（分析化学专业论文）间苯二酚杯4芳烃液相色谱整体柱的制备.pdf

中山大学硕士学位论文 间苯二酚杯 4 芳烃液相色谱整体柱的制备 姓名：伍品端 专业：分析化学 指导老师：马志玲副教授 摘要 色谱整体柱是一种在色谱管柱内通过原位的有机或无机物聚合而得的连续 床固定相。与目前商品化的填充色谱柱相比，整体柱具有制备方法简单、通透性 好、柱前压低、活性位点利用率高、峰容量高等优点，是一种极具应用潜力的新 型色谱柱，其作为一种新型的分离介质，有着极为广泛的实用价值和发展前景。 杯芳烃由于具有独特的空腔结构，能通过形成典型的主客体包结络合物而识 别范围极广的离子、分子等客体。它集合了冠醚和环糊精的主体特点为一身，具 备更高的选择性，被誉为是继冠醚和环糊精之后的“第三代主体分子，其分子 识别功能在现代分离科学中有较为广泛的应用。 杯芳烃整体柱结合了整体柱在色谱动力学的优势及杯芳烃的高选择性，杯芳 烃整体柱的制备及应用研究具有重要的理论研究和实用价值。 第一章 在介绍色谱整体柱的发展历史的基础上，着重综述了整体柱的类型及其应用 进展，概述了整体柱的性能评价和特点；重点介绍了杯芳烃与杯芳烃衍生物在包 合作用和色谱分析中的应用进展，以及它们作为主体分子的高选择性和应用广泛 v 中山大学硕十学位论文 性。最后阐述了本课题的研究背景和立题意义。 第二章 制备了以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体( g m a ) 、二甲基丙烯酸乙二醇酯 ( e d m a ) 为交联剂，环己醇和正十二醇的混合液为致孔剂，偶氮二异丁腈为引 发剂的色谱整体柱基质；建立了利用荧光探针测定杯芳烃整体柱上间苯二酚杯【4 】 芳烃键合量的方法。探讨了反应介质、k o h 浓度、间苯二酚杯【4 】芳烃浓度及反 应时间等条件对间苯二酚杯 4 】芳烃键合量的影响，确定了最佳键合条件，在此 基础上，制备了问苯二酚杯 4 】芳烃g 蝴d m a 整体柱。 第三章 在优化的键合条件下，分别制备出间苯二酚杯 4 芳烃液相色谱整体柱、间 苯二酚杯 4 】芳烃在线萃取整体柱和间苯二酚杯 4 】芳烃键合固定相的固相萃取 柱，分别对其性能及应用做了初步探讨。 关键词：g m e d m a ，间苯二酚杯 4 芳烃，杯芳烃整体柱，液相色谱，在线萃 取，固相萃取 中山人学硕士学位论文 f a b r i c a t i o no fr e s o r c i n 4 a r e n em o n o l i t h sf o rl i q u i d c h r o m a t o g r a p h y n a m e ：w - up i n d u a n m 旬o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t 巧 s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o m az h i l i n g a b s t r a c t m o n o l i 廿l i cc o l 硼 1 l li sac o n t i n u o u ss t a t i o n a d ，p h 嬲ef - a b r i c a t c db y 胁咚触r e a c t i o no f o f g a i l i c o r i n o 培a i l i cp o l y m e r i z a t i o n s c o m p a r e d t 0c o m m e r c i a l p a c | 【e d c h r 0 | m a t o 黟a p l l i cc 0 1 u n m s ，i th a sm ef o l l o w i i l ga d v a i l t a g e s ：f a b r i c a t i o ne a s i n e s s ，g o o d o s i n o s i s ，l l i g l lu t i l i z a t i o no fa c t i v es i t e s ，h i g l lp e a l 【c a p a c i t ye t c ；锄dt l l u sh 嬲 p r o m i s i n ga p p l i c a t i o i l s 鹊an e wt y p eo fs 印a r a t i o nm e d i a c a l i x a 雠sa r ec a p v i 妒s h a p e dc y c l i cm 0 1 e c u l e sm a d eu po fp h e l l o lu m t sl i l l l 【e dv i a m e m y l e n eb r i d g e s t l l e yc 锄f o 肌i n c l u s i o nc o m p l e x 懿w i maw i d ev 砌e t ) ro fg u 懿t m 0 1 e c u l e so ri o i 塔，a i l dp o s s e sg r e a tp o t e n t i a l si nt h em o l e c u l a rr e c o g l l i t i o i l w l l i c ha r e c