（微生物学专业论文）芳香聚酮抗生素美达霉素生物合成基因的功能研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 中文摘要 聚酮抗生素美达霉素( m e d e r m y c i n ) 具有抗菌和抗肿瘤等生物学活性，其生物合成 途径还未阐明。本文利用生物信息学、遗传学和分析化学等手段，就其生物合成基因簇中 几个相关基因展开功能分析，内容包括以下几个方面： ( 1 ) 新型c - 糖基转移酶基因：根据同源性分析，推断基因m e d - o r f 8 可能负责催化 美达霉素的c - c 糖苷健的形r & ( i c h i n o s ek e t 厦, 2 0 0 3 ) 。本研究首先使用目前较为常用的 p c r 介导的链霉菌基因突变系统( r e d i r e c t t m ) 对m e d - o r f 8 进行基因突变分析：完整的 美达霉素生物合成基因簇导入一个特殊大肠杆菌细胞，在这个细胞内，定点敲除美达霉 素生物合成基因簇中的这个目的基因m e d - o r f 8 ，获得个携带有美达霉素突变基因簇 的质粒( 命名为p h s l 3 ) ，将其导入一个常片j 链霉菌异源表达细j 包, ( s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r c h 9 9 9 ) 中，并进行发酵产物的提取和l c m s 分析。研究发现同野生完整的美达霉素基 因簇相比，突变基因簇不能合成美达霉素( 初步推断有脱糖基中间产物积累) ；然后进行 目的基因的互补分析，即构建了一个关于m e d - o r f 8 的链霉菌表达质粒p h s l 5 ，导入上面 所获得的突变基因簇表达体系中。对基因回补菌株的发酵产物进行分析，发现m e d - o r f 8 的导入导致美达霉素又重新产生，说明在美达霉素生物合成途径中，基因m e d - o r f 8 确 实是个必需基因。 ( 2 ) 糖基合扇旨睡因：在美达霉素生物合成基因簇中含有6 个脱氧六碳糖基合成 酶的同源基因，推测负责稀有的脱氧六碳糖胺( 安哥拉糖胺) 的形成，前期工作中这6 个 可能参与糖基合成的基因和上面研究的m e d - o r f 8 已经克隆在一个表达质粒上 ( p a y t 5 5 ) 。本研究利用这个多基因共表达体系来验证这些基因的功能，即将这个多基 因共表达质粒通过原生质体转化导入一个能产生芳香聚酮姓m 。u n # a ( 推测与m e d - o r f 8 的糖基受体结构相似) 的链霉菌细胞( s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r b13 5 ) 中，然后对这个体 系的代谢产物进行l c m s 分析。结果显示以上这7 个基因的共表达质粒在b 1 3 5 中可以 导致美达霉素的积累，而仅含这6 个糖基合成酶基因的共表达质粒导入b 1 3 5 中，则没有 检测到美达霉素的产生。此结果说明在美达霉素生物合成途径中，这6 个基因与 m e d - o r f 8 共同完成了糖基合成和糖基转移的功能。 ( 3 ) 新型转录调控基因：根据同源性分析推断在美达霉素生物合成基因簇中的 m e d - o r f l o 为一个新型转录调控基因f r a g u c h it e ta l , 2 0 0 7 ) 。前期工作中利用r e d i r e c t t m 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 系统已经构建好一个突变基因簇( 0 0 在完整美达霉素生物合成基因簇中定向敲除目的基 因m e d - o r f l o ) 。本研究将携带这个突变基因簇的质粒p a y t 6 4 通过原生质体转化导入 链霉菌的异源表达宿主( s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o rc h 9 9 9 ) 中。对获得的菌株的发酵产物进行 l c - - m s 分析。结果显示由于这个基因的敲除导致美达霉素产量急剧减少，同时有中间 体积累，说明该基因在美达霉素生物合成中起到正向调控作用。 以上这些研究结果为进一步阐明美达霉素的生物合成途径奠定了基础。 关键词：美达霉素，生物合成，链霉菌，基因敲除和回补，共表达，天然产物分析 硕士学位论文 m a s t e r st t l e s l s a b s t r a c t m e d e r m y c i ni s as t r e p t o m y c e sa r o m a t i cp o l y k e t i d ea n t i b i o t i c , a n ds h o w ss t r o n g a n t i b a c t e r i a la n da n t i m m o ra c t i v i t y t h eb i o s y n t h e t i cp a t h w a yo fm e d e r m y c i nh a sy e tt ob e c l a r i f i e d i nt h ep r e s e n ts t u d y , f u n c t