（有机化学专业论文）葡萄籽中原花色素的提取分离与抗氧化性研究.pdf

摘要 原花色素为多羟基酚类化合物，衍生于黄烷类化合物，属生物类黄酮。它其有独特的化 学和药理活性，可在许多领域中获得广泛的应用。对其进行研究开发具有十分重要的现实意 义。 研究工作主要分4 个方面：( 1 ) 比较7 0 乙醇、7 0 甲醇和7 0 丙酮的原花色素提取率， 比较6 0 醇、7 0 乙醇、8 0 乙醇的原花色素提取率，对温度、酸碱性、提取时间、料液 比对原花色素提取率的影响进行研究；( 2 ) 采用冷却沉淀、盐析结合溶剂分级法对原花色素 进行初级分离，对产品进行高压液相色谱和质谱分析并测定原花色素含量，考查加盐量、p h 值对低聚原花色素获得率的影响，研究溶剂直接分级法低聚原花色素的获得率；( 3 ) 对大孔 吸附树脂a b 一8 和葡聚糖凝胶l h 一2 0 进行原花色素的静态吸附试验、静态解吸试验、动态解 吸试验，对大孔吸附树脂a b 增进 i 原花色素的动态吸附试验；( 4 ) 试验对葡萄籽原花色素 的还原能力、对亚油酸过氧化的抑制作用、对羟自由基的清除作用、对超氧阴离子的清除作 用、对亚硝酸根离子的清除作用进行测定，并与v c ，b h t 进行比较。 研究结果表明： ( 1 ) 原花色素溶剂提取采用1 ：4 的料液比，粉碎1 0 目左右，7 0 的乙醇或丙酮室温酸 性环境下浸提8 1 0h 的条件较为适宜。此路线具有提取率高，易过滤等特点。 ( 2 ) 冷却沉淀、盐析结合溶剂分级法对原花色素进行初级分离可得四种产品。产品l 和 产品2 为高聚原花色素，产品3 和产品4 为寡聚和低聚原花色素的混合物，产品3 具有良好 的水溶性。对于本方法，每l o o m l 液体加入6 0 9 n a c l 进行盐析是较为适宜的。p h = 35 较有 利于乙酸乙酯对低聚原花色素的萃取。有机溶剂直接分级法由于叶绿素的影响效果不如冷却 沉淀、盐析结合溶剂分级法。冷却沉淀、盐析结合溶剂分级法具有方法简便，成本低廉，原 花色素获得率较高，产品无毒无害，低聚原花色素产品纯度高，水溶性好等特点。 ( 3 ) s e p h a d e x l h 一2 0 和a b 一8 对原花色素均具有较强的吸附能力，在l 小时内均快速吸 附水溶液中的原花色素，1 小时后基本达到吸附平衡，其中l h 一2 0 无论吸附量还是吸附速率 均优于a b 8 。较低的流速有利于原花色素的充分吸附和解吸，但太低的流速不利于生产，对 于本试验所用a b 一8 大孔吸附树脂层析柱，15 m l m i n 的上样和洗脱速率是较适宜的。产品3 可能主要为原花色素二聚体和三聚体的混合物。a b - 8 对原花色素的分离效果不如 s e p h a d e x l h - 2 0 a ( 4 ) 一定浓度范围内，葡萄籽提取物的还原能力随着浓度的增加而增强。当浓度低于 l m g m l 时，葡萄籽提取物对亚油酸的过氧化表现出一定的诱发效应，随着浓度的增加，葡萄 籽原花色素对亚油酸过氧化的抑制作用也逐渐增强。葡萄籽原花色素对羟自由基的清除作用 随着浓度的增加而增强，当浓度为6 0 0 m g l 时，对羟自由基的清除率可达9 68 。在低浓度 条件下，葡萄籽原花色素对邻苯三酚自氧化的抑制作用较弱，在高浓度条件下具有显著的抑 制作用。在光照核黄素体系中，不同浓度的葡萄籽原花色素对超氧阴离子均具有显著的清除 作用。明显优于同浓度的v c 。在低浓度条件下，葡萄籽原花色素对亚硝酸根离子的清除作用 较弱，但随着浓度的增大，葡萄籽原花色素对亚硝酸根离子的清除作用也明显增强。原花色 素抗氧化性能优于v c 和b h t , 是一种优良的纯天然抗氧化剂。 + ， 关键词：原花色素；提取；分离；抗氧化性；洗脱。 4 a b s t r a c t t h ep r o a n t h o c y a n i d i n ，ap o l y p h e n o lc o m p o u n do fm a n yh y d r o x y , d e r i v e sf r o mt h ef l a v a n c o m p o u n d i ti sak i n do ft h el i v i n gc r e a t u r ef l a v o n o i dt h ep r o a n t h o c y a n i d i nh a ss p e c i a lc h e m i c a l a n d p h a r m a c o l o g i c a la c t i v i t y , a n d c a nb e a p p l i e dd i f f u s e l y i n m a n yf i e l d s s o i ti so fg r e a t s i g n i f i c a n c et or e s e a r c ha n de m p o l d e r o ni t r e s e a r c hw o r kc a nb ed i v i d e di n t of o u ra s p e c t s ：( 1 ) ，c o m p a r et h ep r o a n t h o c y