o u n t e d鹊m et h i r dg 髓e r a t i o no f 吼i p r 锄o l e c u l e sa f t c rc r o 、) l ，ne m e 璐a n d c y c l o d e x t r i 粥 c a l i x a r e n em o n 0 1 i t h sc o m b i n em el 【i n e t i ca d v 锄t a g e so fm o n 0 1 i t l l si nc i 啪m a t o 伊a p h y 缸dt h eh i g hs e l e c t i v 埘o fc a l i x a r c l l e s ，、) l 舡c hm a l 【e sr e s e a r c i h e so nm e i rf a b r i c a t i o l l s 锄da p p l i c a t i o n so f 蓼e a tw o m l c h a p t e r1 v 中山大学硕士学位论文 o nb a s i so fi n t r ( ) d u c i n gm eh i s t o r i e so fm o n o l i t h ，m i sc h a p t e rs u m m 撕z e sm et y p e s a 1 1 da p p l i c a t i o nd e v e l o p m e n t so fm o n o l i t l l s i tf o c u s e so nm ei 1 1 c l u s i v ea c t i o n sa i l d c h r o m a t o 铲a p h i c 印p l i c a t i o n so fc a l i x 鲫m e sa i l dc a l i x a r e i l ed 耐v a t i v e s ，a i l dm e i rh i 曲 s e l e c t i v 时a 1 1 de x t e n s i v ea p p l i c a t i o n s 雒h o s tm o l e c u l e s a n ds e q u e n t i a l l yb r i n g f o r w a r dt h er e s e a r c hb a c k g r o u n da n dt l i es i g l l i f i c a n c eo fm i s p a p 既 c h a p t e r 2 am o n 0 1 i t h i cs t a t i o n a 巧p h a s ew a sp r 印a r e d ，w i m 西y c i d y lm e t h a c r y l a t ea sm o n o m e r ， e t h y l e n ed i m e m a c r y l a t ea s1 i m ( i n gr e a g e n t ，t h em i x t u r eo fc y c l o h e x a n o l a n d d o d e c a l l o la sp o r o g e na n da z o - b i s i s o b u t 驴m t r i l ea sm ei n i t i a t o r ad e t e 咖i n a t i o n m e t h o df o rt h er e s o r c i n 4 】a r e n ei m m o b i l i z a t i o n 锄o u n to nt l l em o n 0 1 i m su s i n ga n u o r e s c e n tp r o b ei sd e v e l o p e d i n v e s t i g a t i o n so fm ee 虢c t so fr e a c t i o nm e d i a ，k o h c o n c e n 仃a t i o n ，r e s o r c i n 4 】硼l ec o n c e l l 觚t i o na 1 1 dr e a c t i o nt i m eo nt l l ei 瑚【1 1 1 0 b i l i z a t i o n 锄o u n tw e r em a d e ；a no p t i n l i z e di m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o nw a sf o u n d ，b a s e d0 n w h i c hr e s o r c i n 【4 】a r e i l ei m m o b i l i z e dg m e d m am o n o l i t h sw e r ef a b r i c a t e d c h a p t e r 3 u n d e ro p t i m i z e di m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n s ，r e s o r c i n 【4 】a r 饥es o l i dp h a s ee x 仃a c t i o n c o l