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基因治疗,杨丽萍,北京大学眼科中心北京大学第三医院2018.12,2,目录,第二部分基因治疗载体选择,第一部分基因治疗概述,第三部分基因治疗的发展历程,第四部分临床基因治疗,一、基因治疗概述,1993年FDA定义：基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预包括以下两方面：患者体内分离细胞，进行体外修饰，随后再注入患者体内基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞发生遗传学改变,黑色箭头所示：从患者体内分离细胞，在实验室中修饰后回输给患者（回体基因治疗）灰色箭头所示：细胞在患者体内进行修饰（体内基因治疗）,基因治疗特点,普通的医疗方法对绝大多数遗传病都束手无策，即使治疗也是治标不治本；基因治疗在基因水平上进行操作，能从源头上解决疾病的发生。目前在没有治疗方法或疗效不佳的领域基因治疗将大有作为基因治疗属新兴的治疗技术，技术更迭速度很快目前所有的基因治疗均为体细胞治疗，生殖细胞基因治疗会产生永久的可传递的修饰，由于伦理原因而被禁止,基因治疗方式,基因添加或替代：提供缺陷基因的一个有功能的拷贝基因沉默：沉默功能获得性突变基因编辑：特定靶点的定向修饰,基因治疗三因素,确诊致病基因基因治疗载体构建：替代、沉默、编辑？合适的基因转移载体,二、基因治疗载体,病毒载体：高效性（最常用）反转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、慢病毒等非病毒载体脂质体、直接注射或微粒轰击、受体介导内吞等,没有一个基因转移体系是完美的，每一种都有它的优点和局限性,反转录病毒（RV）,含有反转录酶的RNA病毒，能够合成其基因组的一个cDNA拷贝。反转录病毒释放核蛋白复合体至受感染细胞的细胞质中，此复合体反转录病毒RNA基因组，并随后将产生的cDNA整合到宿主细胞一条染色体的单一随机位点。优点：能高效感染宿主细胞；整合入染色体随细胞分裂传代缺点：随机整合导致成瘤风险；转染分裂期细胞；8kb,反转录病毒含三个转录单位，还有一个顺式作用元件，在载体中，三个转录单位被治疗基因替代，最大克隆的容量是8kb。重组体在特定细胞中包装，该细胞可提供必需的三个转录单位，但不含完整的反转录病毒基因组。,腺病毒（AV）,双链DNA病毒，线性双链DNA基因组在细胞核内作为附加体存在而不整合优点：能高效感染分裂期和非分裂期细胞；35kb；非整合减少插入突变缺点：表达时间短（2-4w），用于基因高水平的瞬时表达；有免疫原性,腺病毒相关病毒（AAV）,非致病性单链DNA病毒，依赖于腺病毒或疱疹辅助病毒共同感染后才能复制；未修饰的AAV在19q的特定位点整合至染色体DNA，提供长效表达但无插入诱变风险优点：感染分裂期和非分裂期细胞；免疫反应小缺点：4.5kb单基因遗传病基因治疗领域广泛应用,ITR为末端重复序列，也是病毒复制和包装唯一需要的顺式作用元件。在载体中，两个转录单位被治疗基因替代,慢病毒（LV）,应用于非分裂细胞的反转录病毒，随机整合入宿主染色体，可供基因长效表达。人类免疫缺陷病毒（HIV）是大多数慢病毒载体的基础优点：多种非分裂细胞进行高效的转染和长期稳定表达缺点：随机整合成瘤风险慢病毒载体逐渐成为基因治疗领域的新生力量,首先将转移质粒、包装质粒和包膜蛋白质粒转染到293T细胞。更换新鲜的培养基后，继续培养4872小时。收集培养液，进行离心浓缩后，就可得到转导细胞级别的病毒颗粒。,脂质体,脂质体是当某一脂类混于水溶液时自发形成的人造囊泡。