（化学工艺专业论文）鸡蛋蛋黄蛋白质制备降血压肽的研究.pdf

鸡蛋蛋黄蛋白质制备降血压肽的研究 摘要 血管紧张素转化酶在血压调节中具有双重的作用，它将无催化活性的 血管紧张素i 转化为具有活性的血管紧张素，同时，它还可催化降压物 质舒缓激肽分解从而导致血压升高。食品蛋白质中存在着活性肽，其中对 血管紧张素转化酶具有抑制作用的活性肽( 降血压肽) 的研究在国内外尤 其引人注目，它可通过酶水解食品蛋白质而获得。 采用鸡蛋蛋黄蛋白质为原料，经超临界c o ：乙醇萃取出蛋黄油和卵磷 脂纯化蛋黄蛋白质，得到含量为7 4 6 8 的蛋黄蛋白质，蛋白质含量较传统 的溶剂提取法提高了2 4 。经s d s - - p a g e 法测定，得蛋黄蛋白主要由 3 5 k d a 、4 0 k d a 、6 7 k d a 和1 0 0 k d a 以上分子量的蛋白质组成。 用1 2 种蛋白酶酶解蛋黄蛋白质，结果显示所用酶水解产物对a c e 皆 具有抑制作用；采用体外保温抑制实验将其中活性较好的6 种酶解产物进 行筛选，确定了产物对a c e 的抑制类型，并筛选出酶l 为制各蛋黄降血压 肽的酶类，其水解产物的i c 靳为1 1 9 m g m l 。 考察了各因素对酶解的影响，得到蛋黄蛋白质酶解作用最适水解时间为 3 0 0 m i n 、温度为4 5 c 、p h 为9 5 、底物浓度为6 0 e , l 、加酶量为0 4 2 9 k g ， 此时蛋黄蛋白质水解度为1 7 2 ，氮溶解指数为8 9 0 9 ，平均肽链长度为 6 5 。建立了酶解蛋黄蛋白质的水解动力学模型，得到其动力学方程为 r = ( 2 7 0 2 e o - 0 4 1 2 5 s o ) 嘲, - 0 2 3 ( 删) 】，动力学模型与实验结果吻合较好。 蛋黄水解液经活性炭脱色、采用截留分子量为1 0 k 和3 5 k 的超滤膜 进行分离，所得蛋黄降血压肽超滤液对a c e 抑制活性明显提高；用d 6 1 大孔阳离子交换树脂对分子量小于3 5 k d a 的水解液进行分离，确定了离子 交换分离降血压肽的适宜条件为；采用p h 4 1 、浓度为0 0 5m o l l 的乙酸 钠缓冲溶液+ 1 0 m o l l 的n a c i 溶液，梯度洗脱，上样量为2 5 m g m l ( 湿树 脂体积) ，洗脱速度为0 5 m l m i n ，在此条件下，肽的得率与活性回收率分 别为6 7 2 和7 3 5 9 。 用s e p h a d e xg 1 5 对离子交换树脂分离出的穿透峰和洗脱峰分别进行 分离和纯化，用r p - h p l c 分离纯化最大活性组分峰，用r p - h p l c 和高 效毛细管电泳o i p c e ) 进行纯度鉴定，经薄层色谱分析和电喷雾质谱鉴定表 征了降血压肽e y - i 的结构序列为l e u t y r p r o 。 蛋黄水解液的功能研究实验表明，蛋黄水解液有较好的耐热、耐酸稳 定性，并发现不同分子量范围的水解产物具有较好的抗油脂氧化性能。与 肠道酶作用结果表明，蛋黄水解液与胃蛋白酶作用后其i c s o 值由 1 1 9 m g m l 变为0 9 4 m g m l ，与胰蛋白酶作用后产物的i c 舯则增至3 1 9 m g m l ，活性有一定的损失，并经毛细管电泳肽谱图得到证实。 关键词：蛋黄蛋白质酶解血管紧张素转化酶降血压肽 s t u d yo nt h e e x t r a c t i o n o fa n t i h y p e r t e n s i v e p e p t i d e sf r o me g gy o l kp r o t e i n a b s t r a c t a n g i o t e m i n - i - c o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) j sb y d e f i n i t i o na s s o c i a t e dw i t ht h e r e n i n - a n g i o t e m i ns y s t e m , w h i c hr e g u l a t e sp e r i p h e r a lb l o o dp r e s s u r e t h ee n z y m ec a l l i n c r e a s eb l o o dp r e s s u r eb yc o n v e r t i n ga n g i o t e n s i nit ot h ep o t e n tv a s o c o n s t r i c t o r ，a n g i o t e n s i n i i ，a n dc a t a l y s et h ed e g r a d a t i o no fb r a d y k i n i na n de n k e p h a l i n s i n h i b i t i o no fa c em a y t h e r e f o r ee x e r ta l la n t i h y p e r t e n s i v ee f f e c ta n dp o t e n