（海洋化学专业论文）海洋天然产物的若干研究工作.pdf

内容摘要 海洋微藻硫酸多糖、海洋环肽以及海人草酸是三类不同的生物活性海洋天 然产物。硫酸多糖具有显著的抗肿瘤和抗艾滋病的活性；海洋环肽具有很强的 胞毒性，抗真菌、抗病毒以及酶抑制活性；海人草酸则是一种很强的神经兴奋 剂。本论文分别对这三种海洋天然产物进行了不同程度的探索。 1 海洋微藻硫酸多糖的分离、纯化：对海洋绿藻硫酸多糖分离、纯化的程序进 行优化。海水小球藻( 自养小球藻) 的培养及硫酸多糖的分离、提取工艺已 趋成熟。确定了利用超声破碎法以n a o h ( 4 ) 作为提取介质，结合3 t c a 除 蛋白、色素，并采用d e a es e 曲a r o s ef a s tf 1 0 w 柱层析进行纯化的工艺流程。 2 海洋环肽研究：对于海洋环肽化合物的研究进展做了详尽的文献调研，对开 展海藻环肽的研究提出了可行性分析。 3 海人草酸的不对称合成研究：设计通过共轭双烯醇醚和a ，d 一不饱和化合物的 类狄尔斯一阿尔德反应，结合g r o b 碎裂化反应作为关键步骤柬合成海人草酸 这一特殊的氨基酸。该项目己获得了国家自然科学基余( 面上) 的资助。 美键词：海洋天然产物。硫酸多糖。海洋环肽，海人草酸分离，纯化，生物活性 不对称合成 a b s t r a c t m a r i n em i c r o a l g a ls u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e s ，m a r i n ec y c l i cp e p t i d e sa n dk a i n i c a c i da r ed i f f e r e n tm a r i n en a t u r a lp r o d u c t s ，w h i c hs h o wd i f f e r e n tb i o a c t i v i t i e s s u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e sh a v ee f f i c i e n ta n t i c a n c e ra n da n t i - v i r u sb i o a c t i v i t i e s ；c y c l i c l p t i d e ss h o ws t r o n gc y t o t o x i c ，a n t i m i c r o b i a l ，a n t i f u n g a la n de n z y m ei n h i b i t o r y a c t i v i t i e s ；k a i n i ca c i dh a sb e e nf o u n dan e u r o t o x i na n dp o w e r f u le x c i t a n t s o m e e x p l o r a t i o n so nt h e s em a d n en a t u r a lp r o d u c t sh a v eb e e nd i s c u s s e di nt h i st h e s i s t e x t r a c t i o na n d p u r i f i c a t i o no fs u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e sf o r mc h l o r e l l a a u t o t r o p i c a ：t h es u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e sf r o mc h l o r e l l aa u t o t r o p i c ac u l t i v a t e d i ns e a w a t e rw e r es t u d i e d t h ec o n d i t i o n so fe x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no f p o l y s a c c h a r i d e sw e r ei n q u i r e da n dh i g he f f i c i e n te x t r a c t i o nt e c h n i q u ew a s e s t a b l i s h e d t h e o p t i m a lp r o c e d u r e o fe x t r a c t i o na n d p u r i f i c a t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e si s a sf o l l o w ：u l t r a s o n i ce x t r a c t i n gp o l y s a c c h a r i d e sw i t h4 n a o h r e m o v i