（高分子化学与物理专业论文）富集荧光素的聚合物分子或微球的制备研究.pdf

富集荧光素的聚合物分子或微球的制备研究 研究生：高海峰导师：府寿宽教授 ( 复旦大学高分子科学系) 关键词：荧光素，荧光高分子，荧光微球，荧光微囊 摘要 近二十年来，随着人们对荧光标记探针认识的深入和其应用领域的拓宽，制 备各种富集荧光基团的聚合物微球和线性聚合物分子逐渐成为分析化学、生物化 学、胶体化学和胶体物理领域的一个热点研究。本文基于这样的一个研究背景， 同时结合本组在聚合物微球功能化方面的长期工作经验，利用不同方法，成功制 备出四种富集有机荧光基团的线性聚合物和聚合物微球，初步取得了以下几方面 的成果： 1 首先合成含伯胺基团的甜甲基苯乙烯类功能单体，利用乳液聚合方法制各 侧基带有伯胺基团的线性聚合物，聚合物中伯胺基园的含量可通过改变单 体投料量而精确控制，聚合物分子量在1 0 4 1 0 5 之间。然后利用含异硫氰酸 酯基团的荧光素分子( f i t c ) 对线性共聚物进行改性，成功制各出侧基接有荧 光索的线性疏水、亲水高分子聚合物。通过改变聚合物与荧光素f i t c 的反 应投料比，可以制各出不同荧光素含量和荧光发光强度的聚合物分子。聚 合物中末反应的伯胺基团可以为荧光高分子与其它生物分子的反应提供反 应靶点。 2 利用改进的微乳液聚合方法，成功制备出内部包埋荧光素芘，表面带有阳 离子基团的交联聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯荧光纳米微球。荧光素芘分 子被均匀的包埋在疏水的聚合物核部，微球荧光强度随荧光素芘的投料量 线性变化，且发光强度是相同浓度芘的苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯溶液的4 0 倍。通过共聚单体a e m h 和引发剂v 5 0 在微球表面引入的阳离子基团胺基 和脒基，不仅可以稳定聚合物胶粒，还可作为聚合物荧光微球与生物大分 子反应的靶点。 3 利用内部包埋有荧光素f i t c 的单分散二氧化硅微球为模板，成功制备出内 部富集荧光分子的对温度敏感的p o l y ( 】姐p a m ) 聚合物荧光微囊。n i p a m 单 体和m b a 交联剂的用量可控制最终微囊壁的厚度和内部孔径大小。微囊体 积对温度敏感，在3 2 附近存在体积相转变，这样利用外界温度的改变便 可控制客体分子f i t c 在微囊内外的进出。从而为温敏性聚合物中空微胶囊 在控释、转载方面的应用奠定基础。 i v s y n t h e s i s o f f l u o r o p h o r e - e n r i c h e dp o l y m e r c h a i n so r p o l y m e r p a r t i c l e s a u t h o r ：h a i f e n g g a o s u p e r v i s o r ：p r o f s h o u k u a nf u ( d e p a r t m e n to f m a c r o m o l e e u l a rs c i e n c e ，f u d a nu n i v e r s i t y ) k e yw o r d s ：f l u o r o p h o r e ，f l u o r e s c e n tp o l y m e r , f l u o r e s c e n tp a r t i c l e ， f l u o r e s c e n tc a p s u l e a b s t r a c t i nt h el a s tt w od e c a d e s ，w i t ha i do fw i d er e s e a r c ha n da p p l i c a t i o no n f l u o r e s c e n c e s y n t h e s i s o fv a r i o u s f l u o r o p h o r e - e n r i c h e d c a r r i e r sh a sb e e na h i g h l i g h to fa n a l y t i c a lc h e m i s t r y , b i o c h e m i s t r y , c o u o i d a lc h e m i s t r ya n dc o l l o i d a l p h y s i c s b a s e do ns u c hap o p u l a rr e s e a r c ha n do u rg r o u pe x p e r i e n c eo nt h e f u n c t i o n a l i z a t i o no fp o l y m e r i c p a r t i c l e s ，f o b r d i f f e r e n t f l u o r o p h o r e - e n r i c h e d p o l y m e r c h a i n sa n d p a r t i c l e sw e r ef