（光学专业论文）提高平面光波导模式光谱生物传感器（owls）传感性能的研究.pdf

提高 平面光波导模式光谱生物传感器( o wl s ) 传感性能的研究 摘要 本文基于平面光波导理论， 在简要介绍光波导模式光谱生物传感器 o w l s ) 的基础上，为提高其传感特性做了以下研究: 一、在分析经典消逝波光波导生物传感器的基础上， 探讨用更为直观的 截止特性来进行生化传感， 分别对三层及四层平板波导进行了研究，指出了作 为基于截止特性的生化传感器三层波导结构存在的局限性。 在理论上研究了可 以在四层波导中使用变折射率材料来进行基于截止特性的生物传感， 并给出了 由空气隙、极化聚合物、高折射率薄膜、待测物组成的传感器结构示意图。用 数值分析的方法绘出了此装置的灵敏度与高折射率薄膜厚度的关系曲线并与 经典消逝波传感器灵敏度相对比， 结果表明这种新型的传感器理论上可以在较 厚的薄膜结构中达到很高的灵敏度。 二、深入研究了反对称模光波导结构， 采用精确公式， 证明了反对称模光 波导传感器比 正对称模光 波导传 感器的 灵敏度更高: 为 使反对称模光波导生物 传感器能在测试的动态过程中始终保持高的灵 敏度，提出了一套新的设计框 架。首先提出用杜邦公司的折射率为 1 . 2 9 的 t e f l o n a f 树脂作为衬底， 这种材 料是目前有报道的一种折射率小于纯水折射率并有良好光学性质的物质. 通过 理论分析及计算， 得出了在已定波导层材料下的最大可测覆盖层折射率及导波 层制造精度。 及在己定最大可测覆盖层折射率情况下， 确定了最小可用的波导 层折 射率及 波导层制造精度。 通过计算机模拟， 给出了两个范例。 所有设计都 可使 传感器的 动态测试过程中保持灵敏度 在0 . 2 到0 . 9 之间。 关键词:平面光波导模式光谱生物传感器截止特性高灵敏度反对称模 设计框 架 提高 平面光波导模式光 谱生物传感器 ( o wl s ) 传感性能的研究 abs tract t h i s t h e s i s f o c u s e s t h e r e s e a r c h o n s e n s i t i v i t y e n h a n c e me n t f o r o p t i c a l w a v e g u i d e l i g h t m o d e s p e c t r o s c o p y ( o wl s ) b a s e d o n t h e t h e o ry o f p l a n a r w a v e g u i d e s . f i r s t , i n o r d e r t o f i n d a mo re e ff e c t i v e m e t h o d mo n i t o r i n g b i o c h e mi c a l r e a c t i o n t i m e l y f o r p l a n a r w a v e g u i d e s , t h e m o r e i n t u i t i o n is t i c e u t - o ff c h a r a c t e r i s t i c o f t h r e e - l a y e r a n d f o u r - l a y e r p l a n a r w a v e g u i d e s i s s t u d i e d . a ft e r a n a l y s i s , t h e l i m i t a t i o n o f t h r e e - l a y e r w a v e g u i d e s i s p o i n t e d o u t . t h e n a s k e t c h m a p o f f o u r - l a y e r w a v e g u i d e s i s d e s i g n e d . w h i c h i s c o m p o s e d o f a i r g a p , p o l a r i z i n g p o l y m e r l a y e r , h ig h i n d e x w a v e g u i d e s l a y e r a n d c o v e r m e d i u m ( a n a l y t e s ) t h a t i s b e i n g m o n i t o r e d t i m e l y ; l a s e r i s c o u p l e d b y p r i s m a n d t h e i n d e x o f p o l a r i z i n g p o l y m e r l a y e r is c o n t r o l l e d b y e l e c t r i c i ty . b a s e d o n t h e s k e t c h m a p , t h e t h e o re t i c a l a