u m n s ，r e s o r c i n 【4 】a r e n em o n o l i t h sr 塔1 i q u i dc ：h r o m a t o 孕a p h ya n dr e s o r c i n 【4 】a r e n e m o n o l i t h sf o ro n - l i n ee x t r a t i o nw e r em a d e a n dp d m a r yi n v e s t i g a t i o n sf 0 rt h e 印p l i c a t i o 璐o ft h e s er c s o r c i n 【4 】a r e n es t a t i o n a r yp h a s e sw e r em a d e k e yw 0 池：g m a e d m a ，r e s o r c i i l 嗍a 僦e ，c a l i ) 【a r 铋em o n o l i t l l ，h p l c ，o n - l i l l ee x t r a c 幻n ，s o l i d p h 舔ee x 仃a c t i o n v i 中山大学硕士学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容 外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品 成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以 明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：伍品即 日期：如口g 年孓月3 0 日 中山大学硕七学位论文 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论 文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复 制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位 论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其 他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：包岛弗 别程名毒吟 弋3 训 日期：少瞬0 月如日 中山大学硕士学位论文 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师指导下 完成的成果，该成果属于中山大学化学与化学工程学院，受国家知识 产权法保护。在学期间与毕业后以任何形式公开发表论文或申请专 利，均需由导师作为通讯联系人，未经导师的书面许可，本人不得以 任何方式，以任何其它单位作全部和局部署名公布学位论文成果。本 人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名机梯 日期：】口毋年占月3 0 日 中山大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 色谱柱的发展及色谱整体柱的特点 高效液相色谱( h i 曲p e r f o 锄a n c el i q u i dc h r o m a t o 伊a p h y h p l c ) 是近年来 发展速度最快的分离检测技术之一，其具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、 应用范围广等特点。高效液相色谱法的研究对象主要是复杂的混合物，其被越来 越多地应用于产品质量检验、环境分析、分离制备和其它各类实验研究中，已成 为化学和生物化学领域中不可缺少的高效、快速、灵敏的分离分析手段。 在高效液相色谱分析系统中，色谱柱是其“心脏，对色谱分离效率起着核 心的作用。提高h p l c 色谱分离效率的一个核心问题是克服由固定相造成的溶质 传质阻力：即溶质从流动相扩散到固定相，其到达两相界面需要一定的时间，该 时间与溶质扩散时所经过的距离的平方成正比，该距离取决于固定相填料的颗粒 大小。解决此问题主要有以下两个途径：第一，减小固定相填料的平均粒径以使 扩散距离最小化，然而随着填料粒径的减小，色谱柱的柱压将急剧上升，其必然 导致溶质在流动相中的传质阻力增大，同时对填料的耐压强度的要求也大大提 高；第二个途径是引入具有双峰孔分布的色谱柱固定相，即同时具有能提供足够 表面积的中孔和能促进传质动力的大孔。 h p l c 色谱柱从诞生发展至今，为了使柱效得到不断提高，h p l c 色谱柱的 发展经历了从填充柱填料粒径减小、柱直径的减小，直至整体柱的出现和发展的 过程。 h p l c 色谱柱最初出现在1 9 6 4 至1 9 6 5 年间【l 】，是由当时常用于g c 色谱柱 的填料通过振动技术以干法装填而成，最典型的是粒径在1 0 0 岬的硅藻土；1 9 6 8 至1 9 6 9 年间，使用粒径在2 5 岫的填料装填的商品化h p l c 色谱柱问世；2 0 世 纪6 0 年代末至7 0 年代初，发展出粒径在5 - 1 0 u m 的球状填料，而匀浆装柱法也 由此应运而生，由该法制得的h p l c 色谱柱的柱效被证明比干法装填的色谱柱的 柱效高得多，同时在1 9 6 9 至1 9 7 5 年间，围绕着填料是不规则的形状还是球状更 中山大学硕士学位论文 利于获得低的柱压、好的柱稳定性和高的柱效进行了广泛的讨论；直至1 9 7 0 至 1 9 9 5 年期间，分析柱的不规则填料全部被球状填料所取代【2 1 。