a b r i c a t e ds u c c e s s f u l l y ： 1 a na m i n oc o n t a i n i n gp o l y m e r i z a b l em o n o m e r ( m 2 、w a so b t a i n e da n dt h e c o p o l y m e r so fp o l y ( s t - m 2 ) a n dp o l y ( t - b a - m 2 ) 、 ，i t ha m i n os i d eg r o u pw e r e s y n t h e s i z e db ye m u l s i o np o l y m e r i z a t i o n t h ea m i n oa m o u n ta n dm o l e c u l ew e i g h t o fc o p o l y m e rc o u l db ec o n 仃o e db yt h ea d d e da m o u n to fm o n o m e r s t h e n f l u o r e s c e n tm o l e c u l e sf r r cw j t hr e a c t i v ei s o t h i o c y a n a t eg r o u pw e r ec o n n e c t e d o n t op o l y m e rc h a i n sb yr e a c t i o nw i t ha m i n og r o u p a n dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y o fo b t a i n e dp o l y m e r sc o u l db ea d j u s t e db yt h ea d d e df i t c t 1 1 ef l u o r e s c e n t c o p o l y m e r c o u l df u l l e r h y d r o l y z e t ob e c o m ew a t e r - s o l u b l e 码eu n r e a c t e d 羽1 1 i n o g r o u p so nf l u o r e s c e n tc o p o l y m e r sc o u l dh e l pt h e mt or e a c tw i t ht h e i rt a r g e t s 2 c r o s s - l i n k e d p o l y s t y r e n e a n d p o l y ( m m a ) n a n o p a r t i c l e s w i t h p y r e n e e m b e d d e di nt h ec o r ea n dc a t i o n i c g r o u p so nt h es u r f a c e w e r es y n t h e s i z e d s u c c e s s f u l l y , w h o s ef l u o r e s c e n ti n t e n s i t yi n c r e a s e sl i n e a r l yw i t ht h ea d d e dp y r e n e a m o u n ta n dw a s4 0t i m e sh i g h e rt h a nt h a to f p y r e n es o l u t i o ni ns to r 叭州t h s a m ec o n c e n t r a t i o n t h ec a t i o n i ca m i n oa n da m i d i n og r o u p so nt h e p a r t i c l e s u r f a c ei n t r o d u c e db yf u n c t i o n a lm o n o m e ra e m ha n di n i t i a t o rv 5 0c o u l dn o t o n l ys t a b i l i z e t h e n a n o p a r t i c l e b t i ta l s o h e l pt h ep a r t i c l e s r e a c t 、析t l lo t h e r b i o m o l e e u l e s 3 w i t ht h ef i t c - e m b e d d e dm o n o d i s p e r s e ds i 0 2p a r t i c l e sa st e r n p l a t e ，an o v e l t h e r m o r e s p o n s i v ef l u o r o p h o r e c o n t a i n e dp o l y ( n i p a m ) c a p s u l e s w e r es y n t h e s i z e d t h ea