（蔬菜学专业论文）茄子游离小孢子培养及其形态发育学观察.pdf

摘要 本试验选用了2 4 5 、2 3 9 、2 3 3 、2 0 8 、2 0 7 和1 9 2 这6 个不同的茄子二倍体栽培种， 就基因型、花蕾的选择、预处理方式及培养条件对茄子游离小孢子培养的影响进行了研 究和探讨，同时对小孢子在离体培养后的发育过程和培养产物的发育过程进行了观察。 试验结果如下： 1 茄子不同基因型之间愈伤组织诱导率和成茁率差异显著。在供试的6 种基因型间， 均有愈伤组织的形成品种2 4 5 的愈伤诱导率撮高，可达6 0 5 8 ：并且从中得到了 不定芽，其余5 个品种只有愈伤组织的增长，无分化。 2 研究了茄子花蕾外观形态与其内部小孢子发育时期之间的关系，结果表明：花瓣长 与花蕾萼裂基部之差可以作为茄子小孢子发育时期的判断依据。当花瓣长与花蕾萼 裂基部之差在0 2 m m 时，花药内小孢子多数处于单核期，适于茄子游离小孢子的培 养。 3 研究了低温、高温、变温、饥饿和活性炭预处理对小孢予存活率和维持小孢子活性 的影响，结果表明，各品种对处理的反应不尽相同，而变温处理和饥饿处理是比较 有效的预处理方式，特别是低温4 处理3 天，然后高温3 6 处理3 天的变温处理， 对6 个品种小孢子存活率的提高均有较好的结果。 4 对诱导培养基、碳源和培养基更换时间、激素等因素对6 个品种小孢子诱导的影响 进行了分别比较，筛选出茄子小孢子愈伤组织诱导的最佳配方。无菌水为初步的诱 导培养基，小孢子与花药黑暗共培养7 天，再弃去花药，转入附加了o 2 m g ，l 2 ，4 一d 、 0 5 m lz t 、i o m ln a a 和6 5 葡萄糖的新鲜的k m 培养基中，黑暗培养2 0 天 后可以获得大量的愈伤组织。 5 对诱导小孢子愈伤组织分化成苗的途径进行了初步探讨，结果显示以不附加任何激 素且琼脂的浓度为8 l 的m s 培养基的成茁率最高。对诱导的愈伤组织进行4 5 天的低温培养，有助于愈伤组织的再分化。 关键词：茄子；游离小孢子培养；预处理；愈伤组织；植株再生 i s o i a t e dm i c r o s p o r ec u i t u r eo fe g g p l a n ta n ds t u d i e so nm o r p h o i o g i c a id e v e i o p m e n t a u t h o rm a x j n m a j o r 0 1 e r i c u l m r e t u t o f s h e i is h u x i n g l i a n y o n g a b s t r a c t s i xd i 虢r c n te g g p l a n tc u l t i v a r sw e r eu s e di nm i ss m d y 酬u d i n g2 4 ，2 3 9 ，2 3 3 ，2 0 8 ，2 0 7 a n d1 9 2 t h ee 仃e c t so fg e n o t y p e ，趾t h e rd e v e l o p m e n tp 耐o d ，p r c t r c a t n l e n t 舭dc u l t u r e c o n d i t i o no nm i c m s p o r e 亡u l t u r ew e r es t u d i 甜a tt 1 1 es a f n et i i i l e ，t h ed e v d o p m e n to f m i c m s p o r ea f t e ri s o l a f i n ga n dm eg r o w i r 塔o f c a l l u sw e r eo b s e f v e d t l er e s u l t sa r ea sf 0 1 1 0 w s ： 1 t h e r ew e r ee v i d e n td i h c r e n c e si nc a i l u si n d u c t i o nr a t ca i l dp l a n t l e tf o r m a t i o nr a t co f d i f r e r e n te g g p i a n tg e n o f y p e s a m o n gt t i es i xg e n o t y p e st e s t e d e a c ho b t a i n e dc a l i u s 2 4 5h a d t h eh i 吐e s tc a l l u si n d u c t i o nr a t eo f6 0 5 8 s h o o t sa n dl e a v e sw e f eo b t a i n e df 如mi t o t h e r f i v ec u l t i v a r sd i dn o to b t a i ns h o o t so rl e a v e s 2 t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e