a n i d i ne x t r a t i o n r a t eo f 7 0 e t h a n o l ，7 0 c a r b i n o l ，a n d7 0 a c e t o n e ；c o m p a r e t h ep r o a n t h o c y a n i d i ne x t r a t i o nr a t eo f 6 0 e t h a n o l ，7 0 e t h a n o l ，a n d8 0 e t h a n o l ；d o r e s e a r c ho nt h ee f f e c to nt h ep r o a n t h o c y a n i d i n e x t r a t i o nr a t eb y t e m p e r a t u r e ，a c i d i t y , m a r i n a t i o nt i m e ，s o l u t i o nc u b a g e w e i g h te t c ( 2 ) ，t os e p a r a t e t h e p r o a n t h o c y a n i d i np r i m a r i l y ，a d o p t t h e f o l l o w i n gs e p a r a t i o nm e t h o d ：c o o l i n g o f ft o p r e c i p i t a t e ，c o m b i n a t i o n o fs o l v e n te x t r a c t i o na n ds a l t i n go u t ；a n a l y s et h ep r o d u c tb ym e a n so f h p l ca n dm s ；m e n s u r a t et h ec o n t e n to f t h ep r o a n t h o c u a n i d i n ；e x a m i n et h ee f f e c to n t h ea c q u i s i t i o n r a t eo fo p c b y t h ea d d e dq u a n t i t yo fs a l ta n dp h ；d or a s e a r c ho nt h eo p c sa c q u i s i t i o nr a t eg e tb y t h em e t h o do f s o l v e n t i m m e d i a c y s e p a r a t i o n ( 3 ) d op r o a n t h o c u a n i d i n s t a t i c a b s o r p t i o n e x p e r i m e n t s 、s t a t i cd e s o r p t i 0 9e x p e r i m e n t s 、d y n a m i c d e s o r p t i o ne x p e r i m e n t s o nt h e b i g b o r e a d s o r b i n g r e s i na b 一8a n dd e x t r o s eg e l s e p h a d e xl h 一2 0 ；d op r o a n t h o c u a n i d i nd y n a m i c _ a b s o r p t i o ne x p e r i m e n t s o nt h eb i g = b o r e a d s o r b i n gr e s i na b - 8 ( 4 ) ，t e s tt h ed e o x i d i z a t i o nc a p a c i t yo f t h ee x t r a c t i o n so ft h eg r a p es e e d sa n dt h ei n h i b i t o r ye f f e c t so nt h eh y o x i d a t i o no f l i n o l e i ca c i d ，a n d t h ee f f e c t so fs c a v e n g i n g h y d r o x y la n du l t r a o x y g e n i c a n i o nf r e er a d i c a l s ，a n d c o m p a r ew i t h v c ，b h t t h er e s e a r c hr e s u l t si n d i c a t e st h a t ： ( 1 ) i ti sf e a s i b l et h a tt h ep r o a n t h o c u a n i d i ns o l v e n ts e l e c t s1 ：4r a t eo f t h ew e i g h to f g r a p es e e d s t ot h ec u b a g eo ft h ee x t r