d d e dm o n o m e ra n dc r o s s 1 i n k e ra m o u n t sc o u l dc o n t r o lt h et h i c k n e s sa n d p o r ed e n s i t y o fp o l y m e rw a l l ，w h o s ev o l u m ea r es e n s i f i v et oe n v i r o n m e n t a l t e m p e r a t u r e 砸协t h el c s t a ta b o u t3 2 t h et h e r m o s e n s i t i v em e s h - s i z ec h a n g e o fp o l y m e rw a l lc o u l db eu s e dt oc o n t r o lt h er e l e a s eo fi n n e rg u e s tm o l e c a l e s w h i c hi st h eb a s i ci d e af o rt h ep r o m i s i n ga p p l i c a t i o no fh o l l o wp o l y m e rc a p s u l e o nc o n t r o l l e dr e l e a s ea n dm o l e c u l a r t r a n s p o r t a t i o n v 第一章文献综述 1 1 荧光的基本理论和应用 近二十年来，荧光搽针技术在生物医药、k - 4 辛4 化学、环境检测、临床医学、 d n a 测序、基因分析、细胞成像等各个领域有了长足的发展，相关文献报道更 是呈指数级递增。究其原因，无不归功于荧光探针检测技术的发展赋予了该手段 高灵敏性、易操作性，低成本性和环境友好性等诸多独特的优点，目前，荧光探 针技术已经在很多领域取代了以前的放射性元素标记示踪技术，成为标记示踪领 域最热门的研究。自从18 4 5 年s i rj o h nf r e d e r i c kw i l l i a m 首次发现奎宁溶液在太 阳光下发射荧光以来，荧光光谱学已发展成为- - f 十分完整和深奥的科学，其涵 盖的知识涉及到诸多学科和领域。接下来，本章将首先介绍一下荧光光谱学的一 些基础知识和概念，以便于解释和理解相关的荧光现象【1 捌。 许多物质分子吸收紫外、可见光后，可以从基态跃迁到激发态。激发态分子 富有能量，容易发生各种变化：一种是化学变化，即光化学反应；另一种是物理 变化，主要包括发出荧光和磷光。使用适当的装置可以得到相应物质的荧光光谱 和磷光光谱，从而对物质的结构和性质进行研究。光的能量以光子传递，当光被 物质吸收后，光子的能量随之转移给吸光物质的分子，使分子的电子结构发生改 变，产生各种类型的电子跃迁，其中最重要的是肘兀和n _ 7 c 跃迁；且能量高 的电子优先发生跃迁。化合物在基态时核外电子排布遵循p a u l i n g 原理：每个电 子轨道上最多只能容纳两个电子，且电子自旋方向相反。而在激发态中，两个电 子分别在两个不同轨道上，所以激发态拥有两个半充满的轨道。由于p a u l i n g 原 理并不要求在两个轨道上的电子自旋必须反向，故出现两种可能：一是两个电子 自旋仍是方向相反，另一种是两个电子自旋方向相同。当一个分子束通过强磁场 时，若分子中有两个自旋相同的电子，在磁场中就会分解成三种不同的态，这样 就称这种分子处于三线态，记为t ，按能量从低到高，依次为t 1 ，t 2 ，。如 果分子中两个电子自旋相反，则磁场不分解分子束，这样就称这种分子处于单线 态，记为s ，按能量从低到高，依次为s i ，s 2 ，。有机化台物分子在基态时， 电子自旋都是反向的，所以均处于单线态，记为s 0 ：只是在被激发后，才有单线 态和三线态之分。根据电子跃迁选律，电子自旋方向力求守恒，所以容易发生从 基态单线态到激发单线态的跃迁；而从基态单线态向激发三线态的跃迁是禁阻 的，不容易发生。一般激发三线态都是经激发单线态转交而成。 复旦大学硕士论文 第1 页 第一章文献综述 f i g u r e1 1 o n ef o r mo f j a b l o n s l c yd i a g r a m t l 电子吸收光子跃迁到激发态后，其寿命是有限的，它们的激发能会很快地失 去，然后回到基态。激发能耗散的途径有几种，可用j a b l o n s k y 图( f i g u r e1 1 1 表 示。基态是单线态( s 0 ) ，分子一旦吸收光子后就在1 0 4 3 1 0 。5s 内发生电子跃迁。 对大多数分子而言，这种跃迁不会是0 0 振动能级闻的跃迁，而是其它振动能 级间的跃迁，如图中所示，由s 0 的第一振动能级向s 1 的第三振动能级或s 2 的第 二振动能级跃迁。随后激发态分子与周围分子碰撞，失去振动能量，先降低至同 一电子能级的最低振动能级，再降低至s i 电子能级的最低振动能级，此过程称 为内部转变( i n t e m a lc o n v e r s i o n ) 。