n a l y s i s i s p r e s e n t e d . i t i s a u s e f u l s e n s o r a n d t h e f o r m u l a f o r i t i s p r e s e n t e d . f i n a l l y , a c o m p u t e r p r o g r a m i s g e n e r a t e d t o p a i n t t h e s e n s i t i v i t y c u r v e s f o r d i ff e r e n t m o d e l s y s t e m s , a n d t h e c l a s s i c a l e v a n e s c e n t - w a v e g u i d e b i o s e n s o r s a re c o m p a r e d w i t h t h e m . t h e r e s u l t s h o ws t h a t h i g h e r s e n s i t i v i t y c a n b e a c h i e v e d w i t h t h i c k e r w a v e g u i d e s . s e c o n d , w e n o t i c e d t h a t t h e p l a n a r w a v e g u i d e s s e n s o r s w i t h r e v e r s e - s y m m e t ry h a v e h i g h e r s e n s i t i v i ty t h a n t h a t w i t h n o r m a l s y m m e t r ) 口， w h i c h d e m o n s t r a t e d i t b y a c c u r a t e f o r m u l a . a n e w d e s i g n i s p r e s e n t e d , a i m i n g t o a r r i v e a t h i g h s e n s i t i v i ty ( b e t w e e n 0 . 2 a n d 0 .9 ) o f d y n a m i c m o n i t o r i n g f o r r e v e r s e - s y m me t r y p l a n a r o p t i c a l w a v e g u i d e s b i o s e n s o r s . t h e d e s i g n i s b a s e d o n a n e w ma t e r i a l , a l i n e o f t e fl o n a f r e s i n s w i t h a v a i la b l e i n d e x o f re f r a c t i o n s o f 1 . 2 9 ( 2 4 0 0 ) , w h i c h i s r e g a r d e d a s t h e o n l y c a n d i d a t e f o r s u b s t r a t e . b y t h e o r e t i c a l a n a l y s i s , w e g e t t w o g r o u p s o f p a r a m e t e r s t h a t m u s t b e t a k e n i n t o c o n s i d e r a t i o n i n t h e p r o c e s s o f d e s i g n : o n e i s t h a t , w h e n t h e m a t e r i a l o f t h e w a v e g u i d e s f i l m i s a l r e a d y c h o s e n , w e g e t t h e p o s s i b l e m a x i mu m c o v e r r e f r a c t i v e i n d e x c h a n g e a n d p a r a m e t e r s o f t h e f i l m t h i c k n e s s ; t h e o t h e r i s t h a t , w h e n w e ma k e t h e s e n s o r s m a x i mu m c o v e r r e f r a c t i v e i n d e x c h a n g e s u i t d e f i n i t e r e q u i r e m e n t , w e g e t a n d t h e m i n i m u m o f t h e r e f r a c t i v e i n d e x o f w a v e g u i d e s f i l m a n d p a r a m e t e r s o f t h e f il m t h i c k n e s s . t w o g r o u p s o f s i m u l a t in g r e s u l t s a r e g i v e n a s e x a m p l e s b y c o m p u t e r c a l c u l a t i o n . 