（高分子化学与物理专业论文）酸性茶多糖的研究.pdf

中山大学硕士学位论文 酸性茶多糖的研究 专业方向：高分子化学与物理 硕士生：朱仙娥 导师：杨立群副教授 张黎明教授 摘要 茶多糖具有多种生物活性，如降血糖、降血脂、降血压等，这些生物活性与 茶多糖的化学结构和构象密切相关。因此，本论文的主要工作是从粗老绿茶分离 提取出两种含羧酸基团的酸性茶多糖，深入研究它们的化学结构和在水溶液中的 构象，并初步探讨酸性茶多糖降血糖的机理。整个论文工作包括以下内容： 1 、通过碱液提取法从粗老绿茶中分离提取出一种酸性茶多糖( t p s v ) ，采用 一维和二维核磁共振波谱法( n m r ) 、红外光谱法( f t i r ) 、紫外光谱法( u v ) 、气相 色谱法( g c ) 、氨基酸分析等方法对t p s v 的化学结构进行表征，结果表明t p s v 是一种含有羧酸基团的蛋白多糖，其中糖醛酸含量为3 4 4 l ，蛋白质含量为 3 4 2 ，中性糖含量为3 8 5 0 。中性多糖中各单糖组成的摩尔比为：鼠李糖( r h a ) ： 核糖( r i b ) ：阿拉伯糖( 心a ) ：木糖( x y l ) ：甘露糖( m a n ) ：葡萄糖( g l c ) ：半乳糖 ( g a l ) = 2 3 3 3 ：1 7 5 ：3 2 0 5 ：1 9 3 ：2 3 9 ：8 6 3 ：2 9 9 2 ，蛋白质链段主要由谷氨酸( g l u ) 、 天冬氨酸( a s p ) 、甘氨酸( g l y ) 、丙氨酸( a l a ) 、缬氨酸( 、，a 1 ) 、丝氨酸( s 哪、苏氨酸 ( t 啪等氨基酸组成。通过一维和二维n m r 法分析出t p s v 的主链主要由 口- l r h a ( 1 4 ) 口- d - g a l p a ，伊d g a l ( 1 _ 2 ) 口- d - g a l p a 和口一l 一加a ( 1 _ 5 ) 口一d g a l p a 这三种结构组成，分支点主要在口d g a l p a 的c 一2 ，c 3 上，分支主要由伊d g l c 等含量较少的单糖片段组成。另外蛋白质的氨基酸残基也主要连接在多糖的c 2 ， c 3 和c 5 位置上。 中山大学硕士学位论文 2 、进一步通过丙酮沉淀分级法将t p s v 按分子量大小分成九个级分，采用 动静态光散射法、粘度法测定出每个t p s v 级分的重均分子量细) ，均方旋转 半径俾g ) ，第二维里系数似2 ) 以及特性粘度( p 力) ，运用高分子溶液理论分析出t p s v 在水溶液中的构象为紧缩的聚集体。通过透射电镜( t e m ) 观察到t p s v 聚集成不 规则的球形和棒状结构，动态光散射法进一步证实该结果。此外，还采用圆二色 谱法研究外部因素对t p s v 构象的影响，结果表明水溶液的p h 值、温度、盐离 子的存在等因素均会对其溶液构象产生一定的影响。 3 、通过n a c l 溶液提取法从粗老绿茶中分离提取出另一种酸性茶多糖 ( t p s a ) ，采用f t i r 、u v 和g c 等方法证实t p s a 也是一种含有羧酸基团的蛋白 多糖，其中含有3 4 4 8 的糖醛酸、3 6 4 1 的中性多糖和3 2 5 的蛋白质。中性 多糖中各单糖组成的摩尔比为：鼠李糖( i m a ) ：核糖( r i b ) ：阿拉伯糖( a r a ) ：甘露 糖( m a l l ) ：葡萄糖( g l c ) ：半乳糖( g a l ) = 2 2 6 5 ：6 9 4 ：2 5 9 4 ：2 9 2 ：1 4 8 6 ：2 6 6 9 。 采用圆二色谱法研究t p s a 水溶液构象的影响因素，结果表明水溶液的p h 值和 温度等因素也会对其溶液构象产生一定的影响。 4 、通过研究t p s a 对葡萄糖的吸附及扩散的影响，表明t p s a 对葡萄糖有 着较强的吸附作用，将有利于减少被小肠吸收的葡萄糖量，从而对降血糖起到一 定的促进作用。 关键词：酸性茶多糖，化学结构，溶液构象，葡萄糖，吸附 v 中山大学硕士学位论文 s t u d i e so nt h ea c i d i c1 1 e ap o l y s a c c h a r i d e m a j o r ：p 0 1 y m e rc h e m i s t r ya n dp 1 1 ) ，s i c s n a m e ：x i a n ez h u s u p e r 、，i s o r ：a s s o c i a t e dp r o f e s s o r “q u ny ，a n g a b s t r a c t t b ap o l y s a c c h a r i d e sm a ye 文t l i b i t 砒l t m y p e 四y c e m i c ，锄t i h y p e r l i p o p r o t e i n e m i c ， a n t i h y p e r c h 0 1 e s t e r o l e m i ca 1 1 da n t i h y p e r t e n s i v eb i o a