n gp r o t e i na n dp i g m e n tb y3 t e aa n dp u r l f y i n gp o l y s a c c h a r i d e s b yc o t u m ec h r o m a t o g r a p h yw i t hd e a es e p h a r o s ef a s tf l o w 2 t h es t u d yo nm a r i n eb i o a c t i v ec y c l i cp e p t i d e s ：l i t e r a t u r e sa b o u tm a r i n ec y c l i c p e p t i d e sh a v eb e e nr e v i e w e d t h ef e a s i b i l i t yt os t u d yt h ec y c l i cp e p t i d e sf r o m a l g a eh a sb e e nd i s c u s s e d 3 t h ea s y m m e t r i cs y n t h e s i so f ( 一) 一o t k a i n i ca c i d ：i nt h i sp r o j e c t ，an e wa s y m m e t r i c c y c l o a d d i t i o nr e a c t i o no fc o n j u g a t ed i e n o l e sa n dd i e n o p h i l e sw i l lb ed e v e l o p e da s ak e y , w h i c hw i l lb ea l li n t e r e s t i n ge x p l o r a t i o no fs y n t h e s i sm e t h o d o l o g y g r o b s f r a g m e n tw i l lb eu s e df o l l o w i n gt h ec y e l o a d d i t i o nt of o r mt h ec 3a n dc 4 s t r u c t u r e so fk a i n i ca c i dw i t hh i g hs t e r e o s e l e c t i v i t y 。t h i sn e wp r o j e c tf o r a s y m m e t r i cs y n t h e s i so f ( ) 一a k a i n i ca c i dh a sb e e ns u p p o r t e db yn s fo f c h i n a k e yw o r d s ：m a r i n en a t u r a lp r o d u c t ，s u l f a t e dp o l y s a c c h a r i d e ，m a r i n ec y c l i cp e p t i d e ， k a i n i ca c i d ，e x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，b i o a e t i v i t y , a s y m m e t r i cs y n t h e s i s 概述 海洋，令人神往的神秘世界，拥有1 3 7 亿立方米的水体，占据地球表面的 十分之七。她孕育了地球上的生命，使地球成为宇宙中一颗生机勃勃的蔚蓝星 球。人类的文明从远古开始就与之息息相关，多少世纪以来人类在文学作品中 寄寓梦想与揣测，在朦瞳中摸索前行。渐渐的，海洋地质的研究使我们认识到 在广袤的海底有着象陆地一样的山川、平原、沙漠和戈壁，海底蕴藏着比陆地 更为丰富的矿产资源；海洋生物的研究使我们了解到海洋是生命的故乡，孕育 着种类繁多、数量巨大的海洋生物。近半个世纪以来，随着陆地资源的开发与 消耗待尽，人类将目光更多地投向了海洋。经过几十年的发展，对海洋的研究 与开发已进入到分子水平。在医药领域，实际上，从1 9 9 0 年开始发现的生物活 性天然产物已大部分来自海洋而非陆地。由于生源环境迥异，海洋天然产物往 往表现出令人兴奋的强生物活性，已成为先导药物和药物筛选的重要来源。 海洋天然产物的药用价值之所以受到越来越多的关注，主要有三个原因。 首先，在陆生药用动植物的活性物质研究中存在着个普遍的问题，单纯的一 种化合物往往只有很弱的生理活性，多个化合物的共同作用才起到令人满意的 作用，这对于药物开发是致命的困扰。目前，中药现代化所面对的主要问题也 在于此。相比较而言，单纯的海洋天然产物往往却能表现出很强的生理活性。 这可能是因为生源环境迥异，导致陆生生物机体对海洋天然产物缺乏耐受性所 致。其次，海洋天然产物的结构丰富多样，比如就菲蛋白源氨基酸而言就有近 百种，这是陆生天然产物所缺乏的。这为医药学、生物学、化学等多个学科研 究应用提供了丰富的资源。另外，提供海洋天然产物的生物量巨大。