目前，最典型的 h p l c 填充柱是由粒径为5 岬的填料经过匀浆装柱法填制而成；快速或高效 h p l c 色谱柱填料的粒径可以小至1 3 岬。 除了填料粒径的减小外，h p l c 色谱柱的发展还经历了柱直径的减小历程。 柱直径的减小是为了减少被分析样品的稀释，并且在保持柱效的前提下，获得比 大内径色谱柱更高的峰高，从而改善色谱峰的峰型。小内径的h p l c 色谱柱，如 “微柱”和“纳柱”，它们所使用的流动相流速相应降低；并且柱外效应会对柱效有 着更加明显的影响，所以需要考虑进样体积、检测池体积、连接管路等因素以尽 量减小柱外效应，限制峰形展宽，从而保证理想的柱效。因此微柱、纳柱不能在 传统的h p l c 色谱仪上使用，而需要“微l c ”( m i c r o l c ) 和“纳l c ”( n a n o l c ) 系统与之配套使用，同时流动相的流速控制在每分钟微升、纳升范围。 近l o 至1 5 年间，h p l c 色谱柱的发展呈现向小型化发展的趋势【3 】，以减少 溶剂的消耗和处理，提高灵敏度及便于与m s 联用等。随着对色谱柱高效、高通 量要求的增加，人们需要使用粒径更小、长度更短、可在高流速下使用的色谱柱， 而这些解决方法又带来了柱压急剧增加的问题。为了解决柱压问题，研究者开始 研制新型的色谱整体柱。 近年发展起来的色谱整体柱【4 】( m o n 0 1 i t h i cc o l 硼 1 1 1 ) ，又称棒状柱( r o d ) 、连续 柱支撑体( c o n t i 姗o u sc o l l 肋ns u p p o n ) 、连续床层( c o n t i n u o u sb e d ) 、无塞柱( 衔t l e s s c o l u 舳) ，其是一种在色谱管柱内通过原位的有机或无机物聚合而得的连续床固 定相。 整体柱的最初模型是在1 9 6 7 年k u b i n 等【5 】尝试用聚2 羟乙基甲基丙烯酸酯 凝胶制备分离蛋白质的低压排阻色谱柱。而实用性的整体柱是1 9 8 9 年h j e n e i l 等【6 】首次报道的聚丙烯酰胺整体柱成功地用于蛋白质及多肽的分离。t e n i l i k o v a 和s v e c 【7 】合成了圆盘状的甲基丙烯酸缩水甘油酯二甲基丙烯酸乙二醇酯 ( g m a e d m a ) 聚合物并随后将之商品化，名为“对流相互作用介质( c o r l 、，e c t i o n i n t e r a c t i o nm e d i a ，c i m ) ”。随后，p r c i i l s t a l l e r 等【8 】制备出功能化的整体柱用于分 离核酸。 2 中山大学硕士学位论文 目前，生产整体柱的厂家有u n o ，c 订，c h r o m o l i t l l ，s w i n 等，显示出该技术 的重要性。商品化整体柱主要是作为生化样品色谱分析的固定相，被称为是继聚 糖类基质、交联涂布固定相和单分散性材料之后的第四代生化样品的色谱固定 相。 整体柱与传统填充柱的最大不同之处是它具有相互连通的通道网络贯穿整 个色谱柱中。从形态上看，整体柱使液相色谱中相互接触的两相，即固定相和流 动相都呈现连续状态。由于整体柱充满于整个柱管内，因而消除了填充柱中颗粒 间的空隙，流动相在特定的通道和孔内能够更有效地促进传质，即分离过程中流 动相是在分离介质( 固定相) 中“穿行”而不是“绕过”，因而减小了涡流：根据 a f e v a n 等【9 】的说法，直径在8 0 0 衄及以上的大孔被称为“灌注孔”。在灌注孔中， 传质过程不是依靠扩散，而是由压力梯度产生的流动相液流驱动。而在整体柱中， 这类灌注孔能很好地透过流动相液流，使得流动相传质更加有效进行，因此整体 柱的柱效通过这种“对流”式的传质过程而得到提高。整体柱的传质效率明显高于 传统的填充柱，因此整体柱的范德姆特( v a i ld e 铋t e r ) 速率曲线即流动相线流 速度对塔板高度影响的曲线显得非常“浅”，这表明在整体柱上可实现快速分析而 不牺牲其柱效。另外，整体柱显示出高的渗透性，这意味着整体柱可以承受高的 流速。整体柱的另一明显优点是它们可以在传统的h p l c 色谱仪上使用，因为它 们不需要在最佳流速下才具有高的柱效，这就消除了整体柱对仪器的要求限制： 总的来说，整体柱与常规的色谱柱相比具有以下优点： ( 1 ) 制备方法简单，形状灵活性大。可以原位制备，省去制备稳定床层所 需的填料和装柱过程，且柱子的长度和直径在一定程度上不受限制。 不必受装柱技术和填料的限制，可根据需要制成各种形状，如柱状、 毛细管状、膜状等。 ( 2 ) 渗透性好、柱前压低。整体柱中具有灌注色谱的特点，即色谱柱中既 有流动相的流通孔又有便于溶质进行传质的中孔( 几十个纳米) ，可 以对生物大分子进行快速分离，而且色谱柱的稳定性很好。 ( 3 ) 分辨率高、柱容量大。高的柱容量和快的传质动力有利于获得高的柱 效。 