i o n a la n a l y s i so fs e v e r a lg e n e sl o c a t e di nt h em e d e r m y c i n b i o s y n t h e t i cg e n ec l u s t e rw a sc a r r i e do u tb yb i o i n f o r m a t i c s , g e n e t i c s , 锄曲面c a lc h e m i s t r ya n d o t h e ra p p r o a c h e s ： ( 1 ) an o v e lc - g l y c o s y l t m n s f e r a s eg e n e ：m e d - o r f 8 ，ap u t a t i v eg l y c o s y l t r a n s f e r a s eg e n e , i s p r o p o s e dt ob ei n v o l v e di nt h e 联l 坨c g l y c o s y l a t i o ni nt h eb i o s y n t h e s i so fm e d e r m y c i n a c c o r d i n gt oh o m o l o g ya n a l y s i s i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h ef u n c t i o no f m e d - o r f 8 ，f i r s t l y , g e n e i n a c t i v a t i o ni nv i v ow a sc a r r i e do u tb yr e d i r e c t t mt e c h n o l o g yt og a i nam u t a n tg e n ec l u s t e r , w h i c hc o n t a i n sa l ln e c e s s a r yg e n e sf o rb i o s y n t h e s i so fm e d e r m y c i ne x c e p tm e d - o r f 8 h e t e r o l o g o u se x p r e s s i o no ft h i sm u t a n tg e n ec l u s t e rr e s u l t e di nt h ea b s e n c eo fm e d e r m y c i n p r o d u c t i o n m e a n w h i l e ，t h en o r m a lp r o d u c t i o no fm e d e r m y c i nc o u l db er e s t o r e db y c o m p l e m e n t a t i o n 、) v i t l lm e d - o r f 8 d a t a 舶ml c - m sm e a s u r e m e n ts u g g e s t e dt h a tm e d - o r f 8 i sa ne s s e n t i a lg e n ei nt h e p a t h w a yo f m e d e n n y c i nb i o s y n t h e s i s ( 2 ) g l y c o s y l s y n t h a s eg e n e s ：s i xg l y c o s y l s y n t h a s e - h o m o l o g o u sg e n e si nm e d e r m y c i ng e n e c l u s t e ra l ep r o p o s e dt ob ei n v o l v e di nt h e 勰a n g o l o s a m i n e ( d e o x y h e x o s e ，d o h ) b i o s y n t h e s i s p a r r 5 5 ，ac o - e x p r e s s i o np l a s m i dc o n t a i n i n gt h e s e6p u t a t i v ed o hs u g a rb i o s y n t h e t i cg e n e s a n dm e d - o r f 8w a st r a n s f o r m e di n t os t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o rb 13 5 ，ap r o d u c e ro fk a l a f i m g i n w h i c hi sap u t a t i v ef i n a li n t e r m e d i a t ew i t h o u ta n g o l o s a m i n ea t t a c h m e n t l c m sm e a s u r e m e n t p r o v e dt h a t a f u n g i nw a sg