ts y n t h e t i ci n h i b i t o r so fa c ea r cu s e d e x t e n s i v e l yi nt h et r e a t m e n to f h y p e r t e n s i o ni nh u m a n s an u m b e ro f a c e - i n h i b i t o r yp e p t i d e s h a v eb e e ni s o l a t e da n dc h a r a c t e f i s e df r o mf o o d sa n dp r o t e i nh y d r o l y s a t e s ，f a c i l i t a t i n g i m p r o v e dt m d e r s t a n d i n go f t h e i rs t r u c t u r e - a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p a sat b wm a t e r a l s ，c h i c k e ne g gy o l kw a sd e g r e a s e da n dp u r i f i e db y s u p e r c f i t i c a l e x t r a c t i o no f c a r b e nd i o x i d ea n de t h a n 0 1 t h ee g gy o l kp r o t e i nw a so b t a i n e di np u r i t yo f 7 4 6 8 w t w h i c hw a s2 4w t h i g h e rt h a nt h a tb yt r a d i t i o n a lm e t h o d i tw a sm a n i f e s t e dt h a tt h e m a i nc o m p o n e n t si nt h ep r o t a i nw e r ec o m p o s e do fo v e l 3 5 k d a , 4 0 k d a , 6 7 k d aa n d1 0 0 k d a m o l e c u l e s t h ep r o d u c tp r o t e i nw a sh y d r o l y z e db y1 2t y p e so fp m t e a s ef o rp r e p a r i n g a n t i h y p c r t a n s i v ep e p t i d e sf o l l o w i n ga l k a l i n ed e p h o s p h o r y l a t i o n , r e s p e c t i v e l y i c 5 0o ft h e h y d r o l y s a t c sf o ra c e w a sd e t e r m i n e db yh i g hp e r f o m m c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i c ( h p l c ) t h es t a b i l i t ya g a i n s ta c ef o rs i xk i n d so f h y d r o l y t ew h i c hw e r eo fl o w e ri c 5 0v a l u e sa m o n g t w e l v ew e r ei n v e s t i g a t e df o l l o w i n gp r e i n c u b a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a t1 2t y p e so f h y d r o l y t eh a dt h ei n h i b i t i o ne f f e c tt oa c e 。f u o c i i c rm o r e ，t h ep r e i n c u b a t i o ne x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei c s 0v a l u e so f5k i n d so ft h eh y d r o l y t ch a d1 1 0e f f e c t0 1 i n c r e a s e d d e s p i t eo fp r e i n c u b a t i o n 、析血a c e a n dt h e yc a l lb er e g a r d e da si n h i b i t o ra n ds u b s t r a t et y p e t h eh y d r o l y t eo b t a i n e do n l yf r o mp r o t e a s els h o w e dt h a ti t si c 5 0v a l u e ( i