（分析化学专业论文）无机纳米材料、溶胶凝胶材料在电化学生物传感器中的研究.pdf

中田辩学技术大学博士学位论文 摘要 生物传感技术是一个由生物、化学、材料、医学、物理等多种学科相互渗透 形成的研究领域。生物传感器具有选择性高、分析速度快、操作简易和仪器价格 低廉等特点，在临床诊断、环境监测、食品工业等方面得到了高度重视和广泛应 用。开发稳定的、能够保持生物活性的固载材料来实现氧化还原蛋白质的直接电 化学是非常必要的。本论文以介孔材料、层状材料以及离子液体基溶胶凝胶材料 作为蛋白质载体构建了稳定性良好的电极，并对其性质及其在第三代生物传感器 的应用方面做了研究。具体内容如下： ( 1 ) 以层状钛酸盐剥离的二氧化钛片为重构层状材料的前体，基于带负电荷 的二氧化钛纳米片和电正电荷的m 口分子的静电组装，成功地构建了h r p 1 n s 酶电极。x r d 结果表明h r p 以单分子层的方式嵌入到二氧化钛层状结构中。嵌 入到二氧化钛层状结构中的h r p 不仅保持了自身的天然构像并且能够和电极之 间实现直接电子转移。此外，h r p - t n s 电极对h 2 0 2 表现出很好的催化性能，能 够检测2 1 x 1 0 4 到1 8 5 x 1 0 4 m 浓度范围内的h 2 0 2 。h r p t n s 电极具有很好的重 复性和稳定性。使用二氧化钛片作为蛋白质的载体构建生物传感器，为制备出 新颖的生物传感器提供了一种方法和途径。 ( 2 ) 基于前期使用二氧化钛片制备固载h r p 的层状材料并成功构建了第三 代生物传感器的研究，使用m b 与二氧化钛片进行组装，形成m b 嵌入的层状二 氧化钛的复合物( m b - t n sc o m p o s i t e ) 修饰电极。高分辨透射电镜和x 射线衍射实 验表明m b 是以单分子层形式嵌入到二氧化钛层状结构中的。紫外可见光谱和 红外光谱实验表明嵌入的m b 仍然保持了其天然构像。循环伏安技术研究了嵌 入在二氧化钛层状结构中的m b 在电极表面上的直接电子转移行为，并详细地讨 论了固载的m b 与电极表面电子转移的可能机理。相对于其他的m b 修饰电极， m b t n s 电极对过氧化氢的催化具有宽的浓度检测范围( 2 x 1 0 - 6 到1 6 x 1 0 4m ) ， 很低的检测限( o “的，很小的米氏常数( 1 3 7 肛m ) ，这些都说明m b - t n s 电极 对过氧化氢具有优良的电催化性能。层状材料对于固载于其中的生物分子具有 很好的保护作用，本论文使用电化学方法考察m b t n s 电极的稳定性( 热稳定性 和p h 稳定性) 。实验结果表明，m b - t n s 电极在p h2 2 的高酸性条件下仍然能 中田科学技术大掌博士学位论文 够实现对h 2 0 2 的电催化；m b - t n s 电极在8 5 的高温下加热2 0 分钟后仍然保 持了其9 2 的原始活性。 ( 3 ) 通过双孔径介孔硅( b m s ) 和壳聚糖杂化膜来固载l i b 成功构建了 h b b m s c s 电极。h b b m s c s 电极在除氧的p h7 0 的p b s 缓冲溶液中于0 3 2v ( v s a g a g c l ) 处表现出可逆的氧化还原峰，对应于血红蛋白中铁原子与电极表 面问的直接电子转移过程。相对于不存在b m s 的h 1 ) ，c s 电极，h b b m s c s 电 极对h 2 0 2 表现出更明显的直接电化学信号，这表明b m s 的存在能够促进h b 的 直接电子转移行为。此外，相对于不存在b m s 的h b c s 电极，h b b m s c s 电 极表现出更好的电化学催化性能，如宽检测范围，低检测限，高灵敏度。由 此，表明这与b m s 的双孔径结构有关，即b m s 大于h b 尺寸的大孔结构为h b 提供了高固载量和适宜的微环境，有利于多层h b 参与直接电子转移过程，同 时，b m s 小于l i b 尺寸的小孔结构为h 2 0 2 提供了“传输通道”，有利于h 2 0 2 在膜 内的扩散。 ( 4 ) 基于离子液体的独特性质和溶胶凝胶工艺的特点，将离子液体与溶胶凝 胶通过简单的物理混合，制备了物理包埋 b m i m b f 4 i 离子液体的溶胶凝胶修饰 电极( b m i m i b f 4 g e y a u ) ：通过【p m l m p f 6 】离子液体硅烷化试剂，将 p m i m p f 6 离子液体共价修饰到凝胶骨架上，制备了共价 p m i m p f 6 离子液体 基溶胶凝胶修饰电极( p m m t 田f 6 - 6 e v h b 6 c ) 。本论文分别对这两种离子液体基 溶胶凝胶修饰电极的电化学性质作了研究，发现相对于裸a u 电极，f e ( c n ) 6 3 在 b m i m b f 4 g e l a u 电极上峰位负移，并且在多圈扫描条件下，电极上有普鲁士 蓝生成：相对于裸g c 电极，f e ( c n ) 6 3 宅e p m i m p f d g e l g c 电极上的氧化还原 被明显的抑制了。