c t i v i t i e s ，w 1 1 i c _ ha r ed e p e n d e n to n t h e i rc h e m i c a ls t l u c t l j l e sa n dc o n f o 姗a t i o n s i nm i sw o f k 觚ok i n d so fa c i d i ct e a p o l y s a c c h 撕d e sw e r ei s o l a t e df b mt h ec r u d eg r e e l l t h e i rc h 锄i c a ls 讯l c t i j r e s 锄d c o n f o r m a t i o n sw e r ca n a l y z e d t h em e c h a i l i s mo f 觚t m y p e 珂y c 觚ca c 舡o nw 弱 研m a r i l yi n v e s t i g a t e d t 1 1 ew o r ki n c l u d e s ： ( 1 ) ak i n do fa c i d i ct e ap o l y s a c c h 撕d e ( t p s w a sa b s 仃a c t e db ya l k a l ia q u 咖s s 0 1 u t i o nf 而mm ec n l d e 粤e e nt e a t h ed l e m i c a ls t n j c t u r ew a sc h a r a l c t e r i z e du s i n go n e a n dt w od i m 吼s i o nn m rs p e c t r o s c o p y ，f t i rs p e c t r o s c o p y u vs p e c t r o s c o p y g a s c h r o m a t o 伊a p h y ( g c ) a 1 1 d 锄i n oa c i d i ca i l a l y s i s t h er e s u l t ss h o w e d 也a tt p s vw 弱 a 1 1a c i d i cp 0 1 y s a c c h 撕d eb o n d e dw i t hp r o t e i n t h ec o n t e l l t so fu r o l l i ca c i d ，m en e u 臼m p o l y s a c d l r i d ea i l dp r o t e i nw e r ed e t 锄i n e d t ob e3 4 4 1 ，3 8 5 0 锄d3 4 2 ，r e s p e c t i v e l y t h es u g a rc o m p o s i t e so ft l l en e u t r a lp o l y s a c c h 撕d ew e r ed e t e n ：i l i n e dt 0b er h a 鼬b ， a r a ，x y l ，m a n ，g l ca i l dg a li nm o l a rr a t i o so f2 3 3 3 ：1 7 5 ：3 2 0 5 ：1 9 3 ：2 3 9 ：8 6 3 ： 2 9 9 2 t h em a i na m i i l oa c i d si nt l l ep r o t e i nr e s i d u e sw e r ce s t i m a t e da st ob eg l u ，a s p ， g l y a l a ，v 砒，s e r 觚d1 k1 1 1 er e s u l t so fo n e 觚d 押od i 删猢i o nn m r 锄a l y s i s 中山大学硕士学位论文 s h o w e dt h a tt h em a i nc h a i n so ft p s vw e r e 口一l r h “1 4 ) 口- d - g a l p a ， 伊d g a l ( 1 2 ) 口- d - g a l p aa n d 口一l - 心a ( 1 5 ) 口一d - g a l p a t 1 1 eb r 趾c h e sw e r el o c a t e d o nc 一2 a i l dc 一3o f 口- d g a l p a t h e yw e r ec o m p o s e do fs o m e - d - g 1 cr e s i d u e s h l a d d i t i o n ，t h e 锄i n o a c i dr e s i d u e sw e r el i n k e d 、析t 1 1c - 2 ，c 一3a n d c - 5o f 1 e p 0 1 y s a c “r i d ec h a i n s ( 2 ) t p s vw a s 仔a c t i o n a t e db ya d d i n ga c e t o n ea sap r c c i p i t a n t n i