DNA在体外由脂质体包装并被转移，直接用于转移至靶细胞优点：容易制备，对转移DNA大小无限制缺点：转移效率低；导入DNA不整合入染色体，瞬时转染,DNA被转运到带负电荷的脂质体的内部或结合到带正电荷的脂质体的表面当脂质体与细胞质膜融合时DNA转移就发生了阳离子脂质体是最常用的,裸基因直接注射,DNA可以用注射器或针头直接注射到靶组织缺点：转染效率低1991年裸基因注射治疗DMD动物实验，注射的DNA可持续表达几个月可应用于疫苗，把致病微生物的蛋白质基因整合于质粒载体中，注射机体后会产生蛋白质作为免疫原，诱导机体免疫反应以治疗感染性疾病。,基因枪注射,DNA由金属颗粒包装后由特殊的枪发射到细胞中优点：简单、安全缺点：转染效率低,三、基因治疗的发展历程,1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋的结构模型，是分子生物学划时代意义的伟大事件，从此生命科学的研究进入到了分子水平。1960，Nirenberg和Khoran等人相继破解了遗传密码，揭示了从DNA到蛋白质的阅读方式为三个碱基组成的三联体对应一种氨基酸，为我们打开了解人类基因奥秘的大门。半个世纪以来，分子生物以空前的速度迅猛发展，极大的推动了基因工程技术和基因治疗的发展。,第一次基因治疗人体实验,1990年9月14日，NIH的Blease教授和Culver教授等人，为一位4岁女性腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症患者进行人类历史上的首次基因治疗。ADA缺陷为常染色体隐性遗传，ADA缺乏可使T淋巴细胞因代谢产物的累积而死亡，从而导致严重的联合性免疫缺陷症（SCID）。通常婴儿出生几个月后死亡。,患者体内取出的缺陷T淋巴细胞,反转录病毒改造的ADA基因,改造后的正常T细胞,人体,4个月内重复治疗4次，患者抵抗力大大增强。尽管该疗法是否真正意义上获得成功还有争议，但是该临床试验是基因治疗历史上重要的里程碑。这是人类历史上第一个基因治疗案例。从这一年起，全世界掀起了基因治疗研究的热潮。,首例基因治疗死亡病例,18岁的Gelsinger成为第一例基因治疗死亡病例（1999年9月17日）。患者患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷，1999年在宾西法尼亚大学接受以编码OTC基因的腺病毒基因治疗。为获得足够的有功能的基因，通过肝动脉注射了大剂量的病毒载体。注射后几小时患者体温升高达摄氏40.7，第二天出现昏迷。透析治疗并使用呼吸机，但肺泡腔仍充满液体，血氧浓度降低，注射后4天不幸死亡。,项目负责人宾西法尼亚大学的Wilson教授3个月后解释说：尽管给患者注射的病毒载体剂量很大，但到达肝细胞不会大于1%。他回顾了以往对动物和人进行的研究资料，认为使用的病毒剂量虽然比较大，但并未达到致死剂量。患者骨髓红系造血极度衰竭，可能合并有其他的遗传疾病，或者同时伴有微小病毒的感染，二者都会触发很强的免疫反应。,德国研究者将与腺病毒具有相同蛋白质外壳的病毒加入18个人类血样中，触发了强烈的补体系统的反应。认为Gelsinger的剂量会提高补体浓度并触发免疫反应。患者之前曾经有胸部感染，补体系统可能已经致敏，病毒蛋白可在血循环里与抗体结合，形成复合物，激活补体，引起肝脏，肺和肾脏的血管壁的炎性反应，导致多器官衰竭。,Gelsinger去世是基因治疗临床研究开展10年来最无情的打击。美国FDA取消了Wilson从事任何临床实验的资格，这是对研究者最严厉的惩罚。FDA还停止了宾西法尼亚大学研究所的所有基因治疗临床实验，包括对肺间皮瘤、黑色素瘤、乳腺癌、囊性纤维化、肌营养不良、神经胶质瘤的治疗。,X-连锁SCID（BubbleBoy）,IL-2R基因缺陷所致，占SCID（重症联合免疫缺陷病)总患者80%.,小男孩叫大卫威特（1971-1984），自出生时便患有SCID，他的体内没有任何免疫系统，没有任何抵御细菌、病毒的能力。所以他出世20秒后，即住进了一个塑料隔离泡泡里。,接受骨髓移植后4个月，因供体的病毒感染导致癌症去世。,2000年4月，法国巴黎的MarinaCavazzana-Calvo博士及其同事用反转录病毒回体基因治疗方法对11例X-连锁SCID(重症联合免疫缺陷)患者进行治疗。