na p p e a r a n c ec h a r a c t e ro fb u da n ds t a g eo fm i c r o s p o r ew a s s t u d i e dh e r e t h el e n g t hb e t w e e nt h ep e t a la n dt h eb a s eo ft h es 印a ls p l i ti st h es t a n d a 耐o f j u d g e m e n t w h e nt h el e n g mo fp e t a li s 2 m ml o n g e ro rs h o n e rt l a i lt h eb a s eo ft h es 印a i s p i i t ，m o s tm i c r o s p o r e sw e r ea tu n i n u c l e a t es t a g e i t ss u i t a b l ef o ri s o l a t e dm i c r o s p o r cc u l t i 】r e o f e g g p l a n t 3 t h ee h c c to fp r e t r e a t m e n to ns u r v i v a lr a t eo fm i c m s p o r ew a ss t u d i e db y5k i n d so f p r e t r c a t m e n ti n c l u d i n g4 ，3 6 ，c h a n g e dt e m p e r a t u r ei r e a t i n e n t ，n os u g a rt r e a t m e n l a c t i v a t e dc a r b o nt r e a i m e n t a tt h es a m et i m e ，t h ee m c i e n tp r e t r e a t i l l e n tt h a td e v a t i n g8 f i d m a i n t a n i n 譬s u i v er a t eo fm i c m s r cw a sc h o s e nf o rc o n d i t i o nt e s t t h er e s u l ts h o w e dt h a t d i f f e r e n tc u i t i v a r sh a dd i 肫r e n tf b e d b a c ka r e rd i f f e r e n tp r e t r e a t m e n t s c h a n g e dt e m p e r a t u r e t r c a t m e n ta n dn os u g a rt r e 她e n th a db e t t e re 贷e c to ns u r v i v a lr a t ef o r6c u l t i v a r s ，e s p e c i a l i y t h ef o r n l e rt r e a t m e n to f 4 p r e t r e a t m e n tf o r3d a y sm 肌3 6 f o r3d a y s 4 n os u g a rt r c a t f l l e n ta n dc o c u l t u r eo fm i c r o s p o r e sa n da n t h e r sw e r ec o m b i n e dt o i n d u c ec a i i u s 劬mi s o i a t e dm i c r o s p o r e s i n i t i a lc 0 c u l t u r eo f 行e s h l yi s o l a t e dm i c r o s p o r e s 赳1 d a n t h e r sw 嬲i ns t e r i l ed i s t i l l e dw 砒e rf o r7d a y si nt h ed a r k ，t 圭l e nm ea n t l l e r sw e r em o v e da w a y a n dt h em i c m s p o r e sw e r et r a n s f b r r e dt o 行e s i l l yk mm e d i u mw i t ho 2 m l2 ，4 d ，o 5 m l z t 1 o m ln 从a n d6 5 g i u c o s ei nm ed 盯k a 腑2 0d a y so f 静c u l t u r e ，s m a l ic a 【i iw e r e d e r i v e df 如mm i c m s p o r e s t h ei n d i v i d u a ie 任b c t so fi n d u c t i o nm e d i 啪，c a r b o nr e s o u r c ea n d t