l y c o s y l a t e di nt h er e s u l t i n gr e c o m b i n a n ts t r a i na n dc o n v e r t e dt o m e d e r m y c i n t h ep r e s e n td a t as u g g e s t e dt h a ts i xp u t a t i v eg l y c o s y l s y n t h a s eg e n e st o g e t h e r w i t hm e d - o r f 8a r ei n v o l v e di na n de o n o u g hf o rg l y c o s y l s y n t h e s i sa n d g l y c o s y l t r a n s f e r r i n gi n t h em e d e r m y c i nb i o s y n t h e s i s ( 3 ) an o v e lt r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t o r yg e n e ：m e d - o r f loi sp r o p o s e dt ob ea p o s i t i v e t r a n s c r i v a o n a lr e g u l a t o r yg e n ei nt h eb i o s y n t h e s i so f m e d e r m y c i n i no r d e rt op r o v et h ef u n c t i o n o fm e d - o r f l 0 ，p a y t 6 4c o n t a i n i n gam u t a n tg e n ec l u s t e rg a i n e dw i t ht h es a m es t r a t e g ya s a b o v ef o rg e n ei n a c t i v a t i o no fm e d - o r f l ov c a sl r a n s f o r m e di n t oah e t e r o l o g o u sh o s t 1 1 l 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s s t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o rc h 9 9 9 l c - m s a n a l y s i ss u g g e s t e dt h em e d - o r f 10d i s r u p t a n t p r o d u c e dr e d u c e da m o t m to fm e d e r m y c i n , t o g e t h e rw i t ha c c u m u l a t i o no fas h u n tp r o d u c l t h e s er e s u l t sp r o v i d e ds o m ee v i d e n c e sf o rt h ef u n c t i o no f m e d - o r f l 0 嬲ap o s i t i v er e g u l a t o r y g e n e o u rd a t ah e r eo p e n e au pt i l ep o s s l o l l l t yt oc l a e x t e n s i v e l yt h eb i o s y n t h e t i cp a t h w a yo f m e d e r m y c i n k e yw o r d s ：m e d e r m y c i n , b i o s y n t h e t i cp a t h w a y , s t r e p t o m y c e sg e n ek n o c k - o u ta n d c o m p l e m e n t a t i o r t , g e n ec o - e x p r e s s i o n ，n a t u r a lp r o d u c ta n a l y s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工 作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均己在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：皇知釉吼 日期：卅年口多月p 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同 意华中师范大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分 内容。 