内部转变过程进行得非常迅速，一般在 1 0 “3 1 0 1 4s 之间完成，以至于可以认为吸收了光子的分子，几乎都是在瞬间直 接降到s 1 的最低振动能级。从s l 的最低振动能级出发，又可以有以下三个过程： 1 通过发光回到基态的过程，这种从s l _ s o 的发光现象称为荧光，图中用 f l u o r e s c e n c e 表示，其进行速度是1 0 一1 0 4 s 。 2 通过分子间的碰撞失去能量回到基态的过程，这个过程也称为内部转变。 3 向三线态t l 的转变，由于s i _ t l 过程中存在电子自旋方向的改变，所以 称为系问窜跃f i n t e r s y s t e mc r o s s i n g ) 。系间窜跃需要改变电子的自旋方向， 所以比内部转变慢，一般约1 0 4s 。从t l 往后主要又有两种过程： 1 经过t l 斗s o 的非辐射系间窜跃返回基态s 0 的过程。 2 发光回到s o 的过程，这种t 1 _ s o 的发光现象称为磷光，图中用 p h o s p h o r e s c e n c e 表示。 这两种过程都需要改变电子的自旋方向，所以也是慢过程，如磷光过程的进 行速度为l o 弋l os 。 复旦大学硕士论文第2 页 第一章文献综述 内部转变和系问窜跃过程中，激发态分子均失去了能量，但没有光的辐射作 用，可以分别表示为s 1 一s o + 热，s 1 斗t 1 + 热，t 1 呻s o + 热，这些过程又可统称 为无辐射失活过程。 具有芳香环结构的物质由于分子体系中存在大兀电子共轭，通常可以受光激 发而发射荧光，几种典型的荧光分子列在f i g u r e1 2 中。与芳香有机物相对照， 大多数普通原子很难发射荧光，而其中一个例外是镧系元素。如镧系元素中的铕 和铽原子发出的荧光便来源于原子f 亚层电子间的跳跃【3 】。 奎宁荧光素罗丹明b h 腺 p o p o p吖啶橙7 一羟基香豆素 f i g u r e 1 2 s t r u c t u r e so f t y p i c a lf l u o r e s c e n ts u b s t a n c e s 物质的荧光性质通常以荧光发射光谱表示，谱图的形状和位置与荧光素的分 子结构、所处溶剂极性、温度、酸碱度等直接相关。荧光的一个显著特点就是高 灵敏性，这个特点使得荧光分子成为目前的一种主要标记物质。历史上关于人为 加入荧光物质进行标记示踪的一个著名例子是人们于1 8 7 7 年利用荧光素证明多 瑙河与莱茵河是通过地下暗流相连的。人们首先将荧光素投入多瑙河，6 0 小时 以后，绿色的荧光出现在莱茵河的一条支流中。这样人们便利用简单的荧光示踪 手段，证实了多瑙河与莱茵河的相通。 复旦大学硕士论文 第3 页 p 汕 o 、旷 a。 z - z 咻 第一章文献综述 w a v e l e n g t h 【n r r l ) t i i o ol i t 6 1 1 0 0t z l o ll t o l l o l l l l l o o w a v e n u m b e r c m ) f i g u r e1 3 a b s o r p t i o n a n df l u o r e s c e n c e e m i s s i o ns p e c t r a o f p e r y l e n e f i g u r e1 4 e m i s s i o ns p e c t r ao fp y r e n e a n di t se x c i m e r , t h ec o n c e n t r a t i o no f p y r e n e i sd e c r e a s e df r o m6 1 0 3m ( t o p ) t o0 9 1 0 。4m ( b o t t o m ) 4 通过对荧光图谱的研究，几个经典的定则逐步被人们所发现和理解：第一、 荧光分子发出的光能量总是小于荧光分子吸收的光能量，即荧光发射光谱的位 置，相对于其吸收光谱的位置总是出现在长波长方向。这个现象是由ggs t o k e s 于1 8 5 2 年首先发现的，故称为s t o k e s s h i f t 。第二、荧光发射谱的形状和位置与 激发波长无关。这一现象也称为k a s h a sr u l e 。第三，大多数荧光物质的发射光 谱与吸收光谱成镜像对称，即s 1 _ s o 的荧光发射是s o 哼s l 吸收的镜像，如f i g u r e 1 3 所示。当然并非所有荧光物质都遵循“镜像规则”，有少量荧光分子在激发态 会发生反应，例如，与处于基态的荧光分子形成“激基缔合物”( e x e i m e r , t h e a b b r e v i a t i o nf o re x c i t e d - s t a t ed i m e r ) ，导致长波长方向上出现一个新的、没有精细 结构的、宽的荧光发射峰，这其中一个典型的例子就是“芘”( p y r e n e ) 。芘在低 浓度时表现出一个规则的荧光发射峰( f i g u r e1 4 ) ，随着芘浓度的升高，其荧光发 射谱在4 7 0n l n 处逐渐表现出个宽峰。而这个发射峰是激发态芘分子与基态芘 分子形成激基缔合物的标志。