使用循环伏安技术以及光谱技术，对 b m i m b f 4 g e l a u 、 p m i m p f 6 - g e l h b g c 电极表现出的电化学行为作了解释。此外本论文还尝 试了以共价 p m i m p f 6 基溶胶凝胶( b m t m 【p f 6 - g e l ) 为载体固定h b 构建了蛋白 质修饰电极，发现固载到 p m i m i 【p f d g e l 中的h b 能够在电极表面实现很好的直 接电子转移，并能够催化h 2 0 2 ，催化电流在l o 7 0r t m 范围内与h 2 0 2 浓度成正比。 从而为构建了第三代生物传感器提供了一个新的平台 中国科学技术大学博士学位论文 a b s t r a c t 1 1 把i m m o b i l i z e dp r o t e i ni ns u i t a b l em a 灯i 】【e sc o u l dr e a l i z er e l a t i v e l yf a s t e rd i r e c t e l e c t r o nt r a n s f e r s o ，g r e a te f f o r t sh a v eb e e nd e v o t e dt od e v e l o p i n gg e n e r a l ，s t a b l e m a t r i x e sf o rc a r r y i n ga c t i v ep r o t e i n si nd i r e c te l e c t r o c h e m i s t r ys t u d ya n dc o n s t r u c t i o n o f t h et h i r dg e n e r a t i o nb i o s e n s o r s t h eo b j e c t i v eo ft h i sd i s s e r t a t i o ni st oe x p l o r em e s o p o r o u ss i l i c a , i n o r g a n i c l a y e r e dm a t e r i a la n di o n i cl i q u i d sb a s e ds o l - g e lm a t e r i a lf o rf 零b r i c a t i o nt h et l l i r d g e n e r a t i o nb i o s e m o r m o r ed e t a i l sa r es u m m a r i z e db e l o w ： ( 1 ) i n t e r c a l a t i o n o fh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r e ) i n t ol a y e r e dt i t a n a t e b y a s s e m b l i n gi tw i t ht i t a n a t en & n o s h e e t s ( t n s ) w a sf i r s t l yu s e df o r f a b f i c a t i o no f e n z y m ee l e c t r o d e ( h r p 一 i n se l e c t r o d e ) x r dr e s n i tr e v e a l e dt h a th r p - t n sf i l m f e a t u r e do r d e r e dl a y e r e ds l n m 期l r e sw i t hh r pm o n o l a y e ri n t e r c a l a t e db e t w e e nt h e t i t s n a t el a y e r s u v - v i ss p e c t r ai n d i c a t e dt h e i n t e r c a l a t e di m pi nt n sf i l mw e l l r e t a i n e di t sn a t i v es t r u c t u r e 。t h eh r p t n sf i l mw a su n i f o r mw i t l lp o r o u ss t r u c t u r e w h i c hw a sc o n f i r m e db ys e m n 屺i m m o b i l i z e dh r pi nt h et n sf i l me x h i b i t e df a s t d i r e c te l e c t r o nt r a n s f e ra n ds h o w e dag o o de l e c t r o c a t a l y f i cp e r f o r m a n c et oh 2 0 2 、i t l l h i g i ls e n s i t i v i t y ，嘶d el i n e a rr a n g ea n dl o wd e t e c t i o n t h