c 5 0 = 0 5 9 n 垮m l 1 ) a g a i n s ta c ew a ss m a l l e rt h a nt h a tb e f o r ep r e i n c u b a t i o n ( i c s o = 1 1 9 m g m l “1a n dc o u l db e i l l r e g a r d e da sap r o d r u g - t y p ea c e i n h i b i t o r t h er e l a t i o nb e t w e g nd e g r e eo f h y d r o l y s i s o f h y d r o l y s a t ea n d i t si n h i b i t i o nf o ra c e w a sa l s oi n v e s t i g a t e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m a lt e c h n o l o g i cc o n d i t i o n sf o r h y d r o l y z i n ge g gy o l k sw e r e a s f o l l o w i n g ：h y d r o l y s i st i m ew a s3 0 0m i r gh y d r o l y s i s t e m p e r a t u r e4 5 c ，p h9 5 ，t h ec o n c e n t r a t eo fs u b s t r a t e ( 回6 0 9 几，a n dt h er a t i oo f 廿l z y n - l et o s u b s t r a t e ( e s ) o 4 2 9 k ga n dt h e nt h ed h , n i t r o g e ns o l u t i o ni n d e x ( n s i ) a n dt h ep e p t i d e c h a i nl e n g t h ( p c l ) w e r e1 7 2w t ，8 9 0 9 a n d6 5 ，r e s p e c t i v e l y f u r t h e r m o r e ，t h ek i n e t i c m o d e lf o r t h e d e h y d r a t i o n o f e g gy o l kp r o t e i n w a sc o n c l u d e da s r = ( 2 7 0 ：z 昂一0 4 1 2 5 s 0 ) e x p - 0 2 3 ( d h ) ，w h i c ht h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s t h eh y d r o l y t eo f e g gy o l kp r o t e i nw a sd e c o l o r e d 晰mt h ea c t i v ec a r b o na n dp u r i f i e d 诵t l l u l t r a f i i t r a t em e m b r a n ew h i c hc a l lb l o c kt h em o l e c u l e so f1 0ka n d3 5 艮r e s p e c t i v e l y t h e i n h i b i t i n ga b i l i t yo ft h eo b t a i n e dp r o d u c tt oa c e s h o w e da ne v i d e n ti n c r e a s e t h eh y d r o l y t e o fe g gy o l kp r o t e i nw i t hl e s st h a n3 5k d am o l e c u l ew a sa d s o r b t e db yad 6 1i o ne x c h a n g e r e s i n t h es u i t a b l es e p a r a t i o nc o n d i t i o n so fi o ne x c h a n g er e s i na d s o r p t i o nw e r e 勰f o l l o w i n g ： p h4 1 t h ec o n c e n t r a t i o no fs o d i u ma c e t a t eb u f f e ri n o 0 5m o f lp l u ss o d i u mc h l o r i d ei n 1 0 m o l l ，g r a d i e n tw a s h i n gw i t hs a m p l i n gi n2 5 m g m l ( w e tv o l u m e ) ，a n dw a s h i n gv e l o c i t y a t0 5 m l m i n a sr e s u l t s ，t h ey