作者签名：毓阁， 日期：砷年一朗口日 导师签名谚嚷丕 日期刎口7 年移月f 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程 ，同意将本人 的学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库中全文发布，并可按“章程” 中的规定享受相关权益。回重途塞握童厦澄卮! 旦坐生；旦二生；鬯三生筮盔! 作者签名：瓤l 虱 日期：呻年矿i 月。f 目 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 1 链霉菌与抗生素简介 第一章前言弟一早刖i 1 1 1 链霉菌概述 链霉菌是具有菌丝及孢子分化的革兰氏阳性菌，在土壤表层中广泛分布，在分类地位 上属于放线菌纲、放线菌目、链霉菌科。它们可以分解消化很多有机废物和动植物腐骸 残枝，所以在大自然界中扮演重要的清道夫角色。除了生态上的重要性，在近代，链霉 菌引起人们注意的最大的原因是它们能产生众多重要的天然化合物，目前已知的抗生素 大都是链霉菌产生的，约占已经发现抗生素总数的2 3 ( h o p w o o d d a ，1 9 9 9 ) 。 链霉菌属于细菌，但形态比细菌要复杂，呈现分枝丝状结构( 即菌丝) 。根据菌丝 形态和功能的不同，链霉菌菌丝可以分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三种( 图1 1 ) 。 在固体培养基上，链霉菌菌丝相互交错缠绕，形成质地致密的干燥、不透明、难以挑取 的小菌落。由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的正反而呈现不同的色泽( 图1 2 ) 。 与一般细菌不同的是链霉菌具有复杂的生活史，包括从孢子基质菌丝气生菌丝 孢子的发育分化过程( 图1 1 ) 。因此链霉菌这特殊的微生物类群成为研究细菌 形态分化的重要的生物学材料。 链霉菌基因组大约是大肠杆菌基冈组的两倍( 平均为8 m b ) ，具有极高的( g 屺) ( 平均为7 3 0 0 - 7 5 ) ，是目前所有已经研究过的生物中基因组( g 屺泓最高的类q 乏物。 大部分链霉菌的染色体是线性结构。染色体末端有长的末端反向重复序列( t e r m i n a l i n v e r t e dr e p e a ts e q u e n c e ，t m ) ，长度凼种不同而不同；在染色体5 术端共价结合着术 端蛋白，对末端起到保护作用。线性染色体可能与链霉菌的另一个特性有关，即它们存 在大量缺失和扩增的趋势，而且缺失发生在近末端。比如链霉菌s a m b o f a c i e n s 的菌株可 以自发发生高频的染色体缺失，突变基冈组大小只有6 5 m b ( 刘志恒等，2 0 0 4 ) 。在遗 传学研究最深入的变铅青链霉菌6 6 和天蓝色链霉菌中，最频繁的缺失标记( 大约每个孢 子1 ) 是染色体一端的近末端的氯霉素扰f 生基因。这种末端染色体缺失可横穿两个术 端导致形成环状且可复制的染色体( 刘志恒等，2 0 0 4 ) 。 毫夕罗触t 一萌，7 7 、 7 争镑 。，o 4 产生孢子链 镰一s 产生t 生t t ? i ? i 繁 图1 2 链霉菌莳落形态 f i g i2 m q p l 0 l o 科0 f 锄印o m 婶嘏c o 皓 2 c 0 2 年5 月由英国w e l k 瑚n e 基金会s t a g e r 黼j o h n l n n e s 研究所合作完成了 模式菌株天蓝色链霉菌a 3 圆( 踟印柳哪梯f 哦加) 的基因纽全序列测定，成为第一 个对公众开放的链霉菌基因组朗e y s d , 2 0 0 2 ) ，目前又有数个链霉菌全基因组测序已 园一一一塑_ 就豳囤湖藿囫圈 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 经完成( 1 k e d ah e ta , 2 0 0 3 ；o h n i s h iy e ta 1 ，2 0 0 8 ) ，这意味着进一步利用各种功能基因组信 息，开展对链霉菌初生及次生代谢的研究已经开始。 1 1 2 抗生素简介 抗生素( a n t i b i o t i c s ) 是指在低浓度下能够选择性地抑制或杀死它种生物机能的一类 有机化合物，主要是在微生物、植物、动物生命活动过程中产生。目前也包括许多通过 化学、生物或生化方法所衍生的化合物。 微生物是种类繁杂的抗生素的主要产生者。已发现的三分之二的抗生素是仅由一类 细菌即放线菌产生的，其中主要是链霉菌属。抗生素是链霉菌的次生代谢产物，其积累 主要发生在孢子丝以及孢子形成阶段( 图1 1 ) 。一般的真细菌相对很少产生抗生素，但 芽孢杆菌属可以产生特定种类的抗生素和肽类；近年来研究发现粘细菌在抗生素生产方 面也显示出很大的潜力( 刘新丽等，2 0 0 7 ) 。真菌中，仅有两个属的真菌( 黑曲霉菌、 青霉菌) 产生较多种类的抗生素，而在其它不完全真菌属中，每个属产生少于1 0 种抗生 素。这说明抗生素在不同微生物中的分布有很大差异。另外抗生素的产生并非属种专一 的：同样种抗生素可以由不同种、不同属甚至不同族的微生物产生( 王以光，1 9 9 7 ) 。 根据抗生素结构特点的不同，可将抗生素分为p 内酰胺、氨基糖苷、大环内酯、四 环素、聚醚、类萜、核苷、多肽、糖肽、安莎等种类。