n ef h c t i o n s w i md i f f 打e n tm o l e c u l a rw e i g h t sw e r eo b t a i n e d t h ew e i g l l tm o l e c u l a rw e i g h t ( ， t h er a d i u so fg y r a t i o n 陴g ) a 1 1 dm es e c o n dv i r i a lc o e m c i e n t0 2 ) o f 1 ed i 妇衙e n tt p s v d i 缅b c t i o n sw e r ed e t e m i n e db ys t a t i ca n dd y n a m i cl i 曲ts c a t t e r i n g ，a n dv i s c o s i t y a i l a l y s i s t h ec o n f o m a t i o no ft p s vi na q u e o u ss o l u t i o nw a sc h a r a c t e r i z e da s c o m p a c ta g 蓼e g a t e s s o m ei r r e g u l a rs p h e r e sa n ds t i c k sw e r eo b s e e d 丘o mt l l et e m i m a g e s t 1 1 er e s u l tw a s 缸t h e rc o n f i m e db yd y i l 锄i c1 i 曲ts c a t t 嘶n ga n a l y s i s i i l a d d i t i o n ，t h er e s u l t so fc i r c u l a rd i c h r o i s ma i l a l y s i ss h o w e dt h a tt h ec o n f o m a t i o no f t p s vw 弱a 虢c t e db ym ep hv a l u e so fa c i u e o u ss o l u t i o n s ，t e i 】叩e r a t l u - ca i l d l es a l t i o n s ( 3 ) a m o t h e rk i n do fa c i d i ct e ap 0 1 y s a c c h 撕d e ( t p s a ) w a sa b s t r a c t e db ya q u e o u s n a c ls o l u t i o n 舶mm ec m d e 黟e e l lt e a t h er e s u l t so ff t i ra n du vs p e c t r o s c o p y ， a 1 1 dg ca i l a l y s i ss h o w e dm a tt p s aw 弱a l s oa 1 1a c i d i cp o l y s a c c h 撕d eb o n d e dw i m p r o t e i n i tc o n s i s t e do f3 4 4 8 o fu r o l l i ca c i d ，3 6 41 o ft h en e u t r a lp 0 1 y s a c c h 撕d e a n d3 2 5 o fp r o t c i n t h es u g a rc o m p o s i t e so ft h en e l i t i a lp o l y s a c c h 撕d ew e r e d e t e n n i n e dt ob er h a ，r i b ，a m ，m a n ，g l ca n dg a li nm 0 1 a rr a t i o so f2 2 6 5 ：6 9 4 ： 2 5 9 4 ：2 9 2 ：14 8 6 ：2 6 6 9 t h er e s u l t so fc i r c u l a rd i c h r o i s ma n a l y s i sa l s os h o w e dt h a t 1 ec o n f o m l a t i o no ft p s aw a u sa f | f e c t e db yt h ep hv a l u e so fa q u e o u ss o l u t i o n sa i l d t 铋p c r m u r e ( 4 ) t p s ae x l l i b i t e d l es 臼0 n ga b s o r p t i o na b i l i t yf o r 西u c o s e ，w h i c hw 鹊 b e i l e f i c i a lt od e r e 嬲et l l ec o n t e n to f 哲u c o s ea b s o r b c d 丘o mm es m a l lm e s t i n c k e yw o r d s ：a c i d i ct 鼢p