3 中山大学硕士学位论文 ( 4 ) 种类众多。由于制备过程中使用聚合方法，因而可以方便地往固定相 中引入各种可能的官能团及进行相应的表面衍生化，以满足不同的分 析需要。 ( 5 ) 化学稳定性良好，可以在较宽的p h 值范围内使用。 ( 6 )不易产生不可逆的吸附作用，特别对于生化物质的分离能够较好的保 存其生物活性。 整体柱的以上优点，使整体柱作为一种新型的分离介质，有着极为广泛的实 用价值和发展前景。 1 2 色谱整体柱的类型及研究进展 按照整体柱基质材料的不同，整体柱可分为无机硅胶整体柱和有机聚合物整 体柱。前者主要是将硅氧化物直接烧结在柱内或用溶胶凝胶法在柱中反应获得。 后者则由有机聚合物的单体通过在柱管内原位聚合而得。两类整体柱都能用于高 效液相色谱及毛细管电色谱。 1 2 1 硅胶整体柱 硅胶整体柱制备过程【2 】如下：以烷氧基硅烷如四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷 等为原料，经酸催化水解，然后在水溶性的高分子( 如聚丙烯酸) 和表面活性添 加剂的存在下进行缩聚反应，使该多组分溶液通过成核与长大机理转变为溶胶 凝胶系统。第二部是干燥、老化过程，以获得均一的双孔结构相，使柱床可以在 较长时间内能保持较好的稳定性。凝胶的形态可通过水解与缩聚这两个竞争过程 之间的动力学来控制。所得的凝胶经过老化后，用溶液处理凝胶从而得到合适的 孔结构。硅胶整体柱的制备过程可以产生两个连续的孔系统，并可通过合成条件 分别独立地调节及控制孔径、大孔的孔隙率和中孔的孔隙率。所得硅胶整体柱床 层可直接作为固定相或再进行衍生化。 4 中山大学硕士学位论文 1 9 9 6 年，m i n a k u c l l i 等【l o 】率先将溶胶凝胶法应用于硅胶整体柱的制备：他 们将四甲氧基硅烷、聚环氧乙烷及催化剂乙酸在o 下搅拌3 0 m i n 形成溶胶，将 溶胶倒入聚碳酸酯模具管内于4 0 下过夜，使之发生水解缩聚反应生成凝胶。 然后于5 0 下干燥3 天，再经6 0 0 焙烧2 h 制成硅胶整体柱。该柱可作为固定 相或再进行柱上化学修饰。采用该方法制备的硅胶整体柱同时具有微米级的骨架 和通孔( 亦称大孔) 及纳米级的中孔。其中大孔( 灌注孔) 的存在使硅胶整体柱 具有很好的通透性，柱压降随流速变化缓慢；而中孔则为整体柱提供大的比表面 积，是保证其高柱效的前提条件之一。 目前开发的硅胶整体柱大多是反相柱，这种柱子的空隙率一般大于8 0 ， 即使在较高流速下使用也不会有太大的柱压，这使其很适合高通量分析和快速分 离。商品化的硅胶整体柱主要有s i l i c 出o d 【l l ，1 2 1 和c h r 0 m o l i “1 3 ，1 4 1 。硅胶基质整 体柱多用于分析低分子量化合物及多肽的分离。 1 2 1 1 取代芳香化合物的分离 1 9 9 7 年，m i n a l ( 1 l c l l i 【1 5 】等将其制作的硅胶整体柱基质进行十八烷基硅烷化后， 用于对多种烷基取代苯的分离以考察该柱的反相性质，结果显示该c 1 8 硅胶整 体柱在8 0 甲醇水下对烷基苯分离的最小塔板高度达l o 1 5 m 。他们还发现， 小骨架尺寸的c 1 8 硅胶整体柱在高流速下具有比粒径为5 岬的c 1 8 填充柱更高 的柱效和更低的柱压降。g f b a r b 啪等【16 】使用1 0 0n 瓶4 6m m 硅胶基质反 相整体柱( c h r 0 】【i l o l 池p e r f o 肌柚c er p 18 e ，m c k ) 以6 m l m i n 1 流速的梯度 洗脱方式，在7 2 2 m i i l 内实现了对辣椒中的五种主要辣椒素实现了快速分离，大 大地缩短了使用传统的c 1 8 柱所需的分析时间，并且重现性很好( r s d 6 0 ) ，呈现出典型的h i l i c 1 0 中山人学硕士学伊论文 机理，并且对中性、碱性和酸性的分析物具有很好的选择性。由于该整体柱在带 电分析物分离过程中，亲水作用和静电作用都对分析物的保留产生作用，因此为 色谱工作者提供了分离极性化合物的又一选择。 1 2 3 3 离子交换整体柱 离子交换整体柱也是一种用于大分子分析和分离的非常重要的整体柱类型。 向整体柱骨架上引入离子交换官能团的方法包括：吸附、共聚合或在整体柱基质 合成后进行键合修饰。 y a i l g 等【3 4 1 以乙烯二胺和单氯代乙酸修饰g m 觚d m a 共聚整体柱制备了弱 阳离子交换( w e a kc a t i o n - e x c h a l l g e ，w a x ) 整体柱，能同时实现去蛋白和药物富 集，而不需经过繁琐的前处理过程。w e i 等【3 5 】报道从g m 刖e d m a 共聚物为基质 的大孔整体柱，通过两步反应制得弱阳离子交换整体柱：先用乙二胺将表面氨化， 然后与氯乙酸反应以引入羧基。所得的弱阳离子交换整体柱尽管在高流速下也能 显示出对蛋白有良好的分离作用。 z h u 等【3 6 】以甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) 、甲基丙烯酸( m a a ) 为功能单 体，二甲基丙烯酸乙二醇酯( e d m a ) 为交联剂，在不锈钢柱管中原位聚合反应， 然后用乙二胺在线修饰为弱离子交换整体柱。