h ec h a n 画n gt i m eo f 雠s h l ym e d i 啪a n do m c rf a c t o r so ns i xg 嘶o t y p e sw e r ee v a l u a 主e di nt h i s s t u d mt h es u i t a b l em e d i u mt h a tb e f i f o rm em i c r o s p o r ed e v e l o p m c n tw a sf o u n d m e a n w h i l e t h ec a l i u si f i d u c t i o nr a t eo fe a i c hc u l t i v a r sw e r ee v a l u a t e da n dm ed i f f b r e n c e s b e t w e e ng c n o t y p e sw e r co b t a i n c d 5 t h ec a l l u s e sd e r i v e d 舶mi s o l 砒。dm i c r o s p o r ec u l t u r ew e r er e c u l t u r e df o rp l a n t l c t s f b m l a t i o n t h ew a yo fp l a i l n e if b 咖a t i o n 疗o mc a l l u sw a ss t u d i e d i ts h o w st h a t l eb e s t p l a n t l e lf o r t n a t i o nw a so b t a i n e d 的mt h ep h y t o h o 响o n e s f r c em sm e d i u mw i f ha g a r8 l t h ec u l t u r i n go f c a l l u sa t4 f o r5d a y sw a sb 黜e f i c i a lf o rc a l l u sd j 疏r e n t i a t i o n k e y w o r d s ： e g g p l a t l t ；i s o i a t c dm i c m s p o r ec u l t u r c ；p r e t r e a t m e n 七c a i i u s ；p l a n t l e tf o 腓a t i o n 缩写词 d h 晒 蹦 n l n i m n a a 2 4 一d 6 一b a z t k t a c l x p e g 缩略词表 ( a b b r e v i a t i o n ) 英文 d o u b l eh a d l o i d m e d i u mm u r a s h i g ea n ds k o o g k nk o aa n dh rm i c h a y l u k m e d i u mn i t s c ha n dn i t s c h ( i m p r o v e db yl i c h t e r ) 中文 双单倍体 m s 培养基 蹦培养基 n i t s c ha n d n i t s c h 培养基( 由l i c h t e r 改良) i n d o l e 一3 一a c e t i ca c i d 吲哚一3 一丁酸 卜n a p h t h a i e n e a c e t i ca c i d a 一禁乙酸 2 ，4 一d i c h l o r o p h e n2 ，4 一二氯苯氧乙酸 6 - b e n z y l a m i n o d u r i n e6 一苄氨基嘌呤 z e a l i n k i n e t i n a c t i v a t e dc a r b o n l u x p o i y e t h y l e n eg 1 y c o 玉米素 激动素6 一糠氮基瞟呤 活性炭 勒克斯 聚乙二醇 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑! 堡垒些盘堂或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：马坎 签字日期：吒年占月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑些盔些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权塑! 垦壅些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印? 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：弓绽 签字口期：伽年月j 日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 翮虢忙 签字日期：歹年f 月吵r 电话： 邮编： 茄f 游离小孢于培养及其形态发育学观察 1 引言 茄子( 勋肠n “m 8 0 n 譬al ) ，茄科( s o l a n a c e a c ) 茄属，雌幼嫩浆果为产品的一年生草本 植物，染色体数2 n = 2 x = 2 4 。