o l y s a c c h 撕d e ，c h e m i c a ls 仃u c “i r e ，s o l u t i o nc o i d 0 m a t i o l l g l u c o s e ，a b s o 印t i o n v 论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 学位论文作者签名：琛似舐 日期：辟月多日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交 论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量 复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学 位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或 其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：霖仙振 导师签名： 彬 日期：捌年莎月占日 日期：加游z 月日 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师指 导下完成的成果，该成果属于中山大学化学与化学工程学院，受 国家知识产权法保护。在学期间与毕业后以任何形式公开发表论 文或申请专利，均需由导师作为通讯联系人，未经导师的书面许 可，本人不得以任何方式，以任何其它单位作全部和局部署名公 布学位论文成果。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承 担。 学位论文作者签名：禾彳旃舐 日期：2 口衫年月歹日 m 中山人学硕i ? 掌位论j ! = 第一章前言 1 1 多糖的研究现状 1 1 1多糖的研究背景 多糖广泛地存在于自然界中，是一类幽糖苷键将各种糖单元连接起来的生物 高分予，如同蛋白质和核酸一样，它是构成生命体的基本物质f l 】。近年来的研究 发现一些多糖具有多种多样的生物活性，如促进免疫、抗肿瘤、抗突变、降血脂、 抗病毒等。九十年代起，随着我国人民生活水平的普遍提离，饮食结构的改变， 保健食品走上了市场，人们对多糖的保健及药理功能做了更多的研究，使得多糖 在促进入类健康方面显示出更为广阔的应用前景，香菇多糖、茯苓多糖已用于临 床治疗癌症。尽前有关续构和生物活性研究较多的多糖主要是香菇多糖、茯苓多 糖、黑木耳多糖和灵芝多糖等。 1 1 2 多糖的提取分离及纯化 从不同材料中提取多糖之前，一般先用乙酸乙酯、乙醚、石油醚除去脂肪和 脂溶性杂质；用甲醇、乙醇、丙酮等除去肇糖、低聚糖及营类等成分。由于多糖 属于极性大分子化合物，故常用一定温度的水、氯化钠水溶液、稀碱或稀酸溶液 进行提取，同一原料用不同试剂提取得到的多糖成分通常不一样。粗多糖中往往 混杂着蛋白质、色素、低聚糖等杂质，必须进一步分离。常用脱蛋白的方法有 s e v a g e 法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法。部分植物多糖因为含有酚型化合物 而颜色较深，常用h 2 0 2 、活性碳、d e a e 纤维素等进行脱色。对于盐，低聚糖 等小分子杂质，通过逆向流水透析即可去除【2 吲。 一般方法提取的粗多糖是混合物，需进一步分离纯化。分离多糖的常用原理 中_ 人学预i j 学位论文 有：利用多糖混合物中各组分的分子量差异；利用在不同浓度有机溶剂与水的混 合液中溶解度的差异；对带可电离基团的酸性或碱性多糖，利用其所带电荷多少 的差异。常用的方法如下：有机溶剂分部沉淀、酸性乙醇沉淀、季胺盐沉淀、金 属络合物分级、超滤分离、分子筛分离、离子交换分级、亲和层析法以及制备性 区域电泳等。在纯化过程中应充分考虑样品特点、组成摩尔比、样品用量等因素， 灵活利用各种纯化方法才能获得理想的效果，并且同一样品要保持纯化方法的相 对一致性，否则会得到不同的产品。在获得单一多糖组分后，必须对其纯度进行 鉴定。常用的方法有过滤法、高压电泳法、超离心法、旋光测定法、毛细管电泳 法等，一般要求用两种以上的方法进行检查，其结果才能肯定p 6 j 。 1 1 3 多糖的结构研究方法 多糖的结构是其生物活性的基础，只有在充分认识和了解多糖结构的基础上 才能更清楚地研究清楚其结构与生物活性之间的关系，更好地利用和开发多糖。 多糖的结构一般分为化学结构、构象和聚集态结构【7 母】。多糖的化学结构主要是 指多糖的单糖残基的组成、排列序列、相邻单糖残基的连接方式、异头物的构型 及糖链有无分支、分支的位置和长短等，多糖的构象主要有无规线团、螺旋链和 棒状链形态等，聚集态结构指多糖链间以非共价作用力而结合形成的聚集体结 构。其中多糖的化学结构和构象对生物活性的影响较大。 1 1 3 1多糖的化学结构研究方法 ( 1 ) 甲基化法【l o 】：该法可以阐明单糖的键接方式、重复结构中某种单糖的数 目、末端糖的性质及分支点的位置等。首先将多糖中各种单糖残基中的游离羟基 全部甲基化，然后酸水解糖苷键得到各种甲基化单糖，水解后得到的化合物，其 羟基所在的位置即为原来单糖残基的连接点。