用该离子整体柱同时实现在线预处 理和测定人血浆中头孢唑啉钠。分析采用的流动相为1 om l m 酊1 的9 4 n l i i l 0 1 l 。1n a 2 h p 0 4 和5 3m m 0 1 l - 1 柠檬酸乙腈，在2 5 4 胁处进行检测。实 验结果表明，该方法在头孢唑啉钠血样浓度为1 om g l 一- 1 0 0 0m g l - 1 范围内 具有良好的线性，回收率在9 5 o 1 0 5 0 之间，精密度良好( 日内、日间r s d 均小于5 o ) ，避免了繁琐的样品预处理过程，为血浆中痕量药物的分析提供 了一种快速、经济和有效的新方法。 1 2 3 4 亲和整体柱 中山大学硕士学位论文 有机高分子整体柱也可以应用于亲和色谱中，对生化样品的分离和分析。亲 和整体柱研究得最多的领域是在c i m 亲和色谱整体柱，该类整体柱最典型的制 作方法是：先在柱管内原位聚合整体柱支撑体，然后在此支撑体上键合配合基。 r a l l g a i lm a l l i k 等【3 7 】在一4 6 m mi d 5 0 m m 不锈钢主管内原位合成甲基丙烯 酸缩水甘油酯二甲基丙烯酸乙二醇酯共聚物( g m 刖e d m a ) 整体柱基质，然后 分别用s h i f f 碱法、c d i 法、环氧基法和d s c 法键合人血清白蛋白( h s a ) ，考 察了键合方法对键合量的影响，并用所得的亲和整体柱成功地用于r ，s 杀鼠灵对 映体和d ，l 色氨酸对映体的分离。 l u o 等【3 8 】制备了g m a e d m a 基质整体柱后，对g m a 上环氧基进行不同的 化学修饰，然后与蛋白a 反应，分别制备了含有1 1 个碳原子间隔臂以及不含间 隔臂的蛋白a 键合高效液相亲和色谱柱。利用蛋白a 与免疫球蛋白的f c 区之间 有很强的特异性，使用该蛋白a 键合高效液相亲和色谱柱，在p h 梯度洗脱条件 下测定了血浆中人免疫球蛋白g ( h i g g ) 的含量，定量标准曲线线性相关系数 达到o 9 9 9 。他们分别考察了含有1 1 个碳原子间隔臂以及不含间隔臂的蛋白a 键合高效液相亲和色谱柱对牛血清白蛋白( b s a ) 的非特异性吸附性能，结果表 明，含间臂的蛋白a 键合高效液相亲和色谱柱对b s a 具有一定的非特异性吸附 作用。 另外，他们【3 9 】还在不锈钢柱内通过自由基聚合，合成了g m a 僵d m a 整体 柱基质，然后在p h1 0 5 的n a c l n a 2 c 0 3 - n a o h 缓冲液条件下，使环氧基与亚氨 基二乙酸( h n i n o d a c e t i ca c i d ，i d a ) 反应，再分别通过含5 0 i i l m 金属离子浓度的 盐溶液，以分别形成不同金属( c u 2 + ，n i 2 + ，z n 寸) d a 螫合物的活性位点，从而 制得金属键合亲和色谱( m a c ) ，考察不同金属离子i m a c 对各蛋白( 牛血清 白蛋白、胰岛素、细胞色素、溶解酵素) 的分离情况。他们成功地将c u z + 一d a 柱用于从人血清白蛋白中提纯溶解酵素。其实验结果表明，很多蛋白都被 c u 2 + d a 强烈保留；蛋白在金属键合亲和色谱柱上的保留同时受金属蛋白螯合 作用大小及金属键合量的影响。 j e l l n y m 加m e n t a 等1 4 0 】在预先于内壁预先涂布了与蛋白相容的聚合物 聚乙烯醇( 以避免待分析蛋白与毛细管内壁间的相互作用) 的毛细管入口端处， 通过u v 引发，合成了甲基丙烯酸丁酯二甲基丙烯酸乙二醇酯共聚物亲和整体 1 2 中山大学硕士学位论文 柱，用于溶解酵素、细胞色素c 和胰蛋白酶a 的在线预富集，富集倍数达1 0 0 倍以上。该在线预富集柱与蛋白g 整体柱联用，以乙腈o 1 四氟乙酸溶液作流 动相，用毛细管电泳分离。 1 3 色谱整体柱的表征方法 整体柱的形貌形态、孔径大小、孔径分布、表面积等直接影响色谱整体柱的 性质，是整体柱的重要参数。常用的整体柱表征方法有扫描电镜( s c a i l l l i n g e l e c 仃d nm i c r o s c o p e ，s e m ) 、氮吸附法( n i 们g e i la d s o 印t i o n ) 、压汞法( m e r c l 叫 i l l 仇l s i o n ) 等。 1 3 1 形貌观察 扫描电镜是最常用的整体柱形貌观察手段。该法是将样品轻轻削成粉末状 后，粘结于样品座上，再镀上一层导电膜，然后基于s e m 仪器用极细的电子束 在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显 像管，从而在荧光屏上显示被观察样品的表观形貌。 s e m 能提供整体柱床层截面的形貌及孔径大小和均匀情况，但由于其只能 提供床层的局部形貌情况，因而无法对整根柱子作出全面、综合的评价。 1 3 2 孔径结构的影响及控制 孔径分布的常用测量方法有氮吸附法和压汞法。尽管氮吸附法和压汞法这两 种方法是在材料干燥后测定的，不能真实反映色谱运行中的孔径大小，但是柱子 “干 时和“湿”时的孔径存在着严格的对应关系。 1 3 中山大学硕十学位论文 压汞法是利用导电率比，分别将整体柱与空柱充满电解质测量各自的导电 率。