茄子在我国栽培历史悠久，类型品种繁多，一般认为中国是茄子的 第二起源地，茄子在全世界都有分布我国栽培面积广泛，产量居世界之首l l i 。茄子营养丰富， 其中富含的维生素p 在果蔬中含量最高，可以增加毛细血管的弹性和细胞间的黏力，防止微血管 破裂，特有的维生素d 可以降低血液中的胆州醇含量因此得到人 j 的广泛喜爱和种植。茄子在 我国是非常重要的果菜类蔬菜之一，在细胞学、分子生物学和遗传育种等方面也是非常重要的研 、 究对象。 单倍体育种主要是指通过花妁培养或游离小孢子培养的方式得到单倍体植株，然后经过秋 水仙素等处理加倍为烈单倍体，从而直接获得纯化的品系或将其作为育种过程中的中间材科或亲 本的育种方式。在茄子育种i ：作中，臼交系的选育是非常重要豹工作，但往往存在选育周期长等 问题。单倍体育种是解决这一问题的重要的育种方法之一，可以大大提高育种选择的效率，缩小 育种群体韵规模，并缩短育种年限。花曲和小孢f 培养是获得单倍体的主要途径。经花药培养得 到的花粉株系间性状变异幅度人超亲现象和出现特殊优良性状的频率要显著高于常规育种：株 系内性状整_ 卉，世代间稳定性强：通过花蓟或小孢二f 培养选育出的自交系具有高度的纯年i f 性以 此配制的杂交纽台往往具有更慢的杂种优势。为此，单倍体育种技术在世界各国得到了j - 泛深入 的研究，在茄子单倍体育种技术的研究方面也取得了显并成果。 早在1 9 6 4 年，印度德里入学的g u h a 和m a h e s h w a f t l ，自毛叶曼陀罗( d a 眦i n “i a ) 花药 进行培养得到单倍体植株，此后，义相继有烟草( n i c o t i a n at a b a “m ) 和水稻( o r y z as a t i v a ) 成 功地得到了单倍体的报告1 4 5 6 l 。在园艺作物中花药培养的研究开展地比较早的是十字花科植物， 1 9 7 0 年t k a m e y a 离体培养甘蓝花药获得花粉植株：1 9 7 3 年邓立平等用大白菜花药培养获得单倍 体植株；1 9 7 7 年，钟仲贤等进行小白菜、甘监和人向菜的花药培养也获得了单倍体幼苗”】。 茄科植物开展这方面的研究也比较犁。1 9 7 1 年s h a r p m 等从番茄的游离花粉中得到了单倍体 愈伤组织；1 9 7 2 年g r c s h o 斤、i y e r 等通过花药培养经愈伽组织途径分别获得了番茄、茄予的单倍 体植株p 10 l ；1 9 7 7 年，高秀云等i l ”从番茄花药中得到了胚状体，说明了从胚状体途径形成单倍体 植株的可能性。t u b e r o s ar 等”“培养茄子花药成功的通过胚状体途径成苗，并观察了单倍体植株 的形态特征。蔡奇助( 台湾，1 9 9 0 ) 应j 日茄子花筠培养经愈伤组织途径获得一株单倍体植株。辣 椒也是蔬菜作物中最早进行花药培养并取得成功的例子之一。1 9 7 3 年，王玉英”、k u o i “l 、g e o f g e 和n a r a y a n s m m y l ”1 报道了单倍体植株的获得；目前北京市海淀区组织培养研究室的工作已经达 到实用化，花培品种“海花系列”已得到推广种植。与花药培养相比。小孢子培养开展的并不娩， 但进展缓慢。最早是s h i m a i 【u i a ( i 9 3 4 ) ，以紫路革减数分裂中期的花粉母细胞在蔗糖溶液中培养 结果有2 0 一4 0 产生四分体f ；到了8 0 年代，有效的游离小孢子培养体系被k y o 和h a r a d a f l l ”j 在烟草上建立起来，并且进行了小孢子离体萌发和离体胚胎发生的调控研究。8 0 年代后期游离 小孢子培养在十字花科的油菜上得到了迅速发展。1 9 8 9 年，日本学者s a t 0 【1 1 在进行大白菜游离 小孢子培养时从一个品种中得到了小孢子胚和再生植株。茄科植物的小孢子培养研究开展得也较 河北农业夫学硕十学位( 毕业) 论文 早，k y o 和i r n a m u r a 口已经在烟草上获得成功。m i y o s h i 在1 9 9 6 年川直接游离小孢子培养的方法 经愈伽组纵途径得剑再生植株口“。连勇f 2 可于2 0 0 2 年应州小孢于培养的方法获得人蛙体细胞融合 杂种株的小孢子再生植株。一般认为茄科植物对小孢于培养比较敏感，但是不同的植物间反差也 很火，例如，烟草小孢子的培养系统就建立得比较完善，广泛应h j 丁_ 研究及调：肖雄核发育的各种 因素。而类似褡茄年l i 辣椒簿茄科植物就很难诱导成苗。小孢子培养在部分十字花科植物中发展较 好同样在部分作物中发展相当缓慢。 小孢子培养与花药培养相比优点在于，可以排除花药壁、花药隔等体细胞组织的影响：培养 中不存在花粉竞争闷题，可以培养得到较多单倍体材料；小孢子培养能在更大的基冈烈范围内以 更高频率诱导小孢子愈伤组织发生。