提高平面光波导模式光谱生物传感器( owl s ) 传感性能的研究 k e y w o r d s : o p t i c a l wa v e g u i d e l i g h t m o d e s p e c t r o s c o p y ( o wl s ) ; c u t - o f f c h a r a c t e r i s t i c ; r e v e r s e - s y m me t r y ; h i g h s e n s it i v i t y ; d e s i g n ; 提高平面光波导模式光谱生物传感器( o wl s ) 传感性能的研究 第一章:概论 1 .1现代生物科学仪器的发展现状与趋势ii i 2 1世纪被称为是生命科学的世纪。多种动物的克隆成功、人类基因组计 划的提前完成、 各种新型生物材料的出 现等， 都标志着现代生物科学在宏观和 微观水平及各个方向上正在取得 日新月异的进步。 科学的发展与技术的进步相 辅相成、密不可分，生命科学领域也莫不如此。毋庸置疑，正是各种高新技术 的出现、各种生物分析仪器的推陈出新， 为这些令人鼓舞的生命进展提供了坚 定的技术平台和支撑。 现代生物科学分析仪器的发展现状及趋势如下: 一、大型综合性仪器与小型专一性仪器共同发展 大多 数生 物大分子的组成和结构本身就非常复杂，在结构和功能的分析 上 存在不少困难。 面对这种情况， 各种多功能综合性的分析仪器正不断推陈出新: 并获得了广泛的应用，大大提高了分析的工作效率和可靠性。例如，新型激光 共聚 焦显微镜的出现， 已 从过去的单纯的局部形态结构观察提升到可以对 活细 胞内成分进行定位、定时、定性的同时分析，功能大为扩展，分析结果的可靠 性也得以大大提高。另一方面， 功能较为单一的小型仪器也在不断获得开发和 应用。 例如， 生态学研究、 环境保护工作中需要 对果 蔬等各种生物样品的 有害 元素、 污染物等进行现场分析的仪器，及各种快速侧定的便携式仪器设备也在 不断问世。这将是今后研究和技术开发的一个热点。 二、各领域技术交叉明显，共同构筑高新技术平台 毫无疑问， 精密 机电设备制造技术、 激光技术、 光学技术、 数码转换技术、 计算机技术、 各种荧光标记技术、 检测技术等的交叉和综合应用，共同构筑高 新技术的平台，是实现小型或大型分析仪器的技术基础，使得设计、制造大型 多功能的仪器设备成为可能。 三、计算机技术与 自动化、智能化工作站的出现 这是现代化生物科学分析仪器发展最明显的特点之一。 计算机正以空前的 速度广泛引入各种分析仪器中， 使得分析仪器如虎添翼。 利用 数码技术和各种 专用软件， 在计算机提供的 友好 工作界面上实现人机对话， 大大提高了 分析速 度和测试结果的重现性和可靠性. 从自动进样器开始，整个分析过程中各种测 试参数的设定、对样品组分的流向、测试信息的自动收集、反馈、监控，以及 分析 数据的 储存、 加工和输出 等都有赖于计算机技术的应用。 越来越多的集 这 些功能于 一身的 工作站的出现， 也使得自 动 化、 智能化的日 常分析工作成为 可 能。 另外， 适合各种生物样品预制备过程的自 动化设 备也 将是今后开发和应用 提高平面光波导模式光谱生物传感器( o wl s ) 传感性能的研究 第一章:概论 1 .1现代生物科学仪器的发展现状与趋势ii i 2 1世纪被称为是生命科学的世纪。多种动物的克隆成功、人类基因组计 划的提前完成、 各种新型生物材料的出 现等， 都标志着现代生物科学在宏观和 微观水平及各个方向上正在取得 日新月异的进步。 科学的发展与技术的进步相 辅相成、密不可分，生命科学领域也莫不如此。毋庸置疑，正是各种高新技术 的出现、各种生物分析仪器的推陈出新， 为这些令人鼓舞的生命进展提供了坚 定的技术平台和支撑。 现代生物科学分析仪器的发展现状及趋势如下: 一、大型综合性仪器与小型专一性仪器共同发展 大多 数生 物大分子的组成和结构本身就非常复杂，在结构和功能的分析 上 存在不少困难。 面对这种情况， 各种多功能综合性的分析仪器正不断推陈出新: 并获得了广泛的应用，大大提高了分析的工作效率和可靠性。例如，新型激光 共聚 焦显微镜的出现， 已 从过去的单纯的局部形态结构观察提升到可以对 活细 胞内成分进行定位、定时、定性的同时分析，功能大为扩展，分析结果的可靠 性也得以大大提高。另一方面， 功能较为单一的小型仪器也在不断获得开发和 应用。 例如， 生态学研究、 环境保护工作中需要 对果 蔬等各种生物样品的 有害 元素、 污染物等进行现场分析的仪器，及各种快速侧定的便携式仪器设备也在 不断问世。