a c t i o ns o l v e n t ，a n dt a k e s8 - 1 0h o u r st oe x t r a c tp r o a n t h o c u a n i d i ni nt h e e n v i r o n m e n to f7 0 e t h a n o lo ra c e t o n ea n dr o o mt e m p e r a t u r e ；t h i sr o u t eh a st h ec h a r a c t e r i s t i co f h i g h e re x t r a c t i o nr a t ea n d e a s i e rf i l t r a t i o n e t c 5 ( 2 ) t h es e p a r a t i o nm e t h o do ft h ep r o a n t h o c u a n i d i n ( c o o l i n go f ft op r e c i p i t a t e c o m b i n a t i o no f s o l v e n te x t r a c t i o na n ds a l t i n go u t ) t os e p a r a t et h ep r o a n t h o c y a n i d i np r i m a r i l y , w i l l p r o d u c ef o u r k i n d so f e x t r a c t i o n s ；f o rt h i sm o t h o d ，i ti sf e a s i b l et oa d d6 0 9n a c lt op e r1 0 0 m ls o l v e n t ；i ti so f a v a i lt o e t h y l a c e t a t et oe x t r a c tt h eo p cw h e np h 2 35 ；o w i n gt ot h ee f f e c to fc h l o r o p h y l ，t h e o u t c o m eo f t h em e t h o do f o r g a n i c - - s o l v e n t i m m e d i a c y - - s e p a r a t i o ni sn o t b e t t e rt h a nt h eo t h e rm o t h o d ( c o o l i n go f ft op r e c i p i t a t e ，c o m b i n a t i o no fs o l v e n t _ e x t r a c t i o na n ds a l t i n go u t ) ；t h e l a t t e r o p e r a t e s s i m p l y ，h a sl i t t l ec o s ta n d t h ec h a r a c t e r i s t i co f h i g h e re x t r a c t i o nr a t e ；t h ee x t r a c t i o n so f t h i sm e t h o d i sn o tp o i s o n o u sa n dh a r m f u la n dn o 3p r o d u c th a st h ec h a r a c t e r i s t i co fb e r t e rw a t e r - s o l u b i l i t ya n d h i g h e rp u r i t y o f t h ee x t r a c t i o n s ，e t c ( 3 ) b o t ht h es e p h a d e x l h 一2 0a n da b 一8h a v ec o m p a r a t i v e l ys t r o n ga b s o r p t i o nc a p a c i t yt ot h e p r o a n t h o c u a n i d i n ；i n l e s st h a na nh o u r ，b o t hc a na b s o r bt h ep r o a n t h o c u a n i d i ni nw a t e rs o l u t i o n r a p i d l ya n dc a nr e a c ht h ea b s o r p t i o nb a l a n c e o nt h ew h o l ea f t e ra nh o u r ；a f t e ra l l ，w h e t h e rt h e a b s o r p t i o nq u a n t i t y o rt h e a b s o r p t i o nr a t e ，t h es e p h a d e x l h 一2 0 i sb e t t e rt h a nt h ea b _ 8 ；a c o m p a r a