随着科学技术的发展，小孢子培养应用范围日趋广泛： ( i ) 基础科学中对小孢子在培养过程中脱分化，再分化及细胞内的相应生理生化变化的研究。对实验 胚胎学、生理学和分子生物学中基因表达取i 调控机理的研究也部有很大帮助。( 2 ) 由于小孢子 数量大单个状态体积小且形态均一，因而便于在人工控制条件下研究其生长、分化和遗传转化 过程，例如人工诱变花粉、染色体功能鉴定等。( 3 ) 小孢子植株隐性性状容易表现，因而植株 类型多样，同时可咀得到纯台的单倍体、双单倍体以及异源附加系和代换系，提供了多种遗传分 析材料，加速了育种进程。( 4 ) 小孢子为单细胞，具有天然的分敞性，数量巨人。易丁获得， 所以小孢子培养具有与单细胞微生物系统相似的所有优势，加上小孢子胚胎发生和植株再生能力 强，网而能h j 于胚胎兜隆和i 新基冈型或突变体的人量快速繁殖。( 5 ) 从分子生物学角度看，单 倍体的重要意义还在丁通过此法所建立起米的双单倍体群体( d o u b k d _ h a p l o 耐p r 0 铲n i 嚣) ，冈为 d h 群体在遗传上是纯合的基因组，所以是a f l p 、r a p d 、s s r 等分子标记雨l 基冈 蚓谱的理想材 料，可避免二倍体由于来自双亲的两条染色体在d n a 碱基分子碱基序列的细微差异从而人人 提高基因定位标图的准确性。 茄子游离小孢子培养技术在今后的育种和基础研究上作中具有广泛的应用前景。但是，小孢 子培养本身有一些机制还不明了。诱导率不高是目前实际应用一f ：作中的一入障甜。基因型的差异 也导致许多优良的单橼或品系不能快速通过单倍体途径应用于杂交育种中。目前的研究多为单因 子水平上的研究，对影响诱导率的各因子之间互作效应的研究极少。小孢子培养的启动机理也仅 是在猜测、探讨之中。为克服以上几方面问题，建立一个完善高频率的茄子小孢子再生体系t 必 须同时加强技术和理论两方面的研究。不仅要摸索和改善小孢子培养过程中的各种方法和技术， 还应该深入了解和探讨小孢子的发育途径、启动机理、诱导机制及其与生理生化、遗传因素的关 系。从而使小孢子培养技术不仅可以直接应用于遗传和育种实践中而且能够成为应_ 【l jr 其他生 物技术的桥梁。 奉试验宦在通过一系列尝试性试验对茄子小孢子培养技术进行初探，目的是研究基阕型、小 孢子发育时期、培养技术、培养条件等诸多因素对茄子小孢子培养的影响：通过研究花蕾外部形 态与内部小孢子发育时期的关系，对比低温、高温、变温、饥饿和活性炭等预处理方式对小孢子 存活率的影响，对游离小孢子采用饥饿处理和与子房、花药共培养的方法诱导愈伤组织，比较激 素、碳源等因素对愈伤组织诱导的影响，来研究有效提高小孢子愈伤组织诱导率的培养条件和因 素，探索一条适于茄子小孢子培养的新途径。 2 茄子游离小孢子培养及其形态发育学观察 2 1 材料 2 1 1 材料选择 2 材料和方法 6 个供试的二二倍体栽培种分别为：绿抗( 2 4 5 ) 、春喜十a 号( 2 3 9 ) 、黑帅( 2 3 3 ) 、快圆 茄( 2 0 8 ) 、黑茄乇( 2 0 7 ) 平i 川、茄子( 1 9 2 ) 。均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所茄子育种 组提供。 各供试品种丁2 0 0 5 年春播种。4 月底定植丁露地，n 三常田间管理。 2 ，1 ，2 试验材料的采集 幼苗定植后3 0 大，植株进入花期定；肼击掉植株上已开的花，使植株总处于花期状态。 取发育正常的花蕾。将花蕾按花瓣妖与萼裂基部之箨人丁2 m m ，o 2 m m 和小于o 分成三个等 级，因备供试品种的开花量不同，所以取材的数量_ ；尽相同。 2 2 研究内容与方法 2 2 1 小孢子发育时期的检测 从花蕾中剥出花药，放在载玻片上，加一滴无菌水，圳小刀轻压花药挤出花粉，加盖玻片， 在显微镜下观察小孢子发育时期井拍照。 对花蕾外观形态的观察指标包括：花瓣k 与萼裂基部之羞、花瓣颜色和花药颜色。对小孢 子发育期观察包括：花粉母细胞期、四分体期、单核早期、单核靠边期、双核花粉期象i 三核花 粉期。 2 2 2 花药的预处理 2 22l 花营的消毒与接种 在盛花期选取处于单核期的花蕾，先用7 0 酒精浸3 0 秒，然后用6 5 次氯酸钠溶液表面 消毒1 5 分钟。最后用无菌水冲洗3 q 次。在超净台上从花蕾中剥出花药置于花药预处理培养基 上，每个培养皿放两个花蕾的花药，设三次重复。 预处理培养基：m s + o 2 m g ，l2 4 一d + 0 5 m g ，lz t + o 6 琼脂+ 2 蔗糖 2 2 2 2 花药的预处理 对花药进行下列预处理： ( 1 ) 低温处理 将花药接种在预培养基上，放入4 冰箱中黑暗培养。 河北农业人学硕+ 学位( 毕业) 论文 ( 2 ) 高温处理 将花药接种任预培养基上放入3 6 恒温箱中黑暗培养。 ( 3 ) 变温处理 将接种后的花药放入4 冰箱中黑暗培养，然后转入3 6 恒温箱中黑暗培养。共设9 个处理， 见表l ： 表1 花药的九种变涅处理 t a b l e in i 眦k i n d so f c h 柏窖。