这包括两 个方面，一是种类繁多：海洋动物约1 8 万种，海洋植物约6 5 0 0 种，海洋真菌 约5 0 0 种，海洋原生物约1 2 0 0 0 种；二是产量巨大：浮游动物约2 1 5 亿吨，低 栖动物约1 0 0 亿吨，游泳动物约l o 亿吨，海洋植物约1 7 亿吨，总计约达3 4 2 亿吨。当然，海洋天然产物的研究现阶段仍存在采集上的困难，但随着采集技 术及海洋养殖业的发展，海洋天然产物的研究范围j 下在不断扩大。 海洋是人类未来药物的宝库。2 0 0 3 年报道的新的海洋天然产物超过7 2 0 个， 其中3 5 4 个被发现具有特定的生理活性( 如图f i gl 和f i 9 2 ) ；进入临床及临床 前期研究的海洋天然和修饰化合物已近5 0 个( 如图f i g3 ) 。从海鞘e c t e i n a s c i d i a t u r b i n a t a 中提取的e c t e i n a s c i d i n7 4 3 即将作为第l 个上市的海洋药物用于软组 织恶性肿瘤的治疗。这标志着海洋药物的时代已经来临。 。啦。，1 州d 。i 小“r l h u ( k 哪m 0 1 b i 当黑嚣裂黑= 鬻翟勰：! ：= ：案捌芝黜墨“”“”“” f i 3n i t k nd m id i 州1 h l l p r 卵n “_ t l “m a r c h l 吣l 篙掣嘴，：忠黠u n c l c i x 。e 忠思：温留：j 嚣嚣盔嬲 e c t e i n a s c i d i n7 4 3 d r u b s ：pdr u p b r i m “帅呻i n 一 l m ；m “ 应该看到海洋天然产物的开发应用不是单纯依靠分离提取就能解决的，还 需要多学科的参与。生化、药化及药理的构效研究将揭示其药用价值：化学合 成，生物发酵将使其药物应用成为现实。而这方面的工作还任重道远。本论文 从分离提取、文献调研以及合成设计三方面对三种不同的海洋天然产物进行了 初步的研究，初步探索了海洋天然产物科研课题的设立，为笔者今后的科研工 作奠定了基础。 2 l 一章海水m 嗥霹硫醢多* 的m r 展 第一章海水小球藻硫酸多糖的研究进展 1 1 引言 糖是一类重要的天然产物，尤其是多糖，一直以来都被视为动、植物体内 支持组织和贮藏能量的重要物质。近年来的研究发现某些多糖因增进机体免疫 功能而有抑制肿瘤、抗病毒等作用，这引起了人们的注意而研究者众多，也使 得关于糖类的传统观念被突破。 许多天然多糖和化学合成的多糖对于诸如艾滋病毒( h i v - t ) 、巨细胞病毒 ( c m v ) 、单纯疱疹病毒( h s v - l ，h s v - 2 ) 、流感病毒等的抑制作用已被持续深 入地研究“；天然多糖所具有的抗逆转录病毒活性也被不断地揭示出来5 一。目 前，在各种多糖及糖复合物( 脂多糖、糖蛋白及糖肽) 中硫酸多糖的研究已成 为多糖研究中的一个热点。硫酸多糖是指糖羟基上带有硫酸根的多糖，又称为 多糖硫酸酯，例如硫酸葡聚糖、硫酸戊聚糖、硫酸香菇多糖、硫酸半乳聚糖、 岩藻依聚糖和卡拉胶等。这类多糖具有显著的抗病毒活性。因此倍受关注。 海藻是一种丰富的、可再生的海洋资源，研究表明海藻可作为硫酸多糖的 主要来源，同时海藻硫酸多糖及其相应生理活性的多样性也为硫酸多糖的药物 开发提供了广阔的前景，最近，鉴于海藻硫酸多糖抗病毒功能的大量实证。一 些食用性海藻更是被视为一种可预防艾滋病的健康食品8 。根据细胞内所含色素 的不同，海藻可主要分为绿藻( c h l o r o p h y t a ) 、红藻( r h o d o p h y t a ) 和褐藻 ( p h a e o p h y t a ) 三种。对于红藻和褐藻硫酸多糖已有较多研究，国内从红藻( 例 如：麒麟菜) 和褐藻( 例如：海带) 等中提取硫酸多糖也已有许多报道9 。但是 对于海洋绿藻，特别是海水小球藻硫酸多糖的研究，目前基本上还是空白。这 在很大程度上可能是受到藻类个体大小的限制，红藻和褐藻中有许多大型藻类， 便于采集；小球藻个体较小，得依靠养殖才能得到足够的研究材料。然而，海 水小球藻是一种广泛分布的绿藻，具有对温度、熊度等变化适应能力强，繁殖 快，培养简便，适合大规模养殖的优点。1 9 6 2 年，日本学者y a m a g i s h i 曾报道了 小球藻对胃溃疡有治疗作用：近年来，国内的一些研究也表明小球藻具有防止 消化性溃疡、抗肿瘤、增强免疫、抗辐射、抗病原微生物、防止贫血、降血脂、 抗动脉粥样硬化等多种生理保健功能m 。有鉴于此，本课题组近年来以海水小球 藻( c h l o r e l l aa u t o t r o p j c a ) 为研究对象，开展了分离提取硫酸多糖并进行构效关 $ 一章海$ 小镕# 畦多* 日r 展 系研究的工作。本章将在介绍海藻硫酸多糖研究进展的基础上重点探讨海水小 球藻硫酸多糖的研究工作。 1 2 硫酸多糖的研究进展 硫酸多糖包括从植物中提取的各种硫酸多糖、肝素、天然中性多糖的硫酸 衍生物及人工合成的各种硫酸多糖。它们具有广泛的生理活性，其中最引入注 目的是抗病毒和抗凝血活性。目前，生理活性、构效关系及临床应用是硫酸多 糖研究的主要内容。 