i e l da n da c t i v i t yo f t h ea i m e dp e p t i d ew e r e6 3 7 a n d7 3 5 9 ， r e s p e c t i v e l y t h ep e n e t r a t i o na n dd e s o r p t i o ns e c t i o n sf r o mi o ne x c h a n g es e p a r a t i o nw e r ef i l r t h e r p u r i f i e db ys e p h a d e xg 一1 5 t h eh i g h e s ta c t i v ec o m p o n e n ti nt h ep r o d u c tw a se n r i c h e da n d i d e n t f i e db yr p h p l ca n dh p c e t h ea c e is e q u e n c ew a sf i n a l l yt e s t i f i e da sl e u - t y r p r o b yt h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h ya n de l e c t r o ns p r a yn l a s ss p e c t r u m m f u n e t i o n a lt e s to f e g g y o l l 【p r o t e i nh y d r a t es h o w e dt h a ti tw a so f b e t t e rh e a ta n da c i d r e s i s t a n t , a n da l s oh o l d sb e t t e ra n t i o x i d a n ta b i l i t yi nac e t t a i nr a n g eo fm o l e c u l a rw e i g h t t h e i n t e r a c t i o nr e s u l t 谢t l lp e p s i nw o u l dc a u s ei t si c s 0c h a n g ef r o m1 1 9 m g m lt o0 9 4 m g m l b u t t h a t w i t hs t e a p s i n w o u l dc h a n g e i t s i c 5 0 f r o m1 1 9 m # m l t 0 3 1 9 m g r n l k e y w o r d s ：e g gy o l kp r o t e i n ，h y d r o l y z a t i o n ，a n g i o t e n s i v ei - c o n v e r t i n g e n z y m e ，a n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d e i v 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的 成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位 发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发 表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研 究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：绨嗽拗衔一明2 汨 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布 口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：涨导师签名：斗队认莎年l 朔日 u 璃j 奢黄叠白质制降皿u 五肽的研究 1 1 简述 第一章绪论 功能食品被称为二十一世纪的食品，其特有的功能就在于本身含有的活性成分对人 体生理节律的调节，以达到预防或辅助治疗疾病、促进健康的目的。近几十年来，随着 基因工程、细胞工程、酶工程等生物技术的飞速发展，使功能食品研究水平得到极大的 提高和加强，功能因子更加专一、有效。而功能因子即生物活性物质已成为研究的重要 热点，已确定的功能性食品基料中活性肽类已成为当今世界最具有活力的功能食品研究 和加工的新领域【“。 1 1 1 活性肽的概念与分类 活性肽是蛋白质中包含的一些特殊的碎片序列，从根本上对人的健康有积极的作 用，经口服后能影响身体的主要系统心血管系统、消化系统、免疫系统和神经系统， 活性肽的生理功能如图1 1 所示，它是具有清除自由基、提高机体免疫能力、延缓衰老、 降低血压等特殊功能的一类功能因子。 i垫皇堡! 