ee x c e l l e n te l e c t r o c h e m i c a l p e r f o r m a n c eo ft h eh r p - t n se l e c t r o d ew a sa t t r i b u t e dt ob i o c o m p a t i b i l i t yo ft h e t i t a n a t es h e e t s o r d e r e da n dp o r o u sa r c h i t e c t u r e so f t h eh r p - t n sf i l mw h i c hr e t a i n e d a c t i v i t yo fh r p t o l a r g ee x t e n t ，a v o i d e da g g r e g a t i o no fh r p ，p r o v i d e db e t t e rm a 嚣 t r a n s p o r ta n da l l o w e dm o r eh r pl o a d i n gp e ru n i ta r e a t h u s t h es i m p l em e t h o d d e s c r i b e dh e r ep r o v i d e dan o v e la n de f f e c t i v ep l a t f o r mf o ri m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e i nr e a l i z i n gd i r e c te l e c t r o c h e m i s t r ya n dh a dap r o m i s i n ga p p l i c a t i o ni nf a b d e a t i o no f t h et h i r d - g e n e r a t i o ne l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s ， ( 2 ) l a y e r e dt i t a n a t es h e e t s ( t n s ) a ss u p p o r tm a t r i x e sf o ri m m o b i l i z a t i o no f m y o g l o b i n w e r ef i r s t l yu s e dt of a b r i c a ：【et h ep r o t e i ne l e c t r o d et os t u d yt h ed k e c t e l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e nr e d o xc e n t e ro fp r o t e i na n dt h ee l e c t r o d ea n de s t a b l i s ha m o d e lo fm e d i a t o r - f r e e ( t h et h i r dg e n e r a t i o n ) b i o s e n s o r s t h eh r t e ma n dx - r a y d j f b 麓c d 伽p a t t e r nr e v e a l e dt h a tm b 一期v sf i l mf e a m r e do r d e r e dl a y e r e ds t r u c t u r e s w i t hm bm o n o l a y e ri n t e r c a l a t e db e t w e e nt i t a n a t el a y e r s u v v i sa n df t i r s p e c t r o s c o p ys h o w e dt h ei m m o b i l i z e dm bw e l lr e t a i n e di t sn a t i v e l i k es e c o n d a r y 中国科学技术大学博士学位论文 s t r u c t u r ei nt h ef i l m ap a i ro fw e l l - d e f i n e da n dn e a r l yr e v e r s i b l er e d o xc o u p l e sw i t h t h ea p p a r e n tf o r m a lp e a kp o t e n t i a la 劲o f - o 2 4v ( v s a g a g c l ) i np h5 4b u f f e r w e r eo b s e r v e da tt h em b t n se l e c t r o d e ，c h a r a c t e r i s t i co fm b f e i i i f e i lr e d o xc o u p l e t h ep o s