t i v e l yl o wv e l o c i t yo f f l o wi s p r o p i t i o u st o t h ee n o u g ha b s o r p t i o na n dd e s o r p t i o no ft h e p r o a n t h o c u a n i d i n , b u ta t o ol o w v e l o c i t yo f f l o wi sn o tp r o p i t i o u st om a n u f a c t u r e ；a st ot h ec o l u m n u s e di nt h ee x p e r i m e n t ，a15 m l m i nr a t eo fe l u t i o na n dp r o v i d i n gt h ep r o a n t h o c u a n i d i nw a t e r s o l u t i o ni s c o m p a r a t i v e l ya p p r o p r i a t e ；n o 3 p r o d u c tm a yc h i e f l yb et h ec o m p o u n dm a d eu po f d i m e r sa n dt r i m e r , t h ee x t r a c t i o ne f f e c to f t h e a b 一8i sn o tb e t t e rt h a nt h es e p h a d e x l h 一2 0 ( 4 ) i nac e r t a i nr a n g eo fc o n c e n t r a t i o n ，t h ed e o x i d i z a t i o nc a p a c i t yo ft h ee x t r a c t i o n sf r o m g r a p es e e d se n h a n c e s w i t ht h ei n c r e a s i n go f t h ec o n c e n t r a t i o n ；w h e nt h ec o n c e n t r a t i o ni sl o w e rt h a n l0 m g m l ，t h ee x t r a c t i o n sf r o mg r a p es e e d ss h o w st h ei n d u c e de f f e c tt ot h eh y o x i d a t i o no fl i n o l e i c a c i d ；w i t ht h ei n c r e a s i n go ft h ec o n c e n t r a t i o n ，t h ei n h i b i t o r ye f f e c to f t h ep r o a n t h o c u a n i d i nf r o m g r a p es e e d so n t h eh y o x i d a t i o no fl i n o l e i ca c i dg e t sg r a d u a i l ys t r o n g e r ；w i t ht h ei n c r e a s i n go ft h e c o n c e n t r a t i o n ，t h ee f f e c to ft h ep r o a n t h o c u a n i d i n f r o mg r a p es e e d so ns c a v e n g i n gh y d r o x y lg e t s g r a d u a l l ys t r o n g e r ；w h e n t h ec o n c e n t r a t i o na a a i n s6 0 0 m g l ，t h es c a v e n g i n gr a t eo f t h eh y d r o x y lc a n 6 r e a c h9 68 ；u n d e rt h ec o n d i t i o no fal o wc o n c e n t r a t i o n ，t h e p r o a n t h o c y a n i d i n h a sa p o o r c a p a b i l i t y i n c d - 1 3 ( o h ) 3a u t o o x i d a t i o n ，o n t h eo t h e i r h a n d ，t h ei n h i b i t o r y e f f e c to ft h e p r o a n t h o c u a n i d i nf r o mg r a p e s e e d so nt h ei n h i b i t o r yo f c 6 h 3 ( o h ) 3 a u t o o x i d a t i o ni s s t r o n g ；i nt h e s y s t e