很多研究就是利用芘分子易形成激基缔合物的特 点，来研究它的猝灭效应及所在微区的相互作用。 q = 志e q 1 1 1 f = r 十吒， - 一r d “娟。n ( 1 0 4 s ) 0 1 l h u 一h 咋卅，k ， l ，r e q 1 2 脚”1 住“喇脚1 “。“蛳“ f i g u r e 1 5 as i m p l i f i e dj a b l o n s k yd i a g r a m 复旦大学硕士论文第4 页 卜卜一们zu卜z一山uzuu蚺址篮o_i。芷 第一章文献综述 在荧光测量中，另外两个比较重要的概念是“量子产率”( q u a n t u my i e l d ) 和 “荧光寿命”( f l u o r e s c e n c el i f e t i m e ) 。量子产率是荧光物质发出光子数与吸收光子 数的比值，其值可由简化的j a b l o n s k y 图表示( f i g u r e1 5 ) 。在图中，激发态分子 向基态跃k ( s l 专s 0 ) 包括两种形式，辐射衰减( r a d i a t i v ed e c a y ) 平n 非辐射衰减 ( n o n r a d i a t i v ed e c a y ) 。量子产率0 的大小由荧光发射速率常数r 和非辐射衰减速率 常数k 的值决定( e q 1 1 ) 。k 越小，量子产率越高，当k “f 时，q 接近于l 。 荧光分子的荧光寿命t 表示荧光分子受激发后处在激发态的平均时间，其大小 由e q1 2 计算。应当指出，荧光寿命是多个受激分子在激发态所处时闻的平均 值，如果s ，斗s o 衰减符合单指数分布，则有6 3 的荧光分子在t t 的时间范围内衰减。 与“荧光寿命”密切相关的另一个概念是“荧光猝灭”( q u e n c h i n go f f l u o r e s c e n c e ) 。荧光猝灭是荧光物质荧光强度降低的一个总称，它主要由荧光分 子激发态反应、分子重排、能量转移、激基缔合物的形成、分子间碰撞等过程引 起，其中最主要的便是荧光分子与猝灭剂通过碰撞导致的荧光猝灭。大量的小分 子或离子，甚至包括同类荧光分子均可充当荧光分子的猝灭剂，它们通过扩散与 激发态荧光分子碰撞、缔合，从而降低了荧光分子的荧光发射强度，其中比较典 型的荧光猝灭剂包括碘负离子，氧气，丙烯酰胺等。荧光分子接近猝灭剂的难易 程度与荧光团在体系中所处的位置直接相关，所以对荧光猝灭的研究是表征荧光 探针所处环境的一个重要手段。 f i g u r e 1 6 f l u o r e s c e n c es e n s i n gi nc l i n i c a lc h e m i s t r y 由于荧光检测技术存在诸多优点，其应用领域已涵盖现今科研的各个方面。 其中一个最受关注的应用领域就是临床医学诊断。荧光检测既可以用于低分子量 药物的检测分离，也可用于高分子量抗原的识别。f i g u r e1 6 是血液诊断中荧光 检测的基本原理，被检测的样品可以是全血，也可以是血清或血浆。利用简单的 发光二极管或激光二极管作为激发光源，可以简便、迅速地鉴定病人血液中的各 项指标。 复虽大学硕士论文 第5 页 第一章文献综述 1 2 荧光探针技术在材料科学中的应用 荧光探针作为标记手段在生产科研中的应用，近年来以爆炸式的速度发展。 这方面的文献报道不计其数，单是1 9 9 0 年以来，在w e bo fs c i e n c e 中，以 “f l u o r e s c e n c e ”检索，就有近3 万篇文献。综合起来，荧光探针作为标记和示踪 物质，主要应用于1 、生物医学领域，如分子间的特异性亲和标记( 5 】，动物体内、 体外示踪【6 】，疾病诊断【7 】，蛋白质组学【8 】，基因测序【9 ，1 0 】和分离【1 1 】，细胞标 记 1 2 ，1 3 1 ；2 、材料领域，如大分子相互作用的示踪 1 4 ，1 5 】，探测高分子体系间 相互作用随外界环境的变化【1 6 】，检测胶柬化行为及介质环境交化【t7 ，1 8 】，测定 受限空间内的流体扩散 1 9 1 ；3 、环境检测、天气预报【2 0 】等诸多领域。应该说， 相比较于放射性元素，有机荧光分子的低毒性、易操作性和高灵敏性等优点正使 其逐步取代放射性元素，成为标记示踪探针的首选。特别是在生物医药等对外加 物质的毒副作用有严格限制的领域，有机荧光物质更是独放异彩。 荧光探针技术在材料科学中的应用是利用荧光化合物的光物理和光化学特 性，在分子水平上研究某些体系的物理、化学变化，检测某种特殊环境材料的结 构和性质的方法。其基本特点是高度灵敏性和极宽的动态时间响应范围【2 1 】。前 者是指当探针在体系中浓度仅l o 。9m 时，仍可检测出探针的荧光信号，且荧光 强度和峰形对环境变化敏感，这对某些要求尽量减少外来分子干扰的研究至关重 要；后者则由于探针分子即可以是发射荧光的化合物，也可以是发射磷光的化合 物，而两个发光体系所跨越的时间间隔达1 0 个数量级，这就使得此方法不仅可 用来对某些体系的稳态性质进行研究，而且还可对这些体系的快速动态过程如对 某种新物种的产生和衰变进行监测。 