s i b l er e a c t i o nm e c h a n i s mw a st h a tas i n g l ep r o t o nt r a n s f e rc o u p l e dt 0 r e v e r s i b l es i n g l ee l e c t r o nt r a n s f e ra n d ri o n si nt n sf i l mm i g h tt a k ep a r ti nt h e e l e c t r o nt r a n s f e rp r o c e s so fm b t h em b - 1 n se l e c t r o d ee x h i b i t e de l e c t r o c a t a l y t i c r e d u c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d ei nt h ew i d el i n e a rr a n g ef r o m2 x 1 0 4t o1 6 x 1 0 4m w i t hl o wd e t e c t i o nl i m i to fo 6 州a n dl o wa p p a r e n tm i c h a e l i s - m e n t o nc o n s t a n t ) o f1 3 7u m t h i se x c e l l e n tc a t a l y t i cp e r f o r m a n c eo ft h em b _ n 、se l e c t r o d ea t t r i b u t e d f r o mm a i n t a i n i n gm ba c t i v i t yt ol a r g ee x t e n ta n dp o r o u ss t r u c t u r eo fm b - t n sf i l mt o i n c r e a s et h ea c c e s s i b i l i t yt o w a r dt h es u b s t r a t e f u r t h e r m o r e ，d u et oc o m p a t i b l e m i e m - e n v i r o n m e n ta n dt h e p r o t e c t i v e e f f e c t p r o v i d e db yt h el a y e r e d t i t a n a t e n a n o - s h e e t s t h em b 田n se l e c t r o d ec o u l dw o r ki ne x t r e m ep hs t a t i o na sl o wa s2 2 a n de x h i b i te n h a n c e dt h e r m a ls t a b i l i t yt h a tt h ei m m o b i l i z e dm br e t a i n e d9 2 i n i t i a l a c t i v i t ya f t e ro v e r th e a t i n ga t8 5 f o r2 0r a i n ( 3 ) f i bm o d i f i e de l e c t r o d ew a ss u c c e s s f u l l yf a b r i c a t e d t or e a l i z ed i r e c t e l e c t r o c h e m i s t r yb yi m m o b i l i z i n go fl i bi nb i m o d a lm e s o p o r o u ss i l i c a ( b m s ) a n d c h i t o s a n ( c s ) i n o r g a n i c - o r g a n i ch y b r i df i l m h e r e ，b m sa c t e d a sas u p p o r tt o i m m o b i l i z eh bd u et oi t sl a r g ep o r e sa n dc h i t o s a na c t e da sab i n d e rt oi n c r e a s ef i l m a d h e r e n c ea n ds t a b i l i z e rt o p r e v e n tt h el e a k a g eo fm t h er e s u l t i n g e l e c t r o d e ( h b b m s c s ) g a v eaw e l ld e f i n e d , r e v e r s i b l er e d o xc o u p l ef b rh b f e i l l f e l lw i t ha f o r m a lp o t e n t i a lo fa b o u t - o 3 2v ( v s a g a g c l ) i np h7 0p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n i b ，b m s ，c se l e c t r o d es h o w e dab e t t e re l e c t r o c a t a l y t i a lp e r f o r m a n c et oh 2 0 2w i t h w i d e rl i n e a rd e t e c t i r a n g e 1 0 w e rd e t e c t i o nl i m i t , a n dh i g h e rs e n s i t i v i t yt h a nt h a ta t e l e c t r o d ew i t h o u tb m s t h ei m p r o v e de l e e t r o c a t a l y t i cp e r f o r m a n c ef o rh b b m s c s e l e c t r o d ew a sp o s s i b l yc o n t r i b u t e dt ob m sb i m o d a ls t l u e t u l ，w h o s el a r g ep o r e sw i t h 1 0 - 4 0n mp r o v i d ef a v o r a b l ec o n d i t i o n sf o rp r o t e i ni m m o b i l i z a t i o na n ds m a l lp o r e s w i t h2 - 3n l na v o i dt h em a s s t r a n s f e rl i m i t a t i o n s i na d d i t i o n , u v - v i sa n df 1 1 r s p e c t r ai n d i c a t e dt h a th bw e l lm a i n t a i n e di t sn a t i v es t r u c t u r ei nt h eh y b r i df i l m ( 4 ) i o n i cl i q u i d o f 0 3 m i m 【b f d b a s e d s o l - g e l m o d i f i e de l e c t r o d e ( 0 3 m i m 0 3 f 4 o e l a ue l e c t r o d e ) w a sp r e p a r e db yi m m o b i l i z a t i o no f 田m i m 0 3 f 4 i n t os i l i c as o l g e lm a t r i xo nt h es u r f a c eo fa ue l e c t r o d ev i aa s i m p l es o l - g e lm e t h o d t a k i n ga d v a n t a g eo fi o ne x c h a n g er e a c t i o nb e t w e e n b m i m 0 3 f 4 】a n dk 3 f e ( c n ) 6 ， i v 中国科学技术大学博士学位论文 f e ( a 叼6 j 。w a se n t r a p p e di n t ot h es o l - g e lm a t r i xw h e n 【b m i m 【b f 4 g e l a ue l e c t r o d e w a si m m e r s e di nk 3 f e ( c n ) 6s o l u t i o n f o l l o w i n gb yc o n t i n u o u s l ys c a n s ，t h ec y c l i c v o l t a m m o g r a m so ft h em s l l l t i n g b m i m 3 f e ( c n ) 6 g e l a ue l e c t r o d ei nk 3 f e ( c n ) 6 s o l u t i o nb e h a v e d “p b ( p r u s s i a nb l u e ) - g r o w i n gp a t t e r n f t i r , e l e m e n t a la n a l y s i sa n d u v v i sa b s o r b a n c es p e c t r ar e s u l t sm a n i f e s t e dt h ef o r m a t i o no fp bi nt h es o l - g e l m a t r i x f u r t h e r m o r e ，t h ef o r m a t i o nm e c h a n i s m , k i n e t i c sa n ds t