r mo fi r r a d i a ml a c t o c h r o m e ，t h ep r o a n t h o c y a n i d i n h a ss t r o n gs c a v e n g i n gc a p a b i l i t yo ff r e e r a d i c a li nd i f f e r e n tc o n s i s t e n c y w i t ht h ei n c r e a s i n go f t h ec o n c e n t r a t i o n ，t h ei n h i b i t o r ye f f e c to f t h e p r o a n t h o c u a n i d i n f r o m g r a p e s e 6 d so n s c a v e n g i n gn 0 2 g e t sg r a d u a l l ys t r o n g e r ；t h e p r o a n t h o c y a n i d i nh a s t h ev e r ys t r o n ga n t i o x i d a t i o nq u a l i t y , b e t t e rt h a nv c ，a n di ti sak i n do f g o o d a n d p u r en a t u r a la n t i o x i d a n t k e yw o r d s ：p r o a n t h o c y a n i d i n ，e x t r a c t i o n ，s e p a r a t i o n ，a n t i o x i d a n t ，e l u t i o n 7 1 前言 原花色素是广泛存在于植物中的一类天然物质，属于多酚类化合物，具有水溶、无毒、 无过敏、安全性好等特性。据报道该物质是一种天然的自由基清除剂和抗氧化剂。国外试 验显示葡萄籽原花色素抗氧化作用是v e 的2 0 倍，v e 的5 0 倍“3 ，近年来在美国、欧洲、珂 根廷、澳大利亚和新西兰等国均相继将葡萄籽原花色素开发成保健品或药品。而国内这方面 特别是抗氧化性方面的研究报道还不是很多。 本试验以葡萄籽为原料，用7 0 乙醇浸提，冷却沉淀、盐析结合溶剂分级法进行初级分 离。得到了四种产品，对其进行质谱和液相分析，结果表明产品1 和产品2 为高聚原花色素， 产品3 和产品4 为寡聚和低聚原花色素的混合物，产品3 具有良好的水溶性。冷却沉淀、盐 析结合溶剂分级法具有方法简便、成本低廉、易过滤、原花色素获得率较高、产品无毒无害， 低聚原花色素产品纯度高、水溶性好等特点。 葡聚糖凝胶l h 一2 0 和大孔吸附树脂a b 一8 对初级分离产品进行柱分离的结果显示， l h - 2 0 的选择性和吸附性均优于a b 一8 。当对分离的精度要求不是很高，a b 一8 具有洗脱速度 快，价格低廉，来源方便等特点。 本文还对葡萄籽提取物的抗氧化性进行试验，试验显示：一定浓度范围内，葡萄籽提取 物的还原能力随着浓度的增加而增强；当浓度低于l m g m l 时，葡萄耔提取物对亚油酸的过氧 化表现出定的诱发效应，随着浓度的增加，葡萄籽原花色素对亚油酸过氧化的抑制作用逐 渐增强；葡萄籽原花色素对羟自由基的清除作用随着浓度的增加而增强，当浓度为6 0 0 m h l 时，对羟自由基的清除率可达9 6 8 ；在低浓度条件下，葡萄籽原花色素对邻苯三酚自氧化 的抑制作用较弱，在高浓度条件下具有显著的抑制作用；在光照核黄素体系中，不同浓度的 葡萄籽原花色素对超氧阴离子均具有显著的清除作用；在低浓度条件下，葡萄籽原花色素对 亚硝酸根离子的清除作用较弱，但随着浓度的增大，葡萄籽原花色素对亚硝酸根离子的清除 作用也明显增强；与v c 和b h t 相比，葡萄籽原花色素抗氧化性能优越，是一种优良的纯天 然抗氧化剂。 2 文献综述 2 ，1 引言 葡萄( v i t i sv i n i f e r a ) 是一种世界性水果，种植面积和产量在水果中都居世界首位。据1 9 9 7 年f a o 估计，它的世界年产量达5 8 0 0 万吨。全世界葡萄产量的9 0 用于酿造葡萄酒，葡萄 酒是仅次于啤酒的第二大含酒精饮料“1 。葡萄酒工业的经久不衰主要归功于其丰富的营养保 健作用，世界卫生组织( w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n ) 在全世界范围内进行的，一项称之为 m o n i c a 的有关心血管疾病免疫学研究结果显示，尽管法国人摄入的饱和脂肪以及血清胆固 醇要高于其它西方国家，如u s a 或者u k ，但是法国人由心脏病引起的致死率显著地低于这 些国家，这就是著名的“法国悖论( f r e n c hp a r a d o x ) ”。经过进一步深入调查研究显示，这 种异常的现象被认为是由于法国人摄食大量葡萄酒的缘故“3 。此后，有关葡萄酒或其有效成 分的生理功能研究一下子成为了世界相关研究及媒体的热门焦点。最近几年的大量研究已把 葡萄酒的这种保护效果归因于它们所含有的大量多酚类化合物。