不同荧光分子有不同的荧光发射图谱、荧光寿命和量子产率，通过测定荧光 发射峰的位置及量子产率就有可能探知荧光分子所处环境的极性和其它有关性 质 2 2 ，2 3 。如荧光分子可因体系中引入另种分子而发生荧光猝灭，光化学家通 过对荧光猝灭机理的研究得知荧光猝灭原因之一是分子间发生了能量转移。这种 能量转移的速率常数仅依赖于能量给体分子( d o n o r ) 与受体分子( a c c e p t o r ) 间距离 ( r d a ) 六次方的倒数【2 ，4 】。因此探测材料中荧光探针间的能量转移现象，对研究 固相材料体系中不同物种或不同微畴的空间分布具有重要价值。 1 3 荧光团富集体的制备及应用 单个荧光分子作为探针在标记示踪领域的应用是对荧光物质的最早应用，然 而随着时代和科技的进步，人们对荧光分子的发光强度、荧光灵敏度、荧光基团 在载体中的分布状态及其对被检测物质的影响都提出了更高的要求。荧光物质已 复旦大学硕士论文第6 页 第一章文献综述 辨一一叠= 1 曩l 萋 ：二兰三二：! ：薹： f i g u r e1 7 c a t e g o r i e so f f l u o r o p h o r ee n r i c h e dm a t e r i a l s ， 1 3 1 富集荧光团的微球的制备 制备富集荧光团的微球，就是将大量荧光素集中于一个载体微球上，荧光素 在微球中的位置可以在球核、核壳间或徽球表面。根据载体的不同，又可将目前 的几种荧光微球细分为有机高分子荧光微球，无机二氧化硅荧光微球和有机，无 机复合型荧光微球：而根据荧光素连接在微球上方式的不同，又可分为通过物理 吸附、化学键合和物理包埋三种方法来制备荧光微球。下面我们就对此做一一介 绍。 复旦大学硕士论文 第7 页 第一章文献综述 1 311 富集荧光团的聚合物微球的制备 有机高分子微球具有许多独特的优点 4 4 1 ：比表面积大；微球粒径大小均一 且可控制；聚合物来源广泛，包括天然及合成高分子；相对于无机金属物质，高 分子与生物分子或组织的相容性好；可选择各种共聚功能单体和聚合工艺进行高 分子微球的设计等。因此，功能化的高分子微球( f u n e t i o n a l i z e dp o l y m e r i c m i c r o s p h e r e s ) 可广泛应用于许多领域，如采用功能化的高分子微球作为蛋白质分 子或寡链核苷酸链的载体，以识别未知蛋白质分子或d n a 链1 8 1 0 。近年来， 制备富集荧光团的功能化高分子微球也逐渐成为高分子微球功能化领域的个 热门研究，其中涉及到的微球制备技术主要包括：1 将有机荧光分子通过物理 吸附方法连接到功能化的微球表面 4 0 ，4 1 , 4 5 1 ；2 通过化学键合方法将改性过的 荧光素分子键合到功能化的微球表面 6 ，3 6 ；3 通过共聚合一种常规单体和含有 双键的改性荧光素分子，将含有荧光团的分子化学连接到微球内部【3 7 ，4 6 】；4 利 用荧光素的极性性质，将荧光素分子物理包埋于极性相近的高分子微球内部 【3 8 1 ；5 利用超支化分子或支状聚合物将荧光素分子包埋于内部【3 4 】；6 利用两 亲性聚合物包载荧光分子制备荧光固体微球；7 利用l a y e r - b y - l a y e r 方法制备中 间包裹有荧光物质的荧光微球或微囊 4 7 ，4 8 。 利用静电吸引作用、氢键作用或琉水相互作用 4 9 】将有机荧光分子通过物理 吸附的方法连接到聚合物微球表面，是制备荧光高分子微球的一种较直接的方 法。通过对荧光素的改性和对微球表面的处理，多种荧光素分子可以物理吸附在 台适的有机聚合物微球表面。y a m a z a k i 等人 5 0 1 在1 9 9 0 年就在磷酸脂质体上物 理吸附荧光素，获得了成功。w i n n i k 小组 4 1 1 将有机荧光分子罗丹明6 g 吸附到 表面带有阴离子基团的聚苯乙烯微球表面，系统研究了荧光素浓度、p h 值和离 子强度对荧光分子在聚合物微球上吸附行为的影响，发现荧光素在微球表面的吸 附基本符合l a n g m u i r 吸附曲线；当荧光分子浓度较低时，吸附主要受静电相互 作用的影响，而当荧光分子浓度变大时，吸附主要受疏水相互作用的影响。h u a n g 等人 5 1 1 通过改变聚苯乙烯微球表面负电荷的量来控制吸附罗丹明6 g 的量，定 量地说明了静电相互作用对罗丹明6 g 在聚苯乙烯微球上吸附的影响。总的来说， 利用物理吸附的方法制各表面富集荧光分子的微球是一种简单、直接的方法，但 是这种方法也存在着致命的缺陷：吸附是物理行为，有吸附就必然有脱附，特别 是当外界条件发生变化时，荧光分子会从微球表面大量脱附，这就使得荧光分子 在微球上的富集不稳定 4 0 1 ，荧光素吸附效率低，大量游离的荧光分子必须通过 后续的渗析或离，i i , 方法除去 4 5 】。 为了克服在微球表面物理吸附荧光素容易伴随分子脱附的缺点，近年来，通 过化学键合法将荧光素分子接到功能化微球表面的研究逐渐兴起。c h e u n g 等人 【3 6 】在1 9 9 3 年的一篇美国专利中，就报道了利用己二胺作为空间臂，将荧光分 复旦大学硕士论文 第8 页 第一章文献综述 子通过化学反应连接到表面修饰有羟基、胺基、或羧基的微球表面。