌氧性细菌和兼性厌氧性细菌。好氧性细菌进行有氧呼吸，以分子氧作为生物氧化过程 的电子受体，因此，只有在有氧情况下才能生长和繁殖。厌氧性细菌的生长不需要分子 氧，在有氧的情况下生长反而受到抑制，甚至会死亡。兼性厌氧细菌是在有氧无氧条件 下都能生长的细菌。 1 5 微生物固定的方法 7 0 年代以来，固定化细胞技术发展的非常迅速。其应用研究已涉及工业、医药、食品、 化t 、环境净化、能源开发等各个领域，展示了广泛的发展前景。用固定化细胞处理工业废 4 第一章文献综述 水是近几年来发展起来的废水处理新技术p “。 传统的废水生物处理法一般是采用活性污泥法。该法操作简单，处理成本低，但对一些 难分解的物质去除率较低且占地面积大，易发生二次污染。而固定化细胞具有活性高，处 理负荷大，占地面积小，无二次污染等优点。近年来国内外学者用固定化细胞处理难降解的 有机物废水成功的例子不少9 “j 。 固定化微生物技术是指通过采用化学或物理的方法将游离微生物定位于限定的空间区 域内，使其保持活性并可反复使用，包括固定化酶、固定化细胞和固定藻，其中以固定化细 胞研究较多”。与普通悬浮生物处理法相比，固定化技术具有以下优点：( 1 ) 能在生物处理装 置内维持高浓度的生物量，提高处理负荷、减少处理装置容积；( 2 ) 污泥产量少：( 3 ) 可选择 性地固定优势菌种，提高难降解有机物的降解效率：( 4 ) 抗毒物毒性强；( 5 ) 对水质及p h 的 变化有较好的稳定性。这些优点使固定化技术在废水处理中受到重视，特别是在难降解和有 毒废水处理中表现出更大的潜力。 固定化方法国内外不同的研究工作者采用不同的分类方法 3 6 1 ，目前较合理的固定方法 大致有吸附法、共价结合法、交联法和包埋法四大类。吸附法是依据带电的微生物细胞和载 体之间的静电作用，使微生物细胞固定的方法，可分为物理吸附法和离子吸附法两种。前者 使用具有高度吸附能力的硅胶、活性碳、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂将细胞吸附到 表面上使之固定化。这是一种最古老的方法，操作简单，反应条件温和，载体可以反复利用， 但结合不牢固，细胞易脱落。后者是细胞在解离状态下通过静电引力( 即离子键合作用) 而固 着于带有相异电荷的离子交换剂上，如d e a e - 纤维素、d e a e s e p h a d e x 、c m 纤维素等。 共价结合法是细胞或酶表面上功能团( 如n ，e 一氨基、n ，b 或y 一羧基、巯基或羟 基、咪唑基、酚基等) 和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而成为固 定化细胞或酶。该法细胞或酶与载体之间的连接键很牢固，使用过程中不会发生脱落，稳定 性良好，但反应剧烈、操作复杂、控制条件苛刻。 交联固定法它是利用双功能或多功能试剂，直接与细胞或酶表面的反应基团( 如氨基酸、 羟基、硫基、咪唑基) 发生反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细胞或酶。常用的交 联剂有戌二醛、甲苯二异氰酸酯等。由于交联固定法化学反应比较激烈，固定化微生物的活 力在多数情况下较脆弱【3 ”。另外，这种方法所用的交联剂价格较贵，这就限制了该方法的 广泛应用。 包埋固定法是将微生物细胞用物理的方法包埋在各种载体之中。这种方法既操作简单， 又不会明显影响生物活性。是比较理想的方法，目前应用最多。但这种方法其包埋材料( 即 载体1 往往会一定程度地阻碍底物和氧的扩散，影响水处理效果。对于包埋法，理想的固定化 载体应是：对微生物无毒性；传质性能好，性质稳定，不易被生物分解；强度高、寿命长； 价格低廉等删j 。通常选用海藻酸钙、角叉藻聚糖、聚丙烯酰胺凝胶( a c a 旧、光硬化性树脂、 聚乙烯醇删等1 3 9 l 。目前聚乙烯醇固定法在日本应用得较广泛，也是固定化微生物处理废 水或分解有毒物研究最多的方法。本研究采用包埋法处理含氟有机废水。 