这将是今后研究和技术开发的一个热点。 二、各领域技术交叉明显，共同构筑高新技术平台 毫无疑问， 精密 机电设备制造技术、 激光技术、 光学技术、 数码转换技术、 计算机技术、 各种荧光标记技术、 检测技术等的交叉和综合应用，共同构筑高 新技术的平台，是实现小型或大型分析仪器的技术基础，使得设计、制造大型 多功能的仪器设备成为可能。 三、计算机技术与 自动化、智能化工作站的出现 这是现代化生物科学分析仪器发展最明显的特点之一。 计算机正以空前的 速度广泛引入各种分析仪器中， 使得分析仪器如虎添翼。 利用 数码技术和各种 专用软件， 在计算机提供的 友好 工作界面上实现人机对话， 大大提高了 分析速 度和测试结果的重现性和可靠性. 从自动进样器开始，整个分析过程中各种测 试参数的设定、对样品组分的流向、测试信息的自动收集、反馈、监控，以及 分析 数据的 储存、 加工和输出 等都有赖于计算机技术的应用。 越来越多的集 这 些功能于 一身的 工作站的出现， 也使得自 动 化、 智能化的日 常分析工作成为 可 能。 另外， 适合各种生物样品预制备过程的自 动化设 备也 将是今后开发和应用 提高平面光波导模式光谱生物传感器( o wl s ) 传感性能的研究 的方向之一。 四、联用技术的优势 生物样品中各种复杂体系，有必要将各种分离、分析仪器联合起来使用， 以使各取所长，发挥各 自 的技术优势，才能获得比较理想的测试结果。例如， 高压液相色谱仪一核磁共振波谱一质谱技术的联用在新药的开发研究中， 已经 获得成功的应用。 五、资源共享及网络化 借助于国际互联网的迅速发展， 不同实验室内部或相互之间不同的仪器组 成网络，进行并机或串联工作，进行测试信息的网上传递和交流，使得资源共 享正在成为现实。 1 .2 典型的光学生物仪器 毫无疑问， 现代光学在生物仪器中扮演了非常重要的作用。 这里我们以几 种典型的光学生物仪器为例，介绍它们的原理及分析方法。 1 . 2 . 1 光谱仪m 光谱分析技术是建立在物质的电磁辐射或电 磁辐射与样品组分之间 相互 作 用基础上的一 类分析方法。 这些作用包括了 光的 发射、 吸收、 反射、 干涉等多 种方式。 这些仪器包括 紫外一可见 光谱、 红外光谱、 荧光光谱、 原子吸收 光谱。 利用这些仪器可以获得反映光辐射与样品组分相互作用的结果一 各种谱图， 并借助这些谱图的特征与有机化合物的分子结构信息间的关系来解析、 印证推 导复杂化合物的结构，进行定量分析或追踪化学反应的进程等。 光的 吸收与 发射是许多 物质分子的 标志 性特征。根据量子力学原则， 分子 中的价电子总是处于某一种运动状态之中，并属于一定的能级。当处于最低能 级时，称为基态。当电子吸收了外加能量 ( 如电致激发、热致激发或是光致激 发等) 后从一 个较低能级 ( e ， ) 转移到另一个 较高的能级 ( 激发态，e z ) ，称 为跃迁。这种跃迁所需吸收的能量是量子化的。当物质的原子或分子的两个能 级间跃迁所需能量4 e 满足下列关系式时，将会产生吸收光谱: a e = e一 乓= h r ( 1 - 1 ) 如果改 变照射某一吸收物质的波长， 并记录该物质在每一个波长的吸光度， 再以波长 久 对吸光度 ( a) 作 a - 人坐标图就可得到该物质的吸收光谱或吸收曲 线。 吸收光谱的波形、强度、 位置及数目等反映了该物质在不同的光谱区域的 吸收能力的分布情况，因 此可以为 推断 物质内部结构提供重要的 信息。 相反， 当激发态的原子和分子从不稳定的激发态返回到低能级或基态时就 会把多余的能量以 光的形式释放出 来， 产生 发射光 谱和发射曲 线。 通过测定物 质的发射光谱进行定性或定量分析的方法称为发射光谱分析法。图 1 一 1 是最简 提高平面光波导模式光谱生物传感器( o wl s ) 传感性能的研究 的方向之一。 四、联用技术的优势 生物样品中各种复杂体系，有必要将各种分离、分析仪器联合起来使用， 以使各取所长，发挥各 自 的技术优势，才能获得比较理想的测试结果。例如， 高压液相色谱仪一核磁共振波谱一质谱技术的联用在新药的开发研究中， 已经 获得成功的应用。 五、资源共享及网络化 借助于国际互联网的迅速发展， 不同实验室内部或相互之间不同的仪器组 成网络，进行并机或串联工作，进行测试信息的网上传递和交流，使得资源共 享正在成为现实。 1 .2 典型的光学生物仪器 毫无疑问， 现代光学在生物仪器中扮演了非常重要的作用。 这里我们以几 种典型的光学生物仪器为例，介绍它们的原理及分析方法。 1 . 2 . 1 光谱仪m 光谱分析技术是建立在物质的电磁辐射或电 磁辐射与样品组分之间 相互 作 用基础上的一 类分析方法。 这些作用包括了 光的 发射、 吸收、 反射、 干涉等多 种方式。 这些仪器包括 紫外一可见 光谱、 红外光谱、 荧光光谱、 原子吸收 光谱。 利用这些仪器可以获得反映光辐射与样品组分相互作用的结果一 各种谱图， 并借助这些谱图的特征与有机化合物的分子结构信息间的关系来解析、 印证推 导复杂化合物的结构，进行定量分析或追踪化学反应的进程等。 