a b i l i t yo ft h e p b g e l 膳me l e c t r o d ef o r m e db yt h i sm e t h o dw e r ed i s c u s s e d i na d d i t i o n , s o l - g e lc o v a l e n t l ym o d i f i e dw i t h p m i m 【p f 6 】雒s u p p o r tf o rf r o ( t h e m s r i n gc o m p o s i t en o t e d a so m r q p f d - g e l h b ) w a sc o n s t r u c t e dt h et h i r d b i o s e n s o r u v - v i ss p e c t r ai n d i c a t e dt h a th bw e l lm a i n t a i n e di t sn a t i v es t r u c t u r ei n p m i m p f 6 一g e l h bc o m p o s i t e i m m o b i l i z e dh ba tt h er e s u l a n ge l e c t r o d eg a v ea w e l ld e f i n e d , r e v e r s i b l er e d o xc o u p l ef o rh b f e l 聊c w i t haf o r m a lp o t e n t i a lo fa b o u t 0 3 2v ( v s a g a g c l ) i np n7 0p b ss o l u t i o n t h e p m i m p f 6 - g e l h be l e c t r o d e e x h i b i t e de l e c t r o c a t a l y t i cr e d u c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d ei nt h el i n e a rr a n g ef r o m 1 0 x l o ot o7 0 x l 旷m t h e p m n v q p f 6 】_ g e lc o m p o s i t ep r o v i d e san e wp l a t f o r mt o c o n s t r u c tt h et h i r db i o s e n s o r v 中国科学技术大学博士学位论文 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 逑型釜日期：卫2 ) ：生：拍 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解中国科技大学有关保留和使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中 国科技大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅：学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名：弦立金日期：迎 ：兰：! 导师签名：淞日期：j 壁斗出 中国科学技术大学博士学位论文第一章 第一章电化学生物传感器概述 1 1 引言 随着生产力的发展，在工农业生产、环境保护、临床检验以及食品工业等领 域，每时每刻都有大量的样品需要分析和检验，而且往往要求在很短的时间内完成 样品检测，有的甚至要求在线或活体内直接检测。生物传感器作为直接或间接检测 生物分子、生理或生化过程相关参数的分析器件，由于具有灵敏度高、选择性好、 响应快、操作简便、样品需要量少、可微型化、价格低廉、可以实现连续在位检测 等特点，在生物医学、环境监测、食品医药工业等领域展现出十分广阔的应用前景 【1 1 。 生物传感器( b i o s e n s o r ) 以生物活性物质( 如酶，抗体，核酸，细胞等) 为生物敏 感基元，通过信号转换器将生物化学信号转化为相应物理化学信号从而实现检测目 的。其中以生物活性物质为敏感基元，以电化学电极为信号转换器，以电势、电流 或电容为特征检测信号的生物传感器称为电化学生物传感器( e l e c u o c h e m i c a l b i o s e n s o r ) ，也称为生物电极嘲按测量信号不同，电化学生物传感器可分为电流 型、电位型、电导型和电容型3 1 根据历届世界生物传感器学术大会发表论文的分 类统计，可以看到关于电化学生物传感器的论文占据很大比例，曾经达到7 0 ， 现在的比例仍然在3 0 【4 l ，此外，因电化学生物传感器具有灵敏度高，易微型化， 能在复杂体系样品中进行检测等优势，并且所需的仪器简单、便宜，电化学生物传 感器在商业化应用领域中也处于重要地位，已被广泛应用于医疗保健、食品工业、 农业、环境等领鲥5 。 