,9例治愈，能过正常的生活。这一成果获得了广泛的赞誉，被称为基因治疗领域十年来首次明确的成功。,不幸发生,治疗的11例患儿里，最初发现一名患儿的T细胞数显著增加，而且是单克隆增生。后被确诊为T细胞白血病，检查发现Moloney逆转录病毒载体插入了11号染色体LMO2基因的编码区，此基因的产物是血细胞早期发育所必须的。,UsinganewPCR-basedtechnique,ChristofVonKalleofCincinnatiChildrensHospital(andformallyattheUniversityofFreiburgMedicalCenter)discoveredthattheretroviralvectorusedintheFrenchtrialhadinsertedintomorethan40sitesinthegenomeofdifferentrepopulatingcells.IntheT-cellclonethatgrewabnormally,thevectorhadinsertedintheLMO-2oncogeneonchromosome11ageneoriginallyidentifiedasabreakpointofatranslocationthatcausesatypeofT-cellleukemia.Theretrovirusinsertionappearedtohavecausedincreasedexpressionofthegene.,全世界对这不幸的孩子给予了极大的关注，虽然已经有了不利于基因治疗的证据，但是人们仍然愿意相信这与基因治疗无关。4个月后，该小组发生了第二例白血病。病毒载体插入了同一位置。这个孩子也发生了染色体核型的改变，出现了SIL-TAL1融合基因。2003年2月发现了第三例患儿，虽然还没有发生白血病，但是病毒载体的整合位点与前两例相同。,在基因治疗刚刚起步的时候，人们就知道逆转录病毒会随机地整合于宿主细胞的任意位置，有可能带来意料之外的后果，但是这一直被认为是理论上的风险。现在看来过去对逆转录病毒将随机整合的认识是不确切的，这种整合至少具有一定的倾向性。所有涉及反转录病毒转染大量淋巴细胞的实验在全世界范围内迅速被搁置起来。,这两起病人恶性事件极大的打击了基因治疗的发展，造成了基因治疗最为黑暗的10年。有些科学家也对基因治疗开展的过快表示担忧，并呼吁基因治疗需要“重回实验室”。基因治疗并非最初所设想的那么容易，基因载体转染效率太低、不恰当的基因整合，以及外源基因引起的免疫反应一直困扰着这一领域的发展。认识到瓶颈所在，找出解决问题的途径，基因治疗仍充满了希望。,经历过以前惨痛教训之后，人们开发出更安全有效的病毒载体，比如重组AAV2/8系统。经历了黑暗的十年之后，基因治疗缓慢的走出困境，以更加成熟的姿态重回大众的视野（2009至今）。,2009年宾夕法尼亚大学在柳叶刀杂志报道通过AAV2过表达RPE65成功治疗Leber先天性黑蒙症2型的临床试验（LCA）。12名患者1.5E10or1.5E11,2011年，英国伦敦大学在新英格兰杂志报道通过AAV8过表达凝血因子IX，体内凝血酶表达水平增加，出血次数大大减少的研究。性连锁隐性遗传,2012年第一例基因治疗药物Glybera（来自uniQure公司）在欧盟获批上市，开启基因治疗的新时代。该产品采用AAV1过表达的方法治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症（LPLD）。非常罕见疾病药物售价120万欧元，四年来只用了一次。销售许可证到期未重新申请,2016年欧盟第二例批准的基因治疗药物来自制药巨头葛兰素史克（GSK）的Strimvelis，用于治疗重症联合免疫缺陷病（ADA-SCID），这是基因治疗走向临床的又一个里程碑。