他们所制备 的荧光微球粒径均在5 0n l t l 以下，且单分散性较好，通过a v i d i n 和b i o t i n 的特异 性结合，可以将该种荧光微球与d n a 单链相连，从而作为基因测序和基因检测 中的信号放大探针。h a u g l a n d 等人【6 利用表面改性过的聚苯乙烯微球化学键合 具有较高荧光效率的藻红蛋白荧光素，然后将该荧光微球连接到细胞表面，可以 在普通显微镜下检测到细胞的表面形态。化学键合法制备荧光微球相对于物理吸 附的方法，其优点在于荧光分子是通过共价键连接到微球的表面，这样荧光分子 不易从微球表面解离。但化学键合方法制备荧光微球过程较复杂，部分反应需在 有机溶剂中进行，而且反应后荧光素分子仍然分布于微球表面，受周围环境，特 别是溶剂的影响较大。因此，将荧光素分子包埋于微球内部，从而降低周围环境 对荧光素光学性质影响的制备方法逐渐产生。 其中一种方法就是，利用分散共聚合或乳液共聚合手段将一种常用的不饱和 单体和一种经改性含有双键的荧光素分子单体进行共聚，从而制备出内部包埋荧 光基团的交联聚合物微球。在微球中，荧光基团被交联的高分子载体所固定，彼 此隔离，从而降低了荧光分子间的碰撞猝灭 2 9 】。b o s m a 等人 3 7 1 通过一系列化 学反应将不饱和单体甲基丙烯酰氯连接到荧光分子n b c - c i 上，然后利用分散共 聚合方法将可聚合荧光分子化学键合到p m m a 微球的交联网络中。由于荧光基 团被包埋在交联的聚合物网络中，受外界环境变化和双分子碰撞猝灭的影响较 小，所以荧光效率提高，荧光寿命变长。b a r t l e t t 等人 4 6 1 也利用分散共聚合技术 成功制备出内部包有荧光素基团( r b d - m m a ) 的单分散聚甲基丙烯酸甲酯微球， f i g u r e1 8 a 是制各可聚合荧光素单体n b d - m m a 的示意图。分散共聚合后，得 到荧光基团位于交联微球内部，外层p m m a 壳层厚度大于3 0 0n n l 的单分散荧光 微球。这样便可利用激光扫描共聚焦显微镜( 1 a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y , l s c m ) 对微球进行表征，从而得到了p m m a 胶体粒子的三维排列图象。利用共 聚合方法将可聚合的荧光分子化学包埋于聚合物徽球内部，显著降低了外界环境 对荧光分子光学性质的影响，是制备荧光聚合物微球的一个进步。但该方法必须 对已有的荧光分子进行改性，引入不饱和双键，这就使得荧光微球的制备过程变 得比较复杂。 因此，b a r t l e t t 等人 3 8 1 r n 用物理包埋的方法，通过分散聚合，将d i l c l 8 和d i o c l 8 两种荧光素分子( 分子结构见f i g u r e1 8b ) 包埋于交联p m m a 微球内， 微球壳层厚度同样大于3 0 0n n l 。这些微球亦可应用激光扫描共聚焦显微镜进行 表征。应用物理包埋的方法将荧光素分子包埋于极性相似的交联聚合物微球内 部，既省去了制备含双键荧光分子的繁冗步骤，又可通过微球壳层保护位于微球 核内的荧光分子免受周围环境的影响，不失为一种制备富集荧光分子的聚合物徽 球的便捷方法。 复旦大学硕士论文 第9 页 第一章文献综述 a n b d c h o r i d e 、。h 3 b d i i c l s k 。= 5 6 5 t i mk = 5 6 6 n m t r l 蛐e 0 0 c n b m a e n b d m m d i o c i s k = 4 9 5n mk 。= 5 0 2d m f i g u r e1 8 a s c h e m ef o r t h es y n t h e s i so ff l u o r e s c e n tm o n o m e rn b d - m m a ，b f l u o r e s c e n td y e sa n dt h e i re x c i t a t i o na n de m i s s i o nm a x i m a f i g u r e1 9 a n t e n n af u n c t i o n ：l i g h te n e r g yi sa b s o r b e db yt h ec h r o m o p h o r e sc o u p l e d t ot h ed e n d r i m e r sp e r i p h e r y , a n dt r a n s f e r r e dt ot h ec e n t r a ll a s e rd y ew h i c he m i t si t s o w nf l u o r e s c e n c e 超支化分子或支状聚合物有规整的分子结构，同时也具有独特的内部和外部 光学性质【5 2 】，光能被支状聚合物外部吸收后，会传递到支状聚合物分子内部富 集。利用这种性质，可以将吸光团连接于超支化分子外部，它们会吸收光子能量 进而将能量传递到分子内部，从而激发位于支状聚合物内部的荧光分子，其具体 示意图见f i g u r e1 9 。