d 衙n p e 豫t u 即订髓砷e n f o ra n 出e r s ( 4 1 饥饿处理 将花药接种在无碳源无激素的预培养基上。2 5 恒温黑暗培养。 ( 5 ) 活性炭预处理 将灭菌后的花药接种在盛有不同浓度活性炭的预处理培养基上，置丁i2 5 _ 卜- 黑暗培养。浓度 设置为h i = l g ，l ，h 2 = 2 9 ，l ，h 3 = 3 9 ，l 。 ( 6 ) 对熄：将花药接种在预培养基上，2 5 恒温黑暗培养。 茄子小孢子存活率的测定方法：对经过预处理的花药进行小孢子的游离将小孢子接种到液 体诱导培养基上后，用倒置显微镜镜检，每个培养皿选取4 个视野内的小孢子计数记录所见小 孢子中膨大的数量及干瘪萎缩的小孢子的平均数量，计算小孢子存活率。计算公式是： 存活率= 膨大的小孢子数量，视野中所有小孢子数量( 包括膨人的和干瘪的小孢子) 。 + 试验共设六个处理，每个处理三次重复，每个重复l o 个培养皿，其中五个处理的处理时间 均设置为2 ，4 6 天。变温处理设置为l ，2 ，3 天。 2 2 3 小孢子的游离和愈伤组织的诱导 2 2 3 1小孢子的游离 从经过预处理的花药中选取膨大、黄绿色的花药，从其中部切一刀，并轻按花药将，j 、孢子游 离于液态诱导培养基中，每个培养皿5 m l 培养基用血球计数板调小孢子密度为4 1 0 3 个 n l ， p a n l m 封口。 2 2 3 2 培养条件和环境因素对愈伤组织诱导的影响 ( 1 1 花药、子房共培养对愈伤组织诱导的影响 初培养以无菌水作为诱导培养基进行愈伤组织的诱导。并同时进行子房与小孢子按培养、花 药与小孢子共培养和小孢子单独培养兰个处理，处理时间设置为3 ，5 ，7 天，黑暗培养。然后弃 去共培养的子房或花药，将小孢子转入新鲜的附加了激素的k m 培养基中继续进行黑暗培养直 到愈伤组织颗粒出现。再移至光下进行培养，光强2 0 0 l o l x ，光照1 4 h ，d 。每个处理重复三次。 子房与小孢子共培养： 耗药被切下后，同一花蕾中的子房也被切下，用固体诱导培养基( m s ) 在2 6 黑暗条件f 4 茄子游离小孢于培养及其形态发育学观察 培养3 4 天，再将子房转移到无菌水中，直接与小孢子接触，进行共培养。然后弃去于房，将小 孢子转入新鲜的k m 培养基中继续进行黑暗培养。每个培养皿放l 一2 个子房。 花药与小孢子共培养： 将花药直接放入无菌水中，用刀在花药中部切一刀，并轻轻挤压花药释放出小孢子，共培养 结束后，移出花药，将小孢子转入新鲜的k m 培养基中继续进行黑暗培养。每个培养皿放4 5 个 花药。 愈伤组织诱导率的计算公式：愈伤组织诱导率= 产生的愈伤组织数，游离的花药数 ( 2 ) 碳源和更换墒养基时间对愈伤纽纵诱导的影响 以7 5 的葡萄糖、2 的蔗糖和3 的麦芽糖作为碳源，更换培养基的时问设置为1 5 天、2 0 天和3 0 天。 培养基的更换：初始培养后，将小孢子悬浮液离心并吸出上清液，每个培养皿重新加入5 m 1 相同糖浓度豹新鲜诱导培养基，以后每隔一定天数更换一次相同糖浓度的新鲜诱导培养基。( 3 ) 激素对愈伤组织诱导的影响 在k m 培养基中加入不同浓度的激素，比较六种不同激素对愈伤组织诱导的影响。各激素浓 度见袭2 ： 裹2 不同浓度的激素 1 曲l c 2p h y t o h o n n o 畦o f d i 脯他n tc o n c c n 岫6 0 n 注：艰位m g ，l ) ( 4 ) 基因型对愈伤组织诱导的影响 对6 个供试品种分别进行以上各处理，比较不同6 种之间异培养因素年l i 培养条件对愈伤 组织诱导影响的差异。 2 2 4 再生植株的获得 ( 1 ) 不定芽诱导培养基 a l ； m s + 2 蔗糖 a 2 ：m s + 1 蔗塘 a 3 ： m s + o 1 m g ，li a a 十2 o r n 扎z t + 2 蔗搪 a 4 ： m s _ 卜o 1 m 班i a a + 2 0 l l i 班z t + 1 蔗糖卜1 活性炭 ”：l 2 m s + 2 蔗潞 a 6 ： l 2 m s + 1 蔗糖 ( 2 ) 生根培养基 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 b l ：m s + 2 蔗糖 b 2 ： m s + o 1 m 班i a a + 2 蔗糖+ 1 活性炭 b 3 ： m s + o 1 m g ，l 从a + 1 蔗糖+ i 活性炭 b 4 ： m s + o 2 m g ，li a a + 2 蔗糖+ 1 活性炭 b 5 ：m s 十0 2 m 玑i 从+ i 蔗糖+ 1 活性炭 b 6 ： l 2m s + 0 1 m g ，ll 从+ 1 蔗糖+ 1 活性炭 + 各培养基添加琼脂7 o g ，l ，调p h 值为5 8 ，经1 2 i 、l s 分钟高压灭菌。 2 2 4 1不定芽的诱导 挑选颗粒直径大、淡黄绿色、紧实的愈伤组织接种于不定芽诱导培养基上每个培养皿接十 个外植体。6 次重复。将愈伤组织分别做两种处理： 将接种的愈伤组织在4 低温生长箱里诱导5 天，再在正常温度和光照“f 培养； 正常培养条件；白天温度( 2 6 1 ) ，晚间温度( 2 2 1 ) ，光强2 0 0 0 l x ，光照1 4 h ，d 。 