根据不同甲基化单糖的比例，可以 推测这种连接键型在多糖重复结构中的比例。水解后的甲基化单糖，经乙酰化后 通过g c 和g c m a s s 分析，也可直接用h p l c 分析。 ( 2 ) 高碘酸氧化和s l i l i t h 降解法【u 】：高碘酸盐作为选择性氧化剂，可以选择 2 中山大学硕上学位论文 性地氧化断裂糖分子中的连二羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲酸，反 应定量地进行。每裂开一个c c 键就消耗一分子高碘酸，通过测定高碘酸的消 耗量和甲酸的生成量，可以判断糖苷键的位置、连接方式、支链状况和聚合度等 结构信息。 ( 3 ) 气相色谱【1 2 1 ( g c ) 和气质联用( g c m a s s ) 【1 3 1 4 】法：多糖水解后，与标准品 的相对保留时间对照或通过质谱鉴定，可以分析单糖组成和相对摩尔比。此法要 求所测样品具有一定的挥发性，因此待测样品多需制备成各种衍生物，目前常用 的衍生物有：糖的三甲基硅醚衍生、糖肟三甲基硅醚衍生物、糖醇乙酸酯衍生物、 糖腈乙酸酯衍生物和三氟乙酸酯衍生物。质谱( m s ) 在糖链的结构分析中，由于其 方法快速、灵敏、试样用量极少而得到越来越广泛的应用。甲基化与g c m a s s 联用可以判断糖的组成和连接位置。 ( 4 ) 紫外光谱法( u v ) 【5 ，1 5 】：在2 6 0 2 8 嘶处检测多糖中是否含有蛋白质、核 酸、多肽类； ( 5 ) 红外光谱法( f t i r ) 【5 ，1 5 】：用于确定糖的种类、糖苷键构型及观察其他官 能团。 ( 6 ) 核磁共振波谱发法( n m r ) 【1 5 1 7 】：对于多糖分子来说，由于不同糖残基中 非异头质子的亚甲基和次甲基的化学位移( 国非常靠近，所以它的1 hn m r 谱峰 严重重叠，大部分质子共振峰出现在63 o 4 o p p m 的非常小的区域内，给解析带 来困难。不在共振区域拥挤区的1 hn m r 信号被称为结构信息共振信号，是分析 谱图的突破口。1 3 cn m r 的化学位移范围较宽，通常采用全去耦法，每一种化 学等价的碳原子只有一条谱线，因此谱图的分辨率好，谱线很少重叠。1 3 cm r 在多糖结构研究中的作用如下【1 5 1 ： 确定糖残基的数目和相对含量【1 6 ，1 7 1 。异头碳的共振信号出现在圆0 1 1 0 p p m ，由于所有异头碳的共振是非等价的且很少重叠，因而可根据这一范围内峰 的个数来确定糖残基的数目，还可根据峰的相对高度来估算糖残基的相对比例。 确定糖链的连接位型1 8 2 1 1 。糖环上某个位置的碳如发生取代，则其化学 位移向低场移动6 7 p p m 。如a g l c 的c 4 的化学位移是j 7 0 6p p m ，c 4 被取代后 化学位移变为6 7 8 1p p m 。因此，如果糖残基的各个碳都得以归属，就可以通过 与已知单糖的碳的化学位移进行比较，确定糖链的连接位置。 3 中山大学硕士学位论文 确定某些糖类【1 5 ，1 引。例如，6 1 7 0 1 7 6p p m 范围内的低场信号表明存在己 糖醛酸的羧基或乙酰氨基，j 1 6 1 8p p 恤范围内的高场信号表明有6 位脱氧糖的甲 基存在。 确定异头碳的构型【1 5 ，18 1 。多数型异头碳的化学位移高于仅型约2 3 p p m ，因而可对h 谱的分析结果进一步确证。但此规律不适用于甘露糖和鼠李糖， 因为它们的a 与口化学位移几乎在同一位置。 二维( 2 d ) n m r 谱能更加详细地分析多糖的化学结构2 2 ，2 3 1 ，目前主要采用的 2 dn m r 技术【2 4 2 6 1 有： c o s y ( 化学位移相关谱，1 h ，1 hc h 啪i c a ls l l i rc o r r e l a t i o ns p e c 咖s c o p y ) ： c o s y 能够提供糖环中相邻氢核之间的耦合关系。c o s y 谱中，每个交叉峰反映 了相邻氢核之间的耦合关系。目前通常用d q f c o s y 【2 3 2 7 1 ( 双量子滤波c o s y ， d o u b l eq u 跗t u mf i l t e r e dc o s y ) ，其优点在于能抑制强峰和溶剂峰，而且由于对 角线峰和交叉峰均为吸收型，所以分辨率较高。然而，d q f c o s y 的灵敏度比同 等条件下的c o s y 低。 ( 多n o e s y 【2 3 1 ( n u c l e a ro v e r h a u s e re 虢c ts p e c t r o s c o p y ) ：n o e s y 的外观与 c o s y 相似，其差别在于交叉峰表示的不是耦合关系，而是n o e 关系。通常间距 小于5 a 的两个质子，在谱上会出现交叉峰，且空间距离越近，n o e 作用越强。 对于多糖，n o e s y 可作为c o s y 的补充来识别谱峰，也可用来确定糖残基间的 连接方式。 