关于捕获光能支状聚合物的制备首先由f r e c h e t 小组报道 复旦大学硕士论文第1 0 页 爵峨 卜 粉 慨 矗 慨 第一章文献综述 【3 4 ，他们合成了一系列外部接有香豆素3 4 3 ，内部接有香豆素2 的聚苯甲基醚 支状聚合物。这种分子可以有效地将光能富集于分子内部，从而激发位于分子中 心的荧光团。 除了利用支状聚合物制各荧光团富集体外，近年来利用两亲性聚合物自组装 固体微球 3 2 1 或利用l a y e r - b y - l a y e r 方法i s 3 也可以制备不同种类的荧光团富集 体。其中，l a y e r - b y l a y e r 方法是将带有相反电荷的聚电解质通过静电吸引作用， 层层包裹在含有荧光分子的球核上。然后利用溶蚀法或刻蚀法除去内核，得到内 部富集荧光素的中空聚合物微囊。如果利用对环境变化有响应的聚合物电解质作 囊壁材料，还可以通过改变外界环境来控制聚合物微囊壁的孔隙大小，从而控制 荧光物质在微囊内外的进出，制备出环境响应型聚合物荧光微囊 a 7 ，4 8 。 1 3 12 富集荧光团的二氧化硅微球的制备 除了利用有机高分子微球做荧光基团的富集载体外，近年来，越来越多的文 献报道将无机二氧化硅微球用作荧光基团的富集载体。之所以选用无机二氧化硅 微球，是因为它相比较于有机高分子微球，在某些方面存在着独特的优点 3 0 ，3 5 1 ： 无机二氧化硅微球不受微生物的侵袭，其内部孔径大小不易受外界条件的影响； 无机二氧化硅微球化学性质比较稳定，不会影响硅球内部或表面后续的氧化还原 反应；利用二氧化硅材料作为微球的壳层，可以保持分散体系的光学透明性；二 氧化硅微球表面的羟基负电荷可以保证微球内部在进行反应时，体系不致凝结； 利用二氧化硅微球做荧光基团的富集载体可以有效的保护荧光基团不受外部环 境的影响，硅球内部的高度交联结构又同时将包埋在内的荧光团彼此分隔开来， 从而显著降低了荧光索分子间的碰撞猝灭，提高了荧光基团的发光效率【2 9 】；最 后，微球表面存在的羟基又为富集荧光团的二氧化硅微球与其它物质的进一步反 应提供了靶点。 内部富集荧光基团的二氧化硅微球有一个很重要的应用领域，即作为基本模 型来研究胶体粒子的相互作用行为和扩散运动行为。其中涉及到的表征手段主要 包括时间分辩荧光光谱( t i m er e s o l v e df l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y ) ，激光扫描共 聚焦显微镜和光漂白后荧光恢复( f l u o r e s c e n c er e c o v e r y a f t e r p h o t o b l e a c h i n g ) 3 5 。5 4 1 。这些表征手段对胶体粒子的要求就是要有较好的稳定性 和单分散性。利用s t o b e r 方法【5 5 】制备的无机二氧化硅微球很容易做到这两点， 因此近二十年来，利用包裹有荧光探针基团的无机二氧化硅徼球模型来研究胶体 粒子间的基本性质已成为胶体化学和胶体物理领域的热点 2 9 - 3 1 ，3 5 - 3 9 1 。 利用无机二氧化硅微球作为荧光基团的富集载体，荧光素可以分布在硅球的 表面 2 9 ，3 0 】、核壳问【3 0 ，3 5 】或硅球的球核内 3 1 ，3 5 】。如果将二氧化硅与其它材料， 如有机聚合物或金属粒子复合，还可以制备出各种各样的内部富集荧光基团的复 合微球或空心囊【3 9 】。v a l lb l a a d e r e n - 等a 2 9 ，3 5 】所在的荷兰v a i l th 0 行实验室自 复旦大学硕士论文 第1 1 页 第一章文献综述 9 0 年代初就开始在二氧化硅微球表面或内部连接荧光素f i t c ( f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e ) ，用以研究二氧化硅胶体的性质。目前他们已经制备出多种富集 荧光素的二氧化硅微球，微球粒径在0 1 3u m 之间，荧光基团可以分布在硅球 的表面、壳层、核壳间、内部或球核等不同位置，其荧光微球示意图见f i g u r e1 1 0 。 荧光素f i t c 是通过硅烷偶联剂，如三乙氧基胺丙基硅烷( a p s ) 键合到硅球中， 其具体键合示意图见f i g u r e1 1 1 。通过改变连有荧光索的硅烷偶联剂和四烷氧基 硅烷前驱体的加入顺序和方式，可以制备出荧光素在不同位置的二氧化硅微球。 同时也可以用三烷氧基硅烷或二烷氧基硅烷部分替代四烷氧基硅烷，从而制备出 具有不同孔径大小和交联密度的富集荧光基团的有机硅微球【3 l 】。这些包有荧光 团的硅球可以广泛地应用在激光扫描共聚焦显微镜和光漂白后荧光恢复测量中， 为研究胶体体系的三维排列和扩散行为提供了有力的依据。 oo abc s def f i g u r e1 1 0 s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ff i g u r e1 1 1 s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f d y ed o p e do r g a n o s i l i c ap a r t i c