苎堡卜_ l垫墨些塑堡卜_ 一 l垫皇笙堕堡卜- 1 血胆甾醇过少卜一j l类吗啡肽l i 煎垫造：堕：莛董选造：睦l 图1 - 1 活性肤的生理功能 f i g 1 - lp h y s i o l o g i c 枷f u n c t i o n a l i t yo f b i o a e t i v ep e p t i d e s 1 鞫一一 鸡蛋蛋，i 蕾白质制p 降柚u 玉朋。的研究 近年来，随着生物技术的迅猛发展，许多蛋白质的一级结构陆续得到揭密，同时， 生物技术在食品加工中的应用越来越广泛，大量具有生理功能的食品被发现，其中备受 瞩目的是存在于自然界中大量具有调节生理和代谢功能的生物活性多肽的发现。这些肽 在原蛋白质序列中并没有活性，当用体内肠道酶或体外酶作用蛋白质时，这些肽将从原 来的序列中释放出来，并表现出特殊的活性【2 捌。因此，在过去的几十年里，这些可减少 慢性疾病的危害和促进天然免疫力保护并存在于食品蛋白中的肽的潜能唤起了人们极 大的兴趣，依据这些肽具有的功能可将它们分为以下几类1 4 j ，具体分类见表1 1 。 表1 一i 生物活性肽的分类 f i g 1 1b i o a c t i v ep e p t i d e sc a t e g o r y 活性肽名称功能作用 类阿片肽 ( o p i o i dp e p t i d e s ) 免疫肽 ( i m m u _ n o p e p t i d e s ) 酪蛋白磷酸肽 ( c a s e i n p h o s p h o p e p t i d e s ，c p p s ) 抗血栓肽 ( a n t i t h r i m b o t i ep e p t i d e s ) 抗菌肽 ( a n t i m i c r o b i o lp e p t i d e s ) 血管紧张素转化酶抑制肽，降血压肽 ( a n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d e s ) 镇痛、止泻、抑制胃肠蠕动、增强机体对氨基酸 和其它营养物质吸收 增强机体免疫力、刺激淋巴细胞增殖，增强巨嗜 细胞的吞噬能力和机体对外界病原体的抵御，并 具有抗肿瘤功能 与矿质元素结合，充当许多矿质元素特别是c a 2 + 在体内运输的载体，促进人体对c a 2 + 和其它矿质 元素吸收 可抑制血纤维蛋白原与血小板表面的特异性受 体结合，具抗凝血和抑制血栓形成 在体外抑制细菌生长，而在体内又具有类似抗生 素活性，可抑制金黄色葡萄球菌 在体外具抑制血管紧张素转化酶活性，在体内具 c a 2 + 有降血压作用 这些生物活性肽具有原蛋白质或组成氨基酸所不具备的、独特的生理功能，它们的 活性主要取决于固有的氨基酸组成和序列，其组成一般由2 2 0 个氨基酸残基组成，很 多种类的活性肽展现出具多种活性功能的特点，而且许多活性肽的组成氨基酸并不是人 2 广西大掌博士学位论文 坞叠蛋 蛋白质制降皿u t 肽的研究 体必须氨基酸种类，这就为更好地利用蛋白质资源，特别对一些原来认为生物价效不高 的蛋白质资源提供了新的机遇和可能【5 】o 1 1 2 生物活性肽吸收机制的研究 蛋白质是构成动物机体的主要成分，在蛋白质营养研究中，氨基酸代谢一直是研究 的重点，对蛋白质的需要即是对氨基酸需要的理论一直指导着蛋白质的消化代谢研究与 生产实践。虽然早在1 0 0 多年前，人们已注意到了肽的吸收和运转，但蛋白质必须水解 成游离氨基酸后才能被吸收的观点，延误了对其它吸收方式的认识。a g a r 等首先观察到 肠道能完整地转运双甘肽，后来n e w e y 和s m i t h 提出了令人信服的肽可被完整转运的证 据，但肽类转运的生理意义，并未得到普遍认识【7 】。直n s o 年代，直接和间接的证据 不断积累，肽类能够被完整吸收的观点才被人们所重视。有关小肽这一吸收机制的发展， 既是对传统蛋白质理论的挑战，也是对其重要的补充，同时也对人类进一步开发蛋白质 资源和研究蛋白质新功能具有重要的指导意义。 小肽与氨基酸吸收机制完全不同，游离氨基酸的吸收存在着中性、酸性、碱性和亚 氨基酸四类转运系统，它们逆浓度转运的动力主要是依靠不同的n a + 泵，通过不同的继 发性主动重吸收系统而进行，是主动转运过程。而小肽的转运机制，目前还不十分清楚， 其转运系统可能有以下3 种：是依赖旷浓度或c a 2 + 浓度进行电导的主动转运过程，需 要消耗a t p ，这种转运方式在缺氧或添加代谢抑制剂的情况下被抑制；二是具有p h 依 赖性的h + n a + 交换转运体系，不消耗a t p ；三是谷胱甘肽( g s h ) 转运系统。由于谷胱甘 肽在生物膜内具有抗氧化的作用，因而g s h 转运系统可能具有特殊的生理意义，但目 前其机制尚不十分清楚【鄹。生物活性肽吸收机制有六大特点：( 1 ) 不需消化，直接吸收。 由于它表面有一层保护膜，不会受到人体的促酶、胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、消化酶及 酸碱物质二次水解，它以完整的形式直接进入小肠，被小肠所吸收，进入人体循环系统， 发挥其功能。( 2 ) 吸收特别快。吸收进入循环系统的时间，如同静脉针剂注射一样，快 速发挥作用。( 3 ) 它具有l00 吸收的特点。吸收时，没有任何废物及排泄物，能被人 体全部利用。( 4 ) 主动吸收，迫使吸收。