近年来，随着植物来源的生 理活性物质的研究开发成为国际热门焦点，作为具有强效清除自由基能力的纯天然抗氧化剂， 原花色素的研究与开发已成为热点。 22 命名历史及原料来源 十九世纪末期，人们已经知道在许多高等植物的叶、果、花内的无色物质在酸的作用下 能生成红色的物质。1 9 2 0 年r o s e n h e n i m 将这种无色的物质命名为“无色花色苷” ( l e u c o a n t h o c y a n i n ) 。 1 9 5 4 年，b a t e s m i t h 用色谱法系统研究无色花色苷在植物中的分布时，发现无色花色苷 主要存在于木质性的植物内，并且它的分布与当时被植物学界称为“单宁”的物质的分布非 常相近。这就第一次把“单宁”与花色素类物质联系起来。 1 9 5 4 年k i n g 等从黑木相思树( a c a c i am e l a n o x y l o n ) 分离出黑木金合欢啶，并且确定 了它的结构式是7 ，8 ，3 ，4 _ 四羟基黄烷一3 ，4 - 二醇。这是首次分离出的黄烷一3 ，4 - 二醇。 后来发现，多数植物体内的能转化为花色素的物质不是黄烷o ，4 - 二醇，而是黄烷醇的 二聚体，三聚体或低聚体。 为了纠正名称上的混乱，1 9 6 0 年f r e u d e n b e r g 与w e i n g e s 提出“原花色素” ( p r o a n t h o c y a n i d i n ) 一词。原花色素是指从植物分离得到的一切无色的，在热酸处理下能产 生花色素的物质。 8 0 年代以来，研究人员针对下列植物中的原花色索进行了研究：葡萄，英国山楂，单子 山楂，花生，银杏，日本罗汉柏，北美崖柏，土耳其侧柏，花旗松，白桦树，野生刺葵，番 荔枝，野革莓，莩果，日本莽草，高粱，可可豆，海岸松和大黄等等。发现这些植物中都含 有丰富的原花色素，而在葡萄籽中含量尤为丰富。占葡萄总质量的3 4 的葡萄籽是葡萄酒 与葡萄汁生产的副产物，据统计，全世界年产葡萄籽2 0 82 万吨，我国仅酿酒业的葡萄籽也 有4 , 2 万吨，这就给原花色素的提取提供了很大的原料来源。 2 3 结构与化学性质 原花色素又叫原花青素，原花青定，为多羟基酚类化合物，衍生于黄烷类化合物，分子 骨架为c 6 c 3 c 6 ，属生物类黄酮，是植物生长过程中的次生代谢产物【6 】。按照分子量大小，原 花色素又可分为黄烷醇单体及聚合体( 具体分类见图21 ) 。习惯上将分子量为5 0 0 3 0 0 0 的聚 合体称为缩合单宁，而将分子量更大的聚合体称为红粉和酚酸。按聚合度的大小，通常将二 四聚体称为低聚体( p r o c y a n i d o l i co l i g o m e r ，简称o p c ) ，将五聚体以上的称为高聚体 ( p r o c y a n i d o l i cp o l y m e r s ，简称p p c ) 川。 蕾t 觯磷 54 0 - 3 t ) 墙o 4 - = 痒 图2 】黄烷醇类多酚的分类 o 2 3 1 单体黄烷醇 黄烷3 醇、黄烷一3 ，4 - 二醇是缩合单宁的前体，经缩合成为缩合单宁。 2 3 1 1 黄烷3 醇 黄烷一3 醇在酸处理下不产生花色素，不属于原花色素，但它是原花色素的重要前体。根 据黄烷醇a 环和b 环的羟基取代形式的差异，黄烷- 3 一醇可分为儿茶素、桔儿茶素、阿福豆素、 刺槐亭醇、菲瑟亭醇和牧豆素( 见表21 ) ，结构式见图2 2 。 表21 黄烷一3 一醇的类型 儿茶奢 0 h o h 咖 括儿茶蠢 o h o h 菲孽事醇 。壬i o h 阿擅豆辜 图2 1 黄烷3 一醇的结构 黄烷一3 一醇的结构中杂环c - 2 ，c - 3 原子是手性碳原子，形成4 个立体异构体a 儿茶素c a t e c h i n 和桔儿茶素g a l l o c a t e c h i n 共有8 个立体异构体( 见图2 3 ) 。儿茶素和桔儿茶素化学构成了缩 合单宁的基础。 帔谬叫蟛 r ：；l 哥譬 越；盏儿藁- ( 一j 一丧儿秉t “- 7 ) ( 一) 幸穑n # 犬p、f 蝌侧 抽 硎佣 * “# 2 叫昭 r 茄跳“ ( 矗j 埘啦t 图2 3 儿茶素和桔儿茶素的同分异构体图2 4 黄烷一3 ，4 - 二醇结构的原花色素 231 2 黄烷一3 ，4 一二醇 黄烷3 ，4 - 二醇在热酸下产生花色素为原花色素，分类示于图2 4 。 232 二聚原花色素 黄烷一3 ，4 - 二醇与黄烷一3 一醇之问能发生缩合反应。此时，前者以其c 一4 亲电中心与后者 的c 8 位或c 一6 位亲核中心结合生成二聚原花色素，来自前者的单元及来自后者的单元分别 组成了二聚体的“上部”及“下部”。聚合物的结构取决于构成单元的类型、单元间连接的位 置( 4 8 位或4 6 位) 及其构型，还取决于连接键的类型( 单连键还是双连键) 。 二聚原花青定( d i m e rp r o c y a n i d i n ) 是分布最广，数量最多的原花色素“，含于许多植物 体内。对b 型系列原花青定二聚体的研究给缩合单宁化学带来突破性进展。原花色素的组成 单元是( + ) 儿茶素及( 一) 一表儿茶索。