1 2 1 硫酸多糖的生理活性 1 2 1 1 硫酸多糖的抗凝血活性 研究表明具有强阴离子性的硫酸多糖一般都表现出不同程度的抗凝血活 性，其中肝素的抗凝血活性最早为人们所认识。肝素存在于动物的脾、肺、肝 脏和肌肉中，以有抗凝血活性而著称。最近的研究发现低分子量的右旋糖硫酸 酯以及硫酸化的苔藓葡甘露聚糖具有显著的抗凝血和抗血栓活性，前者更是作 为抗血栓药物已应用于临床。 1 2 1 2 硫酸多糖的抗病毒活性 上世纪八十年代末的研究发现几种聚阴离子物质可有效抑制h i v 的复制幢。 随后，美国国家癌症研究所在对海洋无脊椎动物的筛选中发现，其水相提取物 显示了高百分率( 2 3 ) 的抗h i v 活性，活性组分主要是硫酸多糖n 。这些结 果引起了人们对硫酸多糖抗病毒研究的关注。近年来在这一方面的研究持续深 入，逐步揭示出硫酸多糖抗病毒活性的机制。大多数硫酸多糖和其他聚阴离子 物质可干扰反转录病毒和其他病毒的吸附和侵入。在体外的实验中，硫酸葡聚 糖和其他硫酸多糖在剂量低于细胞毒水平。就可完全抑制h i v - 1 复制”。 n a k a s h i m a l 6 4 。b a b a l 5 a 和u e n 0 1 7 等人阐明了低分子量和高分子量硫酸葡聚搪，肝 素，多聚硫酸木聚糖，核聚糖及甘草皂素对h i v - 1 的细胞毒活性。这一话住是 通过硫酸多糖中带负电的硫酸基与h i v - 1 蛋白外壳g p l 2 0 上带正电氨基酸的相 互作用来实现的”，作用的结果干扰了h i v - 1 对c d 4 + 细胞( t 淋巴细胞) 的吸 附，抑制了病毒诱导的合体细胞的形成，亦就抑制了h i v - 1 对c d 4 + 细胞的感染 第一章海水小球藻硫畦尊糟的研冀进晨 系研究的工作。本章将在介绍海藻硫酸多糖研究进展的基础上重点探讨海水小 球藻硫酸多糖的研究工作。 1 2 硫酸多糖的研究进展 硫酸多糖包括从植物中提取的各种硫酸多糖、肝素、天然中性多糖的硫酸 衍生物及人工合成的各种硫酸多糖。它们具有广泛的生理活性，其中最引人注 目的是抗病毒和抗凝血活性。目前，生理活性、构效关系及临床应用是硫酸多 糖研究的主要内容。 1 2 1 硫酸多糖的生理活性 1 2 1 1 硫酸多糖的抗凝血活性 研究表明具有强阴离子性的硫酸多糖一般都表现出不同程度的抗撮血活 性，其中肝亲的抗凝血活性最早为人们所认谀。肝索存在于动物的脾、肺、肝 脏和肌肉中。以有抗凝血活性而著称。最近的研究发现低分子量的右旋糖硫酸 酯以及硫酸化的苔藓葡甘露聚糖具有显著的抗凝血和抗血栓活性“，前者更是作 为抗血栓药物已应用于临床。 1 2 1 2 硫酸多糖的抗病毒活性 上世纪八十年代末的研究发现几种聚阴离子物质可有效抑制h i v 的复制1 2 , 随后，美国国家癌症研究所在对海洋无脊椎动物的筛选中发现，其水相提取物 显示了高百分率( 2 3 ) 的抗h i v 活性，活性组分主要是硫酸多糖”。这些结 果引起了人们对硫酸多糖抗病毒研究的关注。近年来在这一方面的研究持续深 入，逐步揭示出硫酸多糖抗病毒活性的机制。大多数硫酸多糖和其他聚阴离子 物质可干扰反转录病毒和其他病毒的吸附和侵入”。在体外的实验中，硫酸萄聚 糖和其他硫酸多糖在剂量低于细胞毒水平就可完全抻制h i v - i 复制”。 n a k a s h i m a ”。，b a b a “6 和u e n o ”等人阐明了低分子基和高分子量硫酸葡聚搪，肝 素，多聚硫酸木聚糖，核聚糖及甘草皂素对h i v - 1 的细胞毒活性，这一活性是 通过硫酸多糖中带负电的硫酸基与h i v - i 蛋白外壳g p l 2 0 上带正电氨基酸的相 互作用来实现的”，作用的结果干扰了h i v - 1 对c d 4 + 细胞( t 淋巴细胞) 的吸 附，抑制了病毒诱导的合体细胞的形成，亦就抑制了h i y - i 对c o ；细胞的感染 附，抑制了病毒诱导的合体细胞的形成，亦就抑南, 3 - rh i v 1 对c 踊+ 细胞的感染 4 第一章海水d 藩碱畦多* 的日究遗晨 ”。一些研究也表明，硫酸多糖的抗h i v - 1 机制并不是单一的，有些是通过抑制 病毒的逆转录酶( r t s ) 的活性来实现的”。 与抗h i v - 1 病毒的机制相仿，硫酸多糖对其他被膜病毒也有抑制作用。例 如：单纯疱疹病毒h s v ，巨细胞病毒，流感a 型病毒，囊状胃炎病毒，反转录 病毒等1 5 a , 2 0 。最近的研究发现，硫酸戊聚糖可作为朊病毒感染( p r i o r id i s e a s e ) 的 预防和治疗药物孔；一些硫酸多糖还具有抗肝炎c 型病毒( h c v ) ”和抑制登革 热病毒感染人体细胞珏的活性。 1 2 1 3 硫酸多糖的其他生理活性 除了最受人们关注的抗病毒和抗凝活性之外，硫酸多糖，特别是从海藻中 提取的硫酸多糖还表现出其他一些具有潜在药用价值的生理活性。例如：从红 藻中提取的卡拉胶具有抗癌活性，最近发现其酶降解的低聚糖( 分子量1 7 2 6 ) 仍具有较强的体钋抗癌活性，有临床应用的可能”；而从绿藻石莼提取的石莼胶 经降解所得的硫酸多糖表现出抗高血脂的活性；另外，k a t a g i r i 等人发现硫酸 多糖与蛋白质发生作用可促进某些蛋白质的生理功能，如骨成形蛋白质”。 