多种多样抗生素的结构特点也决 定了它们生物活性的多样性，除了可以抑菌杀菌外，还可以作为抗癌药、抗寄生虫药、除 草剂、酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、低血胆固醇治疗剂等等，在医疗、工业、农 牧渔业和环境保护等领域均发挥着重要的作用。 不同抗牛素杀菌或抑菌作用机理也不同，主要有4 种机制：( 1 ) 抑制细菌细胞壁的 合成。以这种方式作用的抗菌药物包括青霉素类和头孢菌素类，哺乳动物的细胞没有细 胞壁，所以不受这些药物的影响；( 2 ) 与细胞膜相互作用而影响膜的渗透性。以这种方 式作用的抗生素有多粘菌素和短杆菌素等；( 3 ) 干扰蛋白质的合成，导致细胞存活所必 需的酶不能被正常合成。这类抗生素包括福霉素类、氨基糖苷类、四环素类和氯霉素等； ( 4 ) 抑制核酸的转录和复制，从而阻止了细胞分裂和或所需酶的合成。以这种方式作 用的抗生素包括萘啶酸和二氯基吖啶等( 王以光，1 9 9 7 ) 。 随着临床对抗生素的滥用，病原菌对抗生素耐药性是目前抗生素药物开发的主要难 题。而常规的药物筛选方法已经很难获得较好疗效的新抗生素，所以近年来在抗生素药 物开发方面呈现几个研究趋势：高通量筛选方法的建立；有效的筛选模型的建立；开发 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 新的生物资源( 比如极端坏境中的微生物、海洋微生物等) ；对已有抗生素进行化学改 造；利用多种方法对抗生素的生物合成途径进行阐释，从而借助现有的生物学技术从遗 传学水平上改造生物合成途径以开发新的有更高活性的天然杂合抗生素( 刘志恒等， 2 0 0 4 ) 。 1 1 3 聚酮抗生素与美达霉素 1 1 3 1 聚酮抗生素 聚酮抗生素是抗生素药物中最大的一类，是功能和结构最多样化的天然产物之一， 包括许许多多具有抑制细菌( 如红霉素、四环素) 、真菌( 如灰黄霉素、两性霉素) 、寄生虫 ( 如a v e r m e c t i n 、奈马克丁) 、癌症( 如多柔比星、e n e d i y n e s ) 等活性的抗生素，有些抗真菌 聚酮抗生素同时还具有免疫抑制剂的活性( 如雷帕霉素、f k s 0 6 ) ，所以被广泛地应用于医 药、畜牧和农业( 黄慧娟等，2 0 0 7 ) 。 聚酮抗生素是在细菌、真菌或植物体内，由低级羧酸通过连续的缩合反应产生的天 然产物。它们的合成包括酰基辅酶a 活化羧酸的一系列重复的醇醛缩合而形成有一定长 度的聚酮链骨架，然后经过环化或者芳香化、或者与脱氧糖等结构单位连接等过程。尽 管聚酮化合物的结构和特性千差万别，总的来说它可以分为两大类：芳香族聚酮化合物 和复合聚酮化合物。前者是乙酸通过缩合( 起始单位除外) 形成的大部分p 酮基在酰基链 的延伸和完成后都一直保持非还原状态，经过折叠和醇醛缩合形成六元环，芳香环随后 被脱水还原，如放线紫红素、柔红霉素、四环素等。复合聚酮化合物比芳香族聚酮化合 物在结构变化上大的多，其构成单位有乙酸、丙酸和丁酸等，而且与芳香族聚酮化合物在 合成化学、b 一酮基还原过程、侧链的空间位阻上的本质差别，许多不经过折叠和芳香化， 而是通过内酯化成环，还有一部分仍保持酰基链，如大环内酯抗生素红霉素和螺旋霉素、 抗真菌抗生素雷帕霉素和素莫能霉素和南昌霉素、抗寄生虫抗生素a v e r m e c t i n 等( j u l i a s 甜a 1 ，2 0 0 6 ；尚珂等，2 0 0 7 ；曹孟婵等，2 0 0 8 ) 。 所以归纳起来，聚耐抗生素的生物合成可以分为两个阶段：早期是聚耐链的合成， 类似于脂肪酸的合成，是数个2c 单位缩合形成聚酮长碳链的过程。晚期是长聚酮碳链 的修饰过程，从而形成结构多样和功能多样的各种化合物。负责聚酮抗生素合成的基因 在染色体上并非分散分布，而是成簇存在( 称基因簇) ，所编码的酶称之为聚酮合成酶 ( p o l y k e 6 d es y n t h e t a s e s , p k s ) 。从聚酮合成酶的结构特征和催化机理来看，大致可分三 种类型( i c h i n o s ei c e ta , 2 0 0 3 ；孙宇辉等，2 0 0 6 ) ： 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s i 型p k s 是多功能的大蛋白，包含多个结构域，每个结构域功能各异，数个相关结 构域形成一个模块，负责2 c 单位缩合、还原、释放等过程，主要特征：每个功能域只 使用一次；产物多为一些大环内酯( 即长聚酮链两个末端进行分子内部酯化) ； 型p k s 是一些单一功能的小蛋白，多个蛋白形成多酶复合体发挥功能，且多次使 用，形成足够长度的聚酮链；长碳链形成后，经过折叠、特定酮基还原、芳香化和环化 等过程，最后的产物含有多个芳香环，所以称为“芳香聚酮”； 型p k s 是介于两者之间的过渡类型，既是多功能蛋白( 但分子量小) ，又能被 反复使用。多是在植物中发现，产物为儿茶酚( c h a l c o n e ) 类衍生物，现在在链霉菌中 也分离到型p k s 基因。 