其中b 一1 、b 一2 、b 一3 、b 一4 、为4 - 8 位c c 连接，b 一5 、 b 一6 、b 7 、b 一8 为4 - 6 位c c 连接。原花色素组成单元间除上述的c - c 单键连接外，还常在 c 一2 与c 7 或c 一2 与c 一5 间再形成醚键c o c ，成为双连键型原花青定，又称原花青定a 。 二聚原花青定的具体结构见图2 5 。 冀h o 强 mn x 火如n 腻 “唰 图2 5 二聚原花青定 233 寡聚和三聚原花色素 在已经确定了化学结构式的寡聚原花色素中，绝大部分都是直链型和3 ，4 - 反式的。4 8 连接型多于4 6 型。 原花色素c 。l 及c 2 是最早分离出来的原花色素三聚体。原花色素c 1 在植物界的分布 很广泛，通常与原花色素b 一2 及b 一5 共存在一起。原花色素c 2 则与原花色素b 一3 及b 一6 共 存在一起。 原花色素的异构体的个数随着聚合度的增加而大量增加，分离和纯化的难度也越来越大。 2 , 34 红粉和酚酸 “红粉”( p h l o b a p h e n e ) 泛指缩合单宁水溶液在酸或在氧的作用下生成的不溶于水的红褐 色沉淀，也指植物体内与缩合单宁伴存的不溶于水但溶于有机溶剂( 如甲醇) 的红色酚类物 质( 分子量大于3 0 0 0 ) 。一部分红粉可用弧硫酸盐溶解。聚合度更大的聚合原花色素不溶于 中性水溶液，但溶于碱性水溶液，习惯上又称为“酚酸”( p h e n o l i c a c i d s ) 。 、 、酣蔷筘电 a 日 碴。一喾 2 3 5 化学反应 原花色素的化学反应主要是组成单元的a 环的芳环亲电取代反应、b 环的氧化反应、络 合反应、以及单元问连接键的裂解反应( 酸催化裂解，碱催化裂解) 等等。 原花色素在正丁醇一浓盐酸( 9 5 ：5 ) 的环境下9 5 。c 处理4 0 m i n 生成花色素。原花色素的花 色素反应除了生成花色素外，还生成其它未知色素及红粉。使紫外图谱在4 5 0 h m 区域出现肩 峰。花色素反应是鉴别原花色素的简便方法，但不能鉴别延伸单元的构型。随着聚合度增加， 原花色素上部单元的比例增加，所生成的花色素也相应地增多。 2 4 原花色素的生理活性 2 , 4l 原花色素一蛋白质结合反应 原花色素能与蛋白质发生结合。一般情况下，结合是可逆的。原花色素一蛋白质结合反应 是其最具特征性的反应之一。单宁最初的定义就来自于它具有沉淀蛋白质的能力。使明胶溶 液浑浊也可作为种基本的单宁定性试验”1 。原花色素与口腔唾液蛋白的结合，使人感觉到 涩味，因此原花色素与蛋白质结合的这个性质又称为涩性或收敛性。 2 42 原花色素与生物碱、花色苷以及多糖、核酸等多种天然化合物的复合 与原花色素一蛋白质结合类似，原花色素还可与生物碱、花色苷以及多糖、核酸等多种天 然化合物发生复合。这些反应都属于分子识别的结合机制，要求原花色素和各种底物( 蛋白 质、生物碱、花色苷以及多糖) 在结构上互相适应和互相吻合，通过氢键一疏水键形成复合产 物，多数情况下这种复合反应是可逆的“1 。 原花色素与脂类和核酸也可发生类似的复合。对于蛋白质和脂类，所表现出的亲和性也 与其酸碱性有关，中性或碱性分子的复合趋势较酸性分子高。 2 4 3 无机盐对原花色素的作用 在原花色素的分离和应用中，往往需要考虑无机盐的影响。原花色素对无机盐是高度敏 感的，其作用包括两个方面，一是静电作用，二络合反应。前者主要是一个物理过程，通过 无机盐的脱水和盐析促进多酚溶液或胶体的沉淀；后者主要是一个化学过程，原花色素以邻 位二酚羟基与金属离子形成五元环螯合，可能同时还发生氧化还原和水解配位聚合等其它反 应。原花色素对于大多数金属离子都可以发生显著的络合，特别是单宁，其络合能力较小分 子酚高得多。这一特性不仅可用于原花色素的定性定量检测，而且是原花色素在选矿、水处 理、防锈涂料、染料和颜料微量金属肥料、木材防腐等多种应用方向上的化学基础。 2 44 原花色素对酶和微生物的作用 原花色素具有多种生物活性，而这些生物活性最本质的方面体现在原花色素对酶的抑制 作用上。原花色素是多种酶促反应有效的抑制剂，原花色素对酶的选择具有专一性。虽然原 花色素对多种酶普遍具有抑制作用，但是对于一种原花色素或种酶，抑制是有选择性的。 原花色素蛋白质结合反应本身是一种分子识别反应，两种反应物之间互相具有选择性。抑菌 性与酶抑制性有相当大的关系。主要原因也在于单宁所特有的分子结构和蛋白质结合能力。 2 45 原花色素的抗氧化和自由基清除能力 酚羟基的还原性是酚类化合物的共性之一。这一性质在原花色素上得到了充分的体现。 原花色素分子中的多个酚羟基可以作为h 供体，连苯三酚( 例如桔酸) 或邻苯二酚( 例如儿 茶素的b 环) 的结构进一步加强了其还原性，使原花色素不仅可被重铬酸盐、氯酸盐等强氧 化剂氧化，而且可被空气中的氧所氧化。酚类的氧化机理，存在两条途径，是通过酚羟基 r 的离解，二是通过自由基途径。 原花色素很易被空气中的氧所氧化，特别是在水溶液状态下和有原花色素氧化酶存在的 条件下。酚羟基通过离解，生成氧负离子，再进一步失去氢，生成具有颜色的邻醌，使多酚 的颜色加深。而醌很易被还原为酚。 原花色素在氯酸钾、高锰酸钾、双氧水和重铬酸钾等强氧化剂作用下，不仅酚羟基受到 氧化，而且糖环、杂环甚至苯环同时开裂，被氧化降解。 