1 6 固定化细胞的载体 固定化细胞技术所采用载体的物理化学性质直接影响所固定细胞的生物活性和体系传 质性能。理想的载体材料应具有对微生物无毒性、传质性能好、性质稳定、寿命长、价格低 廉等特性。它可分为有机高分子载体、无机载体和复合载体三大类”。有机高分子载体又分 为天然高分子凝胶载体和合成有机高分子凝胶载体。天然高分子凝胶一般对生物无毒，传质 性能较好，但强度较低，在厌氧条件下易被生物分解。有机合成高分子凝胶载体一般强度较 大，但传质性能较差，在进行细胞固定时对细胞活性有影响，易造成细胞失活。无机载体大 多具有多孔结构，在与微生物接触时，利用吸附作用和电荷效应，从而把微生物固定。它的 5 东南大学硕士论文 操作方法是把载体放入含有一定微生物浓度的溶液中，固定一段时间即可。由有机载体和无 机载体材料组成的复合载体材料，可以改进载体材料的性能。 1 7 固定化技术的优势与需解决的问题 固定化技术的优势如下：( t ) 比普通活性污泥法的处理能力高1 3 倍，且出水水质好， 抗水力、有机负荷的冲击能力强，可降低运行费用与投资。( 2 ) 对于厌氧消化工艺，可持留对 环境干扰敏感、生长缓慢的产甲烷细菌，缩短了起动时间，使工艺稳定地运行。( 3 ) 在降解 有毒污染物方面，抗毒性作用明显加强。更有前途的是用包埋高效率的混合微生物系作为投 菌剂，能强化现存生物处理系统的处理效率。 尽管固定化技术在近些年取得重要进展，但该技术要达到工业化应用还需解决下列问题 ”“：n 1 由于不能精确测定固定化载体内微生物浓度，因此，目前尚缺乏适用于固定化细胞系 统的设计、运行管理及最佳控制的动力学处理法。f 2 涸定化载体的成本及使用寿命是决定 其经济可行性的关键。目前所用载体材料价格较高，使用寿命较短，限制了该技术在实际中 的推广。( 3 ) 包埋载体对基质f 特别是氧气) 和产物存在扩散阻力。因此，需要高效曝气和混合 设备才能使固定化生物处于良好的微环境中，发挥其作用。“) 包埋固定化微生物不能去除 废水中的悬浮物，因此必须先将悬浮物分解或除去。它也不能除去悬浮在反应器中的微生物 细胞( 来自于载体内泄漏出来的细胞的增殖) ，因此出水仍有一定的浑浊度。 1 8 固定化微生物反应器 固定化微生物反应器主要有两大类，即纯种固定化反应器和混合种固定化反应器。 纯种固定化微生物反应器以单一种群微生物细胞为生物活性物质，利用特殊种类的载体、 通过不同的方法将其固定，实现对废水中污染物降解。利用人工纯化的形式筛选并富集特定 的微生物种群，采用物理或化学的形式将其固定。适用于处理含有特定污染物质的废水。 自法国生物学家巴斯德最早设计的一种称之为醋化器的纯种固定化细胞反应器至今，随 着生物工程技术的发展，反应器的类型研究也取得了进展，目前较常用的是流化床生物反应 器、固定填充床、搅拌槽式反应器和膜生物反应器等几种类型。 对于成分复杂，或者仅仅通过一种类型微生物很难达到理想处理效果的废水情况及多去 除目标的情况，就需要发挥不同种类微生物的协同代谢优势，实现多种物质的同时降解，或 使某种难降解物质通过不同阶段相应类型的微生物的代谢而得到去除。由此开发研究和应用 了混合种群微生物固定化反应器工艺。 目前，混合种群固定化生物反应器多通过合理控制反应器营养结构，投加必要的核心物 质，控制反应器水力流态而使微生物实现自身固定化。 1 9 海藻酸钠的理化性质 海藻酸钠的分子式为( c 出7 0 6 n a ) 。聚合度可以从8 0 到7 5 0 ，分子量为1 4 0 0 0 1 3 2 0 0 0 ， 其中海藻酸系天然有机高分子电介质，其一价盐( n a k n h 。) 为水溶性盐，而二价以上的盐 ( c a , a 1 ) 为水不溶性盐，因此可形成耐热的凝胶或被膜，这是海藻酸钠经氯化钙溶液钙化后形 成固定化凝胶的重要依据；同时，海藻酸钠易与蛋白质、明胶等多种物质共溶，并可与细胞 混合成均匀的悬浮液，使凝胶具有微生物分布的均匀性；除此之外，它的无毒、不易被绝大 多数微生物降解等特性都证明海藻酸钠是一种理想的细胞固定化的载体。