聚酮抗生素无可比拟的生物学活性使之具有巨大的新药开发潜力和商业价值，而它 们独特的结构和合成机制为人们研究酶催化的分子机制、分子识别和蛋白质的相互作用 提供了空前的契机( 自林泉等，2 0 0 6 ；孙宇辉等，2 0 0 6 ) ；另外模块化的聚酮合成酶所 具有的可塑性可以使人们方便地通过组合生物合成手段来获得新的化合物( 组合生物 合成即结构不同抗生素生物合成基因之间可以进行重组、组合或互补产生新的非天然的 天然化合物( 、m n a t i l 均l ，n a t u r a lp r o d u c t s ) 的过程) 。目前已发现了不少于1 0 0 0 0 种聚酮化 合物，而由之衍生出的新产物更是难以计数( l u z h e t s k y ya e ta , 2 0 0 5 ；s a n c h e zc e t a ，2 0 0 5 ；赵文英等，2 0 0 6 ；孙宇辉等，2 0 0 6 ；黄慧娟等，2 0 0 7 ) 。所以，这一类抗生素越 来越为人们所重视，聚酮化合物所形成的药物已用于几乎所有重要的疾病治疗，每年的 销售额超过了1 0 0 亿美元。 1 1 3 2 美达霉素 美达霉素( m e d e r m y c i n ) 是一种芳香聚酮类抗生素，与放线紫红素母核结构相似， 最初从链霉菌k 7 3 ( s t r e p t o m y c e ss p k 7 3 ) 中分离出来，具有潜在抗癌、抗菌功效( i c h i n o s e k e ta , 2 0 0 3 ；l ia e la 1 , 2 0 0 5 ；m a r g a r e t a , 2 0 0 3 ；s a l a s k ie j e ld 2 0 0 9 ) 。1 9 8 5 - 1 9 8 6 年, h o p w o o d 和o n l u l a 把美达霉素和放线紫红素的合成基因组合起在细胞体内生成 新的杂合抗生素( m e d e r h o d i n ) ( s a t o s h io m u r a e ta ，1 9 8 6 ；s h e r ip e ta 1 ，1 9 8 7 ) ，由此提出了“组 合生物合成”的概念( s a t o s h io m u l ae ta ，1 9 8 6 ) 。目前美达霉素生物合成基因簇的全部序列 已经从产生菌s t r e p t o m y c e ss p a m - 7 1 6 1 染色体上克隆出来，并进行了序列测定，该基因 簇全长3 6 2 0 2b p ，包含3 4 个完整的基因。这个完整的基因簇已经在异源宿主细胞中成 功表达( i c h i n o s ei c e t , 7 1 2 0 0 3 ) ( 图1 3 ，图1 4 ) 。 美选霉索的结构在生物台成方面有许多值得研究的问题，尤其是聚酮后修饰步骤， 包括脱氧糖基修饰、手性中心的形成等( n 喇拍i c e t a l , 2 0 0 4 s i a “a l , 2 0 0 5 ) 。但目前关 于美达霉素生物合成基因功能研究的文献仅有篇，即李爱英在2 0 0 5 年报道的关于负责 美达霉素手性中心形成的基因# w m - o r f l 2 的功能研究，这个基因编码的立体专一性的酮 基还原酶决定美达霉素3 位碳原子上的手性中心的形成( “a e # a l 2 0 0 5 ) 。另外还发现 在美达霉素的基因簇中含有一些未知功能的基因，如m e d - o r f 0 ，在前期的种问互补实 验中推测此基因可能参与抗生素生物合成的调控。并正效调节抗生素的产量( 李爱英， 未发表) 。对美达霉素这些后期修饰过程进行分子水平上的研究，在化学、生物学、药 理学方面都具有非常重要的意义。尤其是可以利用感兴趣的基因，借助于基因工程手段， 改变现有的抗生素的代谢途径，从而改良它们的活性，或者合成具有新的药理学性质的 非天然的天然抗生素，以进行新药的开发和研制。 美达霉素的脱氧精基修饰是费们最感兴趣的阔韪，尤其足糖基是通过一个非常罕见 的c - c 糖苷键与聚酮母核相连。据报道，糖基的存在对抗生素的生物学活性具有定的 决定性作用，但目前对c - c 糖苷键形成的爿：物学机制报道非常少。催化c c 糖苷键形 成的。糖基转移酶是微生物次级代谢产物生物台成中的一类新型糖基转移酶。通过序列 相似性比较己经发现美达霉素合成基因簇中有一基因m e d - o r f g 可能与糖基转移有关， 是这基因簇中唯一与糖基转移酶同源的基因( 与u r d a r n y c i n 基因簇中的c - c 糖基转移酶 基因u r d g t 2 有5 鲥井列一致性( m i c h a d m e t a l , 2 0 0 7 ) ) ，另外推测有6 个基因可能参与 糖琏( 安哥扣糖胺) 的台成( i c h i n o s e k e t o i ，2 0 0 3 ) 。如图所示( 罔l3 ) ：。 e ，c 科嘲l 刚 劲1 81 7 1 6 1 5 1 4 i 8数字表示可能负责耱基合成 和转移的蓐凶 圈1 3 燕逃霉索生物台成基因簇 f 培l j m 出m y c i n b i o 舯d 倒c 目目e c l l 眦r 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 美迭露秦( m e d e r m y c i n ) s t r e p t o m 涫s s p a m - 7 16 1 0 2 h 旅绫紫红素( a c t n o r h o d l n ) s c o e $ i c o o ra 3 ( 2 ) 图1 4 美达霉素和放线紫红素化学结构比较 f 瞎1 4s l r u c 吣o f m e d e r m y e i na n da c t i n o r h o d i n 1 2 抗生素糖基化与糖基转移酶 糖基化是生物细胞中重要的生理过程之一，因参与细胞能源和结构物质合成、各种 生物学功能的建立以及疾病的发生、发展、预后等过程而成为糖生物学研究的重要内容。 