1 2 2 硫酸多糖的构效关系 许多研究显示，影响硫酸多糖生理活性的主要因素包括；硫酸基，多糖的 结构与构象，多糖分子量。 1 。2 2 1 硫酸基对硫酸多糖生理活性的影响 硫酸多糖的抗病毒活性首先源于其聚阴离子特性。实验表明硫酸多糖对病 毒的抑制作用可随着体系中聚阳离子( 如d e a e 一葡聚糖) 的加入而被抵消。硫 酸多糖的聚阴离子特性首先源至其分子中的硫酸基。这一点可从两个方面说明， 一是硫酸多糖在去除硫酸基后往往会失去其原有的生理活性，例如：卡拉胶具 有抑制疱疹病毒复制的作用，在去除硫酸基后这一活性也随之消失；二是一些 多糖硫酸化后的衍生物会显示出一些新的生理活性，例如；香菇多糖具有抗肿 瘤的作用，而不具有抗艾滋病作用，在硫酸酯化后则表现出显著的抗艾滋病活 性悖6 ，”。其次，硫酸基在多糖骨架上的分布也影响硫酸多糖的抗病毒活性。例 如：硫酸多糖抗病毒谱的不同，可能与硫酸基的分布有关加；单糖残基不同位置 硫酸酯化的半合成低分子量肝素表现出不同程度的抗凝活性”。此外，多糖硫酸 第一， 海$ m 球i 哦多* 日究t 根含量或硫酸化程度也是其生理活性的重要决定因素，但并没有一个固定的指 标。例如：对一系列硫酸多糖抑制单纯疱疹病毒的研究表明，当多糖中每个己 糖单位含一个硫酸基时，抑制活性最强；d ec t e r c q 的研究则显示，无硫酸根或 硫酸根含量不足的右旋糖和肝索钠无抗h i v - 1 活性，而当每个糖单位含有2 - 3 个 硫酸根时可获得最佳抗h i v - 1 活性3 0 。 1 2 2 2 结构与构象对硫酸多糖生理活性的影响 硫酸多糖的结构对其生理活性也有很大影响。一般匀多糖的硫酸酯抗病毒 活性大于杂多糖硫酸酯的活性。例如：m i z o m o t o 等报道，硫酸化匀多糖比硫酸 化杂多糖有更强的抗人类t 淋巴细胞病毒i i i 型活性1 5 b 。此外，硫酸多糖的高级 结构也是其活性高低的决定因素。研究发现，多糖主链柔性降低与抗病毒活性 升高相关联“。这在y o s h i d a 等人的研究中也得到应证：硫酸呋喃戊聚糖比硫酸 毗喃戊聚糖具有更高的活性。是因为呋哺环具有更大的刚性所致3 2 。 1 2 2 3 分子量对硫酸多糖生理活性的影响 硫酸多糖的生理活性与分子量也有很大关系，例如：实验表明，硫酸葡聚 糖的抗h i v - 2 活性随分子量的增大而增大，在m r = t 0 0 0 0 时达到最大，硫酸葡聚 糖抗其他囊膜病毒的能力也有近似的趋势2 0 b - 2 0 d * 与多糖硫酸根台量与生理活性 的关系类似，分子量对多糖生理活性的影响也没有一个量化的指标。 1 2 3 硫酸多糖的临床应用 硫酸多糖在临床应用上应有广阔的前景，但是分子量大引发的吸收问题以 及抗病毒和抗凝血活性所引发的冲突，是必须面对和解决的关键问题。 硫酸多糖是高分子化合物，药用时须通过机体的不同屏障。甚至细胞膜。 例如：硫酸葡聚糖在临床实验中通过胃肠系统的吸收很差，这样就很难达到足 够的血药浓度3 3 。因此，将硫酸多糖降解为易吸收的寡糖是临床应用的方向，然 而生理活性随分子量的变化也是必须考虑的问题。实验表明m r = 5 0 0 0 可能是一 个比较适中的选择。 硫酸多糖因其强阴离子性一般都表现出不同程度的抗凝血活性。对于抗病 毒活性来说，抗凝活性是一种副作用。目前。似乎只有卡拉胶和岩藻依聚糖结 合了高抗h i v - 1 活性和低抗凝特性，有可能应用于临床3 4 。对于大多数硫酸多糖 6 第一章讳 $ m 球藩硫目l 多曲日， 进展 来说，要有效应用于临床，必须有针对性的进行化学改造。 目前最为成功的硫酸多糖抗病毒药物是抗h i v 药物h o e b a y9 4 6 ，其化学成 分是木聚糖硫酸酯( m 户6 0 0 0 ) ，平均每个单糖残基含有1 8 个硫酸根。它是一 种蛋白激酶的抑制剂，可干扰h i v 穿透进入c d 4 细胞1 9 b 另外还有些硫酸多 糖正应用于临床，如：右旋糖硫酸酯，硫酸氨基多糖l 5 以及国家i 类抗艾滋病 新药聚甘古酯( 9 1 1 ) 3 5 等。但真正上市的硫酸多糖类药物并不多。 1 3 海藻硫酸多糖的研究进展 海藻是硫酸多糖的重要来源，硫酸多糖的研究与海藻多糖的研究密切相关。 首先g e r b e r 等人于1 9 5 8 年发现海藻g e l i d i u mc a r t i l a g e n i u m 琼胶具有抗病毒活 性”。之后，t a k e n o t o 等人于1 9 6 0 年鉴别出琼胶中抑制病毒的有效成分是一种 硫酸多糖”。进一步，琼胶的抗病毒谱也得以扩大，并且发现琼胶中的非硫酸化 多糖( 琼脂糖) 不具有抗病毒活性砖。从琼胶中抗病毒硫酸多糖被发现以来，许 多生物的或合成的具有抗病毒活性的硫酸多糖陆续被发现。 上世纪八十年代，出于对艾滋病a i d s 和疱疹病毒感染的治疗需要，海藻提 取物被重新系统地进行抗病毒筛选。结果发现，红藻水提物即可抑制d n a 病毒， 又可抑制r n a 病毒的侵染；并且可在被侵染细胞外部和内部都起作用。进一步 的研究发现，一种普遍存在的细胞壁多糖类物质卡拉胶是抗病毒的主要成分”。 