更换培养基：将产生的愈伤组织更换至附加2 蔗糖和8 9 ，l 琼脂的新鲜m s 培养基上， 以后每隔一定天数更换一次附加2 蔗糖和8 9 ，l 琼脂的新鲜m s 培养基。 2 2 4 2 再生植株的生根 待再生植株砼至2 c m 以上时，白基部切下( 勿带愈伤组织) 移至生根培养基上培养条件同 上。 6 茄子游离小孢子培养及其形态发育学观察 3 结果与分析 3 1 花蕾外部形态与小孢子发育时期之间的关系 结果表明，茄子花蕾的外部形态与小孢于的发育时期有定的关系。本试验以花瓣长与花蕾 萼裂基部之差作为判断小孢子发育时期的基本指标( 见表3 ) 。当花瓣长与花蕾萼裂基部之著大 r2 m m 时，人部分小孢子处于成熟花粉期：当花瓣i 丈与花蕾萼裂基部之羞小于0 时，人部分小 孢f 处丁：小孢子母细胞期；当花瓣j 殳与花蕾萼裂基部之莘在0 2 m m 时，大部分小孢子处于单核 期，较适于小孢子培养。住供试的不同发育阶段的小孢子中，花粉母细胞、四分体以及成熟花粉 细胞均没有观察到进一步脱分化、细胞发生分裂的现象。 表3 花蕾外部彩态与小孢子发育时期之间的关系 1 h b l c 3n cr c l a t i o n s h - pb e t w e 胁m 。a p p 髑m n c cc h 删c ro f b u d a n dt h cd w d o p m 翎ts t a g c0 f m i c s p o 托 7 塑苎垒些查羔堡堂丝! 芝些! 笙苎 3 2 花药预处理对小孢子存活率的影响 3 2 1 温度处理对小孢子存活率的影响 试验包括4 、3 6 和变温处理三种处理，处理开始后分剐在2 ，4 和6 天检测6 个品种的小 孢子存活率。并以培养在2 5 黑暗中的花药为对照，结果如表4 所示。 2 4 5 在4 低温处理过程中随培养时间的延长，小孢子存活率呈逐渐降低趋势，而3 6 条件 下，6 天的培养表现出较高的小孢子存活率，达到4 7 0 4 ，井且从小孢子死亡率的降低来分析， 此条件下的死亡速度都相对于对照降低了，起到了维持小孢子存活率的作用，因此3 6 6 天的处 理方式较适于2 4 5 的培养；2 3 9 在4 条件下2 天的处理获得较高的小孢子存活率，但3 6 条件 下4 天和6 天处理的小孢子存活率达到3 l - 3 2 ，明显高于4 的处理，所以3 6 6 天的处理更适 于2 3 9 的培养；2 3 3 经过4 和3 6 处理后的小孢子存活率均高于对照尤其是在3 6 条件下6 天的处理，小孢子存活率达到2 9 3 8 ，但小孢子死亡率的下降却低于对照，并不能有效维持小孢 子的存活率因此两种处理方式都不适1 ：2 3 3 小孢子的培养；2 0 8 经过两种处理后的小孢子存活 率没有很大变化，对温度并不敏感，两种处理方式都不适于2 0 8 的培养；2 0 7 对高温敏感3 6 条件下各个处理的小孢子存活率均低于对照低渝处理2 天，4 天和6 天后的存活率相对对照分 别增长了4 2 9 3 、t 8 0 ，9 5 和5 4 6 ，6 7 ，所以低温6 天预处理更适合2 0 7 ；1 9 2 在4 2 犬的处理 是所有处理中效果最好的，但两种温度处理都不能有效维持小于毡子的存活率，都不适丁1 9 2 的培 养。 表4 4 和3 6 镁处理对茄子小孢子存活率的影响 n b l e 4 e 侬t so f 4 鲫d 3 6 晒咖t o n i h cs u m m e c o f t h e m i c r o s 他 品种处理小孢子存活辜( )相对对照增减( )4 d 相对2 d 6 d 相对4 d c u l t i v a r sn 髓h t 啪乜2 d4 d6 d2 d4 d6 d 降低( l降低( l 2 4 54 2 7 3 i 1 49 25 1 l1 2 i 4 97 1 6 9 1 8 l l帖3 76 5 7 5 3 6 1 0 0 72 6 3 64 7 ，0 4 1 8 3 32 ，3 46 5 3 月s1 6 1 7 7 7 84 5 对照1 2 3 38 6 96 “2 9 5 2 2 8 1 9 2 3 94 1 6 2 71 3 4 27 3 53 7 4 23 2 4 893 81 7 5 2 4 5 2 3 3 6 1 2 5 62 7 8 93 1 3 26 0 81 7 5 3 23 6 60 71 2 2 0 5 - 1 2 3 0 对照 l l8 4 1 0 1 36 7 2 1 4 “3 36 6 2 3 34 1 7 3 61 94 i7 3 i6 6 7 61 6 4 4 47 l1 91 i8 i 6 2 3 4 3 6 l i 2 42 75 22 9 3 8 7 9 72 7 4 9 35 8 8 0 61 4 4 8 4- 6 7 6 对照l o 4 l7 3 4 4 2 72 9 4 94 1 8 3 2 0 84 7 ，3 21 0 、1 76 4 51 6 3 82 2 5 3 i9 0 0 3 8 9 3 3 6 5 8 3 6 1 2 9 31 4 5 48 