在微生物次级代谢过程中，糖基化则构成众多具有重要应用价值的天然产物，其中包括 氨基糖苷类、非核糖体肽类、聚酮类等大量的含糖抗生素。不同抗生素中糖基供体和受 体的结构、糖苷键成键方式以及成键位置变化都很大，其中糖基供体多数都是由d 或l 一六碳糖衍生而来，以单糖或寡糖形式与受体连接。而受体部分有的是由单糖衍生而来 ( 氨摹糖苷类) ，更多的是非糖体形式。糖基的存在不仅决定了抗生素化学结构的多样性， 对于抗生素抗菌、抗肿瘤等生物学活性都有决定性作用( j a ys e ta 1 , 2 0 0 7 ；丁向明等， 2 0 0 3 ；代焕琴等，2 0 0 7 ；曹梦婵等，2 0 0 7 ) 。作为个非常重要的生物合成步骤，糖皋化 的生物学机制近年来成为微生物来源的抗生素生物合成研究领域的热点之一。根据糖苷 键类型的不同，糖基化可分为0 一糖基化、n - 糖基化和c 糖基化三种方式。而催化糖苷 键形成的糖基转移酶可以作为重要的生物资源，在药物开发方面有望显示其应用价值( f 弋 焕琴等，2 0 0 7 ) 。 根据糖基转移酶的立体化学性质和空问结构研究发现，7 0 以上糖基转移酶只属于 有限的g t - a 和g t - b 两大超级家族( s u p e r f a m i l y ) ，均含有n 和c 端两个功能结构域， 分别与糖基供体和受体结合( b r e t o nc e ta , 2 0 0 6 ) 。不同之处在于g t _ a 催化过程需要二 价阳离子( 多为m ) 的参与，且与保守的d x d 模块( a s p x - a s p ) 相连，而g t - b 7 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 成员则不需要，也无d x d 模块。另有少数糖基转移酶属于一小的g t - c 的超级家族， 特征是含8 1 3 个穿膜功能结构域，多是一些多糖和磷酸长醇合成所必需的酶。微生物次 级代谢产物合成中的糖基转移酶多数属于g t - b 超级家族，且c 一端均存在一个富含甘氨 酸的保守区域和保守的脯氨酸位点( h uy 。e ta 1 2 0 0 6 ；l i a n gd e ta , 2 0 0 7 ) 。 根据催化形成的糖苷键的类型，在微生物抗生素生物合成的研究中已经发现有三类 糖基转移酶： ( 1 ) 负责c - o - c 糖：纾键形成的o - 糖基转移酶( o - g l y c o s y l t r a n s f e r a s e , o - g t ) ：大部 分糖基转移酶都属于这一类型( l u z h e t s k y y a e t a , 2 0 0 5 ；m u l i c h a k a e t a l d 2 0 0 1 ) 。国内自林 泉等发现在氨基环醇类抗生素v a l i d a m y c i n 的生物合成基因簇中有o 糖基转移酶基因 v a l g ，通过基因敲除回补以及基因的体内外过量表达，证明了该基因可以催化 u d p g l u c o s e 以c - o c 糖苷键的形式连接到v a l i d o x y l a m i n ea 上形成v a l i d a m y c i na ( b a i l e ta 1 , 2 0 0 6 ) ；美国t h r o s o n 教授实验组首次揭示抗生素生物合成中的o 糖基转移酶具催 化的糖基化具有可逆性( z h a n gc e ta , 2 0 0 6 ) ，韩国j a y 等人通过在体外进行种问互补的试 验证明了在大环内酯类抗生素新洒霉素、苦霉素、以及酒霉素等抗生素生物合成基因簇 中负责c o - c 糖苷键形成的0 糖基转移酶基冈具有很高的同源陛而且能够进行互相替 换对母核结构起到糖基化的作用等( j a ys e td , 2 0 0 7 ) ； ( 2 ) 负责c - n 糖苷键形成的n 糖基转移酶( n - g t ) ：在微生物中次级代谢产物合 成中并不多见。国内赵沛基、白林泉等通过基因敲除与回补、异源超量表达以及酶催化 动力学研究，阐明了安丝菌素酰胺n 糖基转移酶a s m 2 5 基因在安丝菌素生物合成中的 作用以及催化机理，为酶催化的重组生物合成新的抗生素提供理论基础( z h a op e t a 1 ，z 0 0 8 ) ，日本f u r u m a 和s a l a s 实验室通过基因敲除和异源表达证明在s t a u r o s p o r i n e 和 其类似物r e b e c c a m y c i n 合成巾的s t a n 、s t a g 和r e b g 能催化c - n 糖苷键的形成。