h s q c 【2 7 】( 异核单量子相干，h e t e r o n u c l e a rs i n 9 1 e q a u n t l 蛐c o h e r e n c e ) ： h s q c 反映的是直接相连的1 h 、埒c 核之问的耦合关系，它的作用相应于h ， c c o s y 。在用h 、h c o s y 等将糖单元的氢核的化学位移进行归属后，通过 h s q c ，可将碳核的化学位移进行归属。此外，如果由于某些氢核的谱峰重叠 无法识别，可以根据已识别的1 h 的化学位移通过h s q c 推出相应1 3 c 的化学位移， 然后再根据1 3 cn m r 谱的峰形和峰高，结合甲基化分析的结果，对未知1 h 的化学 位移进行反推。 h m b c 【2 3 ，2 刀( 异核多键相关，h e t e r o n u c l e a rn 蕾u l t i p l e b o n dc o r r e l a t i o n ) ： h m b c 把1 h 核与长程耦合的1 3 c 核关联起来，其作用相应于长程h 、c c o s y ， 它能提供分子骨架的结构信息。对于多糖，h m b c 可作为一种序列分析的工具 4 中山大学硕十学位论文 给出糖单元间的连接次序。由此可见，h m b c 在多糖结构研究中是一个非常有用 的工具，它解决了糖残基连接序列的问题，这是以前的分析手段( 包括l dn m r ) 难以做到的。 1 1 3 2 多糖在溶液中的构象 多糖的分子量和溶液构象对其生物活性起着很重要的作用，不同类型的多糖 表现出不同的溶液构象，如右旋糖苷( d e x t r a l l ) 【2 8 ，2 9 1 为无规线团链，直链淀粉 ( a m y l o s e ) 【3 0 1 为半柔顺链，单螺旋黑木耳多糖3 1 1 则是螺旋链。目前常用高分子溶 液理论和圆二色谱法研究多糖的构象。 ( 1 ) 高分子溶液理论 高分子溶液理论中，通常用静态光散射法、动态光散射法和粘度法研究多糖 的分子量和溶液构象。 静态光散射法【3 2 。3 6 】 在激光光散射法( l a s e rl i g h ts c a t t 嘶n g ) 测量中，高分子溶液可视为不均匀介 质，当激光通过它时被诱导成振荡偶极子，并作为二次光源发出散射光。而高分 子溶液的散射光强强烈依赖于高聚物的分子量、链构象、溶液浓度、散射光角度 和折光指数增量丘砌蚀) 。对于粒子直径大于a 2 0 的高分子稀溶液，其重均分子量 m 可用下列方程求取： 警= 击( ，+ 等州却伪+ 卜2 c m t ， 心 从，i 3 气2 、7 j ”一。 舯舻南讹足= 筹( 害) 2 式中：而，乃分别为入射光和散射光强；，为光源到测量点距离，万为溶剂折光指 数，如为入射光波长( i 砌) ，m 为a v o g a d r 0 常数。由示差折光仪测定不同浓度的 高聚物溶液与溶剂的折光指数差值厶n ，并由厶n 对c 作图的直线斜率求得批 值。根据( 1 1 ) 式，由高聚物溶液不同浓度和散射光角度的实验点可得到一系列直 线。由熙艘口对不同浓度和角度作图( z i m m 图) ，外推至浓度、角度为零，并由 5 中山人：坝f j 学位沦上 截距计算得到重均分子量) ，再由斜率分别得到第二维利系数似2 ) 和高分子的 均方旋转半径限) 。 根据静态光散射测得的两个参数讯和匙，采用磁= 删w 口模型，通过指数口 可以判断高分子链在溶液中的构象。一般仅值愈高高分子链刚性愈大，通常仅 为o 3 左右，表明高分子蜷曲成球状，a 在o 5 o 6 范围属柔顺性无规线团链，而 仅在1 左右为棒状或刚性链陟3 9 1 。此外，彳2 是直接表征溶液中高聚物与溶剂分 子间相互作用程度的参数，当相互作用抵消时彳2 = o ，而且溶剂愈优良则么2 愈大。 按照高分子热力学理论，彳2 一般为正值，但当高分子处于口条件附近，或发生聚 集时，么2 也可能出现负值3 2 1 。 动态光散射法【3 2 3 3 】 动态光散射的基本原理与静态光散射相同，但它考虑了高分子在溶液中的布 朗运动，从而检测散射光强或频率随时间的涨落，及产生的多普勒效应。散射光 频率以入射光为中心形成一个很窄的分布，它包含了丰富的关于分子运动的信 息。如果粒子的平动扩散( 即b r o w n 运动) 是散射光强涨落的唯一因素，平动扩散 系数d 则可同粒子的流体力学半径风联系起来： 凰= 2 “6 册7 d )( 1 2 ) 式中，为波兹曼常数，丁为绝对温度，瑁为溶剂的粘度。 粘度澍3 3 ，1 7 】： 高分子在溶液中的粘度可以反映链结构以及高分子与溶剂分子间相互作用 等特性。根据m a r k h o w i i l l 【方程( m a 妒) 的指数仅可初步判断高分子在溶液 中链构剔1 7 ，3 7 枷】。通常指数。