氮吸附法的测定原理如下：在液氮温度下，氮分子在材料表面的物理吸附量 取决于氮气的相对压力p p o ，其中p 为氮气分压，p o 为液氮温度时氮的饱和蒸气 压，当p p o 在o 0 5 o 3 5 范围时，吸附量与p 停。符合b e t 方程，以此为基础， 成为比表面测定的依据；当p p 企o 4 时，由于产生了毛细凝聚现象，吸附量与表 面微孔的尺寸相关，以此为基础，则成为测定孔径分布的依据。 通过逆体积排阻色谱( i s e c ) 可以测定整体柱子溶胀状态下的孔径分布，但 是，i s e c 的有效应用范围受制于标准样品的尺寸，因为即使是数百万分子量的 样品也无法测定l o o n m 以上的孔。 国际理论与应用化学协会曾把微孔按尺寸大小分为三类：小微孔，孔径 2 n m ；中微孔，孔径2 5 0 n m ；大微孔，孔径5 0 n m ；其中中微孔具有最普遍的 意义，用氮吸附方法测定孔径分布正好能满足这一孔径范围。 聚合与成孔机理如下：反应介质最初是由单体、致孔剂、和自由基引发剂组 成的均匀混合物。当自由基引发剂分解时，聚合物在某一阶段沉淀而从反应混合 物中形成核，即开始发生相分离。随着聚合反应继续进行，核逐渐膨胀，而余下 的溶液形成小滴。这些核通过与反应介质中的聚合核结合及捕捉沉淀物继续长 大，直到这些长大的单元达到了相互间以聚合物链相连的阶段，它们在与之相邻 的小滴中交织，使更大簇的小液滴形成，最后形成孑l 。致孔剂在聚合反应过程中 不参与反应，而是被聚合混合物所包围而留在孔中，直到反应停止后被带出【4 1 1 。 众多实验显示，单体混合物中交联单体的浓度以及反应体系中致孔溶剂的含 量对聚合物整体柱中孔性质有很大作用，而其它一些因素，如引发剂含量，反应 时间及聚合反应温度也对孔性质产生一定的影响，这些因素对整体柱孔结构的影 响都可以归结为对聚合反应中相分离发生的迟早的影响。聚合反应过程中，在其 他聚合条件相同的条件下，相分离发生得越早，所得整体柱的孔径越大。可以主 要通过对致孔溶剂组成的选择来控制孔的性质【4 2 1 ，随着致孔剂( 不良溶剂) 的 用量增大，相分离提前，孔径增大。 孔径较小的整体柱一般具有较高的柱效( 较低的塔板高度) 。 s e e l t i i l l 【等【4 3 】曾对甲基丙烯酸酯基质整体柱的形态对其在液相色谱中的最 优柱效影响进行研究。其研究结果显示，当孔径从2 3 0 0 l l m 降至6 0 0 n m ，传质阻 1 4 中山人学硕十学位论文 力项中的c 呈减小趋势。他们分别以b m a 和e d m a 为活性单体和交联剂( 统 称单体) 合成系一列整体柱，发现当单体与溶剂的比例为4 0 ：6 0 ( w w ) 时，所 得整体柱为高密度多孔材料；而当单体与溶剂的比例将至2 0 ：8 0 ( w w ) 时，所 得整体柱为低密度材料。高密度整体柱的孔径分布为单一分布，其孔径大小随致 孔剂的比例改变可在6 0 5 0 0 0 m 间分布。而低密度整体柱具有更宽大孔径分布 而更趋向显示出双峰分布，细孔的孔径比高密度整体柱中的细孔孔径更小。低密 度整体柱具有比高密度整体柱更高的柱效。 硅胶整体柱与有机聚合物整体在孔结构和操作参数方面的比较如表1 1 所 示。 表1 1硅胶整体柱与有机聚合物整体柱的比较 1 3 3 表面性质 整体柱表面的物理及化学性质决定了整体柱的适用范围及柱效。作为理想的 整体柱，应该满足以下条件：一是具有足够多及分布均匀的大孔，以使流动相传 质更加有效进行，并保证低的柱压；二是具有足够大的表面积及足够多的功能团， 1 5 中山人学硕t 学位论文 从而提供足够多的活性位点以进行后续修饰，以满足分离的需要。整体柱的表面 活性基团越多，则柱容量越大，也是保证柱效及分离度的前提之一。 整体柱表面修饰多采用化学反应键合的方法。以g m a 为单体的整体柱，因 其在聚合后仍含有活泼的环氧基，可以方便地进行化学改性，将其修饰为所需的 不同色谱分离形式的整体柱，故而颇受青睐，应用较为广泛。对于以g m a 为单 体的整体柱修饰，有两种方式：( 1 ) 先将g m a 上的环氧基通过化学反应而转 变成别的基团，再对此新产生的基团进行修饰。( 2 ) 直接在g m a 的环氧基上 进行修饰。b e a t r i xp r e i n e r s t o r f e r 等【4 4 】人曾讨论过将g m a 上的环氧基转化为硫醇 基，然后进行第二步反应使硫醇基和色谱配位基连接。m a l l i k 【4 5 】等人讨论过以 s c l l i f ! f 碱法、c d i 法、环氧基法、d s c 法在g m a 上键合h a s 所得的h p l c 色 谱整体柱的性能区别。这四中键合方法中，除环氧基法是利用h a s 上的氨基对 g m a 上环氧基的亲核作用直接在g m a 整体柱上键合蛋白外，另外三种方法都 是先让g m a 上的环氧基和0 5 m 硫酸反应而转化成二醇，再依次与其他试剂和 蛋白反应，从而修饰整体柱。他们的结果显示，四种方法在g m a 上键合的蛋白 量从大到少依次是s c h i f f 碱法、d s c 法、c d i 法、环氧基法。此外，以s c l l i f f 碱法所制得的h a s 键合整体柱分辨率也最高。 1 4 杯芳烃及其包合作用的研究进展 杯芳烃是由苯酚单元通过亚甲基连接起来的一类环状低聚物，由于其具有独 特的空腔结构，使之能通过形成典型的主客体包结络合物而识别范围极广的离 子、分子等客体。