59.4万欧元每年15名患者,2014年以来，Spark公司的SPK-RPE65治疗LCA2Spark与辉瑞公司合作的SPK-9001治疗B型血友病BluebirdBio公司的LentiGlobin治疗地中海贫血uniQure的AMT-060治疗B型血友病AVeXis公司的FDAAVXS-101等获得美国FDA授予的“突破性疗法”资格。,RPE65基因治疗（商品名Luxturna，美国SparkTherapeutics公司）药物，2017.12.20获得美国FDA批准上市，这是美国历史上第一款利用腺相关病毒（AAV）作为载体，“体内”直接用药，用于治疗“基因缺失遗传病”的基因治疗药物。,85万美元疗效2-3年！,开启基因治疗的黄金时代！,国内基因治疗开展的较晚，不过2003年中国深圳的赛百诺公司异军突起。公司开发的抗肿瘤基因药物（今又生）由国家食品药品监督管理局批准生产，该注射液由通过修饰的腺病毒载体编码p53基因（抑癌基因）组成。“今又生”的获批批准，成为中国第一个获准上市的基因治疗药，但是该项目的获批引起国内外的广泛争议。,四、临床基因治疗,遗传病的基因治疗遗传性视网膜变性遗传性血液病全身系统遗传病,遗传性视网膜变性,遗传性视网膜变性（Inheritedretinaldegeneration,IRDs）是一组以感光细胞和色素上皮细胞进行性、选择性丧失为特点的致盲性眼病，世界范围内的发病率约为1/3000（BessantDAetal.,2001），国内统计仅视网膜色素变性的发病率就高达1/1000（XuLetal.,2006），是难治或不可治愈双眼盲的主要原因，目前无有效疗法。,基因治疗之所以在IRDs上取得较好效果与眼球解剖结构有直接关系。与其它器官相比，眼球具有特殊的解剖结构，尤其适合基因治疗。眼球屈光间质透明，有利于在可视状态下准确注射载体；眼球在解剖上相对封闭，转基因载体只转染到眼球特定的靶细胞，很少播散到身体其他部位；视网膜下腔具有高度的免疫赦免，注射后基本不会引起免疫反应。,基因替代治疗（RPE65）,Leber先天性黑朦(LCA)是德国眼科医师TheodorLeber于1869年首先报道的,属于最严重的遗传性视网膜病变,患儿在出生后一个月内即表现严重的视力障碍，该病多呈常染色体隐性遗传,也有部分报道为常染色体显性遗传，约有10%20%的盲校儿童是LCA患者,占遗传性视网膜疾病的5%以上。,RPE65基因的主要功能是结合全反式视黄酯,使之转化为11-顺-视黄醛,进而合成为视紫红质来维持视网膜色素再循环的过程。因此,当RPE65基因失去功能,视网膜的光感受细胞就会因缺乏视紫红质而不能对光发生反应，导致视力丧失。在所有LCA病例中,RPE65基因突变导致的病例大约占15%。,3名患者参加单眼视网膜下腔注射1.5E10(0.15ml)评价指标：瞳孔对光反射结果：3名患者治疗后视功能有显著性提高,1-2期临床试验12名患者参加单眼视网膜下腔注射1.0E11(4人)or1.0E12（8人）评价指标：光敏度等结果：高剂量组效果好；有效时间为6-12月,31名患者参加（2人失访）（治疗组20，对照组9人）患者3岁；视力20/60双眼先后视网膜下腔注射1.5E11(0.3ml)评价指标：multi-luminancemobilitytesting（多亮度移动性测试）结果：13名患者（65%）治疗后视功能有显著性提高,基因编辑治疗,21世纪以来，以核酸酶为代表的基因编辑技术蓬勃发展，跟现在常用基因替代治疗相比，利用基因编辑技术可实现目的基因DNA水平准确而永久的修复，是更理想的治疗方法。,锌指核酸酶，TALEN以及近几年火热的CRISPR-Cas9技术的应用，极大地拓展了基因治疗的策略和手段，比如我们既可以对突变基因进行原位的修复，也可以在安全位点定点整合，不仅可以实现永久的基因治疗，而且更加安全有效。,Hunter综合症亦名粘多糖贮积症II型。性连锁隐性遗传，IDS基因突变所致，IDS基因编码艾杜糖醛酸硫酸酯酶，突变后导致粘多糖代谢障碍。眼部特征：视力减退、夜盲、视野缩小