【值在o 5 一o 8 范围属柔性高分子链构象，较高的口 值表明分子链的刚性较大，口 ， 1 9 8 7 3 ：2 4 2 8 1 5 中山人学硕士学位论文 5 6 】徐仲溪，王坤波茶多糖化学及生物活性研究茶叶科学，2 0 0 4 ，2 4 ( 2 ) ：7 5 8 l 【5 7 】傅海平，黄怀生，胡孟阳等茶多糖生物活性及提取纯化的研究进展茶叶 通讯，2 0 0 6 ，3 3 ( 1 ) ：2 4 - 2 8 【5 8 】m o r im h y p o l i p e n l i c sc o n t a i n i n gp 0 1 y s a c c h 撕d e s6 o m 黟e c l lt e a p 】j 印a i l ， k o k a it o k k y ok o h o j p 0 2 ，2 8 6 ，6 2 0a 22 6 ，n o v ，19 9 0 【5 9 】汪东风，谢晓风茶多糖的组分及理化性质茶叶科学，1 9 9 6 ，1 6 ( 1 ) ：1 - 8 6 0 周鹏，谢明勇，聂少平茶多糖t g c 的结构表征中国科学c 辑：生命科学， 2 0 0 4 ，3 4 ： 1 7 8 1 8 5 6 1 李布青，张惠玲，舒庆龄等中低档绿茶中茶多糖的提取及降血糖作用茶 叶科学，1 9 9 6 ，1 6 ( 1 ) ：6 7 7 2 6 2 】王丁刚，王淑如茶叶多糖的分离、纯化、分析及降血脂作用中国药科大学 学报，1 9 9 1 ，2 2 ( 4 ) ：2 2 5 2 2 8 【6 3 】王淑如，王丁刚茶叶多糖的抗凝血及抗血栓作用中草药，1 9 9 2 ，2 3 ( 5 ) ： 2 5 4 2 5 6 6 4 w a l l gd ，w a l l gy ，l ij ，e ta 1 c o m p o n e n t sa 1 1 da c t i 讥锣o fp o l y s a c c h a r i d e s6 - o m c o a r s et e a a 鲥c u l t u r ef o o dc h e i l l i s 仃y 2 0 01 ，4 9 ：5 0 7 - 51o 6 5 】刘立军，韩弛，陈君石茶叶防癌有效成分的短期细胞生物学筛选卫生研 究，1 9 9 8 ，2 7 ( 1 ) ：5 3 5 6 【6 6 】t a l ( e ot ，u 1 1 i l ot ，硒n u g 鹤ah ，e ta 1 1 1 1 ec h 锄i c a lp r o p e n i e sa i l d 缸l c t i o n a l e f f e c t so fp o l y s a c c h 嘶d e sd i s s o l v e di ng r e e nt e ai n m s i o n j 】n i p p o ns h o k u l l i n k a g a k uk o g m ( uk a i s l l i ，19 9 8 ，4 5 ( 4 ) ：2 7 0 - 2 7 2 1 6 中山大学硕士学位论文 第二章酸性茶多糖的提取及化学结构研究 酸性茶多糖的化学结构与生物活性密切相关。本工作从粗老茶中分离提取出 酸性茶多糖，采耀一维和二维核磁共振波谱法( 1 d & 2 dn m r ) 、傅立叶红外光谱 法( f t i r ) 、气相色谱法( g c ) 、紫外光谱法( u v ) 、高碘酸氧化法和s m i m 降解法 等方法对酸性茶多糖的化学结构进行分析。 2 。薹实验部分 2 1 1 原料与试剂 粗老茶( 绿茶) ：产于海南自沙农场；无水乙醇( e m a n o l ，c h 3 c h 2 0 h ) ：a r ， 天津市富宇精细化工有限公司；乙酸乙酯( 嚣氆y la c c t a 绝，c 冀3 c c 2 h 5 ) ：a r ， 天津市寓宇精细化工有限公司；三氯甲烷( c h l o r o f o 肭，c h c l 3 ) ：a r ，天津市 红岩化学试剂厂；正丁醇( n b 邋勰o l ，c h 3 ( c 董2 b o k ) ：a r ，天津市富字精细 化工有限公司；盐酸( h y d r o c l l l o r i ca c i d ，h c l ) ：a r ，3 6 哆扣3 8 ，广州化学试 剂厂；半巍糖醛酸( g a l a e 撼f o n i ca c i d ，c 6 h l 0 0 7 ) ：b 。c 。；葡萄糖( 翻u s e ，c 6 h 1 2 0 6 ) ： b c ；半乳糖( g a l a c t o s e ，c 6 h 1 2 0 6 ) ：b c ；核糖( 融b o s e ，c 5 h l 0 0 4 ) ：b c ； 甘露糖( m a l l n o s e ，c 搏1 2 6 ) ：b e ；木糖( x y l o s e ，c 5 h l o o s ) ：b c 。