光的 吸收与 发射是许多 物质分子的 标志 性特征。根据量子力学原则， 分子 中的价电子总是处于某一种运动状态之中，并属于一定的能级。当处于最低能 级时，称为基态。当电子吸收了外加能量 ( 如电致激发、热致激发或是光致激 发等) 后从一 个较低能级 ( e ， ) 转移到另一个 较高的能级 ( 激发态，e z ) ，称 为跃迁。这种跃迁所需吸收的能量是量子化的。当物质的原子或分子的两个能 级间跃迁所需能量4 e 满足下列关系式时，将会产生吸收光谱: a e = e一 乓= h r ( 1 - 1 ) 如果改 变照射某一吸收物质的波长， 并记录该物质在每一个波长的吸光度， 再以波长 久 对吸光度 ( a) 作 a - 人坐标图就可得到该物质的吸收光谱或吸收曲 线。 吸收光谱的波形、强度、 位置及数目等反映了该物质在不同的光谱区域的 吸收能力的分布情况，因 此可以为 推断 物质内部结构提供重要的 信息。 相反， 当激发态的原子和分子从不稳定的激发态返回到低能级或基态时就 会把多余的能量以 光的形式释放出 来， 产生 发射光 谱和发射曲 线。 通过测定物 质的发射光谱进行定性或定量分析的方法称为发射光谱分析法。图 1 一 1 是最简 提高平面光波导模式光谱生物传感器( o wl s ) 传感性能的研究 的方向之一。 四、联用技术的优势 生物样品中各种复杂体系，有必要将各种分离、分析仪器联合起来使用， 以使各取所长，发挥各 自 的技术优势，才能获得比较理想的测试结果。例如， 高压液相色谱仪一核磁共振波谱一质谱技术的联用在新药的开发研究中， 已经 获得成功的应用。 五、资源共享及网络化 借助于国际互联网的迅速发展， 不同实验室内部或相互之间不同的仪器组 成网络，进行并机或串联工作，进行测试信息的网上传递和交流，使得资源共 享正在成为现实。 1 .2 典型的光学生物仪器 毫无疑问， 现代光学在生物仪器中扮演了非常重要的作用。 这里我们以几 种典型的光学生物仪器为例，介绍它们的原理及分析方法。 1 . 2 . 1 光谱仪m 光谱分析技术是建立在物质的电磁辐射或电 磁辐射与样品组分之间 相互 作 用基础上的一 类分析方法。 这些作用包括了 光的 发射、 吸收、 反射、 干涉等多 种方式。 这些仪器包括 紫外一可见 光谱、 红外光谱、 荧光光谱、 原子吸收 光谱。 利用这些仪器可以获得反映光辐射与样品组分相互作用的结果一 各种谱图， 并借助这些谱图的特征与有机化合物的分子结构信息间的关系来解析、 印证推 导复杂化合物的结构，进行定量分析或追踪化学反应的进程等。 光的 吸收与 发射是许多 物质分子的 标志 性特征。根据量子力学原则， 分子 中的价电子总是处于某一种运动状态之中，并属于一定的能级。当处于最低能 级时，称为基态。当电子吸收了外加能量 ( 如电致激发、热致激发或是光致激 发等) 后从一 个较低能级 ( e ， ) 转移到另一个 较高的能级 ( 激发态，e z ) ，称 为跃迁。这种跃迁所需吸收的能量是量子化的。当物质的原子或分子的两个能 级间跃迁所需能量4 e 满足下列关系式时，将会产生吸收光谱: a e = e一 乓= h r ( 1 - 1 ) 如果改 变照射某一吸收物质的波长， 并记录该物质在每一个波长的吸光度， 再以波长 久 对吸光度 ( a) 作 a - 人坐标图就可得到该物质的吸收光谱或吸收曲 线。 吸收光谱的波形、强度、 位置及数目等反映了该物质在不同的光谱区域的 吸收能力的分布情况，因 此可以为 推断 物质内部结构提供重要的 信息。 相反， 当激发态的原子和分子从不稳定的激发态返回到低能级或基态时就 会把多余的能量以 光的形式释放出 来， 产生 发射光 谱和发射曲 线。 通过测定物 质的发射光谱进行定性或定量分析的方法称为发射光谱分析法。图 1 一 1 是最简 提高平面光波导模式光谱生 物传感 器( o wl s ) 传感性能的研究 单的单光束紫外一可见光谱仪的光路图: 。八 / 口 _ i 一牛 火 口y 甲 一甲 图1 - 1 :单光束紫外一 可见光光谱仪光路 卜 光r.; 2 - - 单色器; j 一 参比池;4 - 样品池i 5 - 检测器, 6 - - 显不器 光谱分析技术定量分析的基本依据就是l a m b e r t -b e e r定律， 即在特定 波长处被测样品的吸光度与其浓度成线性关系。测试时一般要用到标准样品， 如紫外分光光度计的定量分析可用标准曲 线法和标准加入法， 都需预先配制标 准溶液。 1 .2 .2 激 光 扫 描 共聚 焦 显 微 镜 系统 ill. iz i 激 光 扫 描 共 聚 焦 显微 镜系 统( l a s e r s c a n n in g c o n fo c a l m i c r o s c o p e , l s c m ) 是 2 0 世纪 8 0 年代发展起来的多功能的生物医学分析仪器， 它是在传统荧光显 微镜成像基础上， 集激光扫描技术、荧光探针标记技术以及计算机图像信息处 理等技术于一身的新型显微系统。 