1 2 电化学生物传感器的三个发展阶段 电化学生物传感器是最早问世的生物传感器2 0 世纪6 0 年代，c l a r k 和l y o n s 首先提出使用含酶的膜将尿或葡萄糖转变为产物，使用p h 或氧电极来检测的设想 中国科学技术大学博士学位论文 第一章 隅1 ；在1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s 把含有葡萄糖氧化酶的聚丙烯酰胺凝胶膜固定到氧 电极上制备了第一支葡萄糖传感器，开创了生物传感器的历史【9 】。此后，随着生 物、化学、物理学、医学、电子技术等相关学科的迅速发展，各种类型的生物传感 器相继出现：1 9 7 2 年。y e l l o ws p r i n g s 仪器公司制造出第一个商业化的用于血糖和 尿糖检测的生物传感器，之后l e e d s ，n o r t h r o p 和b e c k m a n 仪器公司也相继推出用 于血糖和尿糖检测的电化学传感器。自2 0 世纪8 0 年代以来，由于生物技术与传感 技术的提高与应用，带动了生物传感器的发展，使之成为国际上广泛研究的重要课 题。 按照酶分子与电极间电子传递的机理不同，电化学生物传感器大致经历了三个 发展阶剐1 , 1 0 ： 以氧为电子传递体来沟通酶的电活性中心与电极之间的电子通道，实现电催化 的生物传感器为第一代电化学生物传感器，其工作原理如图l - l 所示。 底物 厂 、 e 一 电极 3 一g e n e r a n t i o n ro 拥2 0 2 l m tg e n e r a t i o n m o x m r e d l 1 a r t i f i e a lm e d i a t o r2 “g e n e r a t i o n 图1 - 1 酶与电极之间的电子转移过程示意图 此类生物传感器通过检测反应物( 0 2 ) 的消耗或产物( h 2 0 2 ) 的增加来反映被测物 的浓度变化。由于溶解氧的消耗量受氧分压的影响，这给准确定量检测带来困难。 此外，检测1 4 2 0 2 般在较高的电位( + o 6 + o 8v ，v 5 a g a g c i ) 下进行，这使得生物 样品中经常同时存在的具有较低氧化电位的抗坏血酸、尿酸等活性物质容易对检测 产生严重干扰，所以严重影响了第一代电化学生物传感器的广泛应用。 2 中国科学技术大学博士学位论文第一章 以小分子电子媒介体代替氧来沟通酶的电活性中心与电极之间的电子通道，通 过检测媒介体在电极上被氧化的电流变化来测量底物浓度的变化，由此为基础构建 了第二代电化学生物传感器。电子媒介体( m e d i a t o r ) 是指承担着使生物活性物质的 活性中心再生任务，其本身则被还原，在给定电位下，能在电极上再次氧化的有机 分子，如亚甲基蓝，硫堇、巯基乙酸，四甲基联苯胺或二茂铁等。一般电子媒介体 都具有良好的氧化还原可逆性和较低的式量电位，较氧更容易被还原态的生物活性 物质的电活性中心所还原，而它自身则又可在电极上再次被氧化。在安培酶电极的 响应过程中，酶( e ) 的活性中心与底物发生化学反应，并通过电子媒介体实现酶电 活性中心与电极之间的电子传递，最后的结果是底物被氧化而使电极上有电子输 出，并在外电路产生电流路产生电流。在一定的条件下，该电流c r o p 输出电子的速 率) 与底物浓度成线性关系，基于此可对底物进行定量检测。酶蛋白在其中所起的 作用主要在于提供选择性的催化其工作机制如图1 1 所示这种传感器降低了检 测电位，已成功开发出性能优良的产品，但是使用介体存在着着电极制作复杂、介 体污染电极、测量电位比较正，电活性物质干扰测定等问题【1 1 1 。 1 9 7 8 年俄国科学家发现在分子氧存在下漆酶( i a c c a s e ) “】和过氧化物酶 ( p e r o x i d a s e ) 1 3 】可以实现直接电子转移。此后，其它蛋白质及酶的直接电化学从不 同角度得到广泛的研究。这种不需要电子媒介体的存在，利用生物功能物质与电极 问的直接电子转移即直接电化学，实现生物分子的直接电催化，由此构建的生物传 感器为第三代电化学生物传感器，其工作原理如图1 1 所示。 前两代电化学生物传感器均属于间接电催化，其最大缺点是必须借助电子媒介 体，因此使传感器结构复杂并在其使用上具有较大局限性。而基于氧化还原蛋白质 在电极上直接电子转移的第三代电化学生物传感器却很好的克服了这些缺点，成为 当前电化学生物传感器的研究新方向，它不但在了解生物氧化还原过程的动力学和 热力学，探索生命体内生理作用机制等理论研究方面具有重要意义，而且在选择 性、灵敏度和测量范围等性能方面也都比前两代电化学生物传感器有新的突破。 1 3 氧化还原蛋白质的直接电化学 中国科学技术大学博士学位论文 第一章 1 3 1 常用的氧化还原蛋白质简介 蛋白质和酶等生物大分子是构成生命的主要基元，参与完成生命体中的新陈代 谢等许多生理过程，同时在这些生命过程中很多蛋白质和酶都要经历电子转移过 程，在其氧化型和还原型之间相互转化。酶是一种具有生物活性的蛋白质，很多酶 在生命体内都担负着电子转移的作用，因此属于氧化还原蛋白质。在生命活动过程 中，无论是能量转换、神经传导、光合作用、呼吸过程，还是大脑的思维、基因的 传递，都与电子传递密切相关。