原花色素的抗氧化特性是通过几种途径综合体现出来的。原花色素具有很强的自由基清 除能力，可以消除各种活性氧自由基，抑制氧化酶，络合对氧化反应起催化作用的金属离子 f e 离子和c u 离子。多酚以大量的酚羟基作为氢供体，对多种活性氧具有清除作用，可将单 线态氧还原成活性较低的三线态氧，减少氧自由基的产生，同时也清除各种自由基，生成活 性较低的原花色素自由基，打断自由基氧化的链反应。3 ；其次，原花色素可以邻位二酚羟基 与金属离子螯合，减少金属离子对氧化反应的催化：再者，对于有氧化酶存在的体系，原花 色素对其有显著的抑制能力；原花色素还能与v c 和v e 等抗氧化剂之间产生协同效应，具 有增效剂的作用。 2 4 6 原花色素的紫外吸收特性 原花色素因其分子中所含的苯环结构，在紫外光区有很强的吸收。可起到“紫外光过滤 器”的作用”o 。 2 5 应用方面的研究与开发 原花色素的分子结构赋予它一系列独特的化学活性和生理活性，使其不仅在制革、泥浆 稀释、粘合剂、金属络合材料、矿石浮选、水处理、天然色素等传统领域获得广泛应用。近 年来，随着研究的深入在医药、食品、化妆品等附加值较高的领域原花色素制品也有不俗表 现。 2 51 药用价值的研究 2 5 11 抗氧化活性方面 葡萄籽原花色素具有极强的抗氧化活性“3 ，是一种很好的氧自由基清除剂和脂质过氧化 抑制剂。1 9 8 9 年，m e u n i e r 等测试了葡萄耔原花色素抑制吩嗪甲基硫酸盐在辅酶i ( n a d h ) 和分子氧存在下大鼠肝微粒体内产生自由基的活性及抑制a d p f e + + 与抗坏血酸盐诱发的脂 质过氧化活性，并与来自地中海柏木c u p r e s s u ss e m p e r v i r e n s 的缩合鞣质、来自葡萄、黑果越 桔及茶子的花青甙进行了对照。结果表明，葡萄籽原花色素对抗自由基和抑制脂质过氧化的 活性最强，i c 5 0 分别为l o i xg m l 和1 6ug m 1 1 9 9 0 年e l s t n e r 用模拟局部缺血、炎症和糖尿 病状况的体外生化模型证实了原花色素分子中的黄烷一3 ，4 一二醇是捕获氧自由基的基本结 构。1 9 9 4 年，m a f f e i 等用不同实验模型确证了平均分子量为1 8 0 0 的葡萄籽原花色素可阻剂 量依赖的方式抑制f e 2 + 离子催化的卵磷脂脂质体( p l c ) 的过氧化，其作用明显强于对照的 儿茶素，i c 5 0 为别为2 5i xm o l l 和5 0 l am o l l 。在超声波诱发p l c 过氧化模型中，该原花色 素不仅可明显减少诱导期中的共轭双烯的形成( i c 5 0 为0 1ut o o l ，l ) ，而且在增殖期中对呈 进行性增长的共轭双烯表现出剂量依赖性抑制( i c 5 0 为0 0 5um o l l ) ，明显强于阳性对照品 一生育酚( 诱导期和增殖期中的i c 5 0 分别为1 51 - t m o l l 和1 2 5u m o lr e ) 。电子自旋共振 ( e s r ) 分析表明，上述作用是通过与o h - 直接反应介导的。在增殖期末，加入o 5pm o l l 的原花色素，还可明显推迟共轭双烯的消失，以抑制有毒衍生物的生成，此外，该原花色素 还可非竞争性地抑制能促进自由基形成的黄嘌呤氧化酶( i c 5 0 为2 4 um o l l ) ，强于对照的 别嘌呤醇。1 9 9 4 年，法国v e n n a t 等用洋委陵菜根茎水提物分离的原花色素进行的抗过氧自 由基对照研究显示，其中的五聚体和六聚体活性最强。1 9 9 2 年，法国c h e y n i e r 等研究了原 花色素二聚体捕获氧自由基的构效关系，认为酰化可使二聚体捕获自由基的能力增强”1 。 25l2 酶抑制活性方面 1 9 9 5 年，韩国a i lm o n gj e u n 等研究了可可豆原花色素对葡萄糖基转移酶的抑制活性， 结果表明，原花色素b i 和b 2 对此酶均有非竞争性抑制活性，其中b l 在03 m m 时，抑制率 达5 0 。实验还表明，由( 一) 一表儿茶素形成的二聚体具有较强的抑制活性。在此之前，日 本k o n i s h 等的研究表明原花色素高聚体对n a d h 脱氢酶( n d h ，l 和n f h 一2 ) 有较强抑制活 性，而二聚体无此活性。 2 5 13 抗致突变方面 近1 0 年来，为预防心血管疾病和有害细胞增生等慢性转化性疾病，人们进行了大量研究， 越来越多的证据表明，环境污染，尤其是周围的致突变物质扮演了重要角色。一些学者建议 用天然抗致突变物质抵御致突变物质的侵袭。近年来，一些与线粒体和细胞核有关的体外实 验表明葡萄籽原花色素在这方面有着令人振奋的潜力“3 。1 9 9 4 年，意大利l i v i e r o 等的实验 结果表明，o 5 m g m l 的葡萄籽原花色素可使啤酒酵母$ 2 8 8 c 菌株线粒体的自发性基因突变比 对照组减少6 5 ，用相同菌株进行的实验还观察到原花色素可抑制细胞核由对刀豆氨酸敏感 到耐刀豆氨酸的自发性突变。此外，日本s u g i m o t o 证实葡萄籽原花色素低聚体对t r p p 一2 ( 一 种来自食品的