杯芳烃集合了冠醚和环糊精的主体特点为一身，具备更高的选 择性，被誉为是继冠醚和环糊精之后的“第三代主体分子 ，其分子识别功能在 现代分离科学中已有较为广泛的应用。 杯芳烃最初是由醛与对烷基苯酚通过碱性缩合得到的，由于形似希腊杯，而 被g u t s c h e 称为杯芳烃。它是由苯酚和甲醛在碱性条件下缩合生成的环状化合物。 作为一类新型的环形配体，杯芳烃与许多离子型和非离子型客体均能形成稳定的 络合物或包合物。 1 6 中山大学硕士学位论文 杯芳烃的重要特性之一是其空间结构的多样性。与环糊 精的刚性结构以及冠醚的平面二维结构不同，杯芳烃分子的 杯环属于柔性骨架，其亚甲基与苯环间以旋转势垒很小的 c c 单键相连接，分子内热运动会导致多种稳定构象并存。 它的骨架是一个由若干苯环单元构成的大环状疏水腔，其上、 下沿的取代基团分别用r 和r 表示。上缘的疏水性烷基基团 和苯环一起构成疏水性杯状空腔，能与中性有机分子形成主。 客体包结物。下缘是整齐排列的酚羟基，能螯合和输送阳离 图t - l 杯【n 】芳 烃一；4 8 的一般表 达式 子及离子型化合物。疏水腔的尺寸随组合单元数n 的增加而 r 和r 为取代基团 增大，常见的杯芳烃化合物为n ：4 8 。例如杯 6 】芳烃比杯 4 】 芳烃的空穴大，其活性位点更多，但这意味着其选择性反而低，且构象较难固定， 可通过进入桥连键等方法，可固定其构象，然后通过引入手性基团成为手性杯芳 烃。因苯环及酚羟基容易发生取代，可通过化学修饰引入适当的官能团而获得具 特殊功能的杯芳烃衍生物。经取代基团修饰的杯 n 】芳烃分子的结构通式如图1 1 所示。 上述结构特点使杯芳烃及其衍生物作为主体分子，比环糊精和冠醚类衍生物 具有更多样化的官能团取代结构和更灵活的空间调控余地，从而可望在超分子化 学领域获得更广阔的应用。超分子化学着眼于有特殊功能的主体化合物的分子设 计，强调主体化合物( 如环糊精、冠醚、杯芳烃等) 与客体化合物( 包括阴、阳 离子、中性分子等) 的分子间相互作用，尤其是有分子识别能力的选择性相互作 用。这些相互作用并不局限于“非共价键”，还涉及到氢键、色散力、静电作用 力、偶极一偶极相互作用、电荷转移作用、疏水作用以及三维空间排列的相互匹 配性等。 近2 0 年来有关杯芳烃的研究发展迅速，杯芳烃及其衍生物已在金属离子的 选择性萃取、中性有机分子的分离、酶模型催化反应、离子选择电极、【广b 膜 星型聚合物等研究领域得到了广泛应用，被誉为是继环糊精和冠醚之后的第三代 超分子物质【拍朋。例如在对叔丁基杯【n 】芳烃( p t e n b 1 】刚c a l i x 【n 】a 崩l e ) 的杯状 结构底部紧密而有规律地排列着n 个酚羟基，杯状结构的上部具有疏水性的空 穴。酚羟基能鳌合和输送阳离子，而疏水性空腔则能与中性分子形成包合物。杯 1 7 中山大学硕士学位论文 芳烃这种独特的结构，使其在主客体化学研究领域中的客体分子绝大部分为金属 离子和有机小分子。 1 4 1 对金属离子的包合 杯芳烃能够与许多金属离子形成包合物。已经报道的包括有碱金属离子【4 8 】 ( 如：n a + 、k _ ) 、过渡金属离子( 如：c d 2 + 、t ，、p d 2 + 、r u 2 + 、c 0 2 + 、f e 3 + 、 a 矿等) 【4 9 - 5 2 1 及副族金属离子等( 如：u 3 + 、1 酽+ 、e u 3 + 和n 3 + 等) 【5 3 。5 5 】，其在贵 金属的提取、分离、催化等方面具有广阔的应用前景。 a t s u s l l i 【e d a 等曾报道【5 6 】，杯 6 】芳烃对碱金属离子具有选择性包合配位作 用，可作为输送金属离子的理想载体。如六酰胺基杯【6 】芳烃能与n a 形成1 ：2 包合物，n 矿被包合在杯芳烃的空腔中。该包合物的1 hn m r 谱图表明：杯 6 】 芳烃与n a + 是以一种简单的对称方式包合，以锥形构象存在。 y i l m a z 掣5 7 1 对杯芳烃的上沿进行了修饰，合成了几种杯【4 】芳烃衍生物，研 究其与f e c l 3 间的配合作用，杯【4 】芳烃与f e ( i i i ) 形成1 ：1 的包合物。在包合物 中f e ( i i i ) 与杯芳烃中的三个酚氧基阴离子以离子键结合。杯芳烃对f e ( i i i ) 所显示 的选择性将用于c u 2 + 、n i 2 + 、c 0 2 + 、f c 3 + 等金属离子的分离过程中f e ( i i i ) 的有机 沉淀剂。k o m l 啪等【5 8 】用磺化的杯【6 芳烃与二茂铁作用合成了二者1 ：1 的包合 物，并对其进行研究。其研究发现：随着杯芳烃浓度的增加，二茂铁二茂铁离 子的形势电势的正电性减小，形成包合物的稳定顺序是阴离子二茂铁二茂铁 阳离子二茂铁。他们认为这可能是杯芳烃磺酸根阴离子与二茂铁阳离子之间静电 作用的结果。 s c l l l t l i t t 【5 9 】合成了一种双杯 4 】芳烃受体，其与扩以l ：1 配比形成包合物。 该杯芳烃受体对旷的包合作用，可用于对海洋中旷的提取，这对解决能源紧缺 问题有着广泛的应用前景。 1 8 中山大学硕士学位论文 1 4 2 对有机中性分子的包合 基于杯芳烃的疏水空腔，它可对有机分子进行有效的识别。 在对有机小分子包结方面：k o