利用可见光或紫外光激发荧光探针而得到细 胞内部微细构的荧光图像，具有快速、实时、定性、定量、定位地进行分析测 量的功能，尤其是可进行活细胞的无损伤测定， 并可利用强大的计算机图像处 理技术将一定厚度范围内的细胞或结构的虚拟光学切片进行三维重建工作， “ 栩栩如生” 地再现细胞或组织的微细三维结构， 这是目前其它显微技术所无 法比 拟的。 l s c m己 经成为形 态学、 细胞分 子生 物学、 遗传学等生物医学领域 中 新一代强 有力的研究工具， 在生物大分子空间构型的研究方面己获得 越来 越 广泛的应用。 l s c m 共聚焦的工作原理可通过图 1 - 2来加以说明。在 l s c m 系统中采 用了点光源，由点光源发出的激光光束通过照明针孔，经色光分离滤光片折射 至物镜后， 聚焦于样品的焦平面上。 从样品表面上反射回来的光信号反向并透 过色光分离滤光片刚好会聚在共聚焦针孔上， 被放置在该位置上的光电倍增器 接收， 这样就采集到了从样品的聚焦点上获得的该点的信息。 在焦平面上作x 轴或y轴向 的逐点逐线的移 动扫描所获得的信息， 经计算机储存、 处理、 即 可 获得该xy平面的二维图像。由于采用的是非常细的点光源照射样品表面，同 一焦平面上的焦点外的光信号 ( 虚线所示) 虽然也可以同时透过色光分离滤光 片，可能会聚于共焦针孔之前或之后， 但不能刚好会聚在共焦针孔后的光电倍 增器上，即焦点外的信息不被采集。由于共焦针孔和照明针孔是连动的，它们 相 对于物 镜焦平面是共辘的， 称为共扼体系。 正是这一共辘体系保证每次的扫 描仅能正确地采集到每一焦点内的信息而摈除了焦点外的信息，另外， 显微镜 提高平面光波导模式光谱生 物传感 器( o wl s ) 传感性能的研究 单的单光束紫外一可见光谱仪的光路图: 。八 / 口 _ i 一牛 火 口y 甲 一甲 图1 - 1 :单光束紫外一 可见光光谱仪光路 卜 光r.; 2 - - 单色器; j 一 参比池;4 - 样品池i 5 - 检测器, 6 - - 显不器 光谱分析技术定量分析的基本依据就是l a m b e r t -b e e r定律， 即在特定 波长处被测样品的吸光度与其浓度成线性关系。测试时一般要用到标准样品， 如紫外分光光度计的定量分析可用标准曲 线法和标准加入法， 都需预先配制标 准溶液。 1 .2 .2 激 光 扫 描 共聚 焦 显 微 镜 系统 ill. iz i 激 光 扫 描 共 聚 焦 显微 镜系 统( l a s e r s c a n n in g c o n fo c a l m i c r o s c o p e , l s c m ) 是 2 0 世纪 8 0 年代发展起来的多功能的生物医学分析仪器， 它是在传统荧光显 微镜成像基础上， 集激光扫描技术、荧光探针标记技术以及计算机图像信息处 理等技术于一身的新型显微系统。 利用可见光或紫外光激发荧光探针而得到细 胞内部微细构的荧光图像，具有快速、实时、定性、定量、定位地进行分析测 量的功能，尤其是可进行活细胞的无损伤测定， 并可利用强大的计算机图像处 理技术将一定厚度范围内的细胞或结构的虚拟光学切片进行三维重建工作， “ 栩栩如生” 地再现细胞或组织的微细三维结构， 这是目前其它显微技术所无 法比 拟的。 l s c m己 经成为形 态学、 细胞分 子生 物学、 遗传学等生物医学领域 中 新一代强 有力的研究工具， 在生物大分子空间构型的研究方面己获得 越来 越 广泛的应用。 l s c m 共聚焦的工作原理可通过图 1 - 2来加以说明。在 l s c m 系统中采 用了点光源，由点光源发出的激光光束通过照明针孔，经色光分离滤光片折射 至物镜后， 聚焦于样品的焦平面上。 从样品表面上反射回来的光信号反向并透 过色光分离滤光片刚好会聚在共聚焦针孔上， 被放置在该位置上的光电倍增器 接收， 这样就采集到了从样品的聚焦点上获得的该点的信息。 在焦平面上作x 轴或y轴向 的逐点逐线的移 动扫描所获得的信息， 经计算机储存、 处理、 即 可 获得该xy平面的二维图像。由于采用的是非常细的点光源照射样品表面，同 一焦平面上的焦点外的光信号 ( 虚线所示) 虽然也可以同时透过色光分离滤光 片，可能会聚于共焦针孔之前或之后， 但不能刚好会聚在共焦针孔后的光电倍 增器上，即焦点外的信息不被采集。由于共焦针孔和照明针孔是连动的，它们 相 对于物 镜焦平面是共辘的， 称为共扼体系。 正是这一共辘体系保证每次的扫 描仅能正确地采集到每一焦点内的信息而摈除了焦点外的信息，另外， 显微镜 提高平面光波导模式光谱生物传感器( o wl s ) 传感性能的研究 的载物台在微量步进电机的驱动下， 可使焦平面沿垂直方向做上下移动。 这样 即可在 2方向上采集到特定的厚度 内的一系列光学切片。 华 ” 弓 ” 共住针 孔 照明针孔 色 撼 物镜 焦 点 * 一 一 知 一 一样品台 曰一一 样品 图 t - 2 : l s cm共聚几的工作原理示意图 一f ,j l ! n i t 线一 分一 知 u : 1 .、 外光 线 目前，将荧光探针与 l s c m 技术结合起来组成了激光扫描共聚焦荧光显 微镜， 它实现了高分辨率情况下完整活组织内 生物过程的 观察。 