海藻酸钠固定化细 胞机械强度测试海藻酸钠除具有上述良好特性外，有机废水中各种离子对其产生的侵蚀作用 又是影响海藻酸钠固定化细胞的一个关键环节，这种侵蚀作用随着废水处理过程运行时间的 延长越来越明显，使固定化细胞的三维结构遭到破坏。 6 第一章文献综述 1 1 0 细胞固定化载体的选择 包埋法制备固定化细胞的原理，是利用线性网状结构的高分子聚合物载体的夹裹作用， 将游离细胞截留在形成的高分子材料内，使细胞得以固定。为了制各出高质量的固定化细胞， 必须有高质量的固定化载体，一些学者甚至认为，如果不考虑微生物细胞本身，那么载体的 选择可以说是固定化技术中最重要和最关键的一个环节1 4 2 】。结合有关资料 4 3 1 ，对几种常见 的载体的主要性能进行了比较，结果见表1 , 2 。 表1 2 常见的载体的主要性能比较 扩散系 压缩强耐曝气数( 有效系耐生物对生物固定化 载体成本 度强度 1 0 oc数 分解性 毒性 难易 m = s ) 琼脂 o 5差 7 5差无 易便宜 海藻酸 钠 0 8 一般 6 86 8 一般 无 易较便宜 角叉菜 0 8一般3 7 35 8一般无易贵 胶 聚丙烯 1 4好5 4 _ 6 6 76 0好较强难便宜 酰胺 聚乙烯 醇硼 2 7 5 好 3 4 2 好一般较易便宜 酸 综合考虑选择载体应具备无毒性，制备方便，载体稳定性好，来源容易成本低等几个因 素，从表1 3 可知海藻酸钠和聚乙烯醇硼酸这2 种载体性能相当。黄霞等 4 4 1 分别对这2 种 载体做了传质性能实验、强度实验和c o d 指标测定结果见表1 3 。 表1 _ 3 海藻酸钠和聚乙烯醇一硼酸载体性能比较 有关实验聚乙烯醇珠体海藻酸钠珠体 制备困难，需加入海藻酸 制备难易制备容易 钠后较易制成珠体 虽具多孔微细结构，但球 传质性能传质性能较好 壳厚致使传质性能欠佳 开始较硬，逐渐溶解，易 机械强度逐渐溶解，易碎 碎 c o d c , ( m g l ) 2 7 0 0 0 01 6 4 8 我们在本下面实验中从机械强度上对海藻酸钠固定化细胞进行改进，对改进后海藻酸钠做载 体和聚乙烯醇硼酸载体作了比较。 添加天然物质改进固定化细胞的内部组成文献中曾提到，淀粉对海藻酸钠有抗侵蚀防腐 败作用。引入硅藻土细粉，不仅可以利用其吸附性使凝胶内部的微生物细胞更好地利用底物， 达到高效降解的目的，还可以改善和调节固定化细胞颗粒的比重1 4 ”。对固定化细胞进行表 面化学处理一方面利用添加天然物质改变固定化细胞的内部组成，同时也可利用化学试剂对 同定化细胞表面进行化学处理，使固定化细胞机械强度增加，柔韧度增大，达到防止其膨大 7 东南大学硕士学位论文 胀裂的目的。在众多的化学试剂中，己二胺和戊二醛是高分子聚合物材料的较好的化学交联 剂，因为己二胺在浸泡固定化细胞时，其中的胺分子扩散到海藻酸钙三维网格中，和带正电 的凝胶形成了离子键，当加入戊二醛后，己二胺上的胺基和戊二醛上的醛基形成共价键，起 到了共价交联的作用。这种作用在三维网格内扩展，形成了三维网格的钢性支撑体，防止了 废水中离子对凝胶颗粒的侵蚀，使凝胶不易腐败，同时又增加了凝胶颗粒的机械强度。 1 n 细菌浓度的检测方法与设备 有研究表明，微生物在降解有机物的过程中，必须有足够高的浓度。所以在试验之前， 我们必须了解微生物的具体浓度。微生物的计数方法很多，一般分为直接法和间接法两大类。 f 1 ) 直接法：就是直接观察细胞并进行计数的方法，又可分为比例计数法、血球计数板 法和比浊法。所谓比例计数法，是一种很粗略的计数法，它是将以知颗粒浓度的液体与待测 细胞浓度的菌液按照一定比例混合，在显微镜视野中数出各自的数目，然后求出未知菌液中 的细胞浓度；血球计数板法是将菌液放在血球计数器载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显 微镜下进行计数。由于载玻片上的计数室盖上盖玻片的容积是一定的，所以可根据在显微镜 下观察到的微生物数目来计算单位体积内的