卡拉胶的化学本质是硫酸半乳聚糖。关于卡拉胶的研究已经相当详尽，并还在 不断深入中。在此之后，从褐藻中提取的岩藻依聚糖也被发现具有很强的抗病 毒活性。如前节所述，卡拉胶和岩藻依聚糖结合了高抗h i v - 1 活性和低抗凝特 性，有应用于临床的可能。从红藻和褐藻中也提取到其他一些硫酸杂多糖，这 些多糖的抗病毒活性往往不高，丽抗凝血活性较为突出。例如：近年从褐藻 d i c t y o t am e n s t r u a l i s 中提取的硫酸多糖含有杂脱氧半乳糖，这一多糖被发现具有 较为显著的抗凝血活性柏。而从鄂霍沃克海的一种褐藻黑角菜中提取的岩藻依聚 糖表现出与肝素相同的抗凝血活性“。这表明多糖的高级结构对其活性也有很大 的影响。 对于海洋绿藻硫酸多糖的研究较少。目前所提取到的基本上都是硫酸杂多 糖引。这些多糖的抗病毒活性大多并不突出，但却具有其他一些生理活性。例如： 从石莼中提取的硫酸多糖具有抗高血脂和抗肝毒素的功能。然而，h a y a s h i 等人 第一| 海$ m 藻硫酸多* 的，。& 的最新研究表明，对于绿藻硫酸多糖的抗病毒活性也许要做重新审视。1 1 种源 至1 0 种绿藻的天然硫酸多糖和4 种合成的硫酸多糖被测试发现具有抗疱疹病毒 h s v l 的活性，其中一种合成硫酸多糖和两种天然多糖显示了强的抗病毒活性， 进一步的研究表明这些多糖不但能抑制病毒对宿主细胞的感染，对于已感染细 胞中的病毒复制也具有抑制功能”。 对于海洋微藻硫酸多糖的研究，如前所述由于受到藻个体的影响，基本上 还是一片空白。2 0 0 4 年，l e e 等人报道了从海洋微藻g y r o d i n i u m i m p u d i c u ms t r a i n k g 0 3 中提取的外多糖硫酸酯p - k g 0 3 具有抗心肌炎病毒的活性”。本课题组近 年也开展了这方面的研究“。首先，研究了从海水小球藻( m a r i n ec h l o r e l l a ) 、亚 心形扇藻( p l a r y m o n a ss u b c o r d i f o r m i s ) 和球等鞭金藻( i s o c h r u s i sg a l b a n a ) 2 _ _ 种海洋 微藻中提取的多糖，发现只有海水小球藻提取的多糖含有硫酸根；其次，建立 了海水小球藻硫酸多糖的提取工艺：目前，我们正在进行海水小球藻的扩养和 硫酸精多糖的积累。以期进行硫酸多糖结构和抗病毒活性的研究。 1 4 海水小球藻硫酸多糖的研究进展 1 4 1 小球藻的培养与收集 自养小球藻( c h l o r e l l aa u t o t r o p i c a ) 藻种，引自厦门大学生命科学学院。按 f 2 配方配制营养盐，在消毒的膜滤海水中，2 5 下，光暗周期1 2 1 9 1 2 h ，每天 摇振3 次，并在每次摇振2 0 m i n 后以血球记数板在显微镜下记数，于指数生长 术期离心收集( 4 5 0 0 r p ，1 5 m i n ) ，在6 0 c 下恒温至恒重，研磨成均匀粉术状，在 冲氮密封后于o 下保存备用。 1 4 2 多糖的提取 对于植物来源多糖的提取一般采用在不同介质及温度下的浸提法。在本课题 中，为得到一种简单、快速、高效、温和的方法，我们尝试了超声破碎方法， 采用原料与提取介质l ：2 5 ，3 种提取介质分别为h c i ( o 0 1 m ) 、蒸馏水( p h = 7 ) 及n a o h ( 4 ) 。具体操作是，准确称取小球藻干藻粉2 9 ，分别溶于相应的介质 中超声破碎( 脉冲p u l s eo n ：9 9 s ，p u l s eo f f - 3 3 s ；功率3 0 0 w ；频率2 0 k h z ) 1 0 r a i n ，相同超声条件超声破碎两次，两次中间用冰浴冷却因超声而发热的藻液， 然后在8 0 c 水浴中加热l h ，立即离心取上清液，此上清液即为多糖粗提液。 ，e 一| 海$ m j n n 多* b m & 1 4 3 多糖的定量测定 本实验采用葸酮一硫酸比色法测定多糖45 ，“。标准曲线制作：分别移取葡 萄糖溶液( 1 0 0 m g l ) 0 、0 0 5 、0 1 0 、o 3 0 、o 5 0 、o 7 0 m l ，用蒸馏水稀释到1 o o m l ，再加入4 0 0m l 葸酮试剂( 溶解2 9 葸酮于1 l 的优级纯浓硫酸中，当日配 制使用) ，迅速浸于冰水浴中冷却，待几个试管加完后，加盖，一起置于沸水浴 中准确煮沸l o m i n 后，冲水冷却，于室温平衡1 5 m i n ，用7 2 1 分光光度计测定吸 光值( , = 6 2 0 n m ，l = 0 5 c m ) 标准曲线如图l 。样品测定方法如标准曲线方法。 0 3 5 o 3 吸0 - 2 5 光o 2 值 a0 1 5 0 1 0 0 5 o o 2 04 06 08 0 含量u g m l 图1 - 1 硫酸一蒽酮法测定多糖标准工作监线 其样品浓度计算公式为： 旷坠瓮塑 c s 为样品浓度( m g m l ) ，a s 为测得样品吸光值，v s 为测量所取样品量( m l ) ，a o 为样品空白。 