l s c m具有 层 析能力， 可得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像， 而且不用切片机就能实 现对样品的 三维重建。 它的 这一 优点 使其成为生 物化学、 细胞生物学、 发育生 物学和神经生物学研究领 域中新一代强有力的工具。 但激光扫描共聚焦荧光显 微镜使用的紫外和可见光对样品进行长时间的照射后都会导致样品的光漂白 ， 即当对荧光标记的3 d透明 样品的某一深度聚焦时， 整个照明 锥体内的样品都 被激发出荧光， 发生光漂白， 光漂白影响 数据获取， 不利于活体 研究和组织的 深层成像。同时荧光探针具有一定的毒性，因此使用上受到一定的限制。 提高平面光波导模式光谱生物传感器( o wl s ) 传感性能的研究 1 . 2 . 3 光学生物传感器 1 . 2 . 3 . 1简介 光学生 物传感器是用来检测生物分子的传感器件3 。 作为广义上的光学生 物传感器的一种， 传统的分光光度计是利用蛋白质对光波的吸收来工作的一种 器件。但是，现在，光学生物传感器这一术语，有着更专门的适用范围，它专 指一类检测在表面存在的分子的传感器，如图 1 - 3 所示典型的光学生物传感 器示意图4 1 ，图中 在溶液中的待分析物 ( a ) 流过固定在光学生物传感器的 表 面的配合基 ( b)表面，形成 a b组合的结构。从传感器的发展历程上看，之 所以提出表面这个概念是因为据研究表明， 对生物的表面的检测比对生物大块 物质进行检测更灵敏;后来又有研究表明生物的大部分识别过程 ( r e c o g n i t i o n p ro c e s s e s ) 确 实 发 生 在表 面 。 而 这 里 特 别 值 得 注 意的 是 在固 体 / 液 体 表面 ( 例 如 : 在细胞膜 / 细胞质) 的识别过程。 因 此， 我们就 把用于 检测生物分子在表面存在、 运动和变化的光学传感器称为光学生物传感器 ( o b) ，人们在这方面做了大量 的工作，研究 o b检测分子生物学的一些基本原理及其方法。 虽然，在o b中使用的传感原理原则上同 样适合于传感 任意种类的 分子， 不管它是生物分子还是其它类的分子， 但由于生物分子对于其它种分子所表现 的 特异性 ( 例如 抗体对抗原) ，光学生物传 感器被定义为化学传感器的一种， 它 特定地指它的表面被生物分子包授的一类传感器。 人 : 待分析物 b二 配合 基 导波 光 图 卜3 : 典 型 的光学 生物传 感器 a n . n , o 薄 膜一 衬 底 分界 面 上的 全 反 射 角 设 为 b , ， 而 薄 膜 一 覆 盖 层 分 界 面 上的 全 反 射 临 界 角 为b。 显 然b , 9 , o 当入射角b 逐渐增大时，经分析可知， 存在着三种不同的情况， 如图2 - 2 所示: ( a ) 对 应 于 入 射 角b 小 的 情 况( 夕 8 只 ) ， 从 衬 底一 侧 入 射的 光 按 照 非 涅 尔 定律进行折射， 并穿过覆盖层从波导逸出。 此时， 光基本上没有受到什么限制。 相对于这一图像的电磁模式称为 “ 辐射模”( 或称 “ 包层模” ) 。( b )如图所示， 入 射 角0 略 为 增 大， 使 b ,. n , o 薄 膜一 衬 底 分界 面 上的 全 反 射 角 设 为 b , ， 而 薄 膜 一 覆 盖 层 分 界 面 上的 全 反 射 临 界 角 为b。 显 然b , 9 , o 当入射角b 逐渐增大时，经分析可知， 存在着三种不同的情况， 如图2 - 2 所示: ( a ) 对 应 于 入 射 角b 小 的 情 况( 夕 8 只 ) ， 从 衬 底一 侧 入 射的 光 按 照 非 涅 尔 定律进行折射， 并穿过覆盖层从波导逸出。 此时， 光基本上没有受到什么限制。 相对于这一图像的电磁模式称为 “ 辐射模”( 或称 “ 包层模” ) 。( b )如图所示， 入 射 角0 略 为 增 大， 使 b ,. 0 8 , ， 自 衬 底 入 射的 光 在 薄 膜一 衬 底 分 界 面 上 被 折 射，而在薄膜一覆盖层分界面上全反射，然后再发生折射，回到衬底，并最终 穿过衬底逸出波导结构。这时光仍没有受到限制。这种传播方式称为 “ 衬底辐 提高平面光波导模式光谱生物传感器( o w l s ) 传感性能的 研究 射模” 。 ( c )当b 足够大时， 则有b ,. q , . 0 , 也就是在两个分界面上都发生全反射。 光一旦 进入薄膜后就被封闭在里面沿z字形路径传 播。这种情况对应于传播的 “ 导模，o 2 . 2 . 2 平面波导的导模 图 2 - 3表示了平面波导的侧视图及坐标 系，图中画出了对应于导模的 z字形波的波 阵面。 前面己指出， 平板波导的导模可以用锯 齿形光线图像描述， 并且锯齿形光线与界面法 线的夹角b 只能取有限个离散值。 设导波中的 光沿坐标 z方向传播，而在 x方向受限制。 至于在垂直于x z 平面的y 方向 上，由 于波导 的尺寸相对比较大， 所以在理论上认为平板波 导的 几何结构和折射率分 布沿 y方向上是不 变的， 并可进一步认为光 场沿y 方向也是均匀 一致的。 