；阿拉伯 糖( 知a b i n o s e ，c 5 h l 0 0 5 ) ：1 3 1 c ；鼠李糖( r h a m n o s e ，c 6 h 1 2 0 5 ) ：b c ；硫酸( s u l 触i c a c i d ，h 2 s 0 4 ) ：c p ，9 5 多扣9 8 广州化学试剂厂；苯酚( 弛钮o l ，c 搏5 0 h ) ： a r ，无色结晶，天津市耀华化学试剂有限责任公司；咔唑( c a r b a z o l e ，c 1 2 h 9 n ) ： a r ，无色晶体：吡啶( p 蜘d i n c ，c 5 h 5 n ) ：a r ；乙酸酐( a e e t i ca l l l l 蜩蠢d e ， ( c 2 h 3 0 ) 2o ) ：a r ；乙酸( e m a i l o i ca c i d ，c h 3c o o ) ：a r ：高碘酸钠( s o d i 啪 p 耐o d a t e ，n a l 0 4 ) ：a r ，白色结晶性粉末；碘酸钠( s o d i u m i o d a t e ，n 矾0 3 ) ：a r ， 白色结晶性粉末；乙二酵( e 也y l 蹦eg l y c o l ，c 2 h 6 0 2 ) ：a r ；硼氢化钠( s o d i u m 1 7 中山大学硕士学位论文 b o r o h y d r i d e ，n a b h 4 ) ：a r ，白色结晶性粉末；氢氧化钠( s o d i u nh y d r o x i d e ， n a o h ) ：a r ；邻苯二甲酸氢钾( p o t a s s i 啪a x i dp h t h a l a t e ，c 8 h 5k 0 4 ) ：基准试 剂，白色粉末；酚酞( c2 0 h 1 4 0 4 ) ：a r ，白色粉末；碳酸氢钠( s o d i u mh y d r o g e n c a r b o n a t e ，n a h c 0 3 ) ：a r ，广州化学试剂厂；无水氯化钙( c a l c i 啪c h l o r i d e a n h y d r o u s ，c a c l 2 ) ：白色粒状物，极易潮解，广州化学试剂厂；3 0 双氧水( h y d r o g e n p e r o x i d e ) ：3 0 h 2 0 2 ，a r ，广州化学试剂厂；氨水( a m m o n i as 0 1 u t i o n ( 2 5 ) ) ： a r ，广州光华化学厂有限公司；碳酸钡( b 撕u mc a r b o n a t e ，b a c 0 3 ) ：a r ， 白色粉末；盐酸羟胺( h y d r o x y a m i n eh y d r o c l l l o r i d e ，n h 2 0 h h c l ) ：a r ，白色 结晶；肌醇( i n o s i t o l ，( c h o h ) 6 ) ：a r ，白色结晶；牛血清蛋白：b c ，白 色粉末；考马斯亮兰g 2 5 0 ( c o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u eg 2 5 0 ，c 4 5 h “n 3 0 7 s 2 n a ) ： a r ；8 5 的磷酸( p h o s p h o r i ca c i d ，8 5 h 3 p 0 4 ) ：a r ，无色透明液体； s 印h e d a x g 1 5 0 ：上海源聚生物科技有限公司 2 1 2 仪器设备 5 0 0m h z 超导核磁共振谱仪，v 撕a i li n o v a 5 0 0 n b ，美国v 撕a i l 公司；红外 光谱分析仪，n i c o l e 价4 e x u s6 7 0 ；紫外分光光度计，s p e c t n 】m l a b 5 2 ，上海棱光技 术有限公司；氨基酸分析仪，日立l 广8 8 0 0 型氨基酸分析仪；冷冻离心机，s i g m a ， 3 k 3 0 ；循环水式多用真空泵，s h & 一i i i ，郑州长城科工贸有限公司；旋转蒸发 器，r e 5 2 c s ，上海亚荣生化仪器厂；数显鼓风干燥箱，g z x 9 1 4 0 m e ，上海博 迅实业有限公司医疗设备厂；强力电动搅拌机，j b l o o a 型，广州康恒仪器有限 公司；气相色谱分析仪，a 西l e n t4 8 9 0 d ，安捷伦科技上海有限公司；g c 柱， o v - 1 7 0 1 石英毛细管柱( 3 0m o 3 2m m o 5p m ) ，中国科学院大连化学物理研究 - 所；冷冻干燥器，美国n i s 公司 1 8 中山夕二学硕f ：学位论文 2 1 3 酸性茶多糖的提取分离及纯化 按照图2 1 的路线图分离提取酸性茶多糖t p s a 和t p s v 。 粗老茶1 1 g ) i1 粉碎，过1 目筛 i2 3 0 0 m l 乙醇，乙酸乙醋( 1 门，v ) 索氏提取器4 h ，1 2 0 脱脂粗老茶末 i1 1 n a c i 溶液( g ，m l ) 5 5 搅拌浸泡3 h ，5 次， i 茶末，溶液= o 2 8 - o 4 2 ( g ，m l ) i 2 离心或过滤 提取液i 茶渣i 清液i 沉淀i 茶渣 提取液i i 1 加水溶解 2 透析 3 浓缩冷冻干燥4 粗多糖t p ：。e a e 纤维素柱 厂 中性多糖( t p s n )酸性多糖( t p s a ) 2 1 3 1 预处理 = 9 o ) ， h 溶液脱色 醇沉淀 清液 沉淀 图2 1酸性茶多糖的分离提取路线图 1 加蒸馏水溶解 2 旋转蒸发除乙醇 3 透析 4 旋转蒸发浓缩 5 冷冻干燥 酸性多糖( t p s v ) l 丙酮沉淀分级 9 个不同分子量的级分 将海南白沙农场粗老茶用j y d z 17 m 型植物粉碎机磨碎，将研磨后的茶末 过1 0 0 目筛网。称取1 0 0 克茶末，