1 4 4 小球藻多糖的精制及初步分析 1 4 4 1 小球藻粗多糖中蛋白及色素的去除 根据本课题组在先前研究中利用t c a 法取得较高效率4 4 a , b 本实验中采用 用三倍体积乙醇沉淀1 4 2 中所得多糖粗提液，静置过夜，离心取沉淀。沉淀中 加入3 的t c a ，充分搅拌，至沉淀不再溶解，不溶解部分为蛋白质与t c a 结 9 第一章海女小# 藻m 畦多* 的研j ：r 合生成的絮状凝聚物。离心取上清液，用三倍体积无水乙醇沉淀上清液，离心 得沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤沉淀两次后，经p 2 0 5 真空干燥5 小时即得干燥 粗多糖。 1 4 4 2 小球藻多糖的分离纯化 根据比较，为取得感兴趣的硫酸多糖本实验中采用亲水性阴离子琼脂糖 d e a es e p h a r o s ef a s tf l o w ( p h a r m a e i a ) 进行粗多糖的分离纯化。将所购d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o w 产品按产品说明书预处理，真空脱气后装柱，柱规格为 庐1 6 x 2 0c n l 。2 0 0 m lp h = 7 2 的t r i s h c i 缓冲液平衡。浓度为3 4 m g m l 的粗 多糖水溶液在玻璃棒引流下缓慢加入平衡好的柱内，打开柱出口，待粗多糖溶 液完全渗入后加沈脱液沈脱，采用t r i s h c i 缓冲液和n a c i ( o 1 ，0 m ) 溶液浓度 梯度洗脱。手动每5 m l 收集一管，按1 4 3 中硫酸一蒽酮法测其吸光值。 1 4 4 3 小球藻多糖的红外光谱测定 为确定所提取的物质为多糖，本实验中采用k b r 压片法测定产物的红外光 谱。取0 1 0 5 m g 干燥的产物，与1 0 5 0 m g 干燥的k b r 粉末在红外灯下于玛瑙钵 中研磨均匀，研磨均匀的粉未经压片机压成薄片后即可进行测定。 1 4 4 4 小球藻多糖的硫酸根含量测定 目前报道测定硫酸根常用的方法主要有盐酸水解硫酸钡法47 、盐酸水解一 硫酸钡重量法“、b a c l 2 浊度法”、离子色谱法和联苯胺法”等。在本实验中采 用较为常用的经典的b a c l 2 浊度法。具体操作是，分别移取1 0 0 i _ t g m lk 2 s o 。标 准盐酸( i m o l l ) 溶液0 0 0m l 、0 0 5 m l 、0 1 0 m l 、0 1 5 m l 、0 2 0 m l 和o 3 0 m l ， 用水稀释到2 0 m l ，再分别加入1 o r a l8 的t c a 溶液和1 0 m l 氯化钡( o 5 9 氯化钡溶于1 0 0 m l 明胶溶液中，于4 保存，静置过夜) 溶液，振荡，静置1 5 m i n ， 用紫外分光光度计在3 6 0 n m 波长下测定浊度( l = l c m ) ，作为标准曲线( 图2 。 样品测定为称取1 0 m g 的多糖样品，加入盛有l m l 的h c i ( 1 m o l l ) 的水解管中， 充氮气密封，于l o o 下水解7 小时，冷却，用氮气吹干水解液，残渣用1 0 m l 去离子水溶解。同法作一空白样。分别移取0 1 m l 上述空白样和样品水溶液于 试管中，稀释到2 0 m l ，其余步骤同标准曲线的制作。 ，宵一 海水d 、球藻硫i 多糖的研究进展 吸 光 值 a 24681 0 硫酸根含量u g r a l 图1 - 2 硫酸根标准曲线 计算公式为： ，扭目 一爿oj + o 0 3 2 4 。跚一面而五一 c s 0 4 为样品中s 0 4 2 的浓度( i _ t g m l ) ，a s 0 4 为测得样品吸光值，a o 为样品空白。 1 4 5 结果与讨论 1 4 5 1 小球藻粗多糖产率 分别称取封存备用的小球藻( c h l o r e l l aa u t o t r o p i c a ) 藻粉各约2 9 ，加入提取 介质5 0 m l ，按1 4 2 中超声破碎方法进行提取实验所得的多糖在经过1 4 4 1 方法除蛋白及色素后用乙醇沉淀，离心、真空干燥后称重，其结果如表1 1 。可 以看出，在4 n a o h 介质中，粗多糖产率最高为1 2 0 2 ；其次为h 2 0 介质， 产率为7 6 7 ：在h c i 介质中粗多糖产率最低，为5 4 2 。 表1 - i 超声破碎法小球藻( c h l o r e l l a a u t o t r o p i c a ) 粗多糖产率 提取介质 干藻粉用量( 曲 粗多糖获得量粗多糖产率 5 0 m l ( r a g ) h c l ( 0 0 1 m ) 2 0 0 0 11 0 8 5 5 4 2 h 2 0 ( p h = 7 ) 2 0 0 2 l1 5 3 67 6 7 n a o h ( 4 ) 2 0 0 1 22 4 0 61 2 0 2 卫博“垤_；宝帆睨0 第一，t 海水d 、球藻n j 多* 的日r m & 1 4 5 2 小球藻粗多糖的红外光谱分析 图1 - 3 酸提粗多糖红外光谱图 a 3 3 0 6 ，b - 2 9 2 6 ，c 2 8 5 4 ，d 1 7 4 6 ，e 1 6 5 1 ，1 5 3 8 ，g 1 4 5 5 ，h 1 2 4 0 ，i 11 5 5 ，j 1 0 7 7 ， k 7 7 0 0 4 0 0 03 0 0 0 w a v e “n 。