于是可以 看出， 锯齿形光线实际上是 两个重叠的均匀平面波的图像， 一个是斜向上 图2 - 2在平板彼份中的图像 传播的，另一个是斜向下传播的， 其波阵面法线是图中所示的锯齿形光线。没 这两个平面波是单色并相干的， 其角频率为。 ，自 由 空间的 波长为乳 ，则自由 空间 的波数为:k o = c o l c = 2 ; r i a 式中， c 为 真空中的 光速。 图2 .2 所示的 平面波 的波矢为: ik l = k on , n = 竺 c o s a t p=i c o n , s i n v ( 2 - 1 ) 式中 ，k 和p 分别为 波矢k 的x 分量和z 分量。 以 下 方 式 变 化 : e x p !i 件 x x + 刀 : )】 式 中 ， x 前面的正负号分别对应于斜向上和 斜 向 下 的 传 播 的 平 面 波 。 考 察 某 一 又 为常数的波导截面， 这时只能看到光波 沿x方向的运动， 以下从这个观点出发 推导平板波导维持导模的条件， 设一光 由此可见，薄膜中的波动场按 拉盖层 n , 咔z n, 图2 . 3平板波导的侧视图 波从薄 膜下界面( x = o ) 出 发向 上行进到薄膜上界面( x = h ) ， 在上界面经历全反射 后返回到下界面， 在下界面又经全反射后与原先从下界面出发的光波叠加在一 起， 将此过程中光波所经历的相移累加起来， 可以 看到， 为了 达到相干加强 ( 谐 提高平面光波导模式光谱生物传感器( o w l s ) 传感性能的 研究 射模” 。 ( c )当b 足够大时， 则有b ,. q , . o ) 对于t m模， 有 ic h = m 二 十 arctan ( za r c t a n 4 . 卫 ) 十 ar ct anza r c ta n ( ! 与 n i k n 3尤 ( 2 - 6 ) ( 2 - 7 ) ( 2 - 8 ) ( 2 - 4 ) 导模的传播常数0 介于平面波在衬底和薄 膜的波数 之间，即有: 提高平面光波导模式光谱生物 传感器 ( o wl s ) 传感 性能的研究 月 : p k o n , 为了方便起见，定义波导的有效折射率: ( 2 - 1 0 ) 、 一 k o 二 一 “ ( 2 - 1 1 ) n又 可称为 模折射率或模指数，根据 ( 2 - 1 0 ) ，可知它的取值范围 是: n 2 n n ,( 2 - 1 2 ) 利 用有效 折射率， 可将平板波导的模 式本征方程改写成意义更明 确的形式， 即 t e模: _ . ， 、 犯 ._n2 一 n ?_ 。 _n2 一 心， ， _ t i s 一 i v 一，/ 0 k. n= m g r + a r c t a n ( ( - r一1 + a r c t a n ( ( - r - ( 2 - 1 3 1 n - , 一n一n, 一i v t m模: _ 对 n 2 一 n z 、 _ n z . n 2 一 n .2 ( n . - 一 n 一) k . t i = m g r + a r c t a n ( -( = 1 1 + a r c t a nl -( ， ， “ 1 (z- 1 4) 热n 一 i 一 n巧n, 一i v - 这些不同 形式的 平板波导模式本征方程式可用来研究波导的各种不同性质。 2 . 2 .3 古斯 一汉欣( g o o s - h a n c b e n ) 1 ,. 为光波长。 这个现象的出 现 是基于实际光线都具有一定的空间 谱宽， 也即实际上的光线由一光束构 成， 它们指向同一入 射点， 但入射角 有一角宽度 0 . 为了确定图2 一所示的光线纵向 位 移2 z 、 的 大 小， 现 研究 两 个入 射 角 稍有不同的x = 0 平面波组成的简单 波包。 如果相应波矢的2分量分别为 刀 1 a 刀，则入射波包在x = 0 的分 界 面的复振幅为: a ( z ) 二 【 e x p ( i a ) 6 ) + e x p ( - i a p ) e x p ( i fi z ) = 2 cos(46z) e x p ( i / 6 z )( 2 - 1 6 ) 提高平面光波导模式光谱生物 传感器 ( o wl s ) 传感 性能的研究 月 : p k o n , 为了方便起见，定义波导的有效折射率: ( 2 - 1 0 ) 、 一 k o 二 一 “ ( 2 - 1 1 ) n又 可称为 模折射率或模指数，根据 ( 2 - 1 0 ) ，可知它的取值范围 是: n 2 _ n 3 。 如 果n 2 = n 3 ， 则 称 波导 是 对 称的 ; 当 n 2 a n 3 时 ， 则 波 导是 非 对 称的 。 山于对称波导是非对称波导的极 图2 一 7非对称平板波导和坐标系选择示感图 限情况，故本章仅叙述非对称波导的 基本理论。 设 衬底和覆盖层分别延伸到无穷远， 且导波层的宽度远大于它的厚度。 在 这种假设条件下，可认为平板波导中光场只在x方向上受到限制， 并设平板波