( 5 ) 吸收时，不需耗费人体能量，不会增加胃 肠功能负担。( 6 ) 起载体作用。它可将人所食的各种营养物质运载输送到人体各细胞、组 织和器官。它是一个依赖旷浓度、c a 2 + 浓度、电导和耗能的独立过程。由于肽与氨基酸 吸收机制完全不同且相互独立，因此避免了二者之间的吸收竞争 9 1 。肽吸收的速度和效 率更高，这种吸收特性在人体生理活动中具有重要应用，如为一些特殊状况下的人群补 充营养，当人体由于疾病或其它因素对某种氨基酸不能很好的吸收时，可通过添加含有 广西大掌博士学位论文 j a l , - x - - i - 1 t - - i 白质，时鲁降皿u 啦的研究 此种氨基酸的寡肽来提供氨基酸，寡肽的这种吸收优势具有很大的潜在营养作用。 1 1 3 生物活性肽的作用与功能 生物活性肽存在于天然的动物组织、微生物、乳源蛋白和植物蛋白质的序列中，它 们可通过以下3 种方法从原来的蛋白质中释放产生：( 1 ) 利用体内消化酶水解；( 2 ) 利用 微生物酶水解；( 3 ) 利用动植物蛋白酶水解得到。目前研究较好的是利用体内消化酶水解 和蛋白质的发酵来生产生物活性肽，其中研究最多的乳源性生物活性肽【m 1 2 1 ，而乳源蛋 白中酪蛋白( c n ) 被认为是生物活性肽最重要和丰富的来源，且可通过蛋白水解和发酵得 到更多的活性肽1 1 3 4 5 1 ，部分食品蛋白质中的生物活性肽种类见表1 2 。 表卜2 部分食品蛋白质中的生物活性肽 t a b l e1 - 2s o m eb i o a c t i v ep e p t i d e sf r o mf o o dp r o t e i n 4 璃备j h t 蛋白质制4 1 - 降正u 五肽的司魄 以往人们认为食品蛋白质和肽对人体具有重要的作用，主要包括消化酶将其消化变 成营养物质在肠内被吸收，这是蛋白质通常的功能。但从表1 - 2 可看出许多生物活性肽 都隐藏在蛋白质中，一旦它们被释放出后在生命系统中即可发挥它们特殊的功能作用， 这些特殊的生理功能已经被动物和人体实验所证实，1 9 5 0 年m e l l a n d e r l 2 9 1 最早提出酪蛋白 磷酸肽( c p p s ) 能增强婴儿对v d 的吸收，以后更多的动物和人体实验研究证实牛奶制品、 发酵奶制品、酪蛋白中所含的c p p s 经口服后在人体的小肠末梢可被检测到，由于c p p s 能够固定和溶解矿质元素，一般认为它们具有抗骨质疏松、抗龋齿、抗高血压和预防贫 血等生理功能。动物研究实验结果也证明c p p s 对钙的吸收有一个促进作用【3 0 1 ，同时实验 研究证明口服c p p s 商品还可增强粘膜免疫力和促进牙齿珐琅的再钙化起到抗龋齿作用 3 1 3 2 1 。从奶制品水解获得的抗菌肽对革兰氏阴性菌和阳性菌均有较好的抗菌作用【3 玉3 4 ) ； 通过消化酶水解不同种类的酪蛋白得到阿片肽能够明显提高外周胰岛素和胃泌素的分 泌，对胰高血糖素的分泌也有促进作用；与肠丛阿片受体结合后，可经神经传导引起垂 体内源性阿片肽释放。也可以与中枢神经系统和肠肌丛中的阿片受体结合，抑制其兴奋， 并减少肾上腺皮质激素释放，从而影响胃肠运动。在体内( 主要脑中) 通过与中枢上“受体 高效特异结合而实现其介导麻醉、呼吸抑制、成瘾等作用 3 5 - 3 7 1 。乳蛋白经胃肠道的蛋白 酶水解后还能释放出免疫活性肽。j o l l e s 等首次报道用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可得到一 种短肽，它在体外试验中能增强小鼠腹腔巨噬细胞对羊红细胞的吞噬作用，静脉注射可 使小鼠抗肺炎克氏杆菌感染能力增强【3 8 1 。h a d d e n 等捌用研一g l y 和t y r g l y g l y 注 射9 3 位艾滋病综合征病人，发现2 肽或3 肽能显著地增强艾滋病病人的抗感染能力， 降低其死亡率。免疫活性肽发挥其生理功能的浓度极低，能够刺激机体自身淋巴细胞的 增殖、促进细胞因子的释放、增强机体巨噬细胞的吞噬能力，且不会引起机体的免疫排 斥反应。血管紧张素转化酶抑制肽( 降血压肽) 由于能够抑制肾素一血管系统中引起血 压升高的血管紧张素转化酶的活性，可起到降低血压的作用 4 0 - 4 2 1 。抗氧化肽则具有清除 自由基的活性，可抑制油脂中的过氧化物，因此可作为添加剂应用于油脂含量过高的食 品、化妆品和药品中【4 3 删。 在已发现的生物活性肽中，许多还具有多功能性，其中乳源性活性肽的多功能性是 研究得最多和最广泛的一类1 4 卯，活性肽具有多功能的原因是原料蛋白一级结构中含有具 有不同生物学功能的重叠序列，这些区域被称为“s t r a t e g i cz o n e ”网，例d c i l 的f ( 6 0 - - 7 0 ) 肽片断即是一个“s t r a t e g i cz o n e ”，它是含有免疫和降血压活性等不同生物学活力 的片段，n c n 的f ( 1 9 4 1 9 9 ) 也具有免疫和降血压活性，而p - o n , a - c n 中部分肽片断既是 g - 百大掌博士掌位论文 鸡蛋餐黄j 白质制j p 降且u 五肽的研究 降血肽又是c p p s 1 6 , 4 6 1 。 