2 71 0 s 5 67 5 1 85 2 5 9 1 2 4 54 3 1 2 对照 6 2 9 s 3 05 ，4 2 3 f 蛳3 4 7 0 2 0 74 1 3 2 41 1 8 08 7 34 28 31 8 0 9 55 4 6 6 71 0 8 8 2 6 0 2 3 6 8 3 23 s go o o 1 0 2 s 1 4 7 6 - i 0 0 l 舳5 91 0 0 ，0 0 对照 9 2 74 2 01 3 55 4 6 96 7 s 6 1 9 24 1 5 3 8l i 4 05 9 48 7 7 95 34 38 2 2 i 2 5 8 84 7 8 9 3 6 1 0 6 31 7 2 97 1 一；2 9 7 91 3 2 7 l1 1 9 6 3 6 2 6 55 8 5 9 对照8 1 97 4 3 3 2 69 2 8 5 6 1 2 茄子游离小孢子培养及其形态发育学观察 变濡处理对小孢子存活率的影响j l ! l 倒l ，2 4 5 经9 种处理斤的结果是，c 处理、e 处理利h 处理均得到较高的小孢子存活率，特别是e 处理得到了最高的小孢子存活率5 4 t 7 t 比单独3 6 处理更适丁2 4 5 的培养。 2 3 9 的9 种处理中，也以e 处理效果最好，小孢子存活率达到4 2 6 1 ，比单独3 6 6 天处理 的结果高l l - 3 ，而且还能维持小孢子的存活率。 2 3 3 莅e 处理中，得到最高小孢子存活率，在c 和h 两种处理中，结果也都显著高于对照和 单独低温或高温处理，并且小孢子的存活率f 降平缓，比较透予2 3 3 的培养。 辩名 睦。 辛= 卜： 犁e 七a 罩 5 0 三 4 0 ! 。3 0 萋差。 芒 耋 l o o bcut 6n 处理t r e a t 叶n t bcdefghi 处理t r e a t m n t 5 0 廿。们 * 瓮 喜；3 0 毒i 2 0 七磊1 0 o 5 0 骶 0 bcoe fghi 处理t r e a t e n t bcd efehi 处理t r e a m e n t d l 毒已l j 卜l j l l | l l j i j l l萋；|f-。iii-_ii，_， bcdef ghi 处理t r e a t m e n t 围l 变温处理对小孢于存活率的影响 ( 毛b | c d 矗f 分别表示2 4 5 2 3 9 2 3 3 t2 0 8 2 0 7 和1 9 2 ) f i g ie 髓c to fc i i a n g c dt 翎l p 咖r 。t r c a 廿n 蛳to ns u r v i v a lr 咖o f m i c r o s p o r e 9 轴帅舯m h g tnf 罢毗 e 肿f d 理处 cba 河北农业人学硕士学位( 毕业) 论文 2 0 8 经九种变温处理后的小孢子存活率全部高于对照和单独低温或高温处理的结果住e 处 理中，小孢子存活率高达4 0 3 2 ，在c 利h 两种处理中也得到了比较高的小孢子存活辜，变温 处理对于2 0 8 的培养是适合的。 2 0 7 在九种处理中的小孢子存活率也全部高于对照和单独低温或高温处理所得结果。同样， 在e 处理中，小孢子存活率最高，为3 5 2 0 在b 和c 两种处理中，小孢子的存活率也较高。 对于2 0 7 变温处理是比较理想的预处理方式。 1 9 2 的九种处理中，e 处理得到了最高的小孢子存活率，而其他处理所得结果均显著高于对 照和单一低温或高温处理的结果。因此变温处理也同样适于1 9 2 的培养。 综合分析温度处理对小孢子存活率的影响，供试的6 个品种均在e 处理中得到最高的小孢子 存活率，除e 处理外，在其他各温度处理中，c 和h 两种处理也得到了比较高的小孢子存活率， 且这两种处理问差异不大，这说明3 6 处理3 天或3 天以上对提高小孢子存活率是有效的。 3 2 2 饥饿娃理对小孢子存活率的影响 饥饿处理即在培养基中缺乏碳源和激素的预处理，在培养开始后的2 ，4 和6 天检测小孢子 的存活率，试验结果见表5 。六个品种的小孢子在饥饿处理2 天时获得最高的小孢子存活率结 果明显高丁对照，随着培养时间的延蚝小孢于存活率逐渐f 降，虽然小孢子存活辜仍赢丁对照， 但备品种小孢子经过饥饿处理扁的死亡率较高，不能有效维持小孢子的存活率。与温度预处理相 比，饥饿处理对小孢子存活率的影响，f = 不明显。 表5 饥饿处理对6 个品种小孢子存活率的影响 t 曲i c 5e 觚o f n o 翱g 盯t r e a “玳n o nt | l es u r v i v a lm 忙b f m em i c r o s p o 1 0 茄子游离小孢子培养及其形态发育学观察 3 2 3 活性炭对小孢子存活率的影响 图2 显示了不同浓度的活性炭对茄子小孢子存活率的影响。2 4 5 经活性炭处理后的结果如幽 a 所示，l 牡，2 9 l ，3 9 ，l 活性炭处理2 无时存活率分别为1 1 4 2 、9 3 8 和8 2 6 ，均低于对 照t 采j j j 高浓度后，起始存活率会降低但处理4 犬时各处理的小孢于存活率均高- 丁对