t u b e r s ( e t a - 1 r + 1 6 0 0 图1 - 4 水提粗多糖红外光谱图 a 3 3 7 7 ，b 2 9 3 1 ，c 1 6 5 1 ，d 1 5 3 8 ，e 1 2 3 8 ，f1 1 5 3 ，g 1 0 8 1 ，h 1 0 2 5 ，i 7 6 2 2 5水1hp=sit_t口no r d 第一章海$ m 球q 砬h 多$ 自目究进展 图1 5 碱提粗多糖红外光谱图 a 3 3 9 6 ，b 2 9 3 3 ，c 1 7 2 7 ，d 1 6 3 8 ，e 1 3 7 7 ，f 1 2 4 2 ，g 1 0 7 3 ，h 1 0 3 9 ，i 8 2 8 ，j 7 7 0 从图中可以看出，三种介质所提取得到的粗多糖具有相似的结构。从构成 方面该多糖主要由吡哺糖所构成。在官能团方面，在1 2 3 8 1 2 4 2c m o 处有明显 的吸收，证明了o s 0 3 一h 的存在。其他关于结构及官能团的信息如下表( 表1 - 2 ) 所述。 表1 - 2 种粗多糖红外谱图解析 吸收波数( c m 。1 1 振动方式或官能团 酸提粗多糖水提粗多糖碱提粗多糖 3 3 0 63 3 7 73 3 9 6 0 一h 伸缩振动 2 9 2 6 ，2 8 5 4 2 9 3 l2 9 3 3糖类c - h 伸缩振动 1 7 4 6 1 7 2 7 脂类c = o 伸缩振动 1 6 5 11 6 5 l1 6 3 8 酰氨基c = 0 伸缩振动 1 5 3 8 1 4 5 51 5 3 81 3 7 7 糖类c h 变角振动 1 2 4 01 2 3 8 1 2 4 2 硫酸基 1 1 5 5 1 0 7 7 1 0 8 1 ，1 0 2 5 1 0 7 3 1 0 3 9c o c ，c o h 7 7 07 6 27 7 0 仪一吡哺环对称伸缩振动 第一章* 女m 球藻r 多* 日究t & 1 4 5 3 小球藻粗多糖的分离纯化 称取4 5 。o m g 酸、水和碱提粗多糖分别溶于l o r a lt r i s h c i 缓冲溶液中，在 离心后取上层清液分别按方法1 4 4 2 进行柱层析实验。下图分别为酸、水和碱 三种提取介质下所得粗多糖柱层析所得的结果，在图中可以看出粗多糖在经过 d e a es e p h a r o s ef a s tf l o w 柱后有较好的分离效果。其中，酸提粗多糖和水提粗 多糖在经洗脱后有三个明显的组分峰，碱提粗多糖有两个明显的组分峰，峰型 对称，说明粗多糖中各组分基本得到了较好的分离。 吸 光 值 a 03 02 5 吸0 2 龄1 5 a 0 1 00 5 图1 - 6 酸提粗多糖的洗脱曲线 l591 3 1 72 l2 5 2 93 33 74 14 54 9 5 3 5 76 16 5 6 97 37 78 】8 5 8 9 9 3 洗脱体秘m l 图1 7 水提粗多糖的洗脱曲线 一阳一诣“叭 铀礼 慕慨= = l 皂 一叭拍孔 m h 蛆 。 昭 雅 昭 0 0 0 o o o 0 0 ) s 一章* $ d 、# 目e 多* 日究m & o 1 4 o 1 2 0 1 吸0 0 8 誊o 0 6 a 0 0 4 0 0 2 o - 0 0 2一 i 81 5z 22 93 6 4 35 0 5 76 47 l 7 88 5 洗脱体积m l 图1 - 8 碱提粗多糖的洗脱曲线 收集各组分峰，用3 倍体积无水乙醇沉淀，离心并真空干燥后称量。所得 精多糖量见下表。可以看出水提粗多糖的产率最高为5 2 2 ，其次为碱提粗多糖 4 3 7 ，酸提粗多糖产率最低为3 4 4 。因此，选择水和碱为提取介质较佳。 表1 - 3 d e a es e p h a r o s ef a s tf l o w 柱层析结果 精多糖实际获相对产率硫酸根含量相对含 得量( m g )u g m g 量 酸提粗多糖( 实际 3 4 4 上柱量2 1 8 m g ) p e a k l2 8 51 3 1 p e a k 22 4 5 1 1 2 p e a k32 2 01 0 1 1 7 8 ，41 7 8 水提粗多糖( 实际 5 2 2 上柱量2 3 2 m g ) p e a k l4 8 02 0 7 p e a k 23 。7 01 5 9 p e a k33 6 01 5 5 8 2 3 8 2 $ 一幸海水m l m i j i 丰看日：& 碱提粗多糖( 实际 4 3 7 上柱量2 3 o m g ) p e a k l1 1 65 0 p e a l ( 28 8 93 8 6 1 0 1 81 0 2 1 4 5 4 小球藻多糖的硫酸根含量测定 按方法1 4 4 4 分别测定三种粗多糖经过d e a es e p h a r o s ef a s tf l o w