s t a g 和r e b g 与初级代谢中的大多数n - g t 在进化关系上比较接近，但s t a n 却与细胞色素氧 化酶p 4 5 0 在序列上有很高的相似性( 6 2 2 ) ，这是目自 发现的唯一参与c - n 糖苷键形 成的细胞色素氧化酶p 4 5 0 。s t a n 、s t a g 和r e b g 也呈现底物识别的多样性( o n a k ah e t d , 2 0 0 5 ) ； ( 3 ) 负责c - c 糖苷键形成的c 糖基转移酶( c - g t ) ：这是最近几年在微生物次级 代谢产物生物合成中发现的一类新型糖基转移酶，w a l s h 等通过对大肠杆菌产生的非核 糖体肽类肠菌素合成中的i r o b 进行生化分析，提出c - c 糖苷键形成的两种可能机制 ( f i s c h b a c hm e ta t 2 0 0 5 ) ，b e c h t h o l d 、同本i c h i n o s e 和美国r o h r 等发现聚酮类抗生素 8 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s u r d a m y c i n ( h o f f m e i s t e rd e ta t 2 0 0 d 合成中的u r d g t 2h i 接受不同的糖基供体和受体作为 底物，而且可以催化c - c 或c - o - c 两种成键反应，其n - 端包含3 1 个氨基酸的一段区域 可能与糖基供体和受体的识别特异性有关( h o f f m e i s t e rd e ta , 2 0 0 3 ；d u r r c e t a , 2 0 0 4 ；f e d o r y s h y nm e ta , 2 0 0 7 ) ，德国m i c h a e lm i t t l e r 等在大肠杆菌中过量表达了 u r d g t 2 酶，并对其进行了纯化和结晶得到了第个c 一糖基转移酶的晶体结构( m i c h a e l m e ta t 2 0 0 7 ) ，2 0 0 3 年k o j i 等发现在芳香聚酮抗生素美达霉素合成因m e d - o r f 8 的编码 产物也可能具有糖基转移酶的活性( 1 c h i n o s ei c e ta , 2 0 0 3 ) 。这个基因是本文重点研究的对 象。 1 3 抗生素生物合成的调控 抗生素的生物合成调控是个非常复杂的过程。目前发现抗生素的调控存在级联系统， 即由“多效性的调控因子控制抗生素合成途径中的“途径专一性调控基因”的表达，而后 者则直接决定抗生素的产生水平( 如图1 5 所示) ：种链霉菌可产生多种抗生素，但这些 抗生素可能受控于同个多效性调控因子，每一种抗生素的合成途径都有其途径专性 的调控因子。抗生素合成途径中的调控基因可分为正效调控、负效调控两类( 即促进或 抑制抗生素的产生) 。在实际应用中，增加正效调控基因的拷贝数可以用来提高抗生素 的产生水平，或通过从基因组中敲除负效调控基因，从而解除它对抗生素生产的抑制， 同样达到育种的目的。 l b l d a 的产物为兀a 一尔n a ，高g 屺的链霉菌基因中n a 密码子极为少见，因此成为b d a 的调 控位点。 图i 5 天兰色链霉菌中的种级联调控系统。 f i g , 1 5n e t w o r ko f r e g u l a t o r yf a c t o r si ns t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r 9 =一重熹 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 抗生素代谢调控的级联系统中，高阶层的调控因子具有多样性和多效性：它们不仅 调控多种次生代谢物的合成，也参与链霉菌的形态分化发育控制o r i n ab e ta ，2 0 0 7 ) 。目 前在链霉菌中已发现多种多效性调控蛋白，并以不同机制发挥全局性的调节功能。比如 b i d a 及同源产物能编码识别链霉菌中稀有的1 1 a ( 亮氨酸密码子) 的t r n a ，能有效控 制靶基因中较为罕见的a 的翻译( f e n m l d e zm e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。除天蓝色链霉菌外，狄色 链霉菌、球孢链霉菌、白黑链霉菌和变铅青链霉菌、阿维链霉菌都存在b l d a 同源基因， 参与形态分化以及次生代谢的调控( o m u r as e ta l , 2 0 0 1 ) ；除此之外，含t p r 结构域 ( t e t r a t r i c o p e p t i d er e p e a t , 含 3 4 个氨基酸) 家族中的n s d a 、n s d b 和t c r a 是在天蓝色链霉 菌中发现的负调控基因( 其中n s d a 在不同链霉菌中都存在且高度同源) ，而同样含有 1 p r 结构域的a f s r 则是个起正效调控的多效调控因子( u m e y a m at e ta ，1 9 9 9 ) ；还有 一类是双因子调控系统：包括两个蛋白组分，其一是位于细胞膜上的感应因子( 组氨酸激 酶或丝氨酸苏氨酸激酶) 。在外部环境刺激下，感应因子发生自身磷酸化而激活，然后 转移磷酸基至第二组分应答调节因子，使后者发生磷酸化。磷酸