电子传递在生命过程中是普遍存在的，而且是生命 过程中的基本运动。从某种意义上讲，研究生命过程实质上就是研究生物体中的电 子传递过程【1 4 】。电化学方法适合于研究此类生物大分子的电子迁移反应，因此氧 化还原蛋白质的电化学研究应运而生。 氧化还原蛋白质的直接电化学发展，促进人们迸一步去探讨氧化还原蛋白质的 直接电子转移行为，同时也为第三代生物传感器的研制提供了基础，为用电化学手 段探索生物体系的奥秘打开了大门。一方面，氧化还原蛋白质与电极之间直接电子 传递过程更接近生物氧化还原的原始模型，用电极充当电子的给予体或接受体，可 以模拟生物体系电子传递机理和代谢过程，测定热力学和动力学参数，这对了解生 命体内的能量转换和物质代谢，了解生物分子的结构和各种物理化学性质，探索生 命体内生理作用以及作用机制具有重要的意义此外基于酶氧化还原活性中心与电 极之间的电子传递，在电化学生物传感器中起着关键性的作用，因此研究氧化还原 蛋白质在电极上直接电子转移，利用电极取代氧化还原蛋白质的电子媒介体，这为 开发第三代生物传感器提供了新的思路，含有功能蛋白质的电极材料在生物传感器 和生物催化方面展现了良好的应用前景。 目前，氧化还原蛋白质的直接电化学研究仍只局限于一些结构和功能比较清楚 的氧化还原蛋白质。在氧化还原蛋白质中，有相当一部分属于血红素蛋白质。血红 索蛋白质是一类含有辅基血红素的蛋白质。血红素( h e m e ) l 扫原卟啉i x 与f e 组成， 是一种可以以多重氧化态或还原态存在的分子，其结构如图1 2 所示。 4 中国科学技术大学博士学位论文第一章 o r h o c c h 譬h l c h l c h = i c o h _ o 图1 2 血红素的结构示意图 一c 细胞色素c ( c y tc ) 、肌红蛋白( m b ) 、血红蛋白0 - i b ) ，过氧化氢酶( c a t a i a ) 、辣根过 氧化酶0 - i r r ) 等蛋白质都含有血红素活性中心。本论文主要以m b 、h b 、h r p 为模 型分子，研究了它们在特殊材料修饰电极中的直接电化学。下面简单介绍一下这几 种血红素蛋白质： 1 3 1 1 血红蛋白( i i b ) 血红蛋白在高等生物体内负责运载氧。它是由两条a 链和两条1 3 链相互结合而 成的四聚体，每个多肽链称为一个亚基，每个亚基包含一个环状血红素，故一个 h b 分子内共包括有4 个血红素辅基。这些血红素辅基分别位于血红蛋白的各个亚 基的裂隙空穴中。f i b 的4 个亚基相互排列紧密，形成近似球形的分子。h b 的分子 量约为6 6 ，0 0 0 ，等电点为7 4 1 1 5 1 ，分子大小为5 0 x 5 5 x 6 5 哪【1 6 1 。h b 的亚基与m b 具有非常类似的结构，每个血红素卧啉环中心的铁原子有6 个配位键，其中4 个键 与卟啉环上的n 配位，形成一个平面，另外离血红素平面较近的一个组氨酸残基中 的咪唑氮与血红素的铁原子形成一个轴向配位键，故通常血红素铁原子可形成5 个 配位键，此时它的直径较大，不能全部嵌入卟啉平面。当l i b 血红素铁原子的第6 配位与氧结合后，其直径缩小，落入卟啉环平面内。即伴随着h b 分子与氧的结 中国科学技术大学博士学位论文 第一章 合，h b 的构像也发生了相应的变化。i - - i b 的这种“变构现象”是调节其功能活动的极 为有效的方式。 由于h b 的每个亚基与m b 在三级结构的排列上极为相似，所以它们在功能上 也很相似。如。它们都能进行可逆的氧合作用，都能催化过氧化氢。但是l i b 是一 个四聚体，它的整个结构要比m b 复杂的多，因此具有一些m b 所没有的功能，如 l i b 除了能够运载氧外，还能运输付和c 0 2 。 1 3 1 2 肌红蛋白( m b ) 肌红蛋( m y o g l o b i n ，m b ) 位于肌肉的肌细胞中，其功能主要是储氧和载氧。 m b 是一条多肽链和一个血红素辅基构成的单链蛋白质，其分子量约为1 7 ，8 0 0 ，等 电点6 8 t r n ，分子大小为2 5 x 3 5 x 4 5n m 1 s l 。蛋白质的肽链盘绕成一个球状结构，x 射线衍射研究表明，m b 中的多肽链7 0 是以0 【螺旋形式存在的。链中极性的氨基 酸残基几乎全部分布在分子表面，使m b 具有水溶性；而非极性的氨基酸残基分布 在分子内部，使内部成一个疏水空腔，血红素几乎整个包埋在这个空穴中。血红素 卟啉环中心的铁原子有6 格配位键，其中4 个键与卟啉环上的n 配位，形成一个平 面，第5 轴向配位键与肽链的组氨酸咪唑氮相联，第6 轴向配位键或者空着，或者 结合氧。故m b 的重要生理功能之一是储存和运载分子氧。在水环境中，游离的血 红素中的铁通常很容易被氧化为f e m ，但血红素f e “没有氧合能力。而m b 由于为 血红素提供了一个疏水空腔，避免了f c l l 被氧化为f d “，从而保证了血红素的氧合 能力。此外，第6 配位键还能与h 2 0 ，n 0 2 - ，o h ，f ，c n ，n ，h 2 s ，c o ，n o 等离子或分子配位。 血红蛋白包含在血液的红血细胞中，肌红蛋白位于肌肉的