1 1 4 生物活性肽的生产方法 虽然生物活性肽的来源、功能和组成各不相同，但其生产方法却大致相同。国内外 生产生物活性肽常用到的生产方法主要有以下五种 4 7 - 4 9 1 ：( 1 ) 酶解法，( 2 ) 微生物发酵法， ( 3 ) 重组d n a 技术，( 4 ) 化学合成法，( 5 ) 酶合成法。不同的方法适合不同目标的产物，也 各有其优缺点。微生物发酵法的关键是要选取合适的微生物菌种进行发酵，在发酵的过 程中产生具有活性的肽序列，此法生产活性肽安全且易操作，但生产时间相对较长，乳 源蛋白活性肽的生产利用此法较多；重组d n a 技术目前也有广泛应用，仅限于大肽的生 产，合成短肽仍处于发展初期，而且其表达效率较低、产品提取和回收困难；化学合成 法目前主要广泛应用于生产高价值的中长活性肽，但在合成中可能会带来的环境和健康 方面的问题；酶合成法是以氨基酸衍生物为原料用各种酶来合成活性肽的方法，可在温 和的条件下进行，所用化学品及操作上的危险性相对较低，酶法合成肽是一种有效的、 广泛适用的方法，但在对高度专一性生物催化剂应用研究方面所做的工作相对较少，且 目前酶合成肽的方法仍然很单一；而酶解法生产生物活性肽有很多优点，因此该法应用 较为普遍，此法生产安全性高、能在温和的条件下进行定位水解分裂生产大量的短肽， 生产时间短，且水解过程易控制，价廉易于推广，因此生物活性肽的研究和生产主要采 用酶解的方法进行。 1 2 高血压的产生及血管紧张素酶在血压调节过程中的控制机制 1 2 1 高血压的产生及分类 高血压是对人类健康危害极大的一种疾病，按照世界卫生组织( w h o ) 国际高血压 学会( i s h ) 高血压防治指南和中国高血压防治指南 5 0 1 ，高血压最低限定义为：在1 8 岁以 上成年人，未服抗高血压药物的情况下，收缩玉, 1 4 0 m m h g 和舒张压猡0 m m h g 。医学上， 根据高血压的发病原因，将其分为原发性高血压和继发性高血压两大类1 5 1 1 。原发性高血 压是指发病原因不明的高血压，约占高血压病人的9 5 以上，大多数病人有家族遗传史。 继发性高血压是因全身性疾病引起的高血压，病因明确。最多见的是由肾脏疾病、内分 泌疾病引起，其次是脑部炎症、肿瘤、外伤引起的高血压。某些药物也可导致高血压， 如激素、避孕药、甘草浸膏等。 6 鸡蛋蛋， 蛋白质制j r 降皿l 匪肽的研究 高血压是引起心血管疾病的主要因素，与心血管疾病发生的危险性呈正相关，其主 要危害是造成脑、心、肾等重要器官的损害，脑卒中和冠心病是高血压最严重的并发症。 由于血压长期维持在较高的水平上，加重了心脏负荷，早期发生代偿性左心室肥厚，随 着病情发展心脏继续扩张，最后可能发生心力衰竭及严重心律失常；长期血压升高可促 进动脉粥样硬化的形成，尤其是冠状动脉硬化的发展，也可使小动脉硬化易于破裂出血 或痉挛而导致脑血栓的形成。肾脏入球和出球小动脉痉挛、硬化、退变导致肾脏缺血、 缺氧、肾实质纤维化，高血压晚期多伴有进行性肾功能减退，同时血压长期升高使得视 网膜动脉发生玻璃样变化【5 2 ，5 3 1 。因此防治高血压的目的，是最大限度降低心血管病的死 亡率和病残率。 1 2 2 血管紧张素酶在血压调解过程中的控制机制 血管紧张素转化酶( a c e ，e c3 4 1 5 1 ) 是一种存在于不同组织里的多功能胞外酶， 它在肾素一血管紧张素系统噼e m f l 螂o t e n s i ns y s t e m ，简称r a s ) 和激肽释放酶一激肽 系统( k a l l i k r e m k i n i n ，简称k k s ) 和免疫系统具有重要和关键的生理功能，具体过程见 图1 2 所斜划。 由图1 - 2 知，在人的生理过程中，血压的调节主要是受到r a s 即肾素一血管紧张素系 统和k k s 即激肽一激肽释放酶系统一对拮抗体系相互作用控制的。r a s 是升压系统，肾 素是一种蛋白水解酶，肾素的重要作用在于激活血管紧张素原，使其转为血管紧张素， 当肾素进入血液，血管紧张素原则在肾素水解下转变成血管紧张素i ( a n gd ，血管紧张 素i 在血管紧张素转化酶的作用下转为血管紧张素i i ( a n gi i ) ，血管紧张素是r a s 系 统中已知最强的血管收缩剂，具有刺激交感神经末梢释放儿茶酚胺，收缩血管，刺激醛 固酮分泌，促进心肌及血管平滑肌细胞增殖和肥厚、水盐代谢作用、增加心肌收缩力和 神经系统作用使血压升高。与此相反，k k s 则是降压系统，舒缓激肽原在舒缓激肽释放 酶作用下转变成舒缓激肽，舒缓激肽是一种降压物质，它能舒张毛细管增加其通透性， 使血压下降，激肽一激肽释放酶系统也受到a c e 的调控，即a c e 可使具有血管舒张作用 的舒缓激肽转变为没有活力的缓释肽，两个系统在a c e 的作用下，造成了人体内血压的 升高【5 5 5 6 1 。如果能够抑制a c e 的活性，就可以实现降压作用。而血管紧张素转化酶抑制 剂( a n g i o t e l l s i ni - c o n v e n i n ge n z y m ei n h i b i t o r , 简称a c e i ) 的作用就是抑制a c e 的活性，减 少血管紧张素i i 的生成和舒缓激肽的破坏，从而抑制血压升高达到降低血压的目的。 7 7 - - 西大掌博士学位论文_ 碡蕾量r j 白质御鲁降正u 匮肽的研究 r e n n i n - a n g i o t e n s j ns y s t e m ( 肾素一血管紧菘素系统。r a s ) a n g i o t e n s i n o g e n ( 血管紧张紊原) r e n i n ( 肾囊) k a l l i k r e i n - k i n i ns y s t e m ( 激肽释放酶一擞肚系统。k k s ) k i n i n o g e u ( 舒缓教肚原) k a i l i k r e i ni n c r e a s e d ( 激肮释放酶)l v a s o c o n s t r i c t i o na l d o s t e r o n es e c t i o rv a s o d i l a t a t i o n i ( 血管收缩)i ( 醛甾酮部分)i ( 血管扩张) l l i n c r 而s o dp e r i p h e r a li n c r e a s e dn a + a n dd e c r e a s e dp e r i p h e r a l v a s c u l a rr e s i s t a l i c ew a t e rr e t e n t i o nv a s c u l a rr e s i s t a n c e ( 增大外囝血管收缩阳力) ( 增大+ 和水保留)( 碱小井囝血管收缩阻力) i i n c r e a s e db l o o dp r e s s u r e ( 血压升高) d e c r e a s e db l o o dp r e s s u r e ( 血压降低) 血管紧张素原 a s p - a r g - v a i - t y r - l l e - h i s - p r o - p h e - h i s - l e u - l e a - v a i - t y r - s e r - r 血管紧张素ic a n gi ) a s p - a r g - v a l - t y r - l l e - h i s - p r o - p h e - h i s - l e u 血管紧张素i i ( a n gi i ) a s p - a r g - v a i - t y r - h e - h i s - p r o - p h e 图1 - 2 血管紧张素酶在血肾素一血管紧张素和激肽释放酶一激肽系统中的作用 f 培1 - 2r o l eo f a n g i o t 衄s i nc o n v e r t i n ge x l z f f f l e ( a c e ) i nb l o o dp r e s s u r e g u l a t i o nw i t h i nr a s a n dk s ss y s t e m 1 3 血管紧张素酶抑制剂的作用 血管紧张素转化酶抑制剂( a c e d 根据来源可分为天然和人工合成两大类，目前临 床上使用的二十几种a c e i 都是人工合成的。天然a c e i 主要来源于动物、植物、微生 物蛋白和蛇毒中，通过对天然a c e i 的结构和功能的研究，可为合成药用的a c e i 提供 一定的理论基础，具有很大的现实意义。 1 3 1 天然血管紧张素酶抑制剂 最早发现天然血管紧张素转化酶抑制齐u ( a c e i ) 是1 9 6 5 年f e r r e i r a 等5 7 j 研首次从美洲 茅头蝮蛇( b o t h r o p sj a r a r a c a ) 蛇毒中发现多种舒缓激肽增强肽( b r a d y k i n i np o t e n t i a t i n g p e p t i d e ，简称b p p ) ，并先后阐明了它们的结构。之后国内外陆续从不同种类的蛇毒中分 b 鸡蛋叠黄蛋白质御薯r 降且u 诽的研究 离出舒缓激肽增强肽，1 9 7 1 年k a t o 掣5 9 】从日本蝮蛇亚种( a g k i s t r o d o nh a l y sb l o m h o f f i i ) 蛇 毒中分离并鉴定了五种b p p 的结构；1 9 8 1 年我国何子安【删从浙江蝮蛇( a 然i s 廿0 d o nh a l y s p a i l s ) 蛇毒中分离得到1 1 肽的舒缓激肽增强肽：之后有研究者分别从江西蝮蛇 ( a g l d s t r o d o nh a l y sb r e v i c a u d u ss t e j n e g e r ) 、五步蛇、湖南烙铁头蛇毒( t r i m e r e s u r u s m u c r o s q u a m a t u s ) 、菜花烙铁头蛇( t r i m e r e s u r u s j e r d o n i i ) 等蛇毒中分离出舒缓激肤增强 肽 6 1 侧，这些生物活性肽结构特点为n 端都是环谷氨酸，c 端都是脯氨酸